Νευροπροστατευτικό δυναμικό ισοθειοκυανικών σε ένα in vitro μοντέλο νευροφλεγμονής

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Λήψη: 10 Ιουλίου 2020 / Αποδοχή: 25 Οκτωβρίου 2020 / Δημοσίευση ηλεκτρονικά: 16 Νοεμβρίου 2020

© Οι Συγγραφείς 2020

Λειτουργία φυτικής σκόνης Cistanche: έχει ένα πολύ καλόνευροπροστατευτική δράση

Αφηρημένη

Τα ισοθειοκυανικά (ITCs), που υπάρχουν ως πρόδρομες ουσίες γλυκοσινολικού στα σταυρανθή, έχουν δείξειαντιφλεγμονώδη, αντιοξειδωτική και αντικαρκινογόνο δράση. Εδώ, συγκρίναμε τις επιδράσεις τριών διαφορετικών ITC στην παραγωγή ROS και στην έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (MMP)-2 και -9, που αντιπροσωπεύουν σημαντικούς παθογενετικούς παράγοντες διαφόρων νευρολογικών ασθενειών. Πρωτογενείς καλλιέργειες αστροκυττάρων αρουραίου ενεργοποιήθηκαν με LPS και υποβλήθηκαν ταυτόχρονα σε επεξεργασία με διαφορετικές δόσεις ισοθειοκυανικού αλλυλεστέρα (AITC), 2-ισοθειοκυανικού φαιναιθυλίου (PEITC) και 2-σουλφοραφάνης (SFN). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το SFN και το PEITC ήταν σε θέση να εξουδετερώσουν την παραγωγή ROS που προκαλείται από το H2O2. Η ζυμογραφική ανάλυση των υπερκειμένων κυτταροκαλλιέργειας απέδειξε ότι οι PEITC και SFN ήταν οι πιο αποτελεσματικοί αναστολείς της MMP-9, ενώ μόνο το SFN ανέστειλε σημαντικά τη δραστηριότητα MMP-2. Η ανάλυση PCR έδειξε ότι όλα τα ITC που χρησιμοποιήθηκαν ανέστειλαν σημαντικά τόσο την έκφραση MMP{-2 και MMP-9. Η έρευνα σχετικά με το μονοπάτι σηματοδότησης της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεΐνης κινάσης (MAPK) έδειξε ότι τα ITC ρυθμίζουν τη μεταγραφή MMP αναστέλλοντας τη δραστηριότητα εξωκυτταρικά ρυθμιζόμενης πρωτεϊνικής κινάσης (ERK). Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υποδηλώνουν ότι τα ITC θα μπορούσαν να είναι πολλά υποσχόμενοι διατροφικοί παράγοντες για την πρόληψη και τη συμπληρωματική θεραπεία νευρολογικών παθήσεων που σχετίζονται με τη συμμετοχή MMP.

Λέξεις-κλειδιάΑντιοξειδωτικό · Αντιφλεγμονώδες · Ισοθειοκυανικό · Μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας · Νευροεκφυλιστικές ασθένειες

Εισαγωγή

Η νευροφλεγμονή είναι μια πολύπλοκη απόκριση σε εγκεφαλική βλάβη που περιλαμβάνει έναν καταρράκτη βιοχημικών γεγονότων που οδηγούν στην ενεργοποίηση των εγκατεστημένων κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ). Η ανώμαλη ενεργοποίηση των αστροκυττάρων θέτει σε κίνδυνο τον νευροπροστατευτικό τους ρόλο, οδηγώντας στην απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών, όπως τα αντιδρώντα είδη οξυγόνου (ROS), το μονοξείδιο του αζώτου (NO), οι κυτοκίνες, οι χημειοκίνες και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας

(ΜΜΠ).

Τα MMPs είναι μια μεγάλη οικογένεια ουδέτερων, εξαρτώμενων από Zn2 συν ενδοπεπτιδασών που έχουν ως κύριους στόχους τα συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) όπως η φιμπρονεκτίνη, το κολλαγόνο, η ελαστίνη και η λαμινίνη (Latronico and Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Τμήμα Βιοεπιστημών, Βιοτεχνολογιών και Βιοφαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο του Μπάρι "Aldo Moro",

Μπάρι, Ιταλία

Τμήμα Επιστημών, Πανεπιστήμιο Basilicata, Potenza,

Ιταλία

Στο ΚΝΣ, οι MMPs εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές αποκρίσεις, όπως η μορφογένεση, η ανανέωση και η αναδιαμόρφωση του ECM, η εμβρυογένεση και η αποκατάσταση του τραύματος. Ωστόσο, όταν τα MMPs ξεφεύγουν από τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς γίνονται επιβλαβή (Rosenberg 2009· Agrawal et al. 2008).

Από αυτή την άποψη, είναι γνωστό ότι οι αλλαγές στην έκφραση και τη δραστηριότητα της MMP είναι βασικά παθογενετικά συμβάντα σε αρκετές νευρολογικές διαταραχές (Latronico and Liuzzi 2017; Mastroianni and Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Πειραματικά στοιχεία έχουν δείξει ότι μεταξύ των MMP, οι ζελατινάσες Α (MMP-2) και B (MMP-9) εμπλέκονται ιδιαίτερα στη νευροφλεγμονή, καθώς η ανοδική ρύθμισή τους μπορεί να θέσει σε κίνδυνο την ακεραιότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB). Αυτό οδηγεί σε αυξημένη στρατολόγηση και διείσδυση των ανοσοκυττάρων του περιφερικού αίματος στο παρέγχυμα του εγκεφάλου διαιωνίζοντας τη φλεγμονώδη διαδικασία που προκαλεί προοδευτική νευρωνική απώλεια και εξασθενημένη νευρωνική λειτουργία (Rivest 2009). Αρκετές in vitro και in vivo μελέτες έχουν δείξει ότι η παραγωγή ROS είναι ένας από τους παράγοντες που εμπλέκονται στην αύξηση της ρύθμισης της έκφρασης MMP-9 στα εγκεφαλικά κύτταρα μέσω μηχανισμών σηματοδοσίας που εξαρτώνται από το μονοπάτι ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (MAPK) (Hsieh και Yang 2013).

Με βάση αυτά τα στοιχεία, είναι σαφές ότι η προς τα κάτω ρύθμιση νευροτοξικών παραγόντων, με αποτέλεσμα μειωμένες νευροφλεγμονώδεις αποκρίσεις, μπορεί να αντιπροσωπεύει μια αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για την πρόληψη της εμφάνισης ή την ανακούφιση της εξέλιξης των εγκεφαλικών παθήσεων.

Τα τελευταία χρόνια, το βιοϊατρικό ενδιαφέρον στο νευρολογικό πεδίο επικεντρώνεται όλο και περισσότερο στην έρευνα φυσικών ενώσεων ικανών να ρυθμίζουν τις διαδικασίες που σχετίζονται με νευροφλεγμονώδεις αποκρίσεις. Από την άποψη αυτή, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι φυτοχημικές ενώσεις, όπως πολυφαινόλες, ισοθειοκυανικά (ITCs) και άλλες, έχουν νευροπροστατευτικό δυναμικό, το οποίο επίσης προκύπτει από την ικανότητά τους να αναστέλλουν την έκφραση των MMPs και να εξουδετερώνουν την παραγωγή ROS (Dinkova-Kostova and Kostov 2012· Liuzzi et al. 2007, 2011).

