Natalenamides A-C, Cyclic Tripeptides From The Termite-Associated Actinomadura Sp. RB99

Αφηρημένη:

Τα τελευταία χρόνια, οι έρευνες στη βιοχημεία των βακτηρίων που σχετίζονται με έντομα έχουν αυξηθεί. Όταν συνδυάζονται με αναλυτικές διεργασίες αποδιπλασιασμού, αυτές οι μελέτες παρέχουν μια ισχυρή στρατηγική για τον εντοπισμό δομικά και/ή βιολογικά νέων ενώσεων. Τα μη ριβοσωματικά συντιθέμενα κυκλικά πεπτίδια έχουν ένα ευρύ φάσμα βιοδραστικότητας με υψηλό ιατρικό δυναμικό.

Εδώ, αναφέρουμε την ανακάλυψη τριών νέων κυκλικών τριπεπτιδίων: τα ναταλεναμίδια A-C (ενώσεις 1-3). Αυτές οι ενώσεις ταυτοποιήθηκαν από τον ζωμό καλλιέργειας του μύκητα που σχετίζεται με τερμίτες Actinomadura sp. RB99 με χρήση μεθόδου αποδιπλασιασμού με βάση υγρή χρωματογραφία (LC)/υπεριώδη (UV)/φασματομετρία μάζας (MS). Οι χημικές δομές των νέων ενώσεων (1–3) καθορίστηκαν με ανάλυση περιεκτικών φασματοσκοπικών μεθόδων, συμπεριλαμβανομένων μονοδιάστατων (1H και 13C) και δισδιάστατων (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) πυρηνικής μαγνητικής φασματοσκοπία συντονισμού (NMR), μαζί με δεδομένα φασματομετρίας μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού υψηλής ανάλυσης (HR-ESIMS). Οι απόλυτες διαμορφώσεις των νέων ενώσεων διευκρινίστηκαν χρησιμοποιώντας την ανάλυση του Marfey. Μέσω πολλών δοκιμών βιοδραστικότητας για τα τριπεπτίδια, βρήκαμε ότι η ένωση 3 εμφάνισε σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις στην επαγόμενη από 3-ισοβουτυλ-1-μεθυλξανθίνη (IBMX) παραγωγή μελανίνης. Το αποτέλεσμα της ένωσης 3 ήταν παρόμοιο με αυτό του κοτζικού οξέος, μιας ένωσης που χρησιμοποιείται ευρέως ως καλλυντικό υλικό με αποτέλεσμα λεύκανσης του δέρματος.

Το ανοιχτό, λείο και λεπτό δέρμα ήταν πάντα ο στόχος που επιδίωκαν οι ανατολίτικες γυναίκες. Η έρευνα και η ανάπτυξη λευκαντικών παραγόντων για προϊόντα περιποίησης δέρματος βασίζονται κυρίως στην αναστολή της δραστηριότητας της τυροσινάσης.

Οι ενώσεις που περιέχουν δακτυλίους βενζολίου ή δομές φαινολικού υδροξυλίου έχουν πιθανά λευκαντικά αποτελέσματα, όπως ο ευρέως χρησιμοποιούμενος λευκαντικός παράγοντας arbutin, που μπορεί να ασκήσει λευκαντικά αποτελέσματα αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της τυροσινάσης.

Και διαπιστώσαμε ότι το Cistanche deserticola έχει λευκαντικό αποτέλεσμα. Το κύριο δραστικό συστατικό του Cistanche deserticola, οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, είναι ένα είδος φυσικής ένωσης γλυκοσιδίου. Μελέτες έχουν βρει ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες μπορούν να αναστείλουν τη δραστηριότητα της τυροσινάσης και την παραγωγή μελανίνης στα ανθρώπινα επιδερμικά μελανοκύτταρα και να έχουν λευκαντική δράση. αποτελεσματικότητα του παράγοντα.

Κάντε κλικ σε σκόνη εκχυλίσματος cistanche tubulosa

Λέξεις-κλειδιά:

Μύκητας τερμίτης? Actinomadura sp.; τριπεπτίδια; ναταλεναμίδες A–C; επιδράσεις λεύκανσης του δέρματος.

1. Εισαγωγή

Η χημική ανάλυση των προστατευτικών βακτηριακών συμβιώσεων των εντόμων εκτροφής έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή μεταξύ των χημικών φυσικών προϊόντων τα τελευταία χρόνια [1-5]. Χρησιμοποιώντας υπερσύγχρονες διεργασίες αποδιπλασιασμού βασισμένες σε πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό (NMR)/φασματομετρία μάζας (MS) και οικολογικά σχετικές βιοδοκιμασίες, αποκαλύφθηκε μια εντυπωσιακή ποσότητα δομικά ενδιαφέροντων φυσικών προϊόντων, συμπεριλαμβανομένων αρκετών κυκλικών πεπτιδίων που δεν συντέθηκαν ριβοσωματικά. από μικροβιακά συμβιώματα [6]. Τα πιο σημαντικά παραδείγματα περιλαμβάνουν την αντιμυκητιακή dentigerumycin, ένα κυκλικό δεψιπεπτίδιο που απομονώνεται από ένα μύκητα-αναπτυσσόμενο μυρμήγκι που σχετίζεται με Pseudonocardia sp. [7], και τις γερουμυκίνες A-C, κυκλικά δεψιπεπτίδια που φέρουν πιπεραζικό οξύ που ταυτοποιήθηκαν από το Pseudonocardia sp. [8].

Τα κυκλικά πεπτίδια έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων, ενισχύοντας διάφορες συνθετικές προσεγγίσεις προς αυτές τις φαρμακολογικά υποσχόμενες δομές [9-12]. Πάνω από 40 κυκλικά πεπτιδικά φάρμακα κυκλοφορούν σήμερα στην αγορά και χρησιμοποιούνται ευρέως σε κλινικά περιβάλλοντα, και περίπου ένα νέο κυκλικό πεπτιδικό φάρμακο εισέρχεται στην αγορά κάθε χρόνο, κατά μέσο όρο [13].

