Νευροπροστατευτικά οφέλη της άσκησης και του MitoQ στη λειτουργία της μνήμης, τη μιτοχονδριακή δυναμική, το οξειδωτικό στρες και τη νευροφλεγμονή σε γηρασμένους αρουραίους που προκαλούνται από D-γαλακτόζη Μέρος 2

2.6. Προετοιμασία ιστού

Μετά την ολοκλήρωση 8 εβδομάδων ΤΕ και δοκιμών συμπεριφοράς μνήμης, όλοι οι αρουραίοι υπέστησαν ευθανασία με εισπνοή CO2 και συλλέχθηκαν εγκεφαλικοί ιστοί από 7 ζώα σε κάθε ομάδα θεραπείας.

Το τεστ συμπεριφοράς μνήμης είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την αξιολόγηση της μνήμης. Με την αυξανόμενη κοινωνική και εργασιακή πίεση, η μνήμη των ανθρώπων γίνεται όλο και πιο σημαντική. Επομένως, η λήψη ενός τεστ συμπεριφοράς μνήμης μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε το επίπεδο μνήμης μας και να λάβουμε αποτελεσματικά μέτρα για τη βελτίωση και τη διατήρηση της μνήμης μας σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δοκιμής.

Συγκεκριμένα, τα τεστ συμπεριφοράς μνήμης μπορούν να αξιολογήσουν την ικανότητα των ανθρώπων να λαμβάνουν, να επεξεργάζονται, να αποθηκεύουν και να ανακτούν πληροφορίες. Μέσω της δοκιμής διαφορετικών τύπων πληροφοριών, όπως γλώσσα, αριθμοί, εικόνες κ.λπ., μπορεί να ελεγχθεί πλήρως η μνήμη των ανθρώπων. Τα αποτελέσματα του τεστ θα παρέχουν διάφορες βαθμολογίες για να μας βοηθήσουν να κατανοήσουμε τις αδυναμίες και τα δυνατά μας σημεία και πώς να ενισχύσουμε τη μνήμη μας.

Στην πράξη, πολλά τεστ συμπεριφοράς μνήμης παρέχουν επίσης επαγγελματικές συμβουλές και προτάσεις. Για παράδειγμα, ο καλός ύπνος, η ισορροπημένη διατροφή, η σωστή άσκηση και οι τακτικές ασκήσεις του εγκεφάλου είναι όλα ευεργετικά για τη βελτίωση της μνήμης των ανθρώπων. Μέσω αυτών των μεθόδων, μπορούμε να βελτιώσουμε το χρόνο διατήρησης της μνήμης μας, την ικανότητα αναπαραγωγής μνήμης και άλλες πτυχές, ώστε να προσαρμοστούμε καλύτερα στην καθημερινή ζωή ή στις εργασιακές ανάγκες.

Εν ολίγοις, ένα τεστ συμπεριφοράς μνήμης είναι πολύ χρήσιμο για την κατανόηση, την αξιολόγηση και τη βελτίωση της μνήμης κάποιου. Θα πρέπει επίσης να υιοθετήσουμε κατάλληλες μεθόδους για να ενισχύσουμε τη μνήμη μας σύμφωνα με την πραγματική μας κατάσταση, για να βάλουμε γερές βάσεις για μια πιο ικανοποιητική και πλούσια ζωή. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή το Cistanche είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό με πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η επίδραση του Cistanche προέρχεται από τα διάφορα ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με διάφορους τρόπους.

Κάντε κλικ στην επιλογή Γνωρίστε τη βραχυπρόθεσμη μνήμη πώς να βελτιώσετε

Μετά τον διαχωρισμό του εγκεφαλικού φλοιού και του ιππόκαμπου, ο εγκεφαλικός ιστός καταψύχθηκε αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκε στους -80 ◦C μέχρι την ανάλυση. Τα υπόλοιπα 5 ζώα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση ανοσοϊστοχημείας (IHC).

Μετά το άνοιγμα της θωρακικής κοιλότητας, 50 mM ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) διήλθε μέσω της αριστερής κοιλίας για 10 λεπτά, και στη συνέχεια το ζώο εγχύθηκε με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε 100 mM PBS.

στερέωση μετά την έγχυση, ο εγκέφαλος συλλέχτηκε, τοποθετήθηκε σε 4% PFA και σταθεροποιήθηκε για 4 ώρες στους 4 ◦C. Ο σταθεροποιημένος εγκεφαλικός ιστός βυθίστηκε σε διάλυμα σακχαρόζης 30% για 2 ημέρες και στη συνέχεια κόπηκε σε φέτες πάχους 40 μm χρησιμοποιώντας έναν κρυοστάτη ( Leica Microsystems, Nussloch, Γερμανία).

