Η Norwogonin εξασθενεί το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την υποξία και την απόπτωση στα κύτταρα PC12

Για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Αφηρημένη

Ιστορικό: Η Norwogonin είναι μια φυσική φλαβόνη με τρεις φαινολικές υδροξυλομάδες σε σκελετική δομή και έχει εξαιρετικήαντιοξειδωτική δράση. Ωστόσο, η νευροπροστατευτική δράση της νορβογονίνης παραμένει ασαφής. Εδώ, διερευνήσαμε την προστατευτική ικανότητα της νορβογονίνης έναντι της οξειδωτικής βλάβης που προκαλείται από την υποξία στα κύτταρα PC12. Μέθοδοι: Η βιωσιμότητα των κυττάρων και η απόπτωση εξετάστηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ και χρώση με αννεξίνη V-FITC/PI, αντίστοιχα. Η περιεκτικότητα σε δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία DCFH-DA. Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH), μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) καιαντιοξειδωτικό ένζυμοτα επίπεδα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ. Η έκφραση των σχετικών γονιδίων και πρωτεϊνών μετρήθηκε με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο και στύπωμα Western, αντίστοιχα. Αποτελέσματα: Βρήκαμε ότι η νορβογονίνη ανακουφίζει τον τραυματισμό που προκαλείται από την υποξία στα κύτταρα PC12 αυξάνοντας τη βιωσιμότητα των κυττάρων, μειώνοντας την απελευθέρωση LDH και βελτιώνοντας τις αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων. Το Norwogonin λειτούργησε επίσης ωςαντιοξειδωτικόntμε τον καθαρισμό των ROS, τη μείωση της παραγωγής MDA, τη διατήρηση των δραστηριοτήτων της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), της καταλάσης (CAT) και της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPx) και τη μείωση των επιπέδων έκφρασης του HIF-1 και του VEGF. Επιπλέον, η βογκονίνη απέτρεψε την κυτταρική απόπτωση μέσω της αναστολής των επιπέδων έκφρασης της κασπάσης-3, του κυτοχρώματος c και του Bax ενώ αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης του Bcl-2 και την αναλογία Bcl-2/Bax. Συμπεράσματα: Η νορβογονίνη εξασθενεί τραυματισμό που προκαλείται από υποξία στα κύτταρα PC12 σβήνοντας το ROS, διατηρώντας τις δραστηριότητες των αντιοξειδωτικών ενζύμων και αναστέλλοντας την οδό της μιτοχονδριακής απόπτωσης.

Λέξεις-κλειδιά: Norwogonin,Αντιοξειδωτική δράση, υποξία, οξειδωτικό στρες,Απόπτωση

Ιστορικό

Οι αερόβιοι οργανισμοί χρειάζονται οξυγόνο (O2) για την παραγωγή ενέργειας. Η υποξία ορίζεται ως η ανεπαρκής παροχή Ο2 για τη διατήρηση της κυτταρικής λειτουργίας στον ιστό και συχνά εμφανίζεται σε ορισμένες φυσιολογικές καταστάσεις όπως το μεγάλο υψόμετρο [1] και σε πολλές παθολογικές καταστάσεις όπως το εγκεφαλικό [2]. Ο εγκέφαλος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος σε τραυματισμούς που προκαλούνται από την υποξία λόγω της υψηλής κατανάλωσης οξυγόνου, του πλούσιου σε ακόρεστα λιπαρά οξέα και του χαμηλούαντιοξειδωτική ικανότητα[3]. Όλο και περισσότερα στοιχεία έχουν δείξει ότι η υποξία μπορεί να προκαλέσει δυσμενείς επιπτώσεις στον εγκέφαλο [4-6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia και Huiping Ma

Τμήμα Φαρμακευτικής, το 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA, Lanzhou 730050, Gansu, Κίνα

Το οξειδωτικό στρες και η απόπτωση θεωρούνται ως δύο παράγοντες που συμβάλλουν στον τραυματισμό που προκαλείται από την υποξία [7, 8]. Η έκθεση στην υποξία έχει αναφερθεί ότι αυξάνει την παραγωγή ενδοκυτταρικών αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), γεγονός που διευκολύνει το οξειδωτικό στρες. Το υπερβολικό ROS, όπως το ανιόν υπεροξειδίου (O2−˙), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και η ρίζα υδροξυλίου (HO•), οδηγεί σε δομικές και λειτουργικές κυτταρικές αλλαγές προσβάλλοντας τα λιπίδια, τις μεμβράνες, τις πρωτεΐνες και το DNA, και στη συνέχεια προκαλεί κυτταρική βλάβη. 9].

