Η οπτογενετική αναστολή των εισόδων του έσω εντορινικού φλοιού στον ιππόκαμπο κατά τη διάρκεια μιας σύντομης χρονικής περιόδου αμέσως μετά τη μάθηση διαταράσσει τον σχηματισμό μνήμης του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Αφηρημένη

Ο σχηματισμός χρονικής ένωσηςμνήμηκαι φόβος συγκεκριμένου πλαισίουμνήμηπιστεύεται ότι απαιτεί εισαγωγές έσω ενδορινικού φλοιού (MEC) στοιππόκαμποςκατά τη διάρκεια μαθησιακών εκδηλώσεων. Ωστόσο, το εάν οι είσοδοι MEC εμπλέκονται επίσης στο σχηματισμό μνήμης κατά τη διάρκεια μιας μεταμαθησιακής περιόδου δεν έχει ελεγχθεί ακόμη άμεσα. Για να εξετάσουμε αυτήν την πιθανότητα, αναστέλλαμε οπτογενετικά τους άξονες και τα άκρα που προέρχονται από αμφοτερόπλευρους ραχιαίους διεγερτικούς νευρώνες MEC στη ραχιαίαιππόκαμποςγια 5 λεπτά αμέσως μετά τη συνθήκη φόβου με βάση τα συμφραζόμενα (CFC). Τα ποντίκια που εκφράζουν eNpHR3.0 εμφάνισαν σημαντικά μικρότερη κατάψυξη σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου που εκφράζουν μόνο το EGFP κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανάκτησης στο ρυθμισμένο πλαίσιο 1 ημέρα μετά την εκμάθηση. Αντίθετα, η ίδια οπτογενετική αναστολή των εισόδων MEC που πραγματοποιήθηκε 30 λεπτά πριν από τη δοκιμή ανάκτησης δεν επηρέασε την κατάψυξη κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανάκτησης, αποκλείοντας την πιθανότητα της μη ειδικής επιβλαβούς επίδρασης της οπτικής αναστολής στη διαδικασία ανάκτησης. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι ο σχηματισμός μνήμης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα απαιτεί εισροές MEC στον ιππόκαμπο κατά τη διάρκεια μιας μεταμαθησιακής περιόδου.

Λέξεις-κλειδιά: Μέσος ενδορινικός φλοιός, Ιππόκαμπος, Συνθήκη φόβου

Min Soo Kang και Jin-Hee Han

Το σύστημα ιππόκαμπου-εντορινικού φλοιού είναι κρίσιμο για επεισοδιακήμνήμησχηματισμός [1]. Τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η είσοδος από το στρώμα III του έσω ενδορινικού φλοιού (MECIII) στοιππόκαμπος, κυρίως στο υποπεδίο CA1, είναι ζωτικής σημασίας για τη χρονική συνειρμική μάθηση, όπως η προετοιμασία του ίχνους φόβου, αλλά όχι για την προετοιμασία του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα και τον καθυστερημένο φόβο [2, 3]. Αντίθετα, η οπτογενετική αναστολή των κυττάρων του στρώματος II του έσω ενδορινικού φλοιού (MECII) που προεξέχουν στην οδοντωτή έλικα (DG) και στο CA3, αλλά όχι στα κύτταρα που προβάλλουν στο CA1, κατά τη διάρκεια του CFC βλάπτει το σχηματισμό μνήμης [4]. Έτσι, η είσοδος από το MECII στη ΓΔ ή CA3 θεωρείται ότι απαιτείται για τη μάθηση του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα. Όχι μόνο στη μάθηση, αλλά η εισαγωγή MEC στον ιππόκαμπο εμπλέκεται επίσης σε μοναδικά πρότυπα φυσιολογικής δραστηριότητας που παρατηρούνται στον ιππόκαμπο κατά τη διάρκεια της ανάπαυσης και του ύπνου, όπως κυματισμοί και οδοντωτές αιχμές που σχετίζονται μεμνήμηδιαδικασία ενοποίησης [5-10]. Ως εκ τούτου, η εισροή MEC στοιππόκαμποςμπορεί να παίζει ρόλο στη διαμόρφωση της μνήμης κατά τη διάρκεια μιας μεταμαθησιακής περιόδου. Ωστόσο, αυτή η δυνατότητα δεν έχει δοκιμαστεί ακόμη. Για να ελέγξουμε εάν η εισαγωγή MEC στον ιππόκαμπο είναι απαραίτητη κατά τη διάρκεια της περιόδου μετά τη μάθηση, υιοθετήσαμε μια οπτογενετική προσέγγιση για τη σίγαση της δραστηριότητας εισαγωγής MEC σε υβριδικά ποντίκια 129/C57Bl/6 [11, 12]. Για τον χειρισμό της εισόδου MEC, εγχύθηκε στο αμφοτερόπλευρο αδενο-σχετιζόμενος ιός (AAV) που περιέχει γονίδια που κωδικοποιούν το eNpHR3.0 συντηγμένο με φθορίζουσα πρωτεΐνη EYFP κάτω από τον προαγωγέα CaMKII (AAV-CaMKII - eNpHR3.0-EYFP) Στόχευση MEC στο στρώμα II και III (0.5 µL ανά πλευρά· AP: – 4,65 mm· ML:±3,4 mm· DV: – 3,3 mm) (Εικ. 1a). Ως έλεγχος, εγχύαμε AAV χωρίς eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), το οποίο εκφράζει μόνο τη φθορίζουσα πρωτεΐνη. Η έκφραση AAV περιορίστηκε στα στρώματα MEC II και III, τα οποία στέλνουν προβολή στον ιππόκαμπο (Εικ. 1b). Στον ιππόκαμπο, ανιχνεύθηκαν αξονικές προβολές MEC που εκφράζουν EYFP σε DG και CA3, που προέρχονται από το MECII, και επίσης στο CA1, προερχόμενο από MECIII (Εικ. 1a). Τρεις εβδομάδες μετά τη χειρουργική επέμβαση έγχυσης AAV, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν ξανά για χειρουργική επέμβαση εμφυτεύματος οπτικών ινών.