Τα ισοθειοκυανικά είναι μεταβολίτες που παράγονται από πολλά φυτά που ανήκουν στις οικογένειες Brassicaceae ως σύστημα άμυνας έναντι της επίθεσης παθογόνων (Bones and Rossiter 2006). Προέρχονται από την ενζυματική αποικοδόμηση των γλυκοζινολικών (GSL) από το ένζυμο μυροσινάση. Τα ITC είναι παρόντα σε λαχανικά που καταναλώνονται συνήθως στα σταυρανθή, όπως το μπρόκολο, τα λαχανάκια Βρυξελλών, το λάχανο, το γογγύλι, το χρένο, το κολραμπί, τη μουστάρδα, το ραπανάκι, το κάρδαμο και το λάχανο. Οι ποσότητες τους στα τρόφιμα είναι πολύ μεταβλητές και εξαρτώνται από την επεξεργασία και την προετοιμασία των τροφίμων.

Πρόσφατα έχει δείξει ότι τα ITC διαθέτουν μια ποικιλία θεραπευτικών επιδράσεων, συμπεριλαμβανομένης της αντιοξειδωτικής, αντιβακτηριακής, αντιφλεγμονώδους και χημειοπροληπτικής δράσης (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

Η προστατευτική δραστηριότητα των ITC πραγματοποιείται μέσω της διαμόρφωσης διαφορετικών οδών σηματοδότησης που εμπλέκονται στην αποτοξίνωση, τη φλεγμονή, την απόπτωση και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Αρκετά στοιχεία υποδεικνύουν ότι οι αντικαρκινογόνες και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες των ITC θα μπορούσαν να αποδοθούν κυρίως στην ικανότητά τους να ενεργοποιούν την οδό που σχετίζεται με τον πυρηνικό παράγοντα ερυθροειδούς 2-παράγοντα 2 (Nrf2). Το Nrf2 είναι ένας ευαίσθητος στην οξειδοαναγωγή μεταγραφικός παράγοντας που παρουσία ηλεκτροφιλικών παραγόντων και συνθηκών οξειδωτικού στρες μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου δεσμεύει τα στοιχεία αντιοξειδωτικής απόκρισης (ARE), προκαλώντας την έκφραση κυτταροπροστατευτικών γονιδίων που εμπλέκονται στην αποτοξίνωση και στη ρύθμιση των οξειδωτικών συνθηκών και φλεγμονώδεις διεργασίες (Heiss et al 2001). Από αυτή την άποψη, έχει αναφερθεί ότι τα ITC είναι σε θέση να αυξήσουν την αντιοξειδωτική ικανότητα των ανθρώπινων κυττάρων προκαλώντας την έκφραση των αποτοξινωτικών ενζύμων φάσης ΙΙ και με την αυξημένη ρύθμιση της παραγωγής GSH (Wagner et al 2010). Επιπλέον, έχει αναφερθεί η ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ του Nrf2 και του μονοπατιού του πυρηνικού παράγοντα (NF)-κB που έχει ως αποτέλεσμα τη ρύθμιση της φλεγμονής (Sturm and Wagner 2017· Lee and Johnson 2004). Από αυτή την άποψη, διάφορα πειραματικά in vitro και in vivo μοντέλα νευροφλεγμονής έχουν δείξει ότι τα ITC είναι σε θέση να μειώσουν σημαντικά τη μετατόπιση του NF-κB με την επακόλουθη αναστολή των προφλεγμονωδών κυτοκινών και των MMPs (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

Σε αυτό το άρθρο, διερευνήσαμε την επίδραση τριών ITC, δηλαδή ισοθειοκυανικού αλλυλίου (AITC), 2-ισοθειοκυανικού φαιναιθυλίου (PEITC) και 2-σουλφοραφάνης (SFN) στην απελευθέρωση MMP-2 και -9 καθώς και στην παραγωγή ROS από αστροκύτταρα που ενεργοποιούνται με LPS. Τα αποτελέσματά μας απέδειξαν ότι τα PEITC, SFN και AITC είναι σε θέση να αναστείλουν in vitro την έκφραση των MMP-9 και MMP-2 σε ενεργοποιημένα με LPS αστροκύτταρα και να εξουδετερώσουν την παραγωγή ROS που προκαλείται από το H2O2. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα ITC ρυθμίζουν την υπερέκφραση των MMPs με μηχανισμούς που σχετίζονται με την αναστολή της δραστηριότητας εξωκυτταρικά ρυθμιζόμενης πρωτεϊνικής κινάσης (ERK). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μια διατροφή πλούσια σε σταυρανθή λαχανικά μπορεί να έχει πιθανά οφέλη για την πρόληψη και τη συμπληρωματική θεραπεία νευρολογικών παθήσεων.

Υλικά και μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Το τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (DMEM), ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS), η πενικιλλίνη και η στρεπτομυκίνη παρέχονται από την GIBCO (Paisley, Σκωτία). Ζελατίνη, DNase 1, πολυ-L-λυσίνη

(PLL), θρυψίνη, λιποπολυσακχαρίτης (LPS), Trypan Blue και 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2.5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT) ), ισοθειοκυανικό αλλύλιο (AITC) [κωδ. 377,430, καθαρότητα 95 τοις εκατό (HPLC)], 2-Ισοθειοκυανικός φαιναιθυλεστέρας (PEITC) [κωδ. 253,731, καθαρότητα 99 τοις εκατό )], 2-Σουλφοραφάνη (SFN) [κωδ. S6317, καθαρότητα Μεγαλύτερη ή ίση με 95 τοις εκατό (HPLC)] παρέχονται από τη Sigma (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Η διοξική 2',7'-διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH-DA) αγοράστηκε από την Calbiochem. Οι τυπικές πρωτεΐνες και το R{20}} Coomassie Brilliant Blue ήταν από την Bio-Rad (Hercules, CA, ΗΠΑ). Αντισώματα κατά της ινιδιακής όξινης πρωτεΐνης (GFAP) (RRID: AB_2294571) αγοράστηκαν από τη Serotec (Οξφόρδη, Η.Β.). Τα αντισώματα κατά των εξωκυτταρικά ρυθμιζόμενων πρωτεϊνικών κινασών (ERK) 1/2 και του φωσφορυλιωμένου ERK 1/2 (p-ERK 1/2) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Οι μεμβράνες Hybond-P PVDF, το σύστημα ανάλυσης Western Blotting ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) και το δευτερεύον αντίσωμα κατά ποντικού-HRP ήταν από την GE

Healthcare Life Sciences (Little Chalfont, Buckinghamshire,

Το Ηνωμένο Βασίλειο). Τα ζεύγη εκκινητών ειδικά για τα MMP-2, MMP-9 και 18S rRNA ήταν από τη Sigma Genosys (Cambs, UK). Το μίνι κιτ RNeasy και το κιτ Αντίστροφης Μεταγραφής QuantiTect αγοράστηκαν από την Qiagen (Βαλένθια, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Τα αντιδραστήρια Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix για PCR αγοράστηκαν από την Lucigen Corporation (Middleton, WI, ΗΠΑ).