2.7. Απομόνωση μιτοχονδρίων

Για την απομόνωση των μιτοχονδρίων, χρησιμοποιήσαμε κιτ εξαγωγής μιτοχονδρίων (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για κάθε 100 mg ιστού ιππόκαμπου, προστέθηκε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης.

Μετά την ομογενοποίηση, ο ιστός φυγοκεντρήθηκε στα 900 × g για 10 λεπτά στους 4 ◦C, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε ξανά στους 15, 000 × g για 30 λεπτά στους 4 ◦C.

Λαμβάνοντας το φυγοκεντρημένο κυτοσολικό κλάσμα, το κυτοσόλιο διαχωρίστηκε και το υπόλοιπο ίζημα αναμείχθηκε επιμελώς σε ρυθμιστικό διάλυμα εναιωρήματος 1 mLof, πριν φυγοκεντρηθεί στους 15,000× g για 10 λεπτά στους 4 ◦C.

Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και προστέθηκε άλλο 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος εναιωρήματος πριν αναμιχθεί επιμελώς και φυγοκεντρηθεί ξανά στους 15,000× g για 10 λεπτά στους 4 ◦C.

Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και το υπόλοιπο ίζημα διαλύθηκε σε 1 mL πλήρους ρυθμιστικού διαλύματος μιτοχονδριακής λύσης για 30 λεπτά στους 4 ◦C. Το μιτοχονδριακό εκχύλισμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στους 15,000× g για 5 λεπτά στους 4°C και το υπερκείμενο (μιτοχονδριακό κλάσμα) συλλέχθηκε.

2.8. Δυτική Κηλίδα
Η συνολική πρωτεΐνη που λήφθηκε με μιτοχονδριακή απομόνωση προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford. Μια ίση ποσότητα μιτοχονδριακών πρωτεϊνών (30 μg ανά διαδρομή) φορτώθηκε σε ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) (8% ή 12%).

Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA).

Ο αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας 1×Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα που περιέχει διάλυμα Tween-20 (TBS-T) με 5% BSA και στη συνέχεια η μεμβράνη αντέδρασε με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ◦C.

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, καταλάση και -ακτίνη (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, αραίωση:1: :1000); και TNF- (Abcam, Cambridge, UK, αραίωση: 1:1000).

Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (PBS με 0.1% Tween 20), μετά από το οποίο επωάστηκαν με συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου (HRP) δευτερογενή αντισώματα κατσίκας κατά κουνελιού forp22 phox, gp91 phox και TNF - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, αραίωση: 1:5000).

Δευτερεύοντα αντισώματα κατσίκας κατά ποντικού συζευγμένα με HRP χρησιμοποιήθηκαν για Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, καταλάση και -ακτίνη (Santa Cruz Biotechnology, αραίωση: 1:5000).

Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης κηλίδωσης Western ECL (Santa Cruz Biotechnology). Οι πυκνότητες των αναπτυγμένων ζωνών πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης γέλης ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.9. Ανοσοϊστοχημεία (IHC)
Για ανάλυση IHC, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ελεύθερης επίπλευσης για τον επιλεγμένο ιστό σε κάθε ομάδα θεραπείας. Μετά από πλύση του ιστού 3× για 10 λεπτά το καθένα σε 0,01 M PBS, ο ιστός επωάστηκε στους 80 ◦C για 60 λεπτά σε ποτήρι ζέσεως που περιείχε 0,01 M κιτρικό νάτριο, ακολουθούμενο από αποκλεισμό σε 10% κανονικός ορός γαϊδάρου (Millipore Sigma, Burlington, MA, ΗΠΑ).

Το δείγμα του ιστού στη συνέχεια αντέδρασε με πρωτογενή αντισώματα anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, αραίωση: 1:50}0) και αντιγλοιακή ινιδιακή όξινη πρωτεΐνη (GFAP) (Abcam, αραίωση: 1:500) για 12 h στους 4 ◦C. Την επόμενη ημέρα, ο ιστός πλύθηκε 3x για 5 λεπτά κάθε σε 0,01 Μ PBS και στη συνέχεια αντέδρασε με συζευγμένο με HRP δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας κατά ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, αραίωση: 1:5000) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες.

Τέλος, ο ιστός επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας διάλυμα κιτ Vectastain-Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) και τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ υποστρώματος DABPeroxidase (Vector Laboratories).

Κάθε φέτα ιστού τοποθετήθηκε σε ένα πλακίδιο χρησιμοποιώντας ένα μέσο στήριξης (Vector Laboratories) και επιθεωρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός (Leica Microsystems).