Cistancheμπορεί να βελτιωθείμνήμη

Οι οπτικές ίνες εμφυτεύτηκαν στον ραχιαίο ιππόκαμπο (AP: − 2,0 mm; ML:±1,3 mm; DV: − 1,5 mm) για οπτική καταστολή των εισόδων MEC της ράχης με λέιζερ 561-nm. Οι άκρες των οπτικών ινών βρίσκονταν ακριβώς πάνω από το στρώμα λακουνόζης στιβάδας CA1-μοριακό, και ως εκ τούτου, το λέιζερ 561-nm μπορούσε να καλύψει και τους προσαγωγούς MECII στο μοριακό στρώμα DG/CA3 ακτινοβολία στοιβάδας και τους προσαγωγούς MECIII στο στρώμα λακουνόζης στοιβάδας CA1. Πρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S1). Κατά τη διάρκεια της περιόδου ανάρρωσης μιας εβδομάδας μετά τη χειρουργική επέμβαση εμφύτευσης, τα ποντίκια εξοικειώθηκαν με τις ίνες για 3 ημέρες. Συνδέθηκαν σε ένα οπτικό έμπλαστρο που απέδωσε φως και τοποθετήθηκαν στον κλωβό εξοικείωσης για 5 λεπτά χωρίς παροχή φωτός. Μετά από 3 ημέρες εξοικείωσης, τα ποντίκια EGFP και eNpHR3.0 εκπαιδεύτηκαν για CFC.

Τα ποντίκια μπήκαν στον θάλαμο κλιματισμού και δέχθηκαν ένα ποδοπατύχημα ({{0}},5 mA, 2 s) 3 λεπτά αργότερα. Ένα λεπτό μετά το σοκ, τα ποντίκια μεταφέρθηκαν αμέσως στο συνηθισμένο κλουβί και έλαβαν συνεχές φως 561-nm (5 mW στο άκρο της ίνας) για 5 λεπτά (Εικ. 1β). Μετά την αναστολή μετά τη μάθηση, τα ποντίκια επέστρεψαν στα κλουβιά του σπιτιού τους. Για να ελεγχθεί εάν η μνήμη συμφραζομένων είχε διαμορφωθεί σωστά, δοκιμάστηκε η μακροπρόθεσμη μνήμη (LTM). Τα ποντίκια εισήλθαν ξανά στον θάλαμο προετοιμασίας 24 ώρες μετά το CFC. Τα επίπεδα κατάψυξης μετρήθηκαν ως δείκτης LTM, παρακολουθήθηκαν για 3 λεπτά. Τα ποντίκια στην ομάδα eNpHR3.0 εμφάνισαν σημαντικά λιγότερη κατάψυξη σε σύγκριση με τα ποντίκια στην ομάδα ελέγχου EGFP (Εικ. 1γ), υποδεικνύοντας 24-h LTM έλλειμμα με αναστολή μετά τη μάθηση των εισροών MEC στον ιππόκαμπο. Αυτή η μείωση της κατάψυξης δεν οφειλόταν σε μια μη ειδική επιβλαβή επίδραση της διαδικασίας οπτικής αναστολής. Όταν η ίδια οπτική αναστολή χορηγήθηκε 30 λεπτά πριν από τη δοκιμή LTM, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην κατάψυξη μεταξύ των ομάδων (Εικ. 1d, e).

Η σκληρή πλειονότητα των προσαγωγών MEC στοχεύει στον ιππόκαμπο, η MEC είναι γνωστό ότι στέλνει προβολές σε μεσαίες προμετωπιαίους φλοιώδεις περιοχές όπως ο προμετωπιαίος και ο υπομετωπιαίος φλοιός [13]. Δεδομένου ότι η έκφραση AAV ήταν τυχαία στο MEC, είναι πιθανό η οπτική μας αναστολή να επηρέασε τους άξονες MEC που διέρχονται από τον ιππόκαμπο, εάν υπάρχουν, για να παράγουν την επίδρασή της στον σχηματισμό της μνήμης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα. Για να αποκλείσουμε αυτή την πιθανότητα, επισημάναμε ανάδρομα τους νευρώνες MEC που προβάλλουν στον ιππόκαμπο. Κάναμε ένεση του ιού CAV2-Cre στον ιππόκαμπο, ο οποίος απορροφάται ανάδρομα από νευρώνες που προβάλλουν στον ιππόκαμπο μέσω των άκρων του άξονα (Εικ. 1στ).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP ή AAV-Ef1 -DIO-EYFP εγχύθηκε στο MEC, έτσι οι νευρώνες MEC που έχουν προσλάβει CAV2-Cre μπορούν express eNpHR3.{10}}EYFP ή EYFP (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S2). Δέκα, καταφέραμε να αναστείλουμε τις εισροές MEC στον ιππόκαμπο αμέσως μετά το CFC. Παρόμοια με τα προηγούμενα αποτελέσματα, η οπτική αναστολή διέκοψε το σχηματισμό μνήμης φόβου περιβάλλοντος (Εικ. 1g, h) σε αυτήν την κατάσταση. Έτσι, αυτά τα δεδομένα ενισχύουν περαιτέρω το συμπέρασμά μας ότι οι εισροές MEC στον ιππόκαμπο είναι ζωτικής σημασίας για το σχηματισμό της συγκεντρωτικής μνήμης κατά τη διάρκεια μιας μεταμαθησιακής περιόδου. Ένας περιορισμός σε αυτή τη μελέτη είναι η έλλειψη χωρικής εξειδίκευσης στη χρησιμοποιούμενη οπτική αναστολή.

Έτσι, δεν είναι σαφές σε ποιο βαθμό και ακριβώς πού μέσα στο κύκλωμα του ιππόκαμπου οι ευρέως διαδεδομένες είσοδοι MEC καταστέλλονταν με την οπτική αναστολή στην κατάστασή μας. Η ακριβής αναστολή των εισόδων MEC που στοχεύουν ένα συγκεκριμένο υποπεδίο όπως το CA1 ή το DG του ιππόκαμπου μπορεί να είναι απαραίτητη για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο οι εισροές MEC συμβάλλουν στον σχηματισμό της μνήμης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα στη μελλοντική μελέτη. Παρόλο που δεν δοκιμάσαμε την επίδραση της οπτικής αναστολής των εισόδων MEC στον ιππόκαμπο σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από συνθήκη φόβου σε αυτή τη μελέτη, προηγούμενες μελέτες αναφέρουν έναν ρόλο εξαρτώμενο από το χρόνο των εγκεφαλικών δραστηριοτήτων μετά τη μάθηση για την εδραίωση αναμνήσεων που εξαρτώνται από τον ιππόκαμπο, όπως συνθήκη φόβου. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας μια οπτογενετική στρατηγική, μια προηγούμενη μελέτη χειρίστηκε τεχνητά την επαγωγή ύπνου αργών κυμάτων (SWS) σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από διαφορετικές μαθησιακές εργασίες και φάνηκε ότι υπάρχει ένα κρίσιμο χρονικό παράθυρο (εντός 30 λεπτών) κατά το οποίο προκλήθηκε SWS από το φως μπορεί να βελτιώσει τις εξαρτώμενες από τον ιππόκαμπο μνήμες [14].