Δήλωση ηθικής

Τα πειράματα που αφορούσαν ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals και με την έγκριση της Επιτροπής Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου του Μπάρι, Ιταλία (Αριθμός άδειας: 23-98- ΕΝΑ).

Παρασκευή καλλιεργειών αστροκυττάρων

Τα αστροκύτταρα παρασκευάστηκαν από τους νεοφλοιώδεις ιστούς {{0}}αουραίων Wistar μιας ημέρας (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Ιταλία). Για την παρασκευή αστροκυττάρων χρησιμοποιήθηκαν 6 λίτρα των 12 νεογνών, καθένα από τα δύο φύλα. Τα ζώα υπέστησαν ευθανασία με έκθεση σε διοξείδιο του άνθρακα (CO2) και θανατώθηκαν με γρήγορο αποκεφαλισμό. Οι νεοφλοιώδεις ιστοί ανατέμθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για καθαρισμό πρωτογενών γλοιακών κυτταρικών καλλιεργειών ακολουθώντας τη μέθοδο που αναφέρεται από τους Latronico et al. (2018). Εν συντομία, μετά την ανατομή, οι εγκέφαλοι αρουραίου εξαντλήθηκαν από μήνιγγες και αιμοφόρα αγγεία, κομματιάστηκαν μηχανικά και υποβλήθηκαν σε πέψη με 0,25 τοις εκατό θρυψίνη παρουσία 0,01 τοις εκατό DNase. Μετά τη φυγοκέντρηση και την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε φιάλες επικαλυμμένες με PLL (75 cm2) σε πυκνότητα 1,5 × 107 κύτταρα/φιάλη σε DMEM, 10 τοις εκατό FBS, 100 IU mL -1 πενικιλλίνη, 100 μg mL -1 στρεπτόμυα και διατηρήθηκε στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2. Μετά από 7 ημέρες, οι φιάλες ανακινήθηκαν για να απομακρυνθούν τα ολιγοδενδροκύτταρα και τα μικρογλοία. Η καθαρότητα των αστροκυττάρων, που ελήφθη με θρυψίνη (0,25 τοις εκατό θρυψίνη/0,02 τοις εκατό EDTA), εκτιμήθηκε με ανοσοχρώση για GFAP.

Θεραπεία αστροκυττάρων ενεργοποιημένων από LPS με ισοθειοκυανικό αλλύλιο, ισοθειοκυανικό φαιναιθυλεστέρα ή 2-σουλφοραφάνη

Τα συρρέοντα αστροκύτταρα, σπαρμένα σε 96 πλάκες φρεατίων, διεγέρθηκαν με 10 μg mL -1 LPS και υποβλήθηκαν ταυτόχρονα σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ισοθειοκυανικού αλλυλεστέρα (AITC), 2-ισοθειοκυανικού φαιναιθυλίου (PEITC) ή {{5} σουλφοραφάνης (SFN) σε DMEM χωρίς ορό. Τα αστροκύτταρα σε αστροκύτταρα χωρίς ορό DMEM και ενεργοποιημένα με LPS αντιπροσώπευαν αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες, αντίστοιχα. Επιπλέον, δεδομένου ότι τα μητρικά διαλύματα AITC (100 μΜ), PEITC (67 μΜ) και SFN (56,4 μΜ) κατασκευάστηκαν σε DMSO, μια καμπύλη δόσης-απόκρισης σε DMSO, αραιωμένη σε μέσο καλλιέργειας στην ίδια συγκέντρωση διαλύτη που υπάρχει στο τα αναλυθέντα δείγματα, εκτελέστηκαν για να εκτιμηθεί η τοξικότητα της ένωσης. Μετά από 20 ώρες επώασης στους 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2 τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε -20 βαθμό μέχρι τη χρήση ενώ τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία ΜΤΤ για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων.

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων ΜΤΤ

Η κυτταροτοξικότητα των AITC, PEITC και SFN στα αστροκύτταρα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το MTT [{0}}(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)- 2,{{5 Δοκιμασία }}βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου]. Αυτή η δοκιμασία βασίζεται στην αναγωγή του ΜΤΤ από τη μιτοχονδριακή ηλεκτρική αφυδρογονάση σε βιώσιμα κύτταρα, σε ένα αδιάλυτο προϊόν μπλε φορμαζάνης που μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά. Εν συντομία, μετά από επεξεργασία για 20 ώρες με AITC, PEITC ή SFN, το μέσο καλλιέργειας αφαιρέθηκε και τα κύτταρα φορτώθηκαν με 0,5 mg mL−1 MTT. Μετά από επώαση για 2 ώρες στους 37 βαθμούς, απομακρύνθηκε 5 τοις εκατό μέσο CO2 και οι κρύσταλλοι φορμαζάνης στα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν με 90 τοις εκατό αιθανόλη. Μετά από ανακίνηση των πλακών για 15 λεπτά για να επιτευχθεί πλήρης διαλυτοποίηση των κρυστάλλων, η ποσότητα του προϊόντος φορμαζάνης προσδιορίστηκε με οπτική απορρόφηση στα 560 nm με μήκος κύματος αναφοράς 690 nm. Η κυτταρική βιωσιμότητα εκφράστηκε ως ποσοστό ελέγχου (CTRL), που αντιπροσωπεύεται από μη επεξεργασμένα κύτταρα, το οποίο ορίστηκε στο 100 τοις εκατό. Για κάθε ένωση, ελήφθη μια καμπύλη δόσης-απόκρισης βιωσιμότητας κυττάρων.

Ανίχνευση αντιδραστικών ειδών οξυγόνου

Η ανίχνευση αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) πραγματοποιήθηκε με φόρτωση αστροκυττάρων με 10 μM διοξεικής 2',7'-διχλωροφλουορεσκεΐνης (DCFH-DA) σε DMEM χωρίς ερυθρό φαινόλης στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Στη συνέχεια το DCFH-DA αφαιρέθηκε από φρεάτια και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με AITC (400 μM), PEITC (10 μΜ) ή SFN (25 μΜ) σε DMEM χωρίς ερυθρό φαινόλης παρουσία H2O2 στην τελική συγκέντρωση 100 μM . Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με DCFH-DA ή με H2O2 αντιπροσώπευαν τους αρνητικούς (CTRL) και θετικούς μάρτυρες (H2O2), αντίστοιχα. Μετά την επώαση τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0.5 τοις εκατό, pH 7,5,

στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στους 10,000×g, 4 μοίρες για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και η φασματοφθοριομετρική τους ανάλυση πραγματοποιήθηκε στα 525 nm υπό διέγερση στα 485 nm. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν στο συνολικό περιεχόμενο πρωτεΐνης και η παραγωγή ROS εκφράστηκε ως ένα σχετικό ποσοστό της έντασης της φωτοφωταύγειας (PL) έναντι του θετικού ελέγχου.

Ανίχνευση ζελατινασών

Η δραστικότητα ζελατινάσης σε κυτταρικά υπερκείμενα (SNs) ανιχνεύθηκε με ζυμογραφική ανάλυση όπως αναφέρεται από τους Latronico et al. (2013). Εν συντομία, μια ποσότητα SN, που αντιστοιχεί σε περίπου 10 μg συνολικών πρωτεϊνών, διαλυτοποιήθηκε με 30 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος Laemmli χωρίς -μερκαπτοαιθανόλη. Τα δείγματα διεξήχθησαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 7,5 τοις εκατό συμπολυμερισμένο με 0,1 τοις εκατό (β/ο) ζελατίνη. Μετά την ηλεκτροφορητική δοκιμή, τα πηκτώματα ξεπλύθηκαν δύο φορές με 2,5 τοις εκατό Triton X{-100/10 mM CaCl2 σε 50 mM Tris–HCl, pH 7,4 και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 βαθμούς σε 1 τοις εκατό Triton X-100 /50 mM Tris–HCl/10 mM CaCl2, ρΗ 7,4. Τα πηκτώματα χρωματίστηκαν με Coomassie brilliant blue R-250 και αποχρωματίστηκαν σε μεθανόλη/οξικό οξύ/Η2Ο (4:1:5 ν/ν). Η δραστηριότητα της ζελατινάσης απεικονίστηκε ως μια διαυγής ζώνη πέψης σε ένα μπλε φόντο της γέλης και ποσοτικοποιήθηκε με υπολογιστική πυκνομετρική ανάλυση εικόνας χρησιμοποιώντας λογισμικό Image LabTM (Bio-Rad Laboratories). Ζελατινάση

Η δραστηριότητα εκφράστηκε ως οπτική πυκνότητα (OD) × mm2, αντιπροσωπεύοντας την περιοχή σάρωσης κάτω από τις καμπύλες που λαμβάνει υπόψη τόσο τη φωτεινότητα όσο και το πλάτος της ζώνης λύσης του υποστρώματος. Τα δεδομένα εκφράστηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: ποσοστιαία αναστολή=[100 - (OD δείγμα/OD θετικός έλεγχος) × 100].

Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Τα αστροκύτταρα, σπαρμένα σε πλάκες 6 φρεατίων, ενεργοποιήθηκαν με LPS (10 μg mL−1) και υποβλήθηκαν ταυτόχρονα σε επεξεργασία με ITC στη μέγιστη μη τοξική συγκέντρωση. Μετά από 20 ώρες επώασης ολικό RNA εκχυλίστηκε από αστροκύτταρα χρησιμοποιώντας το μίνι κιτ Qiagen RNeasy σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε από 500 ng RNA χρησιμοποιώντας το κιτ QuantiTect Reverse Transcription σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συνολικά 25 ng προϊόντων αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση ενός θραύσματος 591 bp χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (sense 5'-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG{10}}'; antisense 5'-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3') για την αλληλουχία MMP-2 αρουραίου και ένα θραύσμα 541 bp που χρησιμοποιεί ειδικούς εκκινητές (νοήμα 5'-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3', αντι-πληροφοριακό 5'-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) για την αλληλουχία MMP-9 αρουραίου. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε ενίσχυση ενός θραύσματος 308 bp 18S rRNA αρουραίου (νοήμα 5'-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3'· αντιπληροφοριακό 5'-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3'), ένα σχετικά αμετάβλητο εσωτερικό γονίδιο αναφοράς. . Τα σετ εκκινητών, που έχουν ήδη επικυρωθεί σε άλλες μελέτες (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) αναγνωρίζουν συγκεκριμένα μόνο τα γονίδια ενδιαφέροντος, όπως υποδεικνύεται από την ενίσχυση μιας μεμονωμένης ζώνης του αναμενόμενου μεγέθους της PCR προϊόντα. Η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε για 25 κύκλους ο καθένας αποτελούμενος από μετουσίωση στους 94 βαθμούς, ανόπτηση στους 59 βαθμούς και επέκταση στους 72 βαθμούς. Μετά την ενίσχυση, τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 1,5 τοις εκατό. Μετά την πυκνομετρική ανάλυση των πηκτωμάτων, η ενίσχυση των γονιδίων-στόχων κανονικοποιήθηκε σε έκφραση 18S rRNA και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό αναστολής σε σύγκριση με τον θετικό έλεγχο όπως αναφέρεται για την ποσοτικοποίηση της ζελατινάσης.

Ανίχνευση φωσφορυλίωσης ERK 1/2 με ανάλυση στυπώματος western

Τα ERK 1/2 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση ανοσοστύπωσης όπως αναφέρεται στους Latronico et al. (2018). Συνοπτικά, συρρέουσα πρωτοβάθμια

αστροκύτταρα τοποθετημένα σε {0}}πλάκες με φρεάτιο, σε ηρεμία σε μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες, υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία για 1 ώρα με AITC (400 μΜ), PEITC (10 μΜ), ή SFN (25 μΜ) σε DMEM χωρίς ερυθρό φαινόλης. Μετά από διέγερση για 2 ώρες με 10 ug mL−1 LPS, τα κύτταρα λύθηκαν με 20 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM πυροφωσφορικό Na, 1 mM -γλυκεροφωσφορικό 1 τοις εκατό Triton X-100, 1 mM φαινυλμεθυλσουλφονυλ φουορίδιο, 20 ug/mL απρωτινίνη, 1 mM EGTA, 1 mM Na-φουορίδιο, 1 mM Na3VO4, ρΗ 7,5. Εξήντα ug των συνολικών πρωτεϊνών κάθε δείγματος αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου 10 τοις εκατό και οι πρωτεΐνες στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Μετά από αποκλεισμό κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς με 0,05 τοις εκατό Tween 20, 1 τοις εκατό γάλα, 1 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών σε 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς με ένα μονοκλωνικό αντι-p- ERK 1/2 αντίσωμα (1:500). Στη συνέχεια οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με 0,05 τοις εκατό Tween 20 σε αλατούχο διάλυμα Tris, ανιχνεύθηκαν με δευτερογενές αντίσωμα κατά ποντικού-υπεροξειδάσης χρένου (1:20,000) για 2-h στους 24 βαθμούς και ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Για να εκτιμηθεί η συνολική ποσότητα ERK, οι μεμβράνες αφαιρέθηκαν και επωάστηκαν με ένα αντίσωμα ειδικό για μη φωσφορυλιωμένο ERK 1/2 (1:500). Οι εντάσεις της ζώνης ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική σάρωση κηλίδων και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του ERK 1/2 κανονικοποιήθηκαν σε μη φωσφορυλιωμένο ERK 1/2 και εκφράστηκαν ως ποσοστό σε σύγκριση με τον θετικό έλεγχο (αστροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LPS), σύμφωνα με ακόλουθη εξίσωση:

τοις εκατό pERK 1/2=(ODsample/ODθετικός έλεγχος) × 100.

Στατιστική ανάλυση

Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές ± SD. Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης μονής κατεύθυνσης (ANOVA) που ακολουθήθηκε από τη δοκιμασία Dunnett's Multiple Comparison post hoc.

