Απομόνωση και ποσοτικοποίηση της Ginsenoside Rh23, μιας νέας αντιμελανογόνου ένωσης από τα φύλλα του Panax Ginseng

Αφηρημένη:

Μια νέα ginsenoside, που ονομάζεται ginsenoside Rh23 (1) και 20-O- -D-glucopyranosyl-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahydroxydammar-23-ene (2) απομονώθηκαν από τα φύλλα του υδροπονικού Panax ginseng. Οι ενώσεις απομονώθηκαν με διάφορες χρωματογραφία στήλης και οι δομές τους προσδιορίστηκαν με βάση φασματοσκοπικές μεθόδους, συμπεριλαμβανομένης φασματοσκοπίας μάζας τετραπόλων/χρόνου πτήσης υψηλής ανάλυσης (HR-QTOF/MS), φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και φασματοσκοπίας υπέρυθρου (IR) . Για τον προσδιορισμό της αντι-μελανογόνου δράσης, δοκιμάστηκε η αλλαγή στην περιεκτικότητα σε μελανίνη σε κύτταρα Melan-a που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ταυτοποιημένες ενώσεις.

Επιπλέον, διερευνήσαμε τις ανασταλτικές επιδράσεις της μελανίνης της ginsenoside Rh23 στη μελάγχρωση σε ένα in vivo μοντέλο ζέβρα. Η ένωση 1 ανέστειλε την ισχυρή μελανογένεση σε κύτταρα μελαν-α με 37,{4}} τοις εκατό αναστολή μελανογένεσης στα 80 μΜ και παρουσίασε επίσης αναστολή στη μελάγχρωση του σώματος στο μοντέλο ψαριού ζέβρα. Αν και η ένωση 2 έδειξε ελαφρώς χαμηλότερη ανασταλτική δράση από την ένωση 1, έδειξε επίσης σημαντικά μειωμένη μελανογένεση στα κύτταρα Melan-a και στο μοντέλο ψαριού ζέβρα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ενώσεις που απομονώθηκαν από το υδροπονικό P. ginseng μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως νέες ενώσεις λεύκανσης του δέρματος μέσω των συστημάτων in vitro και in vivo. Επιπλέον, αυτή η μελέτη έδειξε τη χρησιμότητα της ένωσης 1 που βασίζεται σε MS για ποσοτική ανάλυση. Το Ginsenoside Rh23 (1) βρέθηκε σε επίπεδο 0,31 mg/g σε φύλλα υδροπονικού P. ginseng.

Για τη μελανίνη, βρήκαμε ότι το Cistanche μπορεί να μειώσει σημαντικά τη δραστηριότητα της τυροσινάσης, η οποία είναι το κύριο ένζυμο που περιορίζει τον ρυθμό στη βιοσύνθεση της μελανίνης του δέρματος και είναι ένα σύμπλεγμα χαλκού και πρωτεΐνης. Μπορεί να υδροξυλιώσει την τυροσίνη, την κύρια πρώτη ύλη για την παραγωγή μελανίνης στο σώμα, για την παραγωγή L-dopa και στη συνέχεια να οξειδώσει την ντόπα σε ντοπακινόνη. Η ντοπακινόνη υφίσταται μια σειρά μεταβολικών διεργασιών, αναδιατάσσεται και πολυμερίζεται και τελικά συνδυάζεται με Πρωτεΐνες που συνδυάζονται για να παράγουν μια σειρά από χρωστικές μελανίνης που προκαλούν μαύρισμα. Η μελανίνη είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας για τον καθορισμό του χρώματος του δέρματος του ανθρώπινου σώματος. Η υπερβολική σύνθεση μπορεί να προκαλέσει τον σχηματισμό μελαγχρωματικών δερματικών παθήσεων όπως πανάδες, χλόασμα, κηλίδες ηλικίας και μελάνωμα. Ως εκ τούτου, μέσω της έρευνας για την αναστολή της δραστηριότητας της τυροσινάσης, τα αποτελεσματικά συστατικά για την αναστολή της μελάγχρωσης του δέρματος μπορούν να εξεταστούν, έτσι ώστε να φανεί ότι οι συνολικές γλυκοσίδες του Cistanche deserticola έχουν ως αποτέλεσμα την αναστολή της μελάγχρωσης του δέρματος και τη λεύκανση της ομορφιάς.

Κάντε κλικ στο προϊόν δοσολογίας cistanche

Λέξεις-κλειδιά:

ginsenoside Rh23; Panax ginseng; NMR; UPLC-QTOF/MS; zebrafish? ποσοτική ανάλυση.

1. Εισαγωγή

Το Panax ginseng CA Meyer είναι ένα πολύ διάσημο παραδοσιακό φαρμακευτικό βότανο στις ασιατικές χώρες. Το Panax προέρχεται από το "πανάκεια", που σημαίνει ίαση όλων των ασθενειών. Το P. ginseng είναι ένα πολυετές ποώδες φυτό που ανήκει στην οικογένεια Araliaceae [1]. Οι ρίζες του P. ginseng ηλικίας τεσσάρων έως έξι ετών χρησιμοποιούνται κυρίως για θεραπευτικούς σκοπούς. Τα λουλούδια ανθίζουν τον Ιούνιο και τα φύλλα έχουν σχήμα ουρανίσκου. Το P. ginseng έχει καλλιεργηθεί κυρίως στην Ανατολική Ασία, συμπεριλαμβανομένης της Κορέας, της Κίνας και της Ιαπωνίας [2]. Μέχρι σήμερα, έχουν αναφερθεί πολλές μελέτες σχετικά με τα χημικά συστατικά των ριζών, των φύλλων και των μούρων του ginseng. περισσότερα από 100 είδη ginsenosides έχουν απομονωθεί. Αναφέρθηκαν διάφορες βιοδραστηριότητες του P. ginseng, όπως η ενίσχυση της ανοσοτροποποιητικής δραστηριότητας, η διατροφική ενίσχυση, η βελτίωση της ηπατικής λειτουργίας, η αντιδιαβήτη, η αντικαρκινική, η αντιαποπτωτική και η αντιοξειδωτική δράση [3-10].

Επί του παρόντος, το ενδιαφέρον για γεωργικά προϊόντα υψηλής ποιότητας που σχετίζονται με την ευημερία αυξάνεται σταδιακά, οδηγώντας στην υδροπονική καλλιέργεια του ginseng. Η υδροπονική καλλιέργεια έχει τα πλεονεκτήματα μιας απλής καλλιεργητικής διαδικασίας και μιας μικρότερης περιόδου ανάπτυξης από την καλλιέργεια στο έδαφος. Το υδροπονικό ginseng χρειάζεται μόνο 2-4 μήνες σε ένα σύστημα που ελέγχει τη θερμοκρασία, είναι απαλλαγμένο από φυτοφάρμακα, υγρό, ελαφρύ, έχει οργανικά συστατικά κ.λπ. [11]. Τα φύλλα του εδάφους-καλλιέργειας ginseng δεν χρησιμοποιούνται για ιατρικούς σκοπούς και λειτουργικά λαχανικά, ενώ τα φύλλα του υδροπονικού ginseng μπορούν να χρησιμοποιηθούν.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Συμπερασματικά, οι υδροπονικές συνθήκες οδήγησαν σε υψηλή περιεκτικότητα ginsenoside και η συνολική περιεκτικότητα ginsenoside στα φύλλα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στις ρίζες, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα φύλλα ginseng μπορεί να είναι μια καλή πηγή λειτουργικών λαχανικών και φαρμακευτικών βοτάνων.

Αρκετές γνωστές λευκαντικές ενώσεις, όπως η αρβουτίνη και το κοτζικό οξύ, έχουν διερευνηθεί για την αποτελεσματικότητά τους στη μείωση της μελανογένεσης [13]. Δυστυχώς, είναι απαραίτητο να βρεθούν ασφαλέστεροι και πιο αποτελεσματικοί παράγοντες λεύκανσης του δέρματος, λόγω του καρκινογόνου δυναμικού του κοτζικού οξέος και τόσο της ασφάλειας όσο και των παρενεργειών της αρμπουτίνης [14]. Ως εκ τούτου, έχει δοθεί συνεχώς μεγάλη προσοχή στην ανάπτυξη νέων φυσικών προϊόντων στη βιομηχανία καλλυντικών [15,16]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει την αναστολή της σύνθεσης μελανίνης από το P. ginseng που αναπτύσσεται στο έδαφος [17-20].

Ωστόσο, αυτές οι μελέτες αναφέρθηκαν με γνωστές ενώσεις, όπως το κινναμικό οξύ και οι φαινολικές ενώσεις, και δεν έχει αναφερθεί λευκαντική δράση από τα φύλλα του υδροπονικού P. ginseng (HPGL). Η συνεχιζόμενη εργασία μας οδήγησε στην απομόνωση δευτερευόντων ginsenosides από το HPGL. Συνήθως, οι ginsenosides σε ελάχιστες ή ελάχιστες ποσότητες δεν μπορούν να ανιχνευθούν με HPLC. Διαφορετικά, ο χρόνος ανάλυσης είναι πολύ μεγάλος, κάτι που δεν είναι βολικό για τον χαρακτηρισμό των ginsenosides στα μπαχαρικά ginseng [21,22]. Για την ταχεία ποσοτικοποίηση νέων ενώσεων, θα πρέπει να καθιερωθεί μια γρήγορη και ευαίσθητη μέθοδος, η οποία μπορεί να ανιχνεύσει διεξοδικά τα ίχνη νέων ενώσεων. Στην παρούσα μελέτη, καθιερώθηκε μια ευαίσθητη υγρή χρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με τη μέθοδο φασματομετρίας μάζας τετραπόλων/χρόνου πτήσης (UPLC-QTOF-MS) για τον ποσοτικό προσδιορισμό της νέας ένωσης.

Με βάση την παραπάνω περιγραφή, σε αυτή την εργασία, η απομόνωση και η ταυτοποίηση μιας νέας ένωσης, συμπεριλαμβανομένων των φυσικών ιδιοτήτων και της ποσοτικοποίησης, αποκαλύφθηκαν με φασματοσκοπικές μεθόδους και οι αντι-μελανογόνες δράσεις τους διερευνήθηκαν μέσω in vitro και in vivo συστημάτων.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

Φύλλα υδροπονικού Panax ginseng (HPGL) εκχυλίστηκαν με υδατικό MeOH και κατανεμήθηκαν σε κλάσματα οξικού αιθυλεστέρα (EtOAc), n-βουτανόλης (n-BuOH) και H2O, αντίστοιχα. Επαναλαμβανόμενες χρωματογραφίες στήλης SiO2 και ODS του κλάσματος n-BuOH έδωσαν μία νέα τζινσενοσίδη (1) και μία σπάνια τζινσενοσίδη (2) απομονώθηκε από το κλάσμα EtOAc του HPGL.

Η ένωση 1, λευκή σκόνη (μεθανόλη), έδειξε ένα πορφυρό χρώμα στην TLC, με ψεκασμό 10 τοις εκατό H2SO4 και θέρμανση. Ο μοριακός τύπος προσδιορίστηκε ότι είναι C37H64O10 από την κορυφή οιονεί μοριακού ιόντος m/z 713,44723 [M συν COOH]- στο αρνητικό QTOF/MS. Το φάσμα IR πρότεινε την παρουσία μιας ομάδας υδροξυλίου (3377 cm−1) και ενός διπλού δεσμού (1647 cm−1). Το φάσμα 1H-NMR (Πίνακας 1 και Συμπληρωματικά Υλικά) έδειξε δύο σήματα πρωτονίων ολεφίνης μεθίνης (δΗ 6,02, 5,64), τρία οξυγονωμένα σήματα πρωτονίων μεθίνης (δΗ 4,38, 4,03, 3,49), ένα σήμα πρωτονίου μεθοξυ μεθίνης (δΗ 6,02, 5,64). σήματα απλού μεθυλικού πρωτονίου (δΗ 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), υποδεικνύοντας ότι η ένωση 1 έχει ένα τετρακυκλικό τμήμα τριτερπενίου που περιλαμβάνει έναν διπλό δεσμό με trans διαμόρφωση και τρεις ομάδες υδροξυλίου.

Επιπροσθέτως, η ένωση 1 επιβεβαιώνεται ότι είναι ένας τύπος πρωτοπαναξατριόλης (PPT) από τη χημική μετατόπιση ενός σήματος μεθυλικού πρωτονίου σε δΗ 1,94 (Η-28). Η χημική μετατόπιση του Η-28 στον τύπο της πρωτοπαναξαδιόλης (PPD) συνήθως παρατηρείται σε περίπου δΗ 1,30 [23]. Επιπλέον, ένα σήμα πρωτονίου ημιακετάλης (δΗ 5,15) και αρκετές οξυγονωμένες μεθίνες και σήμα πρωτονίου μεθυλενίου σε δΗ 4,45–3,95 παρατηρήθηκαν ως σήματα ενός τμήματος σακχάρου. Από τη σταθερά σύζευξης του σήματος ανωμερούς πρωτονίου (J=7.6 Hz), τόσο το ημιακεταλικό πρωτόνιο όσο και το Η-2 του σακχάρου ήταν σε αξονική διάταξη. Ο συνδυασμός των προαναφερθέντων δεδομένων κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η ένωση 1 είναι ένας αμινογλυκοσίδης πρωτοπαναξατριόλης. Το φάσμα 13C-NMR εμφάνισε 37 σήματα άνθρακα λόγω τμημάτων τριτερπενίου, μεθοξυ και εξόζης. Δύο άνθρακες ολεφίνης μεθίνης (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), ένας οξυγονωμένος τεταρτοταγής άνθρακας (δC 74,9 (C-25)), τρεις οξυγονωμένοι άνθρακες μεθίνης (δC 78.5 (C-3), 7{{9{0}}.3 (C-12), 67.7 (C-6)), ένας μεθοξυάνθρακας (δC 50.2 ( 25-OCH3)), και οκτώ μεθυλάνθρακες (δC 31,9 (C{-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C{-26), 23,0 (C{{{{ 57}}), 17,6 (C{-18), 17,4 (C{-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C{-29)) σήματα παρατηρήθηκαν για την τμήμα αγλυκόνης. Τα δεδομένα NMR της ένωσης 1 ήταν παρόμοια με εκείνα της ένωσης 2, εκτός από τη χημική μετατόπιση για έναν οξυγονωμένο τεταρτοταγή άνθρακα, δηλ. C-25. Επιπλέον, το σάκχαρο ταυτοποιήθηκε ως -γλυκοπυρανόζη από τα σήματα άνθρακα ημιακετάλη (δC 98.3, (C-10 )), τέσσερις οξυγονωμένες μεθίνες (δC 78.9 (C-30), 78.2 (C{{82 }}), 75,2 (C-20), 71,6 (C-40)), και ένα οξυγονωμένο μεθυλένιο (δC 63,0 (C-60)). Στα φάσματα βαθμιδωτής συσχέτισης ετεροπυρηνικού πολλαπλού δεσμού (gHMBC), παρατηρήθηκε συσχέτιση μεγάλης εμβέλειας μεταξύ του σήματος ανωμερούς πρωτονίου (δH 5,15 (H{-10 )) και του οξυγονωμένου σήματος τεταρτοταγούς άνθρακα του αγλυκονίου (δC 83,0 (C -20)), υποδεικνύοντας ότι η -γλυκοπυρανόζη συνδέθηκε με το υδροξύλιο του C-20 (Εικόνα 1).

Επιπλέον, η συσχέτιση μεταξύ του σήματος μεθοξυ πρωτονίου (δH 3,18 (25-OCH3)) και του οξυγονωμένου σήματος τεταρτοταγούς άνθρακα (δc 74,9 (C-25)) έδειξε ότι το μεθοξυ ήταν συνδεδεμένο με το C{{ 7}} (Εικόνα 1). Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, η χημική δομή του 1 προσδιορίστηκε ότι είναι 20-O- -D-γλυκοπυρανοσύλιο-3 ,6 ,12,20 -τετραϋδροξυ-25- methoxydammar-23-ene, και ονομάστηκε ως ginsenoside Rh23. Η ένωση 2 ταυτοποιήθηκε ότι είναι 20-Ο{- -D-γλυκοπυρανοσύλιο-3,6,12,20,25- πενταϋδροξυδαμμάρ-23-ένιο από τις συγκρίσεις NMR και Δεδομένα MS με αυτά που αναφέρονται στη βιβλιογραφία [23,24] (Εικόνα 1). Οι ενώσεις 1 και 2 απομονώθηκαν, για πρώτη φορά, από το HPGL.

Η καθαρότητα της ginsenoside Rh23 προσδιορίστηκε ότι είναι μεγαλύτερη από 99 τοις εκατό από την κανονικοποίηση των περιοχών κορυφής που ανιχνεύθηκαν με ανάλυση UPLC. Εφόσον το UPLC-OTOF/MS έχει αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλο εργαλείο για την αναγνώριση της ginsenoside Rh23, ο διαχωρισμός των συστατικών στο εκχύλισμα HPGL πραγματοποιήθηκε με UPLC-OTOF/MS σε λειτουργία αρνητικού ιόντος. Το σχήμα 2 δείχνει ένα τυπικό χρωματογράφημα ολικών ιόντων (TIC) ginsenoside Rh23 και εκχυλίσματος με ανίχνευση μάζας.

Μια γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης λήφθηκε για τη ginsenoside Rh23 σε διαφορετικά επίπεδα συγκέντρωσης. Τα χαρακτηριστικά των διαγραμμάτων βαθμονόμησης συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Όπως φαίνεται στον πίνακα, η ginsenoside Rh23 δείχνει εξαιρετικούς συντελεστές συσχέτισης. Οι μετρήσεις των ανιχνευτών (σχετική περιοχή κορυφής) εξαρτώνται γραμμικά από τη συγκέντρωση του δείγματος στο εύρος των 0.02–0,8 μg/mL για το ginsenoside Rh23. Τα LOD της ginsenoside Rh23 ήταν 0.002 ppm. Τα LOQ της ginsenoside Rh23 προσδιορίστηκαν να είναι 0,005 ppm με UPLC-QTOF/MS σε τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος. Η ποσότητα ginsenoside Rh23 στο HPGL που ελήφθη χρησιμοποιώντας μεθόδους επικύρωσης (Πίνακας 2) ήταν 0,319 mg/g.

Για να προσδιοριστεί η αντι-μελανογόνος δράση, μελετήθηκε η αλλαγή στην περιεκτικότητα σε μελανίνη σε κύτταρα μελαν-α που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καθαρισμένες και ταυτοποιημένες ενώσεις. Τα κύτταρα μελαν-α υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 72 ώρες με ενώσεις 1 και 2 σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0 έως 80 μΜ και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε μέσω κιτ δοκιμασίας βιωσιμότητας κυττάρων CCK-8. Η κυτταρική βιωσιμότητα των ενώσεων 1 και 2 σε συγκέντρωση 80 μΜ για κύτταρο melan-a ήταν πάνω από 98,1 τοις εκατό και 97,8 τοις εκατό, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ενώσεις 1 και 2 έχουν μη κυτταροτοξική φύση. Η επίδραση των αντι-μελανογόνων δράσεων των ενώσεων φαίνεται στο Σχήμα 3. Η αναστολή της σύνθεσης μελανίνης της ένωσης 1 στα 20, 40 και 80 μΜ ήταν 8,4 τοις εκατό, 15,6 τοις εκατό και 37,0 τοις εκατό σε σύγκριση με τον έλεγχο. Η ένωση 2 έδειξε ελαφρώς χαμηλότερη ανασταλτική δράση από την ένωση 1 σε 7,6 τοις εκατό, 12,8 τοις εκατό και 17,8 τοις εκατό στα 20, 40 και 80 μΜ, αντίστοιχα. Και οι δύο ενώσεις ανέστειλαν τη σύνθεση μελανίνης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Συγκεκριμένα, η ένωση 1 έδειξε την υψηλότερη ανασταλτική δράση μελανίνης, 37,0 τοις εκατό σε συγκέντρωση 80 μΜ. Σύμφωνα με πληροφορίες, το εκχύλισμα ρίζας ginseng στα 0-1000 μg/mL δεν εμφάνισε καμία σημαντική αναστολή της μελανίνης [19] και το κινναμικό οξύ, ένας λευκαντικός παράγοντας που βρίσκεται κυρίως στο P. ginseng, έδειξε 29 τοις εκατό αναστολή της σύνθεσης μελανίνης στα 675 μΜ [20]. Σε σύγκριση με το εκχύλισμα ρίζας ginseng και κινναμωμικού οξέος, η ένωση 1 έδειξε ισχυρή ανασταλτική δράση σύνθεσης μελανίνης και ακόμη και 1.{12}}πλάσια ανασταλτική δράση της σύνθεσης μελανίνης σε οκτώ φορές χαμηλότερη συγκέντρωση σε σύγκριση με το κουμαρικό οξύ [ 17,20].

Το zebrafish είναι ένας εξαιρετικά πλεονεκτικός οργανισμός μοντέλου σπονδυλωτών λόγω των παρόμοιων συστημάτων οργάνων και των αλληλουχιών γονιδίων του με τον άνθρωπο [25]. Επιπλέον, η χρήση εμβρύων ζέβρα τυγχάνει αυξανόμενης προσοχής, καθώς θεωρούνται μέθοδος αντικατάστασης για πειράματα σε ζώα [26]. Το Zebrafish έχει χρωστικές μελανίνης στην επιφάνεια, επιτρέποντας την απλή παρατήρηση της διαδικασίας μελάγχρωσης χωρίς περίπλοκες πειραματικές διαδικασίες [27].

Έτσι, διερευνήσαμε τα ανασταλτικά αποτελέσματα της μελανίνης της ένωσης 1 στη μελάγχρωση του ζέβρα. Χρησιμοποιήσαμε PTU (Ν-φαινυλοθειουρία, αναστολέας τυροσινάσης που περιέχει θείο) ως θετικό μάρτυρα (Εικόνα 4Β), το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα για τα ζέβρα [28,29]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4C, D, 40 και 80 μΜ θεραπεία με την ένωση 1 παρήγαγε αξιοσημείωτη αναστολή της μελάγχρωσης του σώματος zebrafish, η οποία μείωσε αξιοσημείωτα τη συνολική περιεκτικότητα σε μελανίνη σε σύγκριση με το όχημα ελέγχου (Εικόνα 4Α).

Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε νέα ginsenoside Rh23 (1) από υδροπονικά φύλλα P. ginseng. Μέχρι στιγμής έχουν αναφερθεί περισσότερες από 100 ginsenosides από είδη ginseng. Ωστόσο, 25-υδροξυλιωμένοι σενοσίδες σπάνια εμφανίζονται στη φύση, συμπεριλαμβανομένων των φυτών τζίνσενγκ. Επιπλέον, δεν είχε αναφερθεί λευκαντική δραστηριότητα. Η ανασταλτική δράση της ginsenoside Rh23 έδειξε 37 τοις εκατό στο 80 μη συγκέντρωση χωρίς κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα μελαν-α, ενώ δεν παρατηρήθηκε αναστολή της in vitro δραστηριότητας της τυροσινάσης μανιταριού από τη ginsenoside Rh23 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πρόσφατα, τα εκχυλίσματα ή οι καθαρισμένοι τζινσενοσίτες από ρίζες και φύλλα τζίνσενγκ έχουν αποδειχθεί ότι διαθέτουν ευρέως αντιοξειδωτικές ιδιότητες (30,31), ενώ το νερό ή το οργανικό εκχύλισμα τζίνσενγκ έχει επιδείξει δράση καθαρισμού έναντι του DPPH, του ανιόντος υπεροξειδίου και της ρίζας υδροξυλίου (32). Επομένως, η νέα μας ginsenoside Rh23 που απομονώθηκε από τα φύλλα του υδροπονικού P. ginseng μπορεί να έχει μειωμένη ρύθμιση της τυροσινάσης λόγω της αντιοξειδωτικής της ιδιότητας. Ωστόσο, ο μελανογενετικός του ρόλος δεν έχει διερευνηθεί ακόμη. Επομένως, σε περαιτέρω μελέτη, είναι απαραίτητο να προσδιοριστούν οι ακριβείς μηχανισμοί της δράσης της ginsenoside Rh23 στη ρύθμιση της σύνθεσης μελανίνης.

3. Πειραματικό

3.1. Γενικός

Οι ρητίνες Kieselgel 60 και LiChroprep RP-18 χρησιμοποιήθηκαν για χρωματογραφία στήλης (Merck, Darmstadt, Γερμανία). Το Kieselgel 60 F254 (Merck) και το RP{4}} F254S (Merck) χρησιμοποιήθηκαν ως στερεