Νευροπροστατευτική επίδραση του εκχυλίσματος Bu-Shen-Huo-Xue κατά της απόπτωσης που προκαλείται από υψηλή γλυκόζη σε κύτταρα PC12

Για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Ερευνητικό Στούντιο Ενσωμάτωσης Παραδοσιακής και Δυτικής Ιατρικής, Πρώτο Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου, Πεκίνο, Κίνα.

2 State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, University Peking, Beijing, China.

Καλύτερες στιγμές

Η νευροτοξικότητα που προκαλείται από υψηλή γλυκόζη (HG) εμπλέκεται στην παθολογία τουδιαβητικόςεγκεφαλοπάθεια (DE). Στη μελέτη μας, το εκχύλισμα Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), μια πολυβοτανική φόρμουλα, παρουσιάζεινευροπροστατευτικόδραστηριότητα σε κύτταρα PC12 που προκαλούνται από HG και οι πιθανοί μηχανισμοί μπορεί να σχετίζονται με την καταστολή της δημιουργίας αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), καθώς και των σηματοδοτικών μονοπατιών κασπάσης και JNK/p38 MAPK που προκαλούνται από μιτοχόνδρια. Αυτή η μελέτη παρέχει έναν πολλά υποσχόμενο παράγοντα για τη θεραπεία της ΔΕ σε κλινικές εφαρμογές.

Κάντε κλικ για να ωφελήματα εκχυλίσματος κιστάνσε και Cistanche για τα νεφρά

Cistancheείναι ένα γνωστό τονωτικό βότανο που μπορεί να θρέψει και να προστατεύσει τονεφρά. Στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική θεωρία,Cistancheείναι το καλύτερο βότανο γιανεφρά.Cistancheείναι πλούσιο σε εχινακοσίδη, ακτεοσίδη και φλαβονοειδή. Αυτά τα αποτελεσματικά συστατικά σεCistancheμπορεί να μειώσεινεφρόαπόπτωση και αύξηση των κυττάρωννεφρόπολλαπλασιασμός κυττάρων. Επομένως,Cistancheείναι έναφυσικό συμπλήρωμα νεφρού.

Αφηρημένη

Σκοπός: Διερεύνηση της νευροπροστατευτικής επίδρασης του εκχυλίσματος Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), μιας φόρμουλας πολυβοτάνων, έναντι της νευροτοξικότητας που προκαλείται από Υψηλή Γλυκόζη (HG) σε κύτταρα PC12. Μέθοδοι: Πραγματοποιήθηκε δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων, δοκιμασία γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), ανίχνευση ειδών αντιδραστικού οξυγόνου (ROS), Hoechst 33258, διπλή χρώση Acridine Orange (AO)/βρωμιούχο αιθίδιο (EB) και Δυνατότητα μιτοχονδριακής μεμβράνης (M). Επιπρόσθετα, Bax, Bcl-2, κασπάση-3, διασπασμένη κασπάση-3, PARP, διασπασμένη PARP, κυτόχρωμα c και κινάσες πρωτεΐνης ενεργοποιημένες με μιτογόνο (MAPK) ανιχνεύθηκαν με στύπωμα western. Αποτελέσματα: Το εκχύλισμα BSHX αύξησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και μείωσε τη διαρροή LDH με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση σε κύτταρα PC12 που προκαλούνται από HG. Επιπλέον, το εκχύλισμα BSHX μείωσε το επίπεδο του ενδοκυτταρικού ROS, αύξησε το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, ρύθμισε τις εκφράσεις των Bax και Bcl-2 και ανέστειλε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια. Επιπλέον, το εκχύλισμα BSHX εξασθένησε την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και της PARP και ανέστειλε τις φωσφορυλιώσεις της N-τερματικής κινάσης c-Jun (JNK) και των MAPK p38. Συμπέρασμα: Το εκχύλισμα BSHX επέδειξε σημαντική νευροπροστατευτική επίδραση στην απόπτωση που προκαλείται από HG σε κύτταρα PC12. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να συσχετιστεί με την καταστολή της δημιουργίας ROS καθώς και των οδών σηματοδότησης κασπάσης και JNK/p38 MAPK με τη μεσολάβηση των μιτοχονδρίων.

Λέξεις-κλειδιά:διαβητική εγκεφαλοπάθεια, παραδοσιακή κινέζικη ιατρική, εκχύλισμα Bu-Shen-Huo-Xue,νευροπροστατευτικό, υψηλή γλυκόζη

Συντομογραφία: AO: acridine orange; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Διαβητική Εγκεφαλοπάθεια; DM: Σακχαρώδης Διαβήτης; DMSO: Διμεθυλοσουλφοξείδιο. EB: βρωμιούχο αιθίδιο; ERK: Εξωκυτταρικές ρυθμιζόμενες πρωτεϊνικές κινάσες. HG: Υψηλή γλυκόζη. JNK: C-Jun Ν-τελική κινάση. LDH: Γαλακτική αφυδρογονάση. MAPKs: ενεργοποιημένες από μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες. MWP: Συνταγή Wu-Zi-Yan-Zong; ΜΤΤ: 3-[4, 5-Διμεθυλθειαζολ-2-υλ] 2, 5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο. PBS: Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών; PBST: Αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά, 0.1 τοις εκατό Tween 20; ROS: Reactive Oxygen Species; ΣΔ2: Σακχαρώδης Διαβήτης Τύπου 2. TCM: Παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα

Ιστορικό

Τα τελευταία χρόνια, η Διαβητική Εγκεφαλοπάθεια (ΔΕ), μια επιπλοκή του Σακχαρώδη Διαβήτη (ΣΔ) που εμφανίζεται στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ), έχει λάβει ευρεία προσοχή. Η ΔΕ μπορεί να σχετίζεται με διάφορους παράγοντες κινδύνου όπως η ηλικία, η διάρκεια και ο γλυκαιμικός έλεγχος του διαβήτη [1, 2]. Οι κλινικές εκδηλώσεις της ΔΕ είναι μορφολογικές και φυσιολογικές αλλαγές στον εγκέφαλο και επακόλουθη γνωστική δυσλειτουργία. Η υπεργλυκαιμία, το οξειδωτικό στρες και η χρόνια φλεγμονή μπορεί να είναι τα σημαντικά παθογόνα αίτια της ΔΕ [3]. Αν και ένας αυξανόμενος αριθμός πειραμάτων έχει δείξει ότι η μακροχρόνια παρατεταμένη υπεργλυκαιμία μπορεί να επιταχύνει τη γήρανση του εγκεφάλου, η ακριβής παθογένεση της ΔΕ είναι ανεξερεύνητη.