Κάντε κλικ για να καταπολεμήσετε το NZ για αντιοξειδωτικό

Ταυτόχρονα, το υπερπαραγόμενο ROS διευκολύνει επίσης το άνοιγμα του μεταβατικού πόρου της μιτοχονδριακής διαπερατότητας (mPTP) [10] και τη μεταφορά πρωτεϊνών προ-απόπτωσης στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, η οποία προκαλεί αποπόλωση των μιτοχονδριακών μεμβρανών και απελευθερώσεις του κυτοχρώματος c [11]. Αυτές οι αλλαγές τελικά προκαλούν απόπτωση που εξαρτάται από τα μιτοχόνδρια [12]. Έτσι, πιστεύεται ότι τα αντιοξειδωτικά με την ικανότητα να αναστέλλουν ή να εξαλείφουν τα υπερβολικά ROS μπορεί να ασκούν την προστατευτική τους δράση μέσω της άμβλυνσης του οξειδωτικού στρες και της απόπτωσης που προκαλείται από την υποξία. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι τα αντιοξειδωτικά συμπληρώματα όπως η βιταμίνη C [13], η ισοφλαβόνη [8] και οι ρίζες νιτροξειδίου [14], μπορούν να περιορίσουν τον τραυματισμό που προκαλείται από την υποξία in vitro και in vivo. Τα φλαβονοειδή είναι μια μεγάλη και ποικιλόμορφη κατηγορία φυτικών δευτερογενών μεταβολιτών που απαντώνται. Θεωρούνται πάντα ως ένα εξαιρετικό φυσικό αντιοξειδωτικό με την ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες και να αναστέλλει την υπεροξείδωση των λιπιδίων.

Επί του παρόντος, έχει δοθεί όλο και μεγαλύτερη προσοχή σε αυτή την κατηγορία ενώσεων λόγω των ευεργετικών τους επιδράσεων στην ανθρώπινη υγεία. Τα φλαβονοειδή έχουν αποδειχθεί ότι διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα φαρμακολογικών δράσεων, όπως αντιφλεγμονώδη, αντιλοχερατική και νευροπροστατευτική δράση κ.λπ., οι οποίες μπορεί να αποδοθούν στις αντιοξειδωτικές τους δραστηριότητες [15]. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα φλαβονοειδή παρουσιάζουν εξαιρετικά προστατευτικά αποτελέσματα στην αποτυχία που προκαλείται από την υποξία. Για παράδειγμα, η ρουτίνη έχει ισχυρή νευροπροστατευτική δράση έναντι του θανάτου των γαγγλιοκυττάρων του αμφιβληστροειδούς που προκαλείται από την υποξία [16]. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει επίσης ότι η ρουτίνη μπορεί να ανακουφίσει τη βλάβη της υποξίας που προκαλείται από το χλωριούχο κοβάλτιο αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση στα κύτταρα H9c2 [17]. Επιπλέον, οι Liu et al προτείνουν ότι η nobiletin (3',4',5,6, 7,8-εξαμεθοξυ φλαβόνη) εξασθενεί τον τραυματισμό του μυοκαρδίου I/R μέσω της ενεργοποίησης της οδού Akt/GSK-3 στο κύτταρο H9c2 [18]. Επιπλέον, η ακακετίνη μπορεί να προστατεύσει τα καρδιομυοκύτταρα αρουραίου και τους καρδιομυοβλάστες H9C2 από τραυματισμό που προκαλείται από υποξία/επαναοξυγόνωση μέσω της ενεργοποίησης της οδού σηματοδότησης Nrf2 με τη μεσολάβηση AMPK [19].