Το Σχήμα 1 αναστολή της εισαγωγής MEC στον ιππόκαμπο αμέσως μετά το κέρδος βλάπτει τον μακροπρόθεσμο σχηματισμό μνήμης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα. μια Σχηματική απεικόνιση της αμφοτερόπλευρης θέσης εμφύτευσης AAVinection και οπτικού δακτυλίου (eft). Αντιπροσωπευτικές εικόνες conkocalmikroscopk που σπρώχνουν την έκφραση EGFP και eNpHR0-EYFP στην κορυφή MEC) και στον ιππόκαμπο (κάτω). Ο αστερίσκος υποδεικνύει την κατά προσέγγιση θέση του άκρου της οπτικής ίνας. b Το σχήμα συμπεριφοράς.ιστόγραμμα που δείχνει το επίπεδο παγώματος κατά τη διάρκεια του testeNpHR30 περίπου (3589 主 3,21 τοις εκατό ,n=】1】 έδειξε σημαντικά μικρότερο κόσμημα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου EGFP (53,13±265 τοις εκατό ,n σε{12}) Δοκιμή LTM.**σελ<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Students t-test.δεν είναι σημαντικό,f Σχήμα συμπεριφοράς της θέσης εμφύτευσης CAV και AAV ή ανάδρομη επισήμανση των νευρώνων MEC που διαχέονται στον ιππόκαμπο(στ) Σχηματική απεικόνιση αμφοτερόπλευρης έγχυσης CW AW και σχήματος συμπεριφοράς θέσης εμφυτεύματος οπτικού σπονδύλου. h Ιστόγραμμα που δείχνει το επίπεδο κατάψυξης κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Η ομάδα eNpHR3.0 (33,71±4,06 τοις εκατό ,n=11) ​​έδειξε σημαντικά μικρότερο επίπεδο κατάψυξης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου EYFP (50,13±3,18 τοις εκατό ,n=12) στη δοκιμή LIM .**Π<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Είναι ενδιαφέρον ότι μια άλλη μελέτη σε αρουραίους έδειξε ότι οι επιλεκτικές ηλεκτρολυτικές βλάβες της άμεσης εντορινικής προβολής (κροταφοαμμωνικό, ΤΑ) στην περιοχή του ιππόκαμπου CA1 24 h αλλά όχι 3 εβδομάδες μετά την εκπαίδευση σε υδάτινο λαβύρινθο Morris διέκοψαν το σχηματισμό της χωρικής μνήμης σε απομακρυσμένο χρόνο, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση MEC-ιππόκαμπου μέσω της οδού εισόδου ΤΑ κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου απαιτείται για την ενοποίηση συστημάτων [15]. Δεδομένων αυτών των ευρημάτων, είναι πολύ πιθανό οι εισροές MEC στον ιππόκαμπο να έχουν ρόλο εξαρτώμενο από το χρόνο στο σχηματισμό πρόσφατης και απομακρυσμένης μνήμης φόβου.

Είναι ενδιαφέρον στη μελέτη μας ότι μια τόσο σύντομη περίοδος (5 λεπτά) οπτογενετικής αναστολής μετά την προπόνηση ήταν αρκετή για να βλάψει το σχηματισμό της μνήμης του περιβάλλοντος. Μια ερμηνεία είναι ότι τα αποτελέσματά μας μπορεί να αντικατοπτρίζουν ένα μερικό μπλοκ γεγονότων ενοποίησης που απαιτούνται για τον κανονικό σχηματισμό μνήμης. Σύμφωνα με αυτόν τον λογαριασμό, η μνήμη ήταν μερικώς μειωμένη στην κατάστασή μας. Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι μπορεί να συμβεί ένα κρίσιμο συμβάν κατά τη διάρκεια αυτού του σύντομου χρονικού σημείου που απαιτείται για το σχηματισμό της συναφούς μνήμης φόβου. Μια πιθανότητα είναι ότι η είσοδος MEC μπορεί να είναι κρίσιμη για την ενεργοποίηση κυματισμών ή οδοντωτών αιχμών στον ιππόκαμπο που συσχετίζονται με μια επανάληψη προηγούμενων γεγονότων [7, 9, 10, 16] και η οπτογενετική αναστολή της εισαγωγής MEC μπορεί να διαταράξει τέτοια μοτίβα δραστηριότητας. Εναλλακτικά, η σύντομη αναστολή της εισαγωγής MEC μπορεί να έχει επηρεάσει τον επακόλουθο ύπνο βραδέων κυμάτων, ο οποίος έχει επίσης ένα κρίσιμο χρονικό παράθυρο όσον αφορά την εδραίωση μνήμης που εξαρτάται από τον ιππόκαμπο [14].