Η απόπτωση είναι ένας προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος που ελέγχεται από γονίδια για τη διατήρηση της σταθερότητας του μικροπεριβάλλοντος. Οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην απόπτωση περιλαμβάνουν την οικογένεια Bcl-2, τις κασπάσες, την p53, κ.λπ. Η οικογένεια Bcl-2 χωρίζεται σε δύο κατηγορίες, η μία που προάγει τον κυτταρικό θάνατο, όπως το Bax, και η άλλη αντιστέκεται στην απόπτωση. όπως Bcl-2. Μπορούν να ρυθμίσουν την απόπτωση μέσω της οδού σηματοδότησης κασπάσης, η οποία είναι μια αντίδραση καταρράκτη ενίσχυσης του μη αναστρέψιμου πεπερασμένου υποστρώματος υδρόλυσης της κασπάσης [4-6]. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι η απόπτωση που προκαλείται από υψηλή γλυκόζη (HG) σχετίζεται με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, βλάβη του DNA και υπερβολική παραγωγή ειδών αντιδραστικού οξυγόνου (ROS) [7]. Μια μελέτη σε διαβητικά ποντίκια έδειξε ότι η ενεργοποιημένη από 5'-μονοφωσφορική αδενοσίνη (AMP) πρωτεϊνική κινάση (AMPK), ένας υποδοχέας ενδοκυτταρικής ενέργειας και στρες, θα μπορούσε να αναστείλει την απόπτωση που προκαλείται από το ROS. Επιπλέον, αυξανόμενα στοιχεία έχουν δείξει ότι η αναστολή των ενεργοποιημένων από μιτογόνο πρωτεϊνικών κινασών (MAPKs) θα μπορούσε να είναι ευεργετική για την αναστολή της απόπτωσης των νευρώνων. Μια άλλη αναφορά έδειξε ότι η C-Jun N-τερματική κινάση (JNK), οι εξωκυτταρικές ρυθμιζόμενες πρωτεϊνικές κινάσες (ERK), τα μονοπάτια σηματοδότησης της p38 MAPK ενδέχεται να ρυθμίζουν την απόπτωση των νευρώνων [8,9].

Με βάση την παραδοσιακή κινεζική ιατρική θεωρία,νεφρόΗ ανεπάρκεια ουσίας και η στάση του αίματος θεωρούνται ως βασική παθογένεια της ΔΕ. Ως εκ τούτου, η στρατηγική της θρέψηςνεφράκαι το αίμα ενεργοποίησης χρησιμοποιείται συνήθως σε κλινικές εφαρμογές για DE. Προηγούμενες μελέτες θα μπορούσαν να επιβεβαιώσουν ότι η τροποποιημένη συνταγή Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), μια συνταγή που στοχεύει στη θρέψηνεφρά, μπορεί να βελτιώσει τη γνωστική εξασθένηση και να προστατεύσει τους νευρώνες μειώνοντας την τοξικότητα Α [10, 11]. Η συνταγή Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), στην οποία προστίθεται βδέλλα με βάση το MWP, έχει σχεδιαστεί ειδικά γιατρέφωνεφράκαι ενεργοποιούν το αίμα. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η συνταγογράφηση BSHX μπορεί να βελτιώσει το σύνδρομο επιδείνωσης της μνήμης των ασθενών με ΣΔ, υποδηλώνοντας ισχυρές νευροπροστατευτικές ιδιότητες [12]. Ωστόσο, ο λεπτομερής φαρμακολογικός μηχανισμός για το BSHX παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύουμε να παρατηρήσουμε την προστατευτική επίδραση του εκχυλίσματος BSHX σε κύτταρα PC12 που προκαλούνται από HG και να διερευνήσουμε πιθανούς μοριακούς μηχανισμούς.

Μέθοδοι

Υλικά και αντιδραστήρια

Όλα τα βότανα αγοράστηκαν από την Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα) και επικυρώθηκαν από τον Δρ. PF Tu, φαρμακολόγο, σύμφωνα με την Κινεζική Φαρμακοποιία (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-Διμεθυλθειαζολ-2-υλ] 2, 5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT) ήταν από τη Sigma Chemical Co. (Saint Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Ένα κιτ ανάλυσης γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) αγοράστηκε από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, Κίνα). Το κιτ διπλής χρώσης Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) και η Hoechst 33258 ελήφθησαν από την Solar Co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα). Ένα κιτ προσδιορισμού δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης με JC-1, 2, 7-διοξική διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH-DA) αγοράστηκε από το Beyotime Institute of Biotechnology (Σαγκάη, Κίνα). Πρωτογενή αντισώματα για κασπάση-3, διασπασμένη κασπάση-3, PARP, διασπασμένη PARP, κυτόχρωμα C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p Η -JNK και η -τουμπουλίνη ελήφθησαν από την Cell signaling Technology (Βοστόνη, ΜΑ, ΗΠΑ).

Παρασκευή εκχυλίσματος BSHX

Το BSHX αποτελείται από επτά φαρμακευτικά συστατικά (Πίνακας 1). Για την παρασκευή εκχυλίσματος BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Τουρκ.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) και Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) αναμίχθηκαν σε αναλογία 8:8:4:1:2:1:8 και βυθίστηκαν σε συνολικό όγκο 10 φορές (v/w) απεσταγμένο νερό για 30 λεπτά , στη συνέχεια βράσαμε για 1 ώρα και ξαναβράζαμε για 1 ώρα σε συνολικό όγκο 5 φορές (v/w) απεσταγμένο νερό. Τα υπερκείμενα συνδυάστηκαν και ξηράνθηκαν με λυοφιλοποίηση. Το τελικό αποξηραμένο εκχύλισμα ήταν 25 τοις εκατό (β/β) του βάρους των ακατέργαστων βοτάνων και ένα δείγμα κουπονιού κατατέθηκε στο Σύγχρονο Ερευνητικό Κέντρο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής, Κέντρο Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου του Πεκίνου, Πεκίνο, Κίνα.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Κυτταρικές σειρές φαιοχρωμοκυτώματος αρουραίου (κύτταρα PC12) ελήφθησαν από την Peking Union Medical College Cell Bank (Πεκίνο, Κίνα) και αναπτύχθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Πεκίνο, Κίνα) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (Biowest, Γαλλία ) και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (100×, Macgene, Πεκίνο, Κίνα) σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα που περιέχει 95 τοις εκατό αέρα και 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς.

Δείγμα επεξεργασίας

Στην προκαταρκτική δοκιμή, τα κύτταρα PC12 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχύλισμα BSHX (20, 50, 100 mg/L) μόνο για 48 ώρες για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα. Για ανάλυση νευροπροστατευτικής δράσης του εκχυλίσματος BSHX έναντι της επαγόμενης από υψηλή γλυκόζη (HG) νευροτοξικότητας, τα κύτταρα PC12 υποβλήθηκαν σε συν-επεξεργασία με εκχύλισμα BSHX (20, 50, 100 mg/L) και HG (75 mM) για 48 ώρες, ακολουθούμενη από ανάλυση MTT για τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Όλες οι άλλες αναλύσεις έγιναν υπό τις ίδιες συνθήκες με εύρος συγκέντρωσης εκχυλίσματος BSHX από 20 έως 100 mg/L.

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Κύτταρα PC12 σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίου σε πυκνότητα 3,5 × 103 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από επώαση με εκχύλισμα BSHX (με ή χωρίς HG) για 48 ώρες, το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και προστέθηκε διάλυμα ΜΤΤ (0,5 mg/mL). Μετά από επώαση στους 37 βαθμούς για 4 ώρες, το διάλυμα ΜΤΤ απομακρύνθηκε και τα κύτταρα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για ανακίνηση 5 λεπτών. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών. Κυτταρική βιωσιμότητα ( ποσοστό )=[OD (θεραπεία) – OD (κενό)]/ [OD (μη επεξεργασμένος έλεγχος) – OD (κενό)] × 100 τοις εκατό .

Δοκιμασία LDH

Τα κύτταρα PC12 καλλιεργήθηκαν και διεγέρθηκαν σε κατεργασία εκχυλίσματος HG και BSHX όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στη συνέχεια, η LDH που απελευθερώθηκε από τα κύτταρα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ LDH του εμπορίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. LDH (U/L)=[OD (θεραπεία) – OD (κενό)] / [OD (τυπικό) – OD (κενό)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Χρώση Hoechst 33258 και χρώση AO/EB

Για τη χρώση Hoechst 33258, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) 3 φορές και επωάστηκαν με διάλυμα εργασίας Hoechst 33258 (1 μg/mL) στο σκοτάδι για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (IX73, Olympus, Japan) σε μήκος κύματος διέγερσης 352 nm/μήκος κύματος εκπομπής 461 nm. Για χρώση AO/EB, αφαιρέστε το μέσο από 96-πλάκες φρεατίων και προσθέστε μείγμα AO/EB (100 ug/mL AO και 100 ug/mL EB αναμεμειγμένα) για 5 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS 3 φορές. Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού κάτω από μήκος κύματος διέγερσης 490 nm/μήκος κύματος εκπομπής 530 nm για χρώση ΑΟ και μήκος κύματος διέγερσης 520 nm/μήκος κύματος εκπομπής 590 nm για χρώση ΕΒ.

Ενδοκυτταρική ανίχνευση ROS

Για την ενδοκυτταρική ανίχνευση ROS, τα κύτταρα PC12 σπάρθηκαν σε τρυβλία 6- φρεατίων σε πυκνότητα 5×105 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχύλισμα HG και BSHX για 24 ώρες. Μετά από επώαση 24 ωρών, τα κύτταρα PC12 πλύθηκαν με απαλλαγμένο ορού Dulbecco's τροποποιημένο μέσο Eagle για 3 φορές και προστέθηκαν σε 10μΜ 2', 7'-διχλωροφλουορεσκεΐνη διοξική (DCF-DA), η οποία οξειδώνεται σε φθορίζον 2', 7'-fluores. (DCF) με υδροϋπεροξείδια, στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS 3 φορές και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Το ενδοκυτταρικό επίπεδο του ROS ανιχνεύθηκε με μέτρηση της μέσης έντασης φθορισμού με κυτταρομετρία ροής (BD FACSCaliburTM, ΗΠΑ). Τα μήκη κύματος διέγερσης/εκπομπής ήταν στα 488 / 525 nm. Καταμετρήθηκαν τουλάχιστον 10,000 συμβάντα ανά δείγμα. Οι τιμές εκφράστηκαν ως η μέση απορρόφηση κανονικοποιημένη στο ποσοστό της τιμής ελέγχου.