Η Norwogonin (5,7,8-τριυδροξυ φλαβόνη, Εικ. 1) είναι μια φαρμακολογικά ενεργή φλαβόνη που διαχωρίζεται από τη ρίζα του Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" στα κινέζικα), ενός παραδοσιακού κινέζικου βοτάνου που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της γρίπης και του καρκίνου [20, 21]. Ωστόσο, έχουν αναφερθεί περιορισμένες μελέτες σχετικά με τις βιολογικές δραστηριότητες της νορβογονίνης λόγω των χαμηλών επιπέδων της στα φυσικά φυτά. Προκειμένου να αντιμετωπιστεί αυτό το πρόβλημα, αναφέρονται διάφορες μέθοδοι σύνθεσης της νορβογονίνης [22, 23].

Η προηγούμενη μελέτη μας καθιέρωσε επίσης μια απλή μέθοδο για τη λήψη νορβογονίνης από τη χρυσίνη σε τέσσερα βήματα [24]. Αυτές οι έρευνες επηρέασαν θετικά την περαιτέρω αξιολόγηση των βιολογικών δραστηριοτήτων της νορβογονίνης. Μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η νορβογονίνη έχει αντιοξειδωτικές [25], αντικαρκινικές [26, 27], αντιικές [28] και αντιμικροβιακές δραστηριότητες [29] καθώς επίσης αναστέλλει την διεγειρόμενη από κυάνιο παραγωγή ROS [30]. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο εάν η νορβογονίνη έχει προστατευτικές ικανότητες έναντι τραυματισμού που προκαλείται από την υποξία. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των προστατευτικών επιδράσεων της νορβογονίνης έναντι του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από την υποξία και της απόπτωσης σε κύτταρα PC12.

Μέθοδοι

Υλικά και αντιδραστήρια

Η νορβογονίνη (καθαρότητα μεγαλύτερη από ή ίση με 98 τοις εκατό) συντέθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέραμε προηγουμένως [24]. Η ρουτίνη (καθαρότητα μεγαλύτερη από ή ίση με 96 τοις εκατό) αγοράστηκε από την Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Κίνα). Η νορβογονίνη και η ρουτίνη διαλύθηκαν σε στείρο διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς και αραιώθηκαν στο μέσο κυτταροκαλλιέργειας αμέσως πριν από τη χρήση. Το τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (DMEM), ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS), η στρεπτομυκίνη και η πενικιλίνη αγοράστηκαν από τη Solarbio co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα).

Τα κιτ μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD), καταλάσης (CAT) και υπεροξειδάσης γλουταθειόνης (GPx) ελήφθησαν από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, Κίνα). Διοξική 2',7'-διχλωρίδιο-υδροφθοροσκεΐνη (DCFH-DA) και (3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5- διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο) τετραζόλιο (MTT) ελήφθη από τη Sigma-Aldrich Co (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Πρωτογενή αντισώματα για τον επαγόμενο από υποξία παράγοντα-1 (HIF-1 ), τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF), το λέμφωμα των Β κυττάρων-2 (Bcl-2), το Bcl{{17 }} συσχετισμένη πρωτεΐνη Χ (Bax), κασπάση-3, κυτόχρωμα C και -ακτίνη αγοράστηκαν όλα από την Abcam (Cambridge, UK). Δευτερεύοντα αντισώματα ελήφθησαν από την ZsBio Company (Πεκίνο, Κίνα).

Ένα κιτ ανάλυσης απόπτωσης ελήφθη από το Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Κίνα). Όλα τα χημικά και οι διαλύτες ήταν αναλυτικής ποιότητας και ελήφθησαν από έναν εμπορικό προμηθευτή στην Κίνα. Κυτταρική καλλιέργεια Τα κύτταρα PC12 αγοράστηκαν από την Cell Bank της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (TCR 9, Shanghai, Κίνα) και διατηρήθηκαν σε DMEM με 10 τοις εκατό (v/v) FBS, 100 U/mL πενικιλλίνη και 100 U/mL στρεπτομυκίνες στους 37 βαθμούς σε υγροποιημένο επωαστήρα που περιέχει 5 τοις εκατό CO2. Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα της νορβογονίνης, τα κύτταρα PC12 (περίοδος 4 ~ 6) προεπωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις (10− 8 , 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 mol/L) nor wogonin για 1 ώρα και στη συνέχεια καλλιεργήθηκε για 24 ώρες. Έκθεση σε υποξία Για να προκληθεί μοντέλο τραυματισμού κυτταρικής υποξίας, τα κύτταρα PC12 υποβλήθηκαν σε περιβάλλον υποξίας (1 τοις εκατό O2, 5 τοις εκατό CO2 και 94 τοις εκατό N2) στους 37 βαθμούς για 24 ώρες σε έναν υγροποιημένο θάλαμο. Νορμοξικά κύτταρα ελέγχου καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς σε επωαστήρα 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες.