Ως μέρος της συνεχιζόμενης προσπάθειάς μας να εντοπίσουμε δομικά νέους και/ή βιοδραστικούς δευτερογενείς μεταβολίτες από μικρόβια που σχετίζονται με τερμίτες [14–17], εστιάσαμε στο Actinomadura sp. RB99, που απομονώθηκε από τον τερμίτη που αναπτύσσεται σε μύκητες, Macrotermes natalensis. Η στρατηγική αποδιήλωσης που βασίζεται σε υγρή χρωματογραφία (LC)/υπεριώδη (UV)/φασματομετρία μάζας (MS) απέδωσε δυνητικά νέα βιοενεργά φυσικά προϊόντα. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε την απομόνωση και τη χημική ταυτοποίηση τριών νέων κυκλικών τριπεπτιδίων, της ναταλεναμίδης A-C (ενώσεις 1-3, Εικόνα 1), χρησιμοποιώντας μια μέθοδο αποδιπλασιασμού που βασίζεται σε LC/UV/MS καθώς και τις βιολογικές αξιολογήσεις τους για κυτταροτοξική , αντιφλεγμονώδεις και λεύκανση του δέρματος.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Απομόνωση ενώσεων με βάση υγρή χρωματογραφία (LC)/Υπεριώδη (UV)/Φασματομετρία Μάζας (MS) 1-3

Actinomadura sp. Το RB99 απομονώθηκε από την επιφάνεια ενός εργάτη τερμιτών (M. natalensis). Η φυλογενετική ανάλυση μιας σχεδόν πλήρους αλληλουχίας ριβοσωμικού ριβονουκλεϊκού οξέος (rRNA) 16S υποδηλώνει ότι το στέλεχος RB99 ανήκει στο γένος Actinomadura, με τον πλησιέστερο γείτονα Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Η επακόλουθη ανάλυση με βάση LC/UV/MS εμπλουτισμένων εκχυλισμάτων καλλιέργειας αποκάλυψε ένα σύνολο χαρακτηριστικών απορροφήσεων UV με μοναδικές κορυφές μοριακών ιόντων που περιέχουν άτομα αζώτου.

Για τον εντοπισμό των αντίστοιχων μεταβολιτών και τη διερεύνηση της δραστηριότητάς τους, έγινε ζύμωση μεγάλης κλίμακας χρησιμοποιώντας βελτιστοποιημένες συνθήκες ανάπτυξης (100 πλάκες άγαρ από 2 L άγαρ ISP2, pH 6, 10 ημέρες στους 30 ◦C) και μια καθιερωμένη διαδικασία επεξεργασίας και προκαθαρισμού. εφαρμόζεται [17]. Η επακόλουθη κλασμάτωση καθοδηγούμενη από LC-UV/MS και η επαναλαμβανόμενη ημιπαρασκευαστική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) οδήγησαν στην απομόνωση τριών μεταβολιτών με μοναδικό πρότυπο NMR/MS. Πραγματοποιήσαμε μελέτες ανάπτυξης και μέσων χρησιμοποιώντας διαφορετικά αλάτι (NaCl, KBr 1–3 τοις εκατό ) και συνθέσεις μέσων (ISP1-6 μέσα) για να μιμηθούν το φυσικό περιβάλλον και να διεγείρουμε την παραγωγή μεταβολιτών, γεγονός που οδήγησε επίσης στην παρουσία των τριών νέων μεταβολίτες (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα S19).

2.2. Δομική διαλεύκανση των ενώσεων

Το ναταλεναμίδιο Α (1) αποκτήθηκε ως άμορφη σκόνη. Ο μοριακός τύπος του 1 προσδιορίστηκε ότι είναι C19H25N3O5 από το προσαγόμενο με νάτριο μοριακό ιόν σε m/z 398,1691 [Μ συν Na] συν (υπολογισμένο για C19H25N3O5Na, 398,1692) χρησιμοποιώντας λειτουργία θετικού ιόντος υψηλής ανάλυσης (ηλεκτροφασματισμός μάζας HR) ESIMS) δεδομένα. Το υπέρυθρο (IR) φάσμα έδειξε μια ισχυρή ζώνη απορρόφησης στα 1670 cm−1, υποδηλώνοντας την παρουσία αμιδικών ομάδων στο μόριο. Η λεπτομερής ανάλυση των δεδομένων 1H NMR του 1 (Πίνακας 1) έδειξε τα τυπικά σήματα ενός πεπτιδικού σκελετού, που εμφανίζει δύο σήματα μεθυλίου (δH 0.91 (3H, d, J=7).{{29 }} Hz, H-3) και 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), τρία σήματα μεθυλενίου (δΗ 1,95 (1Η, m, Η-7a), 2,27 (1Η, m, Η-8a), 2,36 (1Η, m, Η-8b), 2,48 (1Η , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{{58} }a), και 3.20 (1H, dd, J {= 14.0, 5.0 Hz, H{-12b)), τέσσερα σήματα μεθίνης (δH 2.02 (1H , m, H-2), 4.16 (1H, d, J=7.5 Hz, H{-1), 4.20 (1H, dd, J=8.5, 4,5 Hz, H{-6) και 4,63 (1H, dd, J=8,0, 5,0 Hz, H{-11)) και πέντε επικαλυπτόμενα αρωματικά πρωτόνια (δH 7,18 (1H, m, Η-16), 7,23 (2Η, m, Η-14/18) και 7,24 (2Η, m, Η-15/17)).

Το φάσμα 13C NMR (Πίνακας 1), με τη βοήθεια από τα φάσματα HSQC και HMBC, έδειξε συνολικά 19 συντονισμούς άνθρακα υπεύθυνους για δύο σήματα μεθυλίου (δC 18.9 και 19.9), τρία σήματα μεθυλενίου (δC 27.0, 30.6 και 38.8), εννέα σήματα μεθίνης (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) και 130.6 (×2)), συμπεριλαμβανομένων πέντε αρωματικών ανθράκων, ενός ολεφινικού άνθρακα σήμα (δC 138.8) και τέσσερα σήματα άνθρακα καρβονυλίου (δC 173.2, 173.3, 174.8 και 181.3). Σε συνδυασμό με τα παραπάνω φασματοσκοπικά δεδομένα, η λεπτομερής επιθεώρηση του δισδιάστατου (2D) NMR (πειράματα 1H-1H COSY, HSQC και HMBC) αποκάλυψε την παρουσία τριών αμινοξέων στο 1: γλουταμικό (Glu), φαινυλαλανίνη ( Phe), και βαλίνη (Val) (Εικόνα 2). Η συνδεσιμότητα αυτών των αμινοξέων καθορίστηκε από τις συσχετίσεις HMBC των H-1/C-5 και C-19, H-11/C-10 και C{ {50}} και H-6/C-5 και C-10 (Εικόνα 2).