Δοκιμασία δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης

Η μιτοχονδριακή εκπόλωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ ανάλυσης JC-1. Αφού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχύλισμα HG και BSHX, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα εργασίας JC-1 (1 ×) στους 37 βαθμούς για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, αφαιρέστε το υπερκείμενο και πλύνετε τα κύτταρα 2 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα JC-1 (1 ×). Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού κάτω από μήκος κύματος διέγερσης 460 nm/μήκος κύματος εκπομπής 530 nm για μονομερές JC{10}} (ανιχνεύεται σε κύτταρα με αποπολωμένα μιτοχόνδρια) και μήκος κύματος διέγερσης 520 nm/μήκος κύματος εκπομπής J9{10} }} πολυμερές (υπάρχει στα πολωμένα μιτοχόνδρια). Τα κύτταρα με πράσινο (μονομερικό) φθορισμό θεωρήθηκαν ότι είχαν αποπολωμένα μιτοχόνδρια. Τα κύτταρα με κόκκινο (πολυμερικό) φθορισμό θεωρήθηκαν ότι είχαν φυσιολογικά μιτοχόνδρια.

Ανάλυση Western blot

Τα κύτταρα PC12 συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με έναν αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ 1 χ. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας στις 12,000 rpm για 10 λεπτό στους 4 βαθμούς . Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη δοκιμασία Bradford. Κυττάρο και εμπλουτισμένα με μιτοχόνδρια κλάσματα απομονώθηκαν με το κιτ απομόνωσης μιτοχονδρίων (Pierce, Rockford, ΗΠΑ) για ανάλυση κυτοχρώματος c. Για άλλες πρωτεΐνες, τα ολικά κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (10 τοις εκατό -15 τοις εκατό) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Οι μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό μη λιπαρό γάλα και επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρωτογενή αντισώματα στους 4 βαθμούς για όλη τη νύχτα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με PBST (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικά, 0,1 τοις εκατό Tween 20) τρεις φορές και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν με PBST άλλες τρεις φορές και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας και σαρώθηκαν με το σύστημα ψηφιακού απεικόνισης Kodak (Gel Logic 2200Pro, Kodak, ΗΠΑ).

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Η σημασία των διαφορών μεταξύ των μέσων τιμών προσδιορίστηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.{2}}). Το P < 0.05="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" ελέγχου="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="">

Αποτελέσματα

Το εκχύλισμα BSHX προστατεύει τα κύτταρα PC12 από κυτταρικό τραυματισμό που προκαλείται από HG

Για να διερευνήσουμε εάν το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα PC12 από προσβολή HG, αντιμετωπίσαμε τα κύτταρα PC12 με μια σειρά συγκεντρώσεων εκχυλίσματος BSHX (20, 50 και 100 mg/L) για 48 ώρες υπό συνθήκες HG (75 mM). Η αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ έδειξε ότι η προσβολή HG προκάλεσε σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων PC12 (η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν περίπου 56,9 ± 6,7 τοις εκατό) και ότι η επεξεργασία με εκχύλισμα BSHX απέτρεψε σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αυξήθηκε σε 87,8 ± 9,2 τοις εκατό όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε συν-κατεργασία με εκχύλισμα BSHX (100 mg/L) (Εικόνα 1Α). Η γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) απελευθερώνεται από τα κατεστραμμένα κύτταρα και επομένως μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης κυτταρικής τοξικότητας. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της ανάλυσης MTT, βρήκαμε ότι η προσβολή HG αύξησε σημαντικά την απελευθέρωση LDH από τα κύτταρα PC12 και ότι η θεραπεία με εκχύλισμα BSHX εμπόδισε την απελευθέρωση LDH με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Εικόνα 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το εκχύλισμα BSHX αυξάνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα PC12 που προκαλούνται από HG.

Το εκχύλισμα BSHX αναστέλλει την απόπτωση των κυττάρων PC12 μέσω της εξαρτώμενης οδού κασπάσης-9/3-

Για να προσδιορίσουμε την επίδραση του εκχυλίσματος BSHX στην απόπτωση των κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε τη χρωστική DNA Hoechst 33258 ως ευαίσθητη δοκιμασία για απόπτωση. Οι πυρήνες των φυσιολογικών κυττάρων που χρωματίστηκαν από το Hoechst 33258 έδειξαν ομοιόμορφο μπλε φθορισμό, ενώ τα αποπτωτικά κύτταρα με πυρηνικό σύννεφο χρωματίνης έδειξαν υπερχρωματικά και πυκνά φθορίζοντα σωματίδια. Το ποσοστό της απόπτωσης υπολογίστηκε σύμφωνα με τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων έναντι του συνολικού αριθμού κυττάρων. Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι η προσβολή HG (75 mM) αύξησε δραματικά την αναλογία αποπτωτικών κυττάρων (51,7 ± 4,3 τοις εκατό) και η θεραπεία με εκχύλισμα BSHX προστατεύει σημαντικά από την επαγόμενη από HG απόπτωση σε κύτταρα PC12 (Εικόνα 2Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχθηκαν περαιτέρω από ανάλυση διπλής χρώσης AO/EB. Το AO εισέρχεται τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα αποπτωτικά κύτταρα και εκπέμπει πράσινο φθορισμό ενώ το EB εισέρχεται μόνο στα αποπτωτικά κύτταρα και εκπέμπει κόκκινο φθορισμό [13]. Η ανάλυση AO/EB έδειξε ότι το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά μετά από προσβολή HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 τοις εκατό) και μειώθηκε κατά την επεξεργασία με εκχύλισμα BSHX σε κύτταρα PC12 (Εικόνα 2Β), υποδηλώνοντας ότι το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε αποτελεσματικά αναστέλλουν την απόπτωση των κυττάρων PC12 που προκαλείται από HG.