Αποτελέσματα

Επίδραση ισοθειοκυανικών ενώσεων στη βιωσιμότητα των αστροκυττάρων

Πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικά πειράματα για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας των AITC, PEITC ή SFN. Για το σκοπό αυτό, τα καθαρισμένα αστροκύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 20 ώρες με τις ενώσεις ITC σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται μεταξύ 5 και 400 μΜ ή με DMSO αραιωμένο σε μέσο καλλιέργειας όπως περιγράφεται στην Ενότητα Μεθόδου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, το DMSO δεν ήταν τοξικό σε όλες τις χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις που ταιριάζουν με αυτές των διαλυμάτων ITC που δοκιμάστηκαν. Μεταξύ των διερευνηθέντων ITC, η AITC

Εικ. 1 Κυτταρική βιωσιμότητα αστροκυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισοθειοκυανικές ενώσεις. Τα συρρέοντα πρωτογενή αστροκύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 20 ώρες με ισοθειοκυανικό αλλύλιο (AITC), 2-ισοθειοκυανικό φαιναιθυλεστέρα (PEITC) ή 2-σουλφοραφάνη (SFN) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και στη συνέχεια υποβλήθηκαν στον προσδιορισμό ΜΤΤ. Επιπλέον, δεδομένου ότι είναι στο απόθεμα διαλύματα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), μια καμπύλη δόσης-απόκρισης σε DMSO, αραιωμένη σε μέσο καλλιέργειας στην ίδια συγκέντρωση διαλύτη (%) που υπήρχε στα δείγματα ITC, εκτελέστηκε σε κάθε πείραμα για να ληφθεί αξιόπιστη εκτίμηση της τοξικότητας ITC. Ο έλεγχος (CTRL) επαναπαρασκευάστηκε

με άρωμα από μη επεξεργασμένα αστροκύτταρα σε DMEM χωρίς ορό. Τα γραφήματα αντιπροσωπεύουν τις καμπύλες δόσης-απόκρισης της βιωσιμότητας των κυττάρων, που εκφράζονται ως ποσοστό της κυτταρικής επιβίωσης σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ως μέγιστες μη τοξικές συγκεντρώσεις επιλέχθηκαν οι δόσεις των ενώσεων που προσδιόρισαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων πάνω από 60 τοις εκατό. Οι τιμές είναι οι μέσες τιμές ± SD για n=3 πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων. Τα μικρογραφήματα δείχνουν αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της μορφολογίας των κυττάρων που παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (μεγέθυνση 50Χ) μετά από επεξεργασία με τις διάφορες ενώσεις

ήταν το λιγότερο τοξικό για τα αστροκύτταρα. Συγκεκριμένα, το AITC δεν ήταν τοξικό για κύτταρα έως 400 μΜ ενώ τα PEITC και SFN ήταν τοξικά σε συγκεντρώσεις πάνω από 10 και 25 μΜ, αντίστοιχα. Η μικροσκοπική παρατήρηση επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της ανάλυσης MTT που έδειξε ότι στις τοξικές συγκεντρώσεις PEITC και SFN, τα αστροκύτταρα μειώθηκαν σε αριθμό και αυτά που παρέμειναν εμφάνισαν κυτταροτοξικές αλλαγές στο κυτταρόπλασμά τους.

Προστατευτική επίδραση των ενώσεων ITC στην παραγωγή ROS σε αστροκύτταρα που έχουν υποστεί επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου

Για να αξιολογηθεί η προστατευτική επίδραση των ITC έναντι του οξειδωτικού στρες, τα αστροκύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με PEITC, AITC και SFN στη μέγιστη μη τοξική συγκέντρωση και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με H2O2. Η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS, που προκαλείται από H2O2, προσδιορίστηκε με DCFH-DA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, η έκθεση σε H2O2 ενίσχυσε το φθορίζον σήμα στο

Εικ. 2 Παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) σε αστροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ITCs. Η παρουσία του ROS προσδιορίστηκε με μέτρηση των αλλαγών του σήματος φθορισμού της 2',7'-διχλωροφλουορεσκεΐνης (DCFA) όπως αναφέρεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αστροκύτταρα, σπαρμένα σε πλάκες 6 φρεατίων, υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία για 30 λεπτά με DCFA και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με 10 μM PEITC, 400 μM AITC ή 25 μM SFN παρουσία H2O2 σε τελική συγκέντρωση 100 μM . Τα αστροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με DCFA (CTRL) ή με 100 μM H2O2 αντιπροσώπευαν αρνητικό και θετικό έλεγχο, αντίστοιχα. Το σήμα φθορισμού που ανιχνεύθηκε στα κυτταρολύματα μετρήθηκε με ένα φθορόμετρο στα 525 nm υπό διέγερση στα 485 nm. Η παραγωγή ROS εκφράστηκε ως ποσοστό (%) έντασης φωτοφωταύγειας (PL) σε σύγκριση με τον θετικό έλεγχο. Οι τιμές είναι οι μέσες τιμές ± SD για n=3 πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων. Στατιστικά σημαντική μείωση σε σύγκριση με το H2O2 υποδεικνύεται με αστερίσκους (μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή post hoc Dunnet· *p <>

αστροκύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο (CTRL). Όπως αποδεικνύεται από τη μείωση της έντασης φθορισμού DCF, η προεπεξεργασία των αστροκυττάρων με ενώσεις ITC εξουδετέρωσε τη δημιουργία ROS που προκαλείται από το H2O2. Μεταξύ των ITC που δοκιμάστηκαν, μόνο τα PEITC και SFN μπόρεσαν να μειώσουν σημαντικά την παραγωγή ROS κατά περίπου 20 και 24 τοις εκατό, αντίστοιχα, σε σύγκριση με έναν θετικό έλεγχο (H2O2).

Οι ισοθειοκυανικές ενώσεις αναστέλλουν τα επίπεδα MMP-2 και MMP-9 σε ενεργοποιημένα με LPS αστροκύτταρα

Η επίδραση των ενώσεων ITC στα επίπεδα MMP-2 και MMP-9 αξιολογήθηκε σε αστροκύτταρα ενεργοποιημένα με LPS, τα οποία είναι γνωστό ότι επάγουν την έκφραση ζελατινασών (Gottschall και Deb 1996) και ταυτόχρονα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AITC, PEITC, ή SFN στο εύρος των συγκεντρώσεων που δεν ήταν τοξικές για τα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3α, δύο καθαρές ζώνες πέψης των 72 και 92 kDa ήταν παρούσες στο πήκτωμα που αντιστοιχούσαν, αντίστοιχα, σε MMP-2 και MMP-9 αντίστοιχα. Η ενεργοποίηση αστροκυττάρων με LPS αύξησε τα επίπεδα της MMP-2 και προκάλεσε τη σύνθεση της MMP-9. Η θεραπεία με AITC (Εικ. 3β), PEITC (Εικ. 3γ) ή SFN (Εικ. 3δ) καθόρισε μια δοσοεξαρτώμενη

μείωση των επιπέδων MMP-9, τα οποία διέφεραν ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη ένωση. Ειδικότερα, μεταξύ των ITC που χρησιμοποιήθηκαν, το SFN ήταν το πιο αποτελεσματικό στην αναστολή της MMP-9 αφού προσδιόρισε 70 τοις εκατό αναστολή στη δόση των 10 μΜ και 100 τοις εκατό αναστολή στη δόση των 25 μΜ. Επιπλέον, μόνο ο SFN στη μέγιστη μη τοξική συγκέντρωση μπόρεσε να αναστείλει σημαντικά την MMP-2 (Εικ. 2δ).

Οι ισοθειοκυανικές ενώσεις αναστέλλουν την έκφραση των γονιδίων MMP-2 και MMP-9 σε ενεργοποιημένα με LPS αστροκύτταρα

Για να προσδιοριστεί εάν οι ενώσεις ITC που μελετήθηκαν ήταν σε θέση να αναστείλουν την έκφραση MMP-2 και MMP-9, πραγματοποιήθηκε RT-PCR σε αστροκύτταρα ενεργοποιημένα με LPS που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη μέγιστη μη τοξική συγκέντρωση ITC. Όπως φαίνεται στα αντιπροσωπευτικά πηκτώματα στο Σχήμα 4α, η θεραπεία των ενεργοποιημένων από LPS αστροκυττάρων με τα μεμονωμένα ITC ήταν σε θέση να εξουδετερώσει την αυξημένη έκφραση του MMP-2 και του MMP-9 mRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4β, η ποσοτική ανάλυση των αποτελεσμάτων, απέδειξε ότι, στη μέγιστη μη τοξική συγκέντρωση, οι ενώσεις ITC, προσδιόρισαν μια στατιστικά σημαντική αναστολή της έκφρασης MMP-2 και MMP-9 σε σύγκριση σε θετικό μάρτυρα (LPS). Συγκεκριμένα, το PEITC και το SFN ασκούν το ίδιο ποσοστό αναστολής στο MMP-2 (85 τοις εκατό ) και το MMP-9 (100 τοις εκατό ) ενώ το AITC ήταν λιγότερο αποτελεσματικό από το PEITC και το SFN στην αναστολή του MMP{{17} } (65 τοις εκατό ) και έκφραση MMP-9 (90 τοις εκατό ).

Το ERK 1/2 εμπλέκεται στην αναστολή της έκφρασης MMP από το ITC

Δεδομένου ότι το ERK 1/2 είναι η κύρια οδός μεταγωγής σήματος που εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης MMP{-2 και MMP-9 σε ενεργοποιημένα με LPS αστροκύτταρα (Lee et al. 2003), η επίδραση των ενώσεων ITC στην Δοκιμάστηκε ενεργοποίηση εξωκυτταρικά ρυθμιζόμενων πρωτεϊνικών κινασών (ERK) 1/2.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, το LPS προκάλεσε μια στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα του φωσφορυλιωμένου ERK 1/2 (p-ERK) που εξουδετερώθηκε με προκατεργασία με τις ενώσεις ITC.

Συζήτηση

Πιστεύεται ευρέως ότι οι κύριες αμυντικές στρατηγικές έναντι πολλών ασθενειών συνίστανται κυρίως στην αποφυγή παραγόντων κινδύνου και στην υιοθέτηση ενός σωστού τρόπου ζωής. Υπάρχουν πολυάριθμα επιστημονικά στοιχεία που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι ορισμένοι φυσικοί μεταβολίτες, που συνήθως παράγονται από διάφορα είδη φρούτων και λαχανικών, είναι ικανοί να ρυθμίζουν παθολογικά φαινόμενα όπως ο καρκίνος, οι νευρολογικές ασθένειες και άλλες πολυπαραγοντικές ασθένειες. Σε αυτό το σενάριο, τα ισοθειοκυανικά (ITC) προκάλεσαν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω των αντιμυκητιασικών, αντιβακτηριδιακών,

Εικ. 3 Επίδραση των ισοθειοκυανικών ενώσεων στα επίπεδα MMP-2 και MMP-9 σε ενεργοποιημένα με LPS αστροκύτταρα. Στο α αναφέρεται ένα αντιπροσωπευτικό ζυμογραφικό πήκτωμα της ανάλυσης υπερκειμένων καλλιέργειας από αστροκύτταρα που ενεργοποιήθηκαν με LPS (10 ug mL-1) και υποβλήθηκαν ταυτόχρονα σε επεξεργασία για 20 ώρες με AITC, PEITC ή SFN στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (μM). Οι αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι ελήφθησαν από μη διεγερμένα και μη επεξεργασμένα αστροκύτταρα σε μέσο χωρίς ορό (CTRL) και LPS-

ενεργοποιημένα κύτταρα (LPS), αντίστοιχα. Τα ιστογράμματα b–d αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα (μέσος όρος ± SD) n {{0}} πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς, εκφρασμένα ως ποσοστό αναστολής MMP σε σύγκριση με LPS, υπολογισμένα μετά από σάρωση πυκνομετρίας και ηλεκτρονική ανάλυση πηκτωμάτων . Η στατιστικά σημαντική μείωση σε σύγκριση με το LPS υποδεικνύεται με αστερίσκους (μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή post hoc του Dunnet· *p < 0.05,="" **p=""><>

αντικαρκινογόνες, αντιμεταλλαξιογόνες, αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις βιολογικές ιδιότητες (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay and Fahey 2001). Τα ισοθειοκυανικά προέρχονται από την ενζυματική αποικοδόμηση των γλυκοσινολικών (GSL) που είναι δευτερογενείς μεταβολίτες που υπάρχουν σε 15 βοτανικές οικογένειες της τάξης Capparales και είναι πολύ άφθονα στην οικογένεια Brassicaceae (Fahey et al. 2001). Τα GSL υδρολύονται από τη μυροσινάση (-θειογλυκοσίδη γλυκοϋδρολάση e; EC 3.2.3.147) σε μια ποικιλία συστατικών όπως ITCs, νιτρώδη, θειοκυανικά, επιθειονιτρίλια, SFGate, γλυκόζη και οξαζολιδίνες (Li and Kushad 2005). Αν και τα ITC έχουν μελετηθεί εκτενώς στο χημειοθεραπευτικό πεδίο (Grundemann and Huber 2018), λίγες έρευνες έχουν γίνει σχετικά με το θεραπευτικό δυναμικό τους σε νευρολογικές παθήσεις, παρά το γεγονός ότι έχει αποδειχθεί η ικανότητα του SFN και του AITC να διασχίζουν το BBB και να συσσωρεύονται στο παρέγχυμα του εγκεφάλου. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). Σε αυτό το άρθρο, συγκρίναμε τα αποτελέσματα τριών ITC,

υπάρχει σε πολλά συνήθως καταναλωμένα σταυρανθή λαχανικά, στην παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και στην έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (MMP) σε ένα in vitro μοντέλο νευροφλεγμονής που αντιπροσωπεύεται από αστροκύτταρα που ενεργοποιούνται με λιποπολυσακχαρίτη (LPS) ή έχουν υποστεί επεξεργασία με H2O2. Τα αστροκύτταρα, ο πιο άφθονος τύπος νευρογλοιακών κυττάρων του ΚΝΣ, διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης του εγκεφάλου και αποτελούν χαρακτηριστικά γνωρίσματα διαφόρων νευρολογικών παθήσεων (Cekanaviciute and Buckwalter 2016; Colombo and Farina 2016). Θεωρούνται κρίσιμοι ρυθμιστές της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης και η απόκρισή τους σε επιβλαβείς προσβολές, όπως το οξειδωτικό στρες, μπορεί να επιδεινώσει τις φλεγμονώδεις αντιδράσεις και τη βλάβη των ιστών ή να προάγει την επισκευή των ιστών. Είναι ευρέως γνωστό ότι τα ενεργοποιημένα αστροκύτταρα παράγουν νευροτοξικούς παράγοντες όπως τα MMPs που έχουν βασικό ρόλο στην προώθηση της νευροφλεγμονής και της προοδευτικής νευρωνικής απώλειας σε νευρολογικές ασθένειες (Hsieh and Yang 2013). Επομένως, η διαμόρφωση του

Εικ. 4 Επίδραση των ενώσεων ITC στην έκφραση MMP-2 και MMP-9 σε ενεργοποιημένα με LPS αστροκύτταρα. Τα αστροκύτταρα, σπαρμένα σε πλάκες 6 φρεατίων, ενεργοποιήθηκαν με LPS (10 μg mL-1) και υποβλήθηκαν ταυτόχρονα σε επεξεργασία για 20 ώρες με AITC (400 μM), PEITC (10 μΜ) ή SFN (25 μΜ), και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε RT-PCR. Αντιπροσωπευτικά πηκτώματα αγαρόζης έκφρασης MMP-2 και MMP-9 αναφέρονται στο (α). Τα ιστογράμματα στο (β) αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα (μέσος όρος ± SD) n=3 πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικά κελιά

συμβάντα που συμβαίνουν μετά την ενεργοποίηση των αστροκυττάρων θα μπορούσαν να μετριάσουν τη φλεγμονώδη απόκριση και τη νευρωνική βλάβη.

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι μεταξύ των ITC που μελετήθηκαν, το AITC ήταν λιγότερο τοξικό καθώς δεν είχε ως αποτέλεσμα καμία μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε όλες τις χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις. Αντίθετα, παρόμοια με ό,τι έχει παρατηρηθεί από άλλους συγγραφείς σε διάφορες γλοιακές κυτταρικές σειρές, το PEITC και το SFN έδειξαν κυτταρική τοξικότητα σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 10 και 25 μΜ, αντίστοιχα (Lee et al. 2015, Eren et al. 2018, Su et al. . 2015).

Στην τρέχουσα επιστημονική βιβλιογραφία, υπάρχουν πολλά αμφιλεγόμενα δεδομένα σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που κρύβονται πίσω από τις επιδράσεις των ITC στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Από αυτή την άποψη, οι περισσότερες μελέτες έχουν προτείνει ότι τα ITC αναστέλλουν την απόπτωση που προκαλεί την κυτταρική ανάπτυξη, τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, τη δημιουργία ROS σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα (Fofaria et al. 2015, Qin et. al. 2018· Sestili και Fimognari 2015). Βρήκαμε ότι το SFN και το PEITC, αλλά όχι το AITC, έχουν προστατευτικό ρόλο έναντι του οξειδωτικού στρες στα αστροκύτταρα, πράγματι στις μέγιστες μη τοξικές συγκεντρώσεις ήταν σε θέση να εξουδετερώσουν την παραγωγή ROS που προκαλείται από την έκθεση στο H2O2. Το ΚΝΣ είναι ιδιαίτερα ευάλωτο στο οξειδωτικό στρες λόγω της υψηλής κατανάλωσης οξυγόνου, των αδύναμων αντιοξειδωτικών συστημάτων και της υψηλής περιεκτικότητας σε βιομακρομόρια ευαίσθητα στην οξείδωση. Η δημιουργία ROS και οξειδωτικής βλάβης πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην παθογένεση νευρολογικών διαταραχών όπως η νόσος Alzheimer (AD), η νόσος Parkinson (PD), η Αμυοτροφική Πλάγια Σκλήρυνση (ALS) και η Πολλαπλή Σκλήρυνση (MS) (Lee et al. 2015). Επομένως, αν και στα in vitro πειράματά μας τα SFN και PEITC εξουδετέρωσαν την παραγωγή ROS σε μέτριο βαθμό, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι in vivo μια παρατεταμένη χορήγηση ITCs μπορεί να οδηγήσει σε πιο σημαντική μείωση των ROS που, με την πάροδο του χρόνου, μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική για πληθυσμούς που εκφράζονται ως ποσοστό αναστολής ΜΜΡ σε σύγκριση με τον θετικό μάρτυρα (LPS), που υπολογίζεται μετά από σάρωση πυκνομετρίας και ηλεκτρονική ανάλυση πηκτωμάτων. Η στατιστικά σημαντική μείωση της έκφρασης MMP-2 και MMP-9 σε σύγκριση με το LPS υποδεικνύεται με αστερίσκους (μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή post hoc του Dunnet· *p <>

την πρόληψη και τη ρύθμιση των παθήσεων του εγκεφάλου. Το ROS δρα ως κρίσιμο μόριο σηματοδότησης για να πυροδοτήσει τον καταρράκτη της φλεγμονώδους απόκρισης στο ΚΝΣ. Από αυτή την άποψη, είναι ευρέως γνωστό ότι τα ROS ρυθμίζουν την έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στη νευροφλεγμονή μέσω της ενεργοποίησης προφλεγμονωδών παραγόντων μεταγραφής όπως ο πυρηνικός παράγοντας-κΒ (NF-κB) (Lee et al. 2015· Chiurchiù et al. 2016· Martorana et al. 2019). Σε αυτό το σενάριο, σημαντικό ρόλο παίζουν τα MMP των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται προς τα πάνω από το ROS μέσω της ενεργοποίησης του NF-κB (Yan and Boyd 2007).

Δεδομένου ότι η απορρύθμιση της MMP συμβάλλει στην παθογένεση πολλών νευροφλεγμονωδών και νευροεκφυλιστικών ασθενειών, η αναστολή τους αντιπροσωπεύει μια σημαντική θεραπευτική στρατηγική. Για το λόγο αυτό, το αυξανόμενο ενδιαφέρον έχει επικεντρωθεί την τελευταία δεκαετία στη δυνατότητα των φαρμάκων και των φυσικών ενώσεων να αναστέλλουν τα MMPs. Πολυάριθμες in vitro μελέτες έχουν αποδείξει ότι η αντιφλεγμονώδης και αντιοξειδωτική δράση πολλών φαρμάκων και βιοδραστικών ενώσεων που υπάρχουν σε λαχανικά και θαλάσσιους οργανισμούς σχετίζεται με τις ικανότητές τους να αναστέλλουν την έκφραση των MMPs (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. . 2015). Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι μεταξύ των δοκιμασμένων ITC, το SFN και το PEITC ήταν τα πιο αποτελεσματικά στην αναστολή των επιπέδων και της έκφρασης MMP-2 και MMP{-9 σε ενεργοποιημένα με LPS αστροκύτταρα. Η αναστολή των MMPs από ITCs έχει αναφερθεί σε άλλες in vivo και in vitro μελέτες. Συγκεκριμένα, οι Li et al. (2013) απέδειξε ότι το SFN είναι σε θέση να μετριάσει τη βλάβη του BBB αναστέλλοντας την έκφραση MMP-9 σε ένα in vivo μοντέλο πειραματικής αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας. Άλλοι συγγραφείς ανέφεραν ότι ο SFN ήταν σε θέση να μειώσει την έκφραση MMP-9 μετά από τραυματισμό του νωτιαίου μυελού σε ποντίκια (Mao et al. 2010a). Επιπλέον, in vitro μελέτες έδειξαν ότι η καταστολή από ITC της κυτταρικής μετανάστευσης και

Εικ. 5 Η εξωκυτταρική κινάση 1/2 που ρυθμίζεται με σήμα (ERK 1/2) εμπλέκεται στην αναστολή της έκφρασης MMP από ενώσεις ITC. Αντιπροσωπευτικά αυτοραδιογραφικά φιλμ ανάλυσης western blotting προϊόντων λύσης από αστροκύτταρα προεπεξεργασμένα για 1 ώρα με AITC (400 μM), PEITC (10 μΜ) ή SFN (25 μΜ) και στη συνέχεια ενεργοποιήθηκαν για 2 ώρες με LPS (10 ug mL{{{ 13}}). Τα μη επεξεργασμένα και μη διεγερμένα κύτταρα αντιπροσωπεύουν αρνητικό έλεγχο (CTRL). Το ιστόγραμμα στο (β) αντιπροσωπεύει την εισβολή των επιπέδων pERK1/2 σε κύτταρα γλοιώματος C6 που συσχετίστηκε με την αναστολή της έκφρασης MMP-9 με τη μεσολάβηση του NF-κB (Lee et al. 2015).

Οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους τα ITC αναστέλλουν τα MMPs είναι ασαφείς και δεν υπάρχουν μελέτες που να διερευνούν τις αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες των ITC σε πρωτογενείς καλλιέργειες αστροκυττάρων. Αρκετές μελέτες υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η ανασταλτική δράση των ITCs είναι συνέπεια της ικανότητάς τους να μπλοκάρουν τον NF-κB μέσω της οδού σηματοδότησης Nrf2. Από την άποψη αυτή, μια in vivo μελέτη απέδειξε ότι τα ποντίκια Nrf2 knockout ήταν πιο ευαίσθητα στη φλεγμονώδη απόκριση του νωτιαίου μυελού που προκαλείται από NF-κΒ και στην αυξημένη έκφραση των εξαρτώμενων από NFκB γονιδίων συμπεριλαμβανομένου του MMP-9 (Mao et al. 2010b ). Αν και τα μονοπάτια NF-κB και Nrf2 θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν, δείξαμε ότι η ρύθμιση του NF-κB συμβαίνει επίσης μέσω της διαμόρφωσης μοριακών μηχανισμών που είναι ανεξάρτητοι από το Nrf2. Πράγματι, βρήκαμε ότι τα AITC, PEITC και SFN ανέστειλαν την ενεργοποίηση του ERK1/2 που παίζει κεντρικό ρόλο στον καταρράκτη των γεγονότων μεταγωγής σήματος που τελικά ρυθμίζουν τη μεταγραφή του γονιδίου MMP.

Ωστόσο, τα πειραματικά στοιχεία ότι το SFN στη μέγιστη μη τοξική συγκέντρωση ανέστειλε πλήρως την έκφραση και τα επίπεδα της MMP-9 ενώ η AITC και η PEITC ανέστειλαν σε μέγιστο βαθμό την έκφραση MMP-9 αλλά μείωσαν μόνο την MMP{{3} } επίπεδα σε περίπου 50 τοις εκατό , μπορεί να υποδηλώνουν ότι αυτές οι ενώσεις ρυθμίζουν τη μεταγραφή MMP-9 με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης. Από αυτή την άποψη, έχει αναφερθεί ότι ο SFN, εκτός από την αναστολή της επαγόμενης από το LPS ενεργοποίησης του NF-κB, παρεμβαίνει στη δέσμευση του LPS στον υποδοχέα TLR4 (Koo et al 2013). Η ανασταλτική επίδραση του SFN στο TLR4 θα μπορούσε να αποτρέψει την ενεργοποίηση των αστροκυττάρων από το LPS και αυτό μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της έκφρασης MMP{11}} προς τα πάνω με επακόλουθη έλλειψη παραγωγής MMP-9.

λαμβάνεται μετά από πυκνομετρική σάρωση αυτοραδιογραφικών φιλμ και κανονικοποίηση σε μη φωσφορυλιωμένο ERK 1/2. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SD για n=3 πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων. Οι αστερίσκοι αντιπροσωπεύουν τιμές στατιστικά διαφορετικές από τον θετικό έλεγχο (αστροκύτταρα ενεργοποιημένα με LPS), ο οποίος ορίστηκε στο 100 τοις εκατό (μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Dunnett's post hoc, *p <>

συμπεράσματα

Συνοπτικά, τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι η θεραπεία των αστροκυττάρων με ITCs μειώνει τον σχηματισμό ROS και αναστέλλει την απελευθέρωση των MMP-2 και MMP{-9 παρέχοντας νέες πληροφορίες για τις αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες των ITC στη γλοιακή κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα ITC θα μπορούσαν να είναι πολλά υποσχόμενοι διατροφικοί παράγοντες για την ανάπτυξη νευροδιατροφικών παρεμβάσεων, βασισμένων στη χρήση υγιεινών τροφίμων, για την πρόληψη και τη συμπληρωματική θεραπεία νευρολογικών παθήσεων.

Χρηματοδότηση Χρηματοδότηση ανοιχτής πρόσβασης που παρέχεται από το Università Degli Studi di Bari Aldo Moro στο πλαίσιο της Συμφωνίας CRUI-CARE.

Συμμόρφωση με πρότυπα δεοντολογίας

Σύγκρουση συμφερόντων Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Ανοιχτή πρόσβαση Αυτό το άρθρο αδειοδοτείται με άδεια Creative Commons Attribution 4.0 Διεθνής Άδεια, η οποία επιτρέπει τη χρήση, την κοινή χρήση, την προσαρμογή, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο ή μορφή, αρκεί να αποδώσετε τα κατάλληλα εύσημα στον αρχικό συγγραφέα (s) και την πηγή, παρέχουν έναν σύνδεσμο προς την άδεια Creative Commons και υποδεικνύουν εάν έγιναν αλλαγές. Οι εικόνες ή άλλο υλικό τρίτων σε αυτό το άρθρο περιλαμβάνονται στην άδεια Creative Commons του άρθρου, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά σε ένα πιστωτικό όριο για το υλικό. Εάν το υλικό δεν περιλαμβάνεται στην άδεια Creative Commons του άρθρου και η χρήση για την οποία προορίζεται δεν επιτρέπεται από νομοθετική ρύθμιση ή υπερβαίνει την επιτρεπόμενη χρήση, θα χρειαστεί να λάβετε άδεια απευθείας από τον κάτοχο των πνευματικών δικαιωμάτων. Για να δείτε ένα αντίγραφο αυτής της άδειας, επισκεφτείτε τη διεύθυνση http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.