Για τον προσδιορισμό της απόλυτης διαμόρφωσης του 1, εφαρμόστηκε η μέθοδος του Marfey για τον προσδιορισμό της στερεοχημείας των πολλαπλών -H (C-1, C-6 και C-11). Τα προϊόντα υδρόλυσης οξέος του 1 και τα τυπικά αμινοξέα (L/D-Glu, Phe και Val) παραγωγοποιήθηκαν με 1-φθορο-2,4-δινιτροφαινυλ-5-L-αλανίνη αμίδιο (L-FDAA). Διαδοχικά, το παραγοντοποιημένο μίγμα του 1 και των τυπικών αμινοξέων αναλύθηκαν με LC/MS για να εξεταστεί ο χρόνος κατακράτησης τους. Οι απόλυτες διαμορφώσεις των τμημάτων Glu, Phe και Val προσδιορίστηκαν όλες ότι είναι L-μορφές, με βάση τους χρόνους κατακράτησης των παραγώγων L-FDAA 1 σε σύγκριση με εκείνους των τυπικών αμινοξέων. Έτσι, η δομή του 1 διευκρινίστηκε ως το κυκλικό τριπεπτίδιο που φαίνεται στο Σχήμα 1.

Το ναταλεναμίδιο Β (2) απομονώθηκε ως άμορφη σκόνη. Ο μοριακός τύπος του (C20H27N3O5) προέκυψε από τις κορυφές μοριακών ιόντων που έχουν προστεθεί από υδρογόνο και νάτριο στα 390,2032 [Μ συν Η] συν (υπολογισμένο για C20H28N3O5, 390,2029) και 412,1849 [Μ συν 28, συν 28, για C28, N28, αντίστοιχα] Σε σύγκριση με τον μοριακό τύπο και τα φασματικά δεδομένα NMR του 1, η ένωση 2 φάνηκε να έχει μια επιπλέον ομάδα CH2 στον πεπτιδικό σκελετό. Ο διεξοδικός έλεγχος των μονοδιάστατων (1D) (1H και 13C NMR) και 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC και HMBC) των φασμάτων 2 αποκάλυψε την ύπαρξη τριών υπολειμμάτων αμινοξέων: Glu, Phe και Leu (λευκίνη). Η αλληλουχία αυτών των αμινοξέων κατασκευάστηκε με βάση τις συσχετίσεις HMBC των H-1/C-6 και C-20, H-12/C-11 και C -20 και H-7/C-6 και C-11 (Εικόνα 2). Για να προσδιοριστεί η απόλυτη διαμόρφωση του 2, πραγματοποιήθηκε παραγωγοποίηση των υπολειμμάτων Glu, Phe και Leu με L-FDAA και στη συνέχεια αναλύθηκε με LC/MS. Στα δεδομένα LC/MS, τα L-Glu, L-Phe και L-Leu ανιχνεύθηκαν συγκρίνοντας τους χρόνους κατακράτησης για τα παράγωγα L-FDAA του 2 με αυτούς των τυπικών αμινοξέων. Έτσι, η χημική δομή του 2 καθιερώθηκε ως το κυκλικό τριπεπτίδιο που φαίνεται στο Σχήμα 1.

Τα δεδομένα HR-ESIMS θετικής λειτουργίας του ναταλεναμιδίου C (3) εμφάνισαν μοριακά ιόντα υδρογόνου και νατρίου στα 424,1870 [Μ συν Η] συν (υπολογισμένο για C23H26N3O5, 424,1872) και 446,1694 [McalH25N] συν25 424.1692). Αυτό υποδηλώνει ότι ο μοριακός τύπος του ήταν C23H25N3O5. Μια λεπτομερής ανάλυση των φασμάτων 1D και 2D NMR του 3 έδειξε ότι η χημική του δομή ήταν παρόμοια με αυτή του 2, εκτός από το ότι το Leu αντικαταστάθηκε με Phe στο 3. Η συνδεσιμότητα των τριών ταυτοποιημένων αμινοξέων στο 3 επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας τις συσχετίσεις HMBC του H-1/C-9 και C-23, H-15/C-14 και C-23 και H-10/ C-9 και C-14 (Εικόνα 2). Εφαρμόζοντας τη μέθοδο του Marfey στην ένωση 3, οι απόλυτες διαμορφώσεις των πολλαπλασίων -Η (C-1, C-10 και C-15) διευκρινίστηκαν ότι είναι ένα L-Glu και δύο L -Ομάδες Phe. Κατά συνέπεια, προσδιορίστηκε η πλήρης δομή του 3 όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.

Τα ναταλεναμίδια A-C είναι τρικυκλικά πεπτίδια, πιθανώς μη ριβοσωμικής προέλευσης. Επί του παρόντος, αρκετά βιοενεργά κυκλικά τριπεπτίδια έχουν χαρακτηριστεί ως φυσικά προϊόντα: κυτταροτοξικά 17-μέλη κυκλικά τριπεπτίδια (π.χ. OF4949 I–IV) που απομονώθηκαν από Penicillium rugulose [18]. αντιμυκητιασικές σκληροτομίες A−K, που προσδιορίζονται από τον ζωμό ζύμωσης ανθεκτικών βακτηρίων [10]. και αντιπολλαπλασιαστικό ψυχόφιλο Ε, που απομονώθηκε από μικτή καλλιέργεια δύο στελεχών μυκήτων που προέρχονται από θαλάσσια άλγη του γένους Aspergillus [19].

2.3. Βιολογικές Δραστηριότητες των Ενώσεων 1-3

Εφόσον τα κυκλικά πεπτίδια έχουν αναφερθεί ότι παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων, τα βιολογικά αποτελέσματα των απομονωθέντων κυκλικών τριπεπτιδίων ({{0}}) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τρεις βιοδραστηριότητες. Η κυτταροτοξικότητα των ενώσεων 1-3 διερευνήθηκε έναντι τεσσάρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών (MCE7 καρκινικά κύτταρα μαστού, HeLa καρκινικά κύτταρα τραχήλου της μήτρας, καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα A549 και καρκινικά κύτταρα ήπατος HepG2) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 και 100 μΜ). Η ένωση 1 δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων των κυττάρων MCF-7, HeLa ή A549. Ωστόσο, η επεξεργασία των κυττάρων HepG2 με 100 Μ της ένωσης 1 μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων στο 78,5 συν 3,2 τοις εκατό (Εικόνα 3). Η ένωση 2 μείωσε τις κυτταρικές βιωσιμότητα των κυττάρων HeLa και A549 σε 82.9  2.1 τοις εκατό και 73.5=3.0 τοις εκατό, αντίστοιχα, αλλά δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα του MCF-7 ή Κύτταρα HepG2 (Εικόνα 3). Η ένωση 3 δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα οποιασδήποτε από τις κυτταρικές σειρές (Εικόνα 3).

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν μακροφάγα RAW264.7 για τη διερεύνηση των αντιφλεγμονωδών επιδράσεων των απομονωμένων ενώσεων. Για την εξάλειψη των σφαλμάτων στην παραγωγή ΝΟ που προκαλούνται από την αλλαγή των ποσοστών επιβίωσης των κυττάρων, εξετάστηκαν οι μη τοξικές συγκεντρώσεις κάθε ένωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, οι ενώσεις 1-3 είχαν λίγες κυτταροτοξικές επιδράσεις στα κύτταρα RAW264.7 (Εικόνα 4A-C) και δεν είχαν ανασταλτικές επιδράσεις στην παραγωγή ΝΟ σε κύτταρα RAW264.7 που διεγείρονται από λιποπολυσακχαρίτες (LPS) (Εικόνα 4D-F) .

Οι ανασταλτικές επιδράσεις των ενώσεων 1-3 στην περιεκτικότητα σε μελανίνη στα κύτταρα B16F10 εξετάστηκαν ως απόδειξη των δραστηριοτήτων λεύκανσης του δέρματος (Εικόνα 5). Δεδομένου ότι οι αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων προκαλούν σφάλματα στην παραγωγή και τη μέτρηση της μελανίνης, εξετάσαμε πρώτα τις επιδράσεις των ενώσεων 1-3 στην επιβίωση των κυττάρων B16F10. Οι ενώσεις 1-3 δεν άσκησαν κυτταροτοξικές επιδράσεις στα κύτταρα B16F10 σε καμία από τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν (Εικόνα 5A-C). Στη συνέχεια αξιολογήσαμε τα ανασταλτικά αποτελέσματα των ενώσεων στην επαγόμενη από 3-ισοβουτυλ-1-μεθυλξανθίνη (IBMX) παραγωγή μελανίνης σε κύτταρα B16F10 (Εικόνα 5D–F). Το IBMX, ένας πολύ γνωστός διεγέρτης της μελανογένεσης, προκαλεί σημαντική αύξηση στην παραγωγή μελανίνης μετά από μία μόνο θεραπεία σε κύτταρα μελανώματος. Μεταξύ των ενώσεων που αξιολογήθηκαν, η ένωση 3 (στα 5-100 μΜ) εμφάνισε σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις στη σύνθεση μελανίνης με τη μεσολάβηση IBMX με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Το Kojic acid, ο θετικός μας μάρτυρας, έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως καλλυντικό υλικό με επιδράσεις λεύκανσης του δέρματος [20]. Η ανασταλτική επίδραση της ένωσης 3 στην επαγόμενη από το IBMX παραγωγή μελανίνης ήταν παρόμοια με εκείνη του kojic acid (Εικόνα 5F), υποδηλώνοντας ότι η ένωση 3 λειτουργεί ως ισχυρός αναστολέας της επαγόμενης από το IBMX παραγωγής μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος B16F10.

Επιπλέον, η ένωση 3 μολύνθηκε με μικρό αριθμό ακαθαρσιών, οι οποίες προσδιορίστηκαν ότι είναι ανάλογα λιπαρών οξέων με την ερμηνεία των φασματοσκοπικών δεδομένων NMR και την ανάλυση LC/MS (Συμπληρωματικά Υλικά, Σχήματα S11–S15 και S23). Για να προσδιοριστεί η δραστηριότητα των ακαθαρσιών, διεξήχθησαν πρόσθετα πειράματα με τα ανάλογα λιπαρών οξέων για την ανασταλτική τους δράση στην επαγόμενη από IBMX παραγωγή μελανίνης σε κύτταρα B16F10, τα οποία αποκάλυψαν ότι οι εξεταζόμενες ενώσεις δεν είχαν λευκαντικό αποτέλεσμα (Συμπληρωματικά Υλικά, Εικόνα S24). Έτσι, αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι οι ακαθαρσίες στην ένωση 3 είναι υπεύθυνες για την ανασταλτική επίδραση στην επαγόμενη από το IBMX παραγωγή μελανίνης, αυτό φαίνεται απίθανο.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Γενικές Πειραματικές Διαδικασίες

Τα υπέρυθρα φάσματα αποκτήθηκαν σε ένα φασματόμετρο Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, ΗΠΑ). Τα φάσματα ιονισμού ηλεκτροψεκασμού και HR-ESIMS μετρήθηκαν σε φασματόμετρο μάζας υγρής χρωματογραφίας SI{3}}/LCQ DecaXP (LC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Τα φάσματα NMR, συμπεριλαμβανομένων των πειραμάτων 1H–1H COSY, HSQC και HMBC, πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, USA) που λειτουργεί στα 800 MHz (1H) και 200 ​​MHz (13C), με χημικές μετατοπίσεις που δίνονται σε ppm (δ). Η προπαρασκευαστική HPLC χρησιμοποίησε μια δυαδική αντλία HPLC Waters 1525 με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδου Waters 996 (Waters Corporation, Milford, CT, ΗΠΑ). Silica gel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) και RP-C18 silica gel (230–400 mesh, Merck, χρησιμοποιήθηκαν για χρωματογραφία στήλης. Ημιπροπαρασκευαστική HPLC χρησιμοποίησε σύστημα Shimadzu Prominence HPLC με SPD{ {22}}Α/20AV Series Prominence HPLC υπεριώδεις-ορατοί ανιχνευτές (UV–Vis) (Shimadzu, Τόκιο, Ιαπωνία). Οι αναλύσεις LC/MS πραγματοποιήθηκαν σε σύστημα HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ΗΠΑ) εξοπλισμένο με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων και φασματόμετρο μάζας ESI σειράς 6130 με αναλυτικό Kinetex (4,6 × 100 mm, 3,5 μm). Πλάκες Merck προεπικαλυμμένες με σιλικαζέλ F254 και πλάκες RP{33}} F254s χρησιμοποιήθηκαν για λεπτό -χρωματογραφία στιβάδας (TLC) Ανιχνεύθηκαν κηλίδες σε TLC υπό υπεριώδες φως ή με θέρμανση μετά από ψεκασμό με διάλυμα ανισαλδεΰδης-θειικού οξέος.

3.2. Μικροβιακό Υλικό

Actinomadura sp. Το RB99 απομονώθηκε από την επιφάνεια ενός εργάτη τερμιτών του γένους, M. natalensis, (αποικία Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) στις 2 Ιανουαρίου{ {13}}10. Το βιοϋλικό τοποθετήθηκε σε καθαρές πλαστικές σακούλες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία εντός μίας ημέρας από τη συλλογή. Οι τερμίτες πλύθηκαν σε αποστειρωμένο απιονισμένο νερό και τα βακτήρια απομονώθηκαν με επικάλυψη των εναιωρημάτων που προέκυψαν σε μέσα χαμηλής περιεκτικότητας σε θρεπτικά συστατικά με χιτίνη (ανά λίτρο: 4 g χιτίνης, 0.7 g K2HPO4, 0.3 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 και 20 g άγαρ) [21]. Τα προϊόντα απομόνωσης με μορφολογία τύπου Actinobacteria μεταφέρθηκαν σε άγαρ ISP2 (ανά λίτρο: 10 g εκχύλισμα βύνης, 4 g εκχύλισμα ζύμης, 4 g γλυκόζη και 20 g άγαρ) και υποκαλλιεργήθηκαν έως ότου λήφθηκαν καθαρές απομονώσεις.

3.3. Εξαγωγή DNA και Ενίσχυση Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης

Actinomadura sp. Το RB99 αναπτύχθηκε σε υγρό μέσο ISP2 πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά για πέντε έως επτά ημέρες στους 30 ◦C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού γονιδιωματικού DNA GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή με τις ακόλουθες αλλαγές: (α) η επεξεργασία με λυσοζύμη επεκτάθηκε στα 40 λεπτά και (β) η θεραπεία με πρωτεϊνάση Κ επεκτάθηκε στα 40 λεπτά. Το DNA ποσοτικοποιήθηκε φωτομετρικά χρησιμοποιώντας φασματόμετρο Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Για φυλογενετικές μελέτες, το γονίδιο 16S rRNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το σετ εκκινητών, 1492R/27F. Κάθε αντίδραση ενίσχυσης παρασκευάστηκε σε τελικό όγκο αντίδρασης 25 μL που περιείχε 7,25 μL απεσταγμένου νερού, 5 μL ρυθμιστικού διαλύματος HF, 5 μL από κάθε εκκινητή (2,5 μΜ), {{10}},5 μL dNTPs (10 μΜ), 0,25 μL πολυμεράσης DNA υψηλής πιστότητας Phusion (New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ, ΗΠΑ) και 2 μL εκχυλισθέντος DNA (πρότυπο). Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) πραγματοποιήθηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 98 ◦C για 38 δευτερόλεπτα. 32 κύκλοι των 98 ◦ για 30 δευτερόλεπτα, 52 ◦C για 45 δευτερόλεπτα, 72 ◦C για 1 λεπτό και 20 δευτερόλεπτα. και τελική επέκταση 72 ◦C για 8 λεπτά. Το προϊόν PCR έγινε ορατό με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης και οι αντιδράσεις PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού PCR (Thermo Scientific). Τα θραύσματα DNA αλληλουχήθηκαν σε GATC (Konstanz, Γερμανία).

3.4. Αλληλουχία και Ταυτοποίηση Ειδών

Οι αλληλουχίες αξιολογήθηκαν για καθαρότητα και αναντιστοιχίες χρησιμοποιώντας BioEdit [22]. Οι εμπρόσθιες και αντίστροφες αλληλουχίες που ελήφθησαν για κάθε στέλεχος συναρμολογήθηκαν με το BioEdit και δοκιμάστηκαν για χίμαιρες χρησιμοποιώντας DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Οι προκύπτουσες αλληλουχίες κατατέθηκαν στην GenBank (αριθμός πρόσβασης: KY558684). Οι βλαστικές αναλύσεις με σχεδόν πλήρεις αλληλουχίες 16S rRNA (1368 bp) πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) (αλληλουχίες RNA αναφοράς). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το στέλεχος RB99 είναι μέλος του γένους Actinomadura. Οι ακολουθίες των πρώτων 10 επισκέψεων λήφθηκαν από τη βάση δεδομένων NCBI και ευθυγραμμίστηκαν με την ακολουθία 16S rRNA του Actinomadura sp. RB99 χρησιμοποιώντας την υπηρεσία ευθυγράμμισης ακολουθιών Sina [23]. Δύο διαφορετικά φυλογενετικά δέντρα ανακατασκευάστηκαν με αλγόριθμους γειτονικής ένωσης ή μέγιστης πιθανότητας χρησιμοποιώντας το λογισμικό MEGA έκδοση 7.0.26 [24–26]. Το μοντέλο εξελικτικής απόστασης των Tamura και Nei χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία εξελικτικών πινάκων απόστασης για τους αλγόριθμους μέγιστης πιθανότητας και σύνδεσης γειτόνων, με τη διαγραφή πλήρων κενών και δεδομένων που λείπουν [27]. Για τον αλγόριθμο μέγιστης πιθανότητας, χρησιμοποιήθηκε διακριτή κατανομή γάμμα (συν G) και το μοντέλο μεταβολής του ρυθμού επέτρεψε σε ορισμένες τοποθεσίες να είναι εξελικτικά αμετάβλητες (συν I). Για τον αλγόριθμο γειτονικής ένωσης, η διακύμανση του ρυθμού μεταξύ των τοποθεσιών μοντελοποιήθηκε με μια κατανομή γάμμα (συν G). Οι τιμές εμπιστοσύνης των κόμβων αξιολογήθηκαν με αναλύσεις bootstrap με βάση 1000 βήματα επαναδειγματοληψίας [28].