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την επίδραση του εκχυλίσματος BSHX στο μονοπάτι της κασπάσης-3/PARP, μια σημαντική οδό για την απόπτωση που σχετίζεται με τα μιτοχόνδρια [14]. Το Western blot αποκάλυψε ότι η προσβολή HG (75 mM) αύξησε σημαντικά τις εκφράσεις των ενεργών μορφών κασπάσης-3 και PARP και μείωσε τις εκφράσεις ολικής κασπάσης-3 και PARP στα κύτταρα PC12 και αυτό το αποτέλεσμα αντιστράφηκε σημαντικά με θεραπεία με εκχύλισμα BSHX (Εικόνα 2Γ), υποδηλώνοντας ότι το εκχύλισμα BSHX προστατεύει αποτελεσματικά τα κύτταρα PC12 από την απόπτωση μέσω της ρύθμισης της οδού κασπάσης{10}}/PARP που εξαρτάται από τα μιτοχόνδρια.

Το εκχύλισμα BSHX αναστέλλει την ενδοκυτταρική παραγωγή ROS σε κύτταρα PC12 που προκαλούνται από HG

Δεδομένου ότι το HG θα μπορούσε να ενισχύσει το σχηματισμό ενδοκυτταρικών ROS [15], δοκιμάσαμε το επίπεδο των ενδοκυτταρικών ROS για να προσδιορίσουμε εάν το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να αναστείλει τη δημιουργία ROS. Παρατηρήθηκε 3,{2}}πλάσια αύξηση στη μέση ένταση φθορισμού που παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC12 που εκτέθηκαν σε 75 mM HG για 48 ώρες σε σύγκριση με τον έλεγχο. Αντίθετα, η ταυτόχρονη θεραπεία με εκχύλισμα BSHX μείωσε σημαντικά τη μέση ένταση φθορισμού σε περίπου 0.76-, 0.{{10}} και 0.{ {12}} φορές της ομάδας μοντέλων, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να αναστείλει την παραγωγή ROS που προκαλείται από HG (Εικόνες.3Α, Β).

Το εκχύλισμα BSHX διατηρεί τη μιτοχονδριακή ομοιόσταση σε κύτταρα PC12 που προκαλούνται από HG ρυθμίζοντας την έκφραση Bax και Bcl-2

Το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης είναι μια σημαντική παράμετρος της μιτοχονδριακής λειτουργίας που χρησιμοποιείται ως δείκτης της υγείας των κυττάρων. Το JC-1 είναι μια λιπόφιλη, κατιονική χρωστική που μπορεί να εισέλθει επιλεκτικά στα μιτοχόνδρια και να αλλάξει αναστρέψιμα το χρώμα από πράσινο σε κόκκινο καθώς αυξάνεται το δυναμικό της μεμβράνης. Σε υγιή κύτταρα με υψηλό δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, το JC-1 σχηματίζει αυθόρμητα σύμπλοκα γνωστά ως J-συσσωματώματα με έντονο κόκκινο φθορισμό. Από την άλλη πλευρά, σε αποπτωτικά κύτταρα με χαμηλό δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, το JC-1 παραμένει στη μονομερή μορφή, η οποία δείχνει μόνο πράσινο φθορισμό [16, 17]. Η αναλογία του πράσινου φθορισμού προς τον κόκκινο φθορισμό μπορεί επομένως να αντανακλά την εκπόλωση των μιτοχονδρίων. Στη μελέτη μας, ο αριθμός των κυττάρων με αποπολωμένα μιτοχόνδρια (πράσινος φθορισμός) αυξήθηκε σημαντικά μετά από HG (75 mM) για 48 ώρες και αυτή η αύξηση αντιστράφηκε με επεξεργασία με εκχύλισμα BSHX με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Εικόνα 4Α).

Στη συνέχεια ανιχνεύσαμε τις μιτοχονδριακές και κυτταροπλασματικές κατανομές του κυτοχρώματος c, ενός βασικού παράγοντα στο μονοπάτι της απόπτωσης που εξαρτάται από την κασπάση ενεργοποίησης. Βρήκαμε ότι η προσβολή HG (75 mM) για 48 ώρες προκάλεσε μια δραματική μετατόπιση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα και αυτή η μετατόπιση αποφεύχθηκε σημαντικά με την επεξεργασία με εκχύλισμα BSHX (Εικόνα 4Β), υποδεικνύοντας ότι το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να αναστείλει την απελευθέρωση του κυτόχρωμα c από μιτοχόνδρια.

Επιπλέον, οι πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 είναι σημαντικοί ρυθμιστές διαφόρων αποπτωτικών οδών. Το Bcl-2 μπορεί να αναστείλει την κυτταρική απόπτωση που προκαλείται από μια ποικιλία κυτταροτοξικών παραγόντων και είναι ο αναστολέας της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα. Ωστόσο, ο Bax, ως μέλος της οικογένειας Bcl-2, είναι ένας παράγοντας προ-απόπτωσης. Όταν προκαλείται απόπτωση, το Bax μεταναστεύει από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια και καταστρέφει τη μιτοχονδριακή ακεραιότητα [5, 18]. Στη μελέτη μας, το επίπεδο πρωτεΐνης του Bcl-2 μειώθηκε και το Bax ρυθμίστηκε προς τα πάνω με προσβολή HG (75 mM) για 48 ώρες, αυτό το αποτέλεσμα αντιστράφηκε ανάλογα με τη συγκέντρωση από το εκχύλισμα BSHX (Εικόνα 4C). Όλα αυτά τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το εκχύλισμα BSHX προστάτευσε τα κύτταρα PC12 από την επαγόμενη από το HG μιτοχονδριακή εκπόλωση ρυθμίζοντας την έκφραση των Bax και Bcl-2.