2.10. Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS για Windows Έκδοση 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA. Οι δοκιμές post hoc Bonferroni χρησιμοποιήθηκαν για πολλαπλές συγκρίσεις. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές στο p < 0.05.

3. Αποτελέσματα

3.1. Επιδράσεις της άσκησης σε διάδρομο και του MitoQ στην έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή δυναμική στον ιππόκαμπο γηρασμένων αρουραίων που προκαλούνται από D-Gal

Επαληθεύσαμε ότι το TE και το MitoQ επηρέασαν παράγοντες που σχετίζονται με τη σύντηξη των μιτοχονδρίων (Mfn1, Mfn2, Opa1) και τους παράγοντες που σχετίζονται με τη σχάση (Drp1, Fis1) στον ιππόκαμπο των γηρασμένων αρουραίων (Εικόνα 1).

Τα επίπεδα έκφρασης των παραγόντων που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή σύντηξη διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Mfn1, F4,34=134.750, p < 0.001· Mfn2, F4,34=80. 816, p < 0,001; Opa1, F4,34=51.456, p=0.001).

Τα επίπεδα έκφρασης των παραγόντων που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή σχάση διέφεραν επίσης σημαντικά μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 ,313, p < 0,001). Τα αποτελέσματα των δοκιμών post hoc φαίνονται στο σχήμα 1.

Σε σύγκριση με την ομάδα Y-CON, η έκφραση των παραγόντων που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή σύντηξη μειώθηκε στην ομάδα D-CON και έδειξε αυξητικές τάσεις στις ομάδες D-TE, D-MI και D-COMBI.

Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του παράγοντα Drp1 που σχετίζεται με τη μιτοχονδριακή σχάση αυξήθηκε στην ομάδα D-CON σε σύγκριση με την ομάδα Y-CON. Ενώ τα σήματα μιτοχονδριακής σχάσης μειώθηκαν με συνδυαστική θεραπεία με ΤΕ, η θεραπεία με MitoQ από μόνη της δεν προκάλεσε σημαντική αλλαγή.

Ο άλλος παράγοντας που σχετίζεται με τη μιτοχονδριακή σχάση, ο Fis1, έδειξε τις ίδιες φθίνουσες τάσεις με το Drp1, αλλά επίσης μειώθηκε μόνο με τη θεραπεία με MitoQ.

Σχήμα 1. Επίδραση της άσκησης σε διάδρομο και της μιτοκινόνης (MitoQ) στην έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή δυναμική στον ιππόκαμπο γηράσκων αρουραίων που προκαλούνται από D-γαλακτόζη (D-gal). (Α) Αντιπροσωπευτικά στυπώματα Western μιτοχονδριακής σύντηξης και πρωτεϊνών που σχετίζονται με σχάση. (B–F) Πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών στυπώματος Western που κανονικοποιήθηκαν σε -Ακτίνη. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο στύπωμα Western είναι μέσα από επτά εγκεφάλους αρουραίων.

-Η ακτίνη διερευνήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Το Bonferroni post hoc test χρησιμοποιήθηκε μετά την ANOVA. Οι τιμές είναι μέσα ± SEM.

a Δηλώνει στατιστική διαφορά από την ομάδα νεαρών ομάδων ελέγχου (Y-CON). b Δηλώνει στατιστική διαφορά από την ομάδα της ομάδας D-γαλακτόζης (D-CON). c Δηλώνει στατιστική διαφορά από την ομάδα άσκησης D-γαλακτόζης συν διάδρομο (D-TE).

d Δηλώνει στατιστική διαφορά από την ομάδα D-γαλακτόζη συν MitoQ (D-MI) (p < 0.05). D-COMBI; D-γαλακτόζη συν ΤΕ και ομάδα MitoQ.

3.2. Επιδράσεις της άσκησης σε διάδρομο και του MitoQ στην έκφραση των υπομονάδων οξειδάσης NADPH στον εγκεφαλικό φλοιό και στον ιππόκαμπο γηρασμένων αρουραίων που προκαλούνται από D-Gal

Παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας στην ανοσοαντιδραστικότητα του p22 phox στον εγκεφαλικό φλοιό και στον ιππόκαμπο γηρασμένων αρουραίων (Εικόνα 2) (CA3,F4,24=18.786, p < 0.{{11} }}01; φλοιός, F4,24=12.662, p <0,001).

Στον φλοιό, οι ομάδες D-CON παρουσίασαν αυξημένη ανοσοαντιδραστικότητα του p22 phox σε σύγκριση με την ομάδα Y-CON, η οποία μειώθηκε σημαντικά στις ομάδες D-TE, D-MI και D-COMBI.