Για να αξιολογηθεί η προστατευτική δράση της νορβογονίνης έναντι τραυματισμού που προκαλείται από υποξία, τα κύτταρα PC12 προεπωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) νορβογονίνης για 1 ώρα πριν από τη θεραπεία της υποξίας. Κυτταρική βιωσιμότητα Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, κύτταρα PC12 (1 χ 105 κύτταρα/mL) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων. Στη συνέχεια, διαφορετικές συγκεντρώσεις νορβογονίνης προστέθηκαν στα φρεάτια. Ένας ίσος όγκος DMSO προστέθηκε στα φρεάτια ελέγχου. Η τελική συγκέντρωση DMSO στο μέσο κυτταροκαλλιέργειας είναι 0,1 τοις εκατό. Μετά την επώαση σε συνθήκες νορμοξικής ή υποξίας, προστέθηκαν 10 μL MTT (5,0 mg/mL) σε κάθε φρεάτιο, ακολουθούμενο από επώαση στους 37 βαθμούς για 4 ώρες. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο με ΜΤΤ αφαιρέθηκε και το προϊόν φορμαζάνης διαλύθηκε σε 100 μL DMSO. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) στα 570 nm. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως το σχετικό ποσοστό της ομάδας ελέγχου. Κύτταρα PC12 με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (ΗΕ) που σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες επωάστηκαν για 24 ώρες προτού υποβληθούν σε επεξεργασία με νορβογονίνη με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω.

Το μέσο αφαιρέθηκε και οι γυάλινες καλυπτρίδες πλύθηκαν με ψυχρό PBS, ακολουθούμενο από στερέωση με μεθανόλη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια πλύθηκαν με ψυχρό PBS τρεις φορές για 5 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα χρωματίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο χρώσης HE [32]. Οι αναλύσεις του κυττάρου πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου OLYMPUS IX73 (100×) προκειμένου να επαληθευτούν οι μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων. Οι ψηφιακές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή DXM 1200 C (Nikon) που σχετίζεται με το μικροσκόπιο. Περιεκτικότητα σε ROS Το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS στα κύτταρα PC12 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία DCFH-DA [33]. Εν συντομία, κύτταρα PC12 (1 x 105 κύτταρα/mL) σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίου. Μετά από θεραπεία υποξίας, τα κύτταρα PC12 πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν στο μέσο καλλιέργειας που περιείχε 10 μΜ DCFH-DA για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 37 βαθμούς. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού Olympus (Τόκιο, Ιαπωνία) και αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και μήκος κύματος εκπομπής 525 nm. Το επίπεδο ROS εκφράστηκε ως σχετικό ποσοστό ελέγχου. Διαρροή LDH, περιεχόμενο MDA και αντιοξειδωτική ενζυμική δράση Τα κύτταρα PC12 (1 χ 105 κύτταρα/mL) σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο 90 mm. Μετά τη θεραπεία της υποξίας όπως περιγράφεται παραπάνω, συλλέχθηκαν 50 μL υπερκειμένου καλλιέργειας από κάθε τρυβλίο και η δραστηριότητα της LDH στο μέσο ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ανάλυσης (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Κίνα) και εκφράστηκε ως U/mL. Τα κύτταρα PC12 συλλέχθηκαν και ομογενοποιήθηκαν μετά από πλύση δύο φορές με ψυχρό PBS. Η συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης μετρήθηκε με το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA. Η περιεκτικότητα σε MDA και η αντιοξειδωτική ενζυμική δράση προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ προσδιορισμού (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Κίνα).

Το περιεχόμενο του MDA παρουσιάστηκε ως nmol/mg πρωτεΐνης. Οι δραστηριότητες των SOD, CAT και GPx παρουσιάστηκαν ως πρωτεΐνη U/mg. Κυτταρική απόπτωση (χρώση με αννεξίνη-ν/ΡΙ) Μετά από θεραπεία υποξίας, συλλέχθηκαν τα κύτταρα PC12, πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια εναιωρήθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το διάλυμα Annexin V-FITC και PI ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Beyotime, Shanghai, Κίνα). Οι συλλογές δεδομένων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κυτταρόμετρο ροής Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA). Ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο Το συνολικό RNA των κυττάρων PC12 εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Trizol (Takara, Dalian, Κίνα) και μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Dalian, Κίνα). Το cDNA που κωδικοποιεί γονίδιο HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, κασπάση-3, κυτόχρωμα C και γλυκεραλδεΰδη-3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) ενισχύθηκε με ποσοτική πραγματική time PCR χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο 7300 (Applied Biosystems, CA, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι συνθήκες κύκλου PCR ήταν 95 μοίρες για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενοι από 40 κύκλους των 95 μοιρών για 5 δευτερόλεπτα και 60 μοιρών για 31 δευτερόλεπτα. Τα επίπεδα mRNA υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCt και κανονικοποιήθηκαν σε GAPDH, που είναι το γονίδιο αναφοράς. Κύτταρα Western blot PC12 συλλέχθηκαν και ομογενοποιήθηκαν σε παράγοντες RIPA. Η συγκέντρωση των συνολικών πρωτεϊνών ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA. 30 μg δειγμάτων αναλύθηκαν σε ηλεκτροφόρηση 12 τοις εκατό SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ).

Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5 τοις εκατό ξηρό γάλα χωρίς λιπαρά σε ρυθμιστικό διάλυμα TBST για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, UK), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), αντικασπάση-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), αντικυτοχρώματος C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) και αντι{28}}ακτίνη (1:2000, ab8227 , Abcam, UK) στους 4 βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα (1:2000, ZsBio, Beijing, China;) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Οι σχετικές εντάσεις των ζωνών κανονικοποιήθηκαν στον εσωτερικό έλεγχο της -ακτίνης και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD που προήλθε από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η διαφορά μεταξύ των ομάδων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από τη δοκιμασία Student–Newman– Keuls post hoc. Μια τιμή P < 0.05="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="">

Αποτελέσματα

Προστατευτικά κύτταρα PC12 από Norwogonin έναντι τραυματισμού που προκαλείται από υποξία

Πρώτον, για να αποκλειστεί η πολλαπλασιαστική δραστηριότητα της νορβογονίνης, προσδιορίστηκε η κυτταροτοξικότητα της σε φυσιολογικά κύτταρα PC12 χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2α, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός δεν άλλαξε σημαντικά μετά από θεραπεία με νορβογονίνη σε συγκεντρώσεις 1 × 10- 8 -1 × 10- 5 mol/L (P > 0,05 ). Ωστόσο, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά όταν η συγκέντρωση της νορβογονίνης αυξήθηκε σε 1 × 10− 4 mol/L (P <0,05). τα="" αποτελέσματα="" έδειξαν="" ότι="" η="" νορβογονίνη="" δεν="" εμφάνισε="" τοξικότητα="" ή="" πολλαπλασιαστική="" δραστηριότητα="" στα="" κύτταρα="" pc12="" σε="" συγκεντρώσεις="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Στη συνέχεια εξετάσαμε την προστατευτική δράση της νορβογονίνης έναντι τραυματισμού των κυττάρων PC12 που προκαλείται από υποξία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2β, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η βιωσιμότητα των κυττάρων στην ομάδα της υποξίας μειώθηκε στο 58,71 τοις εκατό (P < 0.01).="" σε="" σύγκριση="" με="" τη="" θεραπεία="" υποξίας,="" η="" οποία="" υποβλήθηκε="" σε="" προεπεξεργασία="" με="" 1="" ×="" 10-="" 8,="" 1="" ×="" 10-="" 7="" και="" 1="" ×="" 10-="" 6="" mol/l="" νορβογονίνη="" δοσοεξαρτώμενη="" προστασία="" pc12="" κύτταρα="" έναντι="" τραυματισμού="" που="" προκαλείται="" από="" υποξία,="" ανακτώντας="" τη="" βιωσιμότητα="" των="" κυττάρων="" από="" 58,71="" έως="" 62,79="" τοις="" εκατό="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" τοις="" εκατό="" (p="">< 0,01)="" και="" 69,88="" τοις="" εκατό="" (p=""><0,01), αντίστοιχα.="" η="" προεπεξεργασία="" με="" ρουτίνη="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" επέδειξε="" επίσης="" προστατευτική="" δράση,="" αυξάνοντας="" σημαντικά="" τη="" βιωσιμότητα="" των="" κυττάρων="" στο="" 63,78="" τοις="" εκατό="" σε="" σύγκριση="" με="" τη="" θεραπεία="" υποξίας.="" η="" βιωσιμότητα="" που="" υποβλήθηκε="" σε="" προεπεξεργασία="" με="" 1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" νορβογονίνης="" μειώθηκε="" στο="" 63,43="" τοις="" εκατό,="" η="" οποία="" εξακολουθεί="" να="" είναι="" σημαντικά="" υψηλότερη="" από="" αυτή="" στην="" ομάδα="" υποξίας="" (p=""><0,05). αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" έδειξαν="" ότι="" η="" νορβογονίνη="" έδειξε="" σημαντική="" κυτταροπροστασία="" σε="" συγκεντρώσεις="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" και="" η="" πιο="" αποτελεσματική="" συγκέντρωση="" είναι="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l.="" στη="" συνέχεια="" αυτή="" η="" δόση="" χρησιμοποιήθηκε="" ως="" η="" βέλτιστη="" δόση="" στα="" ακόλουθα="">