Επίδραση του εκχυλίσματος BSHX στην απόπτωση των κυττάρων μέσω σηματοδοτικών μονοπατιών JNK/p38 MAPK

Ορισμένες μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη παραγωγή ROS έχει συσχετιστεί με την ενεργοποίηση των μονοπατιών MAPK, για την ενεργοποίηση της κυτταρικής απόπτωσης9 [19, 20]. Διερευνήσαμε λοιπόν την επίδραση του εκχυλίσματος BSHX στο μονοπάτι σηματοδότησης της ενεργοποιημένης πρωτεϊνικής κινάσης από μιτογόνο (MAPK) για να προσδιορίσουμε εάν το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να μετριάσει την απόπτωση που προκαλείται από HG. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η προσβολή HG (75 mM) για 48 ώρες αύξησε τις φωσφορυλιώσεις της c-Jun NH2-τελικής κινάσης (JNK) και της ρ38 σε κύτταρα PC12, οι οποίες αναστέλλονταν σημαντικά από το εκχύλισμα BSHX σε συγκέντρωση- εξαρτημένο τρόπο. Ωστόσο, παρόμοιο αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε με την εξωκυτταρική ρυθμιζόμενη πρωτεϊνική κινάση (ERK) MAPK. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να αναστείλει την επαγόμενη από HG απόπτωση των κυττάρων μέσω των οδών σηματοδότησης JNK/p38 MAPK.

Συζήτηση

Η διαβητική εγκεφαλοπάθεια (ΔΕ) είναι μια συχνή επιπλοκή του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2). Μπορεί να προκαλέσει γνωστική έκπτωση του εγκεφάλου και αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου θνησιμότητας και αναπηρίας σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 παγκοσμίως [3]. Επομένως, είναι κρίσιμο να μελετηθεί ο μηχανισμός της ΔΕ καθώς και οι στρατηγικές πρόληψης και θεραπείας.

Στην Κίνα, τα παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα (TCM) χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του ΣΔ για πολλά χρόνια και έχουν δείξει θεραπευτική δράση. Ορισμένες κλινικές μελέτες υποδεικνύουν ότι τα TCM που βασίζονται στη θρέψη των νεφρών και στις στρατηγικές ενεργοποίησης του αίματος μπορούν να μειώσουν τη γλυκόζη του αίματος, να προάγουν την κυκλοφορία και να βελτιώσουν τη γνωστική δυσλειτουργία του εγκεφάλου. Η συνταγή BSHX είναι αντιπροσωπευτική αυτών των TCM. Η προκαταρκτική κλινική μας μελέτη έδειξε ότι η συνταγογράφηση BSHX θα μπορούσε να βελτιώσει αποτελεσματικά τη γλυκόζη του αίματος, την ομοκυστεΐνη (HCY) και την υψηλής ευαισθησίας C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (hs-CPR) στον ορό και να βελτιώσει τη γνωστική λειτουργία των διαβητικών ασθενών με ήπια γνωστική εξασθένηση (MCI). [12]. Ωστόσο, υπάρχει έλλειψη στοιχείων που να αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα και τον φαρμακολογικό μηχανισμό μέχρι στιγμής.

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να μειώσει τη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας που προκαλείται από το HG, όπως μετρήθηκε με τον προσδιορισμό MTT, LDH. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω την προστατευτική επίδραση του εκχυλίσματος BSHX στη βιωσιμότητα των κυττάρων, μελετήσαμε την απόπτωση με Hoechst 33258 και ανάλυση χρώσης AO/EB. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά την απόπτωση που προκαλείται από HG. Ως δείκτης απόπτωσης, η κασπάση-3 και η PARP αυξήθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία με HG, αλλά η ενεργοποίηση αυτών των προ-αποπτωτικών παραγόντων ανεστάλη από το εκχύλισμα BSHX με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση. Τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι το εκχύλισμα BSHX είχε προστατευτική επίδραση στη βλάβη των κυττάρων PC12 που προκαλείται από HG.

Το ROS σχηματίζεται κατά τη διαδικασία της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης των κυττάρων και η αύξηση της παραγωγής του ή η βλάβη των αντιοξειδωτικών συστημάτων μπορεί να οδηγήσει σε οξειδωτικό στρες στα κύτταρα [21]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η υψηλή γλυκόζη θα μπορούσε να προκαλέσει τη συσσώρευση ενδοκυτταρικών ROS και τελικά μια ενεργή οδό αποπτωτικής σηματοδότησης. Και ο κοινός μηχανισμός των διαβητικών επιπλοκών είναι το οξειδωτικό στρες [22, 23]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υψηλή γλυκόζη θα μπορούσε να οδηγήσει σε αύξηση του ROS στα κύτταρα PC12, κάτι που ήταν σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες [24]. Εικάζεται ότι η τοξικότητα της υψηλής γλυκόζης στα κύτταρα μπορεί να επιτευχθεί μέσω της επαγόμενης από το ROS απόπτωσης. Τα μιτοχόνδρια είναι οι κύριες θέσεις παραγωγής ενδοκυτταρικών ROS και το κύριο όργανο-στόχος για επίθεση ROS επίσης [25]. Υπό παθολογικές συνθήκες, η ταχεία αύξηση του ROS μπορεί να οδηγήσει σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, κατάρρευση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και τελικά να οδηγήσει σε απόπτωση των κυττάρων [26]. Έτσι, εντοπίσαμε την ακεραιότητα των μιτοχονδρίων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υψηλή γλυκόζη μείωσε σημαντικά το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, αύξησε την αναλογία Bax/Bcl-2 που έλεγχε τον διακόπτη του μεταβατικού πόρου της μιτοχονδριακής διαπερατότητας (MPTP) και προώθησε τη διαρροή του κυτοχρώματος c, ενώ το εκχύλισμα BSHX μπορούσε αντιστρέψουν αυτές τις αλλαγές. Αυτά υποδηλώνουν ότι η νευροπροστατευτική δράση του εκχυλίσματος BSHX έναντι των επαγόμενων από HG κυττάρων PC12 μπορεί να προκύψει από τη διατήρηση της ακεραιότητας των μιτοχονδρίων.

Το μονοπάτι σηματοδότησης MAPK παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην κυτταρική απόπτωση. Τα JNK, ERK και p38 MAPK είναι τα πιο μελετημένα μέλη της οικογένειας MAPK. Ο κύριος τρόπος δράσης τους είναι να φωσφορυλιώνουν τις συγκεκριμένες θέσεις τους, ρυθμίζοντας έτσι την κυτταρική απόπτωση [8, 27, 28]. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερβολική παραγωγή ROS μπορεί να προκαλέσει φωσφορυλίωση του p38MAPK [29-31] και το ROS μπορεί να προκαλέσει ή να μεσολαβήσει στην ενεργοποίηση των μονοπατιών MAPK [32]. Αρκετά κυτταρικά ερεθίσματα που προκαλούν παραγωγή ROS επίσης παράλληλα μπορούν να ενεργοποιήσουν τις οδούς MAPK σε πολλαπλούς τύπους κυττάρων [32, 33]. Οι πιθανοί μηχανισμοί για την ενεργοποίηση της MAPK από το ROS μπορεί να περιλαμβάνουν την αδρανοποίηση και αποικοδόμηση των φωσφατάσης MAPK που διατηρούν την οδό σε ανενεργή κατάσταση [19]. Από την άλλη πλευρά, για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω εάν οι οδοί MAPK ενεργοποιήθηκαν από τη δημιουργία ROS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αντιοξειδωτικά (π.χ. NAC, σαρωτής ROS) για να αποτραπεί η συσσώρευση ROS. Και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση της MAPK είχε σχεδόν ανασταλεί μετά από κυτταρική διέγερση με κυτταρικά ερεθίσματα [32, 33], υποδεικνύοντας τη συμμετοχή της αδρανοποίησης ROS των οδών MAPK. Επιπλέον, μελέτες έδειξαν ότι όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον ειδικό αναστολέα JNK SP600125, η απόπτωση που προκαλείται από την Καρδιοτοξίνη III θα μπορούσε να αποκλειστεί [34]. Η προηγούμενη μελέτη μας βρήκε ότι η τροποποιημένη συνταγή Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση του MAPK ERK/p38 σε μικρογλοία BV2 που ενεργοποιείται με A [10]. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το εκχύλισμα BSHX θα μπορούσε να αναστείλει τη φωσφορυλίωση του JNK και του p38 MAPK και δεν πετύχαμε το ίδιο αποτέλεσμα με το p-ERK. Υποθέτουμε ότι οι βδέλλες παίζουν διαφορετικό ρόλο στο εκχύλισμα BSHX. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ένας άλλος προστατευτικός μηχανισμός του εκχυλίσματος BSHX έναντι της απόπτωσης σε κύτταρα PC12 που προκαλούνται από HG μπορεί να είναι μέσω της ρύθμισης των μονοπατιών σηματοδότησης JNK/p38 MAPK.

συμπέρασμα

Το εκχύλισμα BSHX, μια πολυβοτανική φόρμουλα, δείχνει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα στα κύτταρα PC12 έναντι της προσβολής HG. Το εκχύλισμα BSHX ανέστειλε αποτελεσματικά την επαγόμενη από HG απόπτωση των κυττάρων PC12 μέσω της μείωσης της παραγωγής ενδοκυτταρικού ROS, της διατήρησης της ακεραιότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης και του αποκλεισμού των οδών σηματοδότησης κασπάσης-3 και JNK/p38 MAPK (Εικόνα 6). Συλλογικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το εκχύλισμα BSHX είναι ένας πολλά υποσχόμενος παράγοντας για τη θεραπεία της ΔΕ σε κλινικές εφαρμογές.

Συνεισφορές συγγραφέα

Σχεδίασε και σχεδίασε τα πειράματα: Zeng KW, Wang XM. Πραγματοποίησε το πείραμα: Zhao SY. Ανάλυσε τα δεδομένα: Zhao SY, Zeng KW και Wang XM. Συνεισφέρθηκαν αντιδραστήρια/υλικά/ εργαλεία ανάλυσης: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW και Wang XM. Έγραψε ο πατέρας: Zhao SY.