Στο CA3, η αυξημένη ανοσοαντιδραστικότητα του p22 phox μειώθηκε στις ομάδες D-TE και D-COMBI σε σύγκριση με το D-CON. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης των υπομονάδων NOX p22 phox, gp91 phox και p47phox διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων (p22 phox, F4,{{10}}.513, p < 0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p <0,001 phox, F4,34=69.249, p <0,001).

Τα αποτελέσματα του post hoctest έδειξαν σημαντική αύξηση στα επίπεδα υπομονάδας NOX στο D-CON σε σύγκριση με το Y-CON. Ωστόσο, τα επίπεδα υπομονάδας NOX ήταν χαμηλότερα σε όλες τις ομάδες παρέμβασης σε σύγκριση με την ομάδα D-CON.

Συγκεκριμένα, η έκφραση των p22 phox και gq91 phox μειώθηκε σημαντικά στην D-TE σε σύγκριση με την ομάδα D-MI. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η άσκηση και το MitoQ μεμονωμένα αποτρέπουν το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τη γήρανση στον εγκέφαλο, αλλά ο συνδυασμός τους δεν έχει επιπρόσθετα αποτελέσματα.

Εικόνα 2. Επιδράσεις της άσκησης σε διάδρομο και του MitoQ στην έκφραση των υπομονάδων οξειδάσης NADPH στον εγκεφαλικό φλοιό και στον ιππόκαμπο αρουραίων που προκλήθηκαν από τη γήρανση του D-gal. (Α1) Φωτομικρογραφίες που δείχνουν ανοσοαντιδραστικότητα NAPDH p22 phox στον εγκεφαλικό φλοιό και στον ιππόκαμπο γηραντικών αρουραίων που προκαλούνται από D-gal σε κάθε ομάδα. Τα μαύρα ορθογώνια στο Α1 υποδεικνύουν το τμήμα των εικόνων όπως φαίνεται στα f–i και p–t. (A2, A3) Ποσοτικοποίηση οπτικής πυκνότητας της χρώσης NADPH p22 phox στον εγκεφαλικό φλοιό και στον ιππόκαμπο.

Bonferroni post hoc test μετά από ANOVA. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM.(n=5 ζώα). (a–e και k–o) Γραμμή κλίμακας=100 μm, (f–j και p–t) Γραμμή κλίμακας=50 μm. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες Western blot για υπομονάδες οξειδάσης NADPH στον ιππόκαμπο.

(C–E) Ποσοτικοποίηση υπομονάδων οξειδάσης NADPH στον ιππόκαμπο. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο στύπωμα Western ήταν μέσα από επτά εγκεφάλους αρουραίων. -Η ακτίνη διερευνήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Μετά την ANOVA χρησιμοποιήθηκε η post hoc δοκιμή Bonferroni. Οι τιμές είναι μέσα ± SEM.

a Δηλώνει στατιστική διαφορά από την ομάδα Y-CON. β Δηλώνει στατιστική διαφορά από την ομάδα D-CON. c Δηλώνει στατιστική διαφορά από την ομάδα D-TE.(p < 0.05).

3.3. Επίδραση της άσκησης σε διάδρομο και του MitoQ στην έκφραση GFAP στον εγκεφαλικό φλοιό και την οδοντωτή έλικα του ιππόκαμπου γηρασμένων αρουραίων που προκαλούνται από D-Gal

Παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας στην ανοσοαντιδραστικότητα GFAP στον εγκεφαλικό φλοιό και την οδοντωτή έλικα του ιππόκαμπου (DG) γηρασμένων αρουραίων (Εικόνα 3) (Cortex, F4,24=13.524, p < 0.001 ; ΓΔ, F4,24=30.364).

Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας post hoc έδειξαν ότι η θεραπεία με D-gal αύξησε σημαντικά την ανοσοαντιδραστικότητα GFAP τόσο στον φλοιό όσο και στο DG.

Σε σύγκριση με την ομάδα D-CON, τα επίπεδα GFAP στον φλοιό μειώθηκαν σε όλες τις ομάδες παρέμβασης και τα επίπεδα GFAP στην DG μειώθηκαν στις ομάδες D-TE και D-COMBI, ενώ η ομάδα D-MI έδειξε διαφορές μόνο στην ανοσοαντιδραστικότητα GFAP στην περιοχή του φλοιού.

Έτσι, αν και η θεραπεία με ΤΕ ή MitoQ μείωσε τη νευροφλεγμονή που προκαλείται από D-gal στον φλοιό, μόνο η παρέμβαση ΤΕ παρήγαγε θετικά αποτελέσματα στη ΓΔ.

For more information:1950477648nn@gmail.com