Η προστατευτική ικανότητα της νορβογονίνης επαληθεύτηκε επίσης με μορφολογικές αλλοιώσεις. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2γ, τα κύτταρα PC12 χωρίς θεραπεία υποξίας αναπτύχθηκαν καλά με κανονικά σχήματα (ατρακτοειδή), ομοιόμορφα μεγέθη. Μετά την έκθεση στην υποξία, τα κύτταρα PC12 παρουσίασαν συρρίκνωση, στρογγυλεμένο σχήμα, απολέπιση και μειωμένη κυτταρική πυκνότητα. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με νορβογονίνη ή ρουτίνη πριν από την έκθεση στην υποξία αυξήθηκαν καλύτερα, ο αριθμός των κυττάρων απολέπισης μειώθηκε και το σχήμα των κυττάρων επανήλθε κανονικά. Εξάλλου, η προστατευτική ικανότητα της νορβογονίνης επιβεβαιώθηκε από τη διαρροή LDH, η οποία σχετίζεται με την απώλεια της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2δ, η δραστικότητα LDH στο μέσο καλλιέργειας αυξήθηκε σημαντικά μετά από έκθεση σε υποξία (Ρ <>

Η προεπεξεργασία με νορβογονίνη ή ρουτίνη μείωσε δραματικά τη διαρροή LDH, υποδηλώνοντας ότι η νορβογονίνη και η ρουτίνη αποκατέστησαν την ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Η νορβογονίνη αναστέλλει το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την υποξία στα κύτταρα PC12 Τα ROS και MDA είναι δύο σημαντικοί δείκτες του κυτταρικού οξειδωτικού στρες που προκαλείται από την υποξία. Όπως φαίνεται στα Σχ. 3α και β, μια σημαντικά αυξημένη περιεκτικότητα σε ROS και MDA παρατηρήθηκε στα κύτταρα PC12 μετά από έκθεση σε υποξία. Η προεπεξεργασία με νορβογονίνη ή ρουτίνη ανέστειλε σημαντικά την παραγωγή ROS και MDA.

Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα, όπως τα SOD, CAT και GPx, θεωρούνται το κύριο αμυντικό σύστημα έναντι του οξειδωτικού στρες στα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3c-e, η έκθεση στην υποξία ανέστειλε σημαντικά τις δραστηριότητες των SOD, CAT και GPx σε κύτταρα PC12. Η θεραπεία με νορβογονίνη ή ρουτίνη ανέστρεψε αυτές τις αλλαγές και αποκατέστησε τις δραστηριότητες των αντιοξειδωτικών ενζύμων. Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η νορβογονίνη προστατεύει τα κύτταρα PC12 από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την υποξία.