3.5. Εξαγωγή και απομόνωση

Actinomadura sp. Το RB99 αναπτύχθηκε σε ζωμό 50 mL ISP2 για επτά ημέρες στους 30 ◦C (προκαλλιέργεια) και χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό 100 πλακών άγαρ ISP2. Οι πλάκες επωάστηκαν για 10 ημέρες στους 30 ◦C, κόπηκαν σε μικρά κομμάτια, ενοποιήθηκαν και βυθίστηκαν όλη τη νύχτα σε MeOH. Η φάση MeOH διηθήθηκε και εξατμίστηκε υπό μειωμένη πίεση. Το εκχύλισμα MeOH (20 g) διαλύθηκε σε απεσταγμένο νερό (700 mL) και στη συνέχεια κατανεμήθηκε με διαλύτη με EtOAc (700 mL) τρεις φορές, αποδίδοντας 1,1 g υπολείμματος. Το διαλυτό σε EtOAc κλάσμα (1,1 g) από το εκχύλισμα MeOH φορτώθηκε σε στήλη πυριτικής πηκτής (230–400 mesh) για χρωματογραφία και εκλούστηκε με σύστημα βαθμίδωσης διαλύτη CH2Cl2-MeOH (100:1 έως 1: 1, ν/ν). Αυτό παρείχε έξι κλάσματα (A-F), τα οποία υποβλήθηκαν σε ανάλυση βασισμένη σε LC-UV/MS. Η ανάλυση αποδιπλασιασμού με χρήση εσωτερικής φασματικής βιβλιοθήκης υπεριώδους ακτινοβολίας πρότεινε την ύπαρξη δευτερευόντων αναλόγων πεπτιδίου στο κλάσμα Ε. Αυτά εμφάνιζαν ένα απλό μοτίβο UV στα 220 nm περίπου και κορυφές ιόντων μοναδικού μοριακού τύπου που περιέχουν άτομα αζώτου. Το πολικό κλάσμα Ε (233 mg) κλασματοποιήθηκε με προπαρασκευαστική HPLC ανάστροφης φάσης (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 μm, Torrance, CA, USA) χρησιμοποιώντας CH3CN/H2O (1:9 έως 9:1, v. /v, σύστημα βαθμίδωσης, ταχύτητα ροής: 5 mL/min) για να δώσει πέντε υποκλάσματα (E1–E5). Το υποκλάσμα Ε2 (27 mg) καθαρίστηκε με ημι-παρασκευαστική HPLC ανάστροφης φάσης (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 μm) με 33 τοις εκατό MeOH/H2O (ισοκρατικό σύστημα, ταχύτητα ροής: 2 mL/min ) για να δώσει την ένωση 1 (5,8 mg, tR=57,0 λεπτά). Οι ενώσεις 2 (1,6 mg, tR=42,0 λεπτά) και 3 (1,5 mg, tR=55,0 λεπτά) απομονώθηκαν από το υποκλάσμα Ε3 (15 mg) με ημι-παρασκευαστική αντίστροφη φάση HPLC με έκλουση 43 τοις εκατό MeOH/H2O (ισοκρατικό σύστημα, ταχύτητα ροής: 2 mL/min).

3.5.1. Ναταλεναμίδη Α (1)

3.5.2. Ναταλεναμίδη Β (2)

3.5.3. Ναταλεναμίδη C (3)

3.6. Οξική Υδρόλυση Ενώσεων 1-3

Μια συνολική ποσότητα 0.4 mg κάθε ένωσης (1-3) υδρολύθηκε με 6Ν HCl (500 μL) για 1 ώρα στους 110 ◦C. Μετά από ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου, τα υδρολύματα του 1-3 εξατμίστηκαν για να αφαιρεθούν τα ίχνη HCl. Απεσταγμένο νερό (500 μL) προστέθηκε στα μείγματα του προϊόντος υδρόλυσης και στη συνέχεια εξατμίστηκε για να απομακρυνθούν τα ίχνη HCl. αυτή η διαδικασία έγινε τρεις φορές.

3.7. Προσδιορισμός της απόλυτης διαμόρφωσης αμινοξέων σε 1–3

Τα μείγματα υδρολυμάτων (1-3), καθώς και τα τυπικά αμινοξέα (L/D-Leu, Glu, Phe και Val), διαλύθηκαν σε 1 Ν NaHC03 (10}0 μL) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μL L-FDAA (10 mg/mL σε ακετόνη). Διαδοχικά, κάθε προϊόν υδρόλυσης θερμάνθηκε για 10 λεπτά στους 80 ◦C. Κάθε μίγμα σβήστηκε με 2Ν ΗΟΙ (50 μL) και συμπυκνώθηκε υπό κενό. Το υπόλειμμα διαλύθηκε σε 300 μL MeOH. Κάθε κλάσμα (5 μL) που αποκτήθηκε από τα μείγματα υδρολύματος εγχύθηκε απευθείας στο LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 μm, ταχύτητα ροής 0,3 mL/min) και πλήρης σάρωση σε θετικό και αρνητικό τρόποι λειτουργίας ιόντων (εύρος σάρωσης από m/z 100 έως 1000) εφαρμόστηκαν για τον προσδιορισμό των χρόνων κατακράτησης των παραγώγων από L-FDAA αμινοξέων.

Η κινητή φάση, αποτελούμενη από μυρμηκικό οξύ σε απεσταγμένο νερό ({{0}}.1 τοις εκατό v/v) (A) και ακετονιτρίλιο (B), μεταφέρθηκε με σύστημα βαθμίδωσης διαλυτών ως εξής: 20–40 τοις εκατό (Β) για 10 λεπτά, 100 τοις εκατό (Β) ισοκρατικό για 5 λεπτά, και στη συνέχεια 20 τοις εκατό (Β) ισοκρατικό για 5 λεπτά, για τη διεξαγωγή μιας διαδικασίας πλύσης μετά την εκτέλεση της στήλης. Οι χρόνοι συγκράτησης των παραγωγοποιημένων με L-FDAA αμινοξέων που χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα ήταν 16,7 λεπτά (L-Glu, m/z 400 [Μ συν Η] συν), 18,2 λεπτά (D-Glu, m/z 400 [Μ συν Η] συν), 22,1 λεπτά (L-Val, m/z 370 [Μ συν Η] συν), 25,1 λεπτά (D-Val, m/z 370 [Μ συν Η] συν), 25,6 λεπτά (L-Phe, m/ z 418 [Μ συν Η] συν), 27,0 λεπτά (D-Phe, m/z 418 [Μ συν Η] συν), 25,5 λεπτά (L-Leu, m/z 384 [Μ συν Η] συν), και 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [Μ συν Η] συν). Οι χρόνοι κατακράτησης των παραγωγοποιημένων υδρολυμάτων 1-3 ήταν L-Glu (16,9 λεπτά), L-Phe (25,7 λεπτά) και L-Val (22,5 λεπτά) από 1. L-Glu (16,7 λεπτά), L-Phe (25,7 λεπτά) και L-Leu (25,6 λεπτά) από 2; και L-Glu (16,9 λεπτά) και L-Phe (25,7 λεπτά) από 3.