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Eichenbaum H. Ένα σύστημα φλοιώδους-ιππόκαμπου για δηλωτική μνήμη. Nat Rev Neurosci. 2000; 1 (1): 41–50.

2. Suh J, Rivest AJ, Nakashima T, Tominaga T, Tonegawa S. Η είσοδος στο στρώμα III του ενδορινικού φλοιού στον ιππόκαμπο είναι κρίσιμη για τη χρονική συσχέτιση

3.μνήμη. Επιστήμη. 2011;334(6061):1415–20.Kitamura T, Pignatelli M, Suh J, Kohara K, Yoshiki A, Abe K, et al. Τα νησιωτικά κύτταρα ελέγχουν τη χρονική μνήμη συσχέτισης. Επιστήμη. 2014;343(6173):896–901.

4. Kitamura T, Sun C, Martin J, Kitch LJ, Schnitzer MJ, Tonegawa S. Τα ενδορινικά κύτταρα του φλοιού του ωκεανού κωδικοποιούν συγκεκριμένα περιβάλλοντα και οδηγούν τη μνήμη φόβου που σχετίζεται με το πλαίσιο. Νευρώνας. 2015;87(6):1317–31.

5. Buzsaki G, Horvath Z, Urioste R, Hedtke J, Wise K. Δίκτυο υψηλής συχνότητας

6.ταλάντωση στον ιππόκαμπο. Επιστήμη. 1992;256(5059):1025–7.Bragin A, Jando G, Nadasdy Z, Vanlandeghem M, Buzsaki G. Αιχμές EEG οδοντωτών και σχετικές εκρήξεις ενδονευρωνικού πληθυσμού στην περιοχή του ιππόκαμπου του αρουραίου. J Neurophysiol. 1995;73(4):1691-705.

7. Chrobak JJ, Lorincz A, Buzsaki G. Physiological patterns in the hippocampal-entorhinal cortex system. Ιππόκαμπος. 2000; 10 (4): 457-65.

8. Girardeau G, Zugaro M. Ιπποκαμπικοί κυματισμοί και ενοποίηση μνήμης. Curr Opin Neurobiol. 2011; 21 (3): 452–9.

9. Yamamoto J, Tonegawa S. Η άμεση είσοδος του έσω ενδορινικού φλοιού στο CA1 του ιππόκαμπου είναι ζωτικής σημασίας για την εκτεταμένη αθόρυβη επανάληψη της εγρήγορσης. Νευρώνας. 2017; 96 (1): 217–27.

10. Nokia MS, Gureviciene I, Waselius T, Manila H, Penttonen M. Η ηλεκτρική διέγερση του ιππόκαμπου διαταράσσει τη συνειρμική μάθηση όταν στοχεύει σε οδοντωτές αιχμές. J Physiol-London. 2017; 595 (14): 4961–71.

11. Wehner JM, Silva Α. Σημασία των διαφορών στελεχών στις αξιολογήσεις των διαδικασιών μάθησης και μνήμης σε μηδενικά μεταλλαγμένα. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 1996;2(4):243–8.

12. Vetere G, Kenney JW, Tran LM, Xia F, Steadman ΡΕ, Parkinson J, et αϊ. Χημειογενετική ανάκριση ενός δικτύου μνήμης φόβου σε ολόκληρο τον εγκέφαλο σε ποντίκια. Νευρώνας. 2017; 94 (2): 363–74.

13. Insausti R, Herrero MT, Witter MP. Εντορινικός φλοιός του αρουραίου: κυτταροαρχιτεκτονικές υποδιαιρέσεις και η προέλευση και η κατανομή των φλοιωδών προσαγωγών. Ιππόκαμπος. 1997;7(2):146-83.

14. Lu Y, Zhu ZG, Ma QQ, Su YT, Han Y, Wang X, et αϊ. Ένα κρίσιμο χρονικό παράθυρο για την επιλεκτική επαγωγή της παγίωσης της μνήμης του ιππόκαμπου από ένα σύντομο επεισόδιο ύπνου βραδέων κυμάτων. Δελτίο Νευροεπιστημών. 2018; 34 (6): 1091–9.

15. Remondes M, Schuman EM. Ο ρόλος της εισόδου του φλοιού στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου στην εδραίωση της μακροπρόθεσμης μνήμης. Φύση. 2004;431(7009):699–703.

16. O'Neill J, Boccara CN, Stella F, Schoenenberger P, Csicsvari J. Επιφανειακά στρώματα του έσω ενδορινικού φλοιού επαναλαμβάνονται ανεξάρτητα από τον ιππόκαμπο. Επιστήμη. 2017; 355 (6321): 184–8.