βιβλιογραφικές αναφορές

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Ο διαβητικός εγκέφαλος και η γνώση. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Χαμέντ Α.Ε. Εγκεφαλική βλάβη με σακχαρώδη διαβήτη: στοιχεία, μηχανισμοί και συνέπειες θεραπείας. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Η Θεωρία της «Μεταβολικής Μνήμης» και η Πρώιμη Αντιμετώπιση της Υπεργλυκαιμίας στην Πρόληψη των Διαβητικών Επιπλοκών. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen Α. Το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψm) στην απόπτωση. μια ενημέρωση. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Συνδέοντας τη μιτοχονδριακή δυναμική και τα συμβάντα ζωής ή θανάτου μέσω πρωτεϊνών οικογένειας Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi Ρ, Scorrano L, Colonna R, et αϊ. Μιτοχόνδρια και κυτταρικός θάνατος. Μηχανιστικές πτυχές και μεθοδολογικά ζητήματα. Feb J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et αϊ. 1,25-(OH)2D3 αναστέλλει την απόπτωση που προκαλείται από υψηλή γλυκόζη και την παραγωγή ROS σε ανθρώπινα περιτοναϊκά μεσοθηλιακά κύτταρα μέσω της οδού MAPK/P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang Η, Schaefer Ε, et αϊ. Η προεπεξεργασία με αυξητικό παράγοντα νεύρων εξασθενεί την επαγόμενη από στέρηση οξυγόνου και γλυκόζης την αμινοτελική κινάση 1 c-Jun και την ενεργοποίηση των κινασών p38 και p38 που ενεργοποιούνται από το στρες και παρέχει νευροπροστασία στο μοντέλο PC12 του φαιοχρωμοκυτώματος. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, et αϊ. Συμμετοχή της κασπάσης-3 και της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεΐνης κινάσης ρ38 σε απόπτωση που προκαλείται από χλωριούχο κοβάλτιο σε κύτταρα PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Αντινευροφλεγμονώδεις Επιδράσεις της Τροποποιημένης Συνταγογράφησης Wu-Zi-Yan-Zong σε μικρογλοία BV2 που διεγείρεται από αμυλοειδές μέσω των μονοπατιών σηματοδότησης NF-κB και ERK/p38 MAPK. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang Τ, Fu Η, et αϊ. Η τροποποιημένη συνταγή Wu-Zi-Yan-Zong, μια παραδοσιακή κινεζική φόρμουλα πολυβοτάνων, καταστέλλει τις νευροφλεγμονώδεις διεργασίες που προκαλούνται από λιποπολυσακχαρίτες σε αστροκύτταρα αρουραίου μέσω σηματοδοτικών μονοπατιών NF-κB και JNK/p38 MAPK. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu Η, Lin WW, Wang Η, et αϊ. Επίδραση της συνταγής Bushen Huoxue στη θεραπεία της ήπιας γνωστικής βλάβης του διαβήτη τύπου 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Ανάλυση απόπτωσης που προκαλείται από κυκλοεξιμίδιο σε ανθρώπινα λευκοκύτταρα: Μικροσκόπηση φθορισμού χρησιμοποιώντας αννεξίνη V/ιωδιούχο προπίδιο έναντι πορτοκαλιού ακριδίνης/βρωμιούχου αιθιδίου. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto Α, Kumar S, et al. Οι κασπάσεις συνδέουν τη σηματοδότηση κυτταρικού θανάτου με την οργανική ομοιόσταση. Immunity 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Οξείδιο του αζώτου: ένας βασικός παράγοντας πίσω από τη δυσλειτουργικότητα των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων σε σακχαρώδη διαβήτη τύπου-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman Α, Wachtel C, Cohen Μ, et αϊ. JC-1: Τα εναλλακτικά μήκη κύματος διέγερσης διευκολύνουν την κυτταρομετρία του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Ανιχνευτές δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης και η βαθμίδα πρωτονίων: ένας πρακτικός οδηγός χρήσης. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Πώς οι πρωτεΐνες BCL-2 επάγουν τη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων; Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Υ, Cheong ΥΚ, Kim NH, et αϊ. Πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιημένες από μιτογόνο και δραστικά είδη οξυγόνου: πώς μπορούν τα ROS να ενεργοποιήσουν τις οδούς MAPK; J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Ζ, Chen F, et αϊ. Οι αρωματικοί ετεροκυκλικοί εστέρες της ποδοφυλλοτοξίνης ασκούν αντι-MDR δράση σε κύτταρα ανθρώπινης λευχαιμίας K562/ADR μέσω της οδού σηματοδότησης ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen Κ, White AR, Koistinaho J, et αϊ. Στόχευση κινάσης συνθάσης γλυκογόνου-3 για θεραπευτικό όφελος κατά του οξειδωτικού στρες στη νόσο του Αλτσχάιμερ: Συμμετοχή της οδού Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev ΜΑ, Strokov ΙΑ, Novikov VV, et al. Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες στη διαβητική νευροπάθεια: Δημιουργία ειδών ελεύθερων ριζών στην αντίδραση γλυκαίωσης και πολυμορφισμοί γονιδίων που κωδικοποιούν αντιοξειδωτικά ένζυμα στη γενετική ευαισθησία στη διαβητική νευροπάθεια σε πληθυσμό διαβητικών ασθενών τύπου Ι. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino ΡΗ, Dos ΡΑ, et αϊ. Κυτταρικός θάνατος, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και διαβητικές επιπλοκές. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen Κ, Zhang Μ, Chen BD, et αϊ. Η Ginkgolide B αναστέλλει την απόπτωση σε ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινης ομφαλικής φλέβας που διεγείρονται με υψηλή γλυκόζη. Chinese Pharmacological Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi Τ, et al. Επιβλαβής Ρόλος της Δισμουτάσης Υπεροξειδίου στον Μιτοχονδριακό Διαμεμβρανικό Χώρο. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται από μιτογόνο: νέα μονοπάτια σηματοδότησης που λειτουργούν στις κυτταρικές αποκρίσεις στο περιβαλλοντικό στρες. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu Ν, Lin X, Zhao X, et αϊ. Το MiR-125b δρα ως ογκογονίδιο στα κύτταρα του γλοιοβλαστώματος και αναστέλλει την απόπτωση των κυττάρων μέσω των ανεξάρτητων από το p53 και p38MAPK μονοπατιών. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang Η, et αϊ. Τα προηγμένα τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης προκαλούν απόπτωση των ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς μέσω της δημιουργίας αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και της ενεργοποίησης των μονοπατιών JNK και p38 MAPK. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung Η, Kim Ε, Lee DH, et αϊ. Η γκρελίνη αναστέλλει την απόπτωση στα νευρωνικά κύτταρα του υποθαλάμου κατά τη διάρκεια της στέρησης οξυγόνου-γλυκόζης. Endocrinology 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A μεταβάλλει τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου και επάγει την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης p38MAPK που εξαρτάται από το είδος του οξυγόνου στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF-7. Tumor Biology 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et αϊ. Οξειδωτικός τραυματισμός που προκαλείται από ROS που εμπλέκεται στην Παθογένεση της Μυκητιασικής Κερατίτιδας μέσω της ενεργοποίησης της p38 MAPK. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Ενεργοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης της κινάσης MAP που προκαλείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redox signaling and the MAP kinase pathways. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Η καρδιοτοξίνη III προκαλεί απόπτωση εξαρτώμενη από την C-jun N-τερματική κινάση σε κύτταρα HL{4}} ανθρώπινης λευχαιμίας. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.