3.8. Κυτταροτοξικές αναλύσεις με χρήση καρκινικών κυττάρων

Τα κύτταρα MCF7, HeLa και A549 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα HepG2 αγοράστηκαν από την Korean Cell Line Bank (Σεούλ, Κορέα). Τα κύτταρα MCF7 καλλιεργήθηκαν σε μέσο Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα HeLa και Α549 καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο απαραίτητο μέσο Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό. Οι συνθήκες καλλιέργειας διατηρήθηκαν στους 37 ◦C σε υγρή ατμόσφαιρα που περιείχε 5 τοις εκατό CO2. Η κυτταροτοξικότητα δοκιμάστηκε σε αυτές τις τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (MCF7, HeLa, A549 και HepG2) χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας βιωσιμότητας κυττάρων EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Ιαπωνία). Εν συντομία, 5 × 103 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίου. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενώσεις στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Μετά από 72 ώρες επώασης, χρησιμοποιήθηκε το κιτ δοκιμασίας βιωσιμότητας κυττάρων EZ-CyTox. Μετά από 2 ώρες επώασης, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm με αναφορά στα 620 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως ποσοστό του ελέγχου.

3.9. Αντιφλεγμονώδης Δραστηριότητα

Η κυτταρική σειρά RAW264.7 μακροφάγου ποντικού αγοράστηκε από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 100 μονάδες/mL πενικιλλίνης και 100 μg/mL στρεπτομυκίνης και επωάστηκαν στους 37 °C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5 τοις εκατό CO2. Η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης βιωσιμότητας κυττάρων Ez-Cytox. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε τρυβλία 96-πηγαδιού σε συγκέντρωση 2500 κυττάρων ανά φρεάτιο για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις των ενώσεων 1-3 για 24 ώρες. Στη συνέχεια, αντιδραστήρια Ez-Cytox προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η οπτική πυκνότητα στα 450 nm μετρήθηκε μετά από 1 ώρα χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) για την εκτίμηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Σε ένα ξεχωριστό πείραμα, τα κύτταρα RAW264.7 επωάστηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων σε συγκέντρωση 30,000 κυττάρων ανά φρεάτιο για 24 ώρες. Μετά από ασιτία ορού για 12 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ενώσεις 1-3 για 1 ώρα και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 1 μg/mL LPS για 24 ώρες. Η απορρόφηση των μέσων καλλιέργειας σε μια αντίδραση Griess μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών PowerWave XS για την εκτίμηση του επιπέδου ΝΟ.

3.10. Μέτρηση της περιεκτικότητας σε μελανίνη

Η κυτταρική σειρά μελανώματος ποντικού, B16F10, αγοράστηκε από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS, 100 μονάδες/mL πενικιλλίνης και 100 μg/mL στρεπτομυκίνης και επωάστηκαν στους 37 °C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5 τοις εκατό CO2. Τα κύτταρα B16F10 επωάστηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 6 cm στους 250,000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε DMEM συμπληρωμένα με 10 τοις εκατό FBS, 100 μg/mL στρεπτομυκίνη και 100 U/mL πενικιλίνης για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με IBMX και επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις ενώσεων 1-3 ή κοτζικό οξύ (θετικός έλεγχος) σε μέσο RPMI χωρίς ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS, 100 μονάδες /mL πενικιλίνης και 100 μg/mL στρεπτομυκίνης για 24 ώρες και 48 ώρες. Η απορρόφηση του μέσου καλλιέργειας μετρήθηκε στα 405 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας PowerWave XS για την εκτίμηση της περιεκτικότητας σε μελανίνη. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως αναδίπλωση σε σύγκριση με τον έλεγχο (κύτταρα που δεν διεγείρονται από το IBMX).

3.11. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα, συμπεριλαμβανομένης της βιωσιμότητας των κυττάρων, του ΝΟ και της παραγωγής μελανίνης παρουσιάστηκαν ως η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση (SD). Όλες οι δοκιμασίες έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλήφθηκαν μόνο μερικοί αριθμοί επαναλήψεων κάθε πειράματος κυττάρου, επομένως η μέθοδος μη παραμετρικής ανάλυσης υιοθετήθηκε για στατιστική ανάλυση. Για τη στατιστική ανάλυση κάθε μεταβλητής χρησιμοποιήθηκε το τεστ Kruskall–Wallis. Το στατιστικό πακέτο SPSS χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS στατιστική έκδοση 21, Boston, MA, USA). Η στατιστική σημασία θεωρήθηκε σε τιμή p χαμηλότερη από 0.05.

4. Συμπεράσματα

Η έκθεσή μας παρέχει μια χημική ανάλυση μικροβιακών απομονώσεων από έναν τερμίτη που αναπτύσσεται σε μύκητες. Τρία νέα κυκλικά τριπεπτίδια, τα ναταλεναμίδια A-C (1-3), απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν δομικά από τον ζωμό καλλιέργειας του μύκητα που σχετίζεται με τους τερμίτες Actinomadura sp. RB99 χρησιμοποιώντας μια μέθοδο αποδιπλασιασμού που βασίζεται σε LC-UV/MS. Όλες οι απομονωμένες ενώσεις αξιολογήθηκαν για βιολογικές δραστικότητες χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς που βασίζονται σε κύτταρα. Οι ενώσεις 1 και 2 εμφάνισαν ασθενή κυτταροτοξικότητα έναντι των κυττάρων HepG2 και HeLa/A549, αντίστοιχα. Καμία από τις απομονωμένες ενώσεις δεν έδειξε σημαντικά ανασταλτικά αποτελέσματα στην παραγωγή ΝΟ σε κύτταρα RAW264.7 που διεγείρονται με LPS. Η ένωση 3 εμφάνισε σημαντικά ανασταλτικά αποτελέσματα στη σύνθεση μελανίνης που προκαλείται από ΙΒΜΧ με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Το αποτέλεσμα ήταν παρόμοιο με αυτό του κοτζικού οξέος, το οποίο χρησιμοποιείται ως καλλυντικό υλικό με λεύκανση του δέρματος.

Ευχαριστίες:

Είμαστε βαθιά ευγνώμονες στον Michael Thomas-Poulsen (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κοπεγχάγης, Δανία) για την υποστήριξη της επιτόπιας εργασίας μας.

Σύγκρουση συμφερόντων:

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Newman, DJ; Cragg, GM Φυσικά προϊόντα ως πηγές νέων φαρμάκων από το 1981 έως το 2014. J. Nat. Κέντρο. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Natural products: Ένας εξελισσόμενος ρόλος στη μελλοντική ανακάλυψη φαρμάκων. Ευρώ. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, Η.; Rischer, Μ.; Poulsen, M. Φυσικά προϊόντα από μικρόβια που σχετίζονται με έντομα. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Οι βακτηριακές συμβιώσεις στα γεωργικά συστήματα παρέχουν μια στρατηγική πηγή για την ανακάλυψη αντιβιοτικών. J. Antibiot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Η επανεμφάνιση των φυσικών προϊόντων για την ανακάλυψη φαρμάκων στην εποχή της γονιδιωματικής. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Ολική βιοσύνθεση: In vitro ανασύσταση πολυκετιδικών και μη ριβοσωμικών πεπτιδικών οδών. Nat. Κέντρο. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Ω, Δ.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, ένα υπεροξείδιο πολυενίου από έναν συνεργάτη Streptomyces sp. Οργ. Κάτοικος της Λατβίας. 2009, 11, 633-636. [CrossRef] [PubMed]

8. Καθίστε, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Οι μεταβλητές γενετικές αρχιτεκτονικές παράγουν σχεδόν πανομοιότυπα μόρια σε βακτηριακά συμβιώματα μυρμηγκιών που αναπτύσσονται σε μύκητες. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Low, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Ορθολογικός σχεδιασμός αναστολέων καλπαΐνης με βάση τα πεπτιδομιμητικά της καλπαστατίνης. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Ζ.; Wang, Υ.; Hong, Κ.; Liu, Ρ.; Zhu, W. Κυκλικά Τριπεπτίδια από τον αλογονοανεκτικό μύκητα Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Κέντρο. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, Α.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, Κ.; Reshetnyak, YK Νέα κυκλικά πεπτίδια ευαίσθητα στο pH. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, Μ.; Lin, HC; Tang, Υ. Biosynthesis of the -nitro-containing cyclic tripeptide psychrophilic. J. Antibiot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, Α.; Deyle, Κ.; Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: Past, παρόν και μέλλον. Curr. Γνώμη. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, Μ.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin Α, μια ανσαμυκίνη από ένα σχετιζόμενο με τερμίτες Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, ισοφλαβονοειδή γλυκοσίδες από σχετιζόμενο με τερμίτες Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Κέντρο. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Υ.; Poulsen, Μ.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Μακροτερμυκίνες A-D, γλυκοζυλιωμένες μακρολακτάμες από ένα σχετιζόμενο με τερμίτες Amycolatopsis sp. Μ39. Οργ. Κάτοικος της Λατβίας. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, Η.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, Η.; Steinacker, Μ.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Απομόνωση, βιοσύνθεση και χημικές τροποποιήσεις ρουτερολονών A–F: Σπάνια αλκαλοειδή τροπολόνης από το Actinomadura sp. 5–2. Chem. Ευρώ. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, Κ.; Katayama, Κ.; Takesako, Κ.; Nakamura, Τ.; Obayashi, Α.; Ezure, Υ.; Enomoto, Η. OF4949, νέοι αναστολείς της αμινοπεπτιδάσης Β. II. Διευκρίνιση της Δομής. J. Antibiot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, Α.; Cutignano, Α.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, ένα κυκλικό τριπεπτίδιο από τον σπόγγο του Βανουάτου Reniera n. sp. J. Nat. Κέντρο. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, Μ.; Ghanem, GH Hypopigmenting agents: Μια ενημερωμένη ανασκόπηση σχετικά με βιολογικές, χημικές και κλινικές πτυχές. Pigm. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, Τ.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Εξερεύνηση της δυνατότητας για ακτινοβακτήρια ως αμυντικά συμβιόνια σε τερμίτες που αναπτύσσουν μύκητες. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Ένα φιλικό προς το χρήστη πρόγραμμα επεξεργασίας και ανάλυσης ευθυγράμμισης βιολογικών ακολουθιών για Windows 95/98/NT. Νουκλεϊκά Οξέα Σύμπτ. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Prusse, Ε.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Ακριβής ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών υψηλής απόδοσης γονιδίων ριβοσωμικού RNA. Bioinformatics 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Σαΐτου, Ν.; Nei, M. Η μέθοδος γειτονικής ένωσης: Μια νέα μέθοδος ανακατασκευής φυλογενετικών δέντρων. ΜοΙ. Biol. Evol. 1987, 4, 406-425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Εξελικτικά δέντρα από αλληλουχίες DNA: Μια προσέγγιση μέγιστης πιθανότητας. J. ΜοΙ. Evol. 1981, 17, 368-376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 για μεγαλύτερα σύνολα δεδομένων. ΜοΙ. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, Κ.; Nei, M. Εκτίμηση του αριθμού των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων στην περιοχή ελέγχου του μιτοχονδριακού DNA σε ανθρώπους και χιμπατζήδες. ΜοΙ. Biol. Evol. 1993, 10, 512-526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Όρια εμπιστοσύνης στις φυλογένειες: Μια προσέγγιση που χρησιμοποιεί το bootstrap. Evolution 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Διαθεσιμότητα δείγματος:

Δείγματα των ενώσεων δεν είναι διαθέσιμα από τους συγγραφείς.

For more information:1950477648nn@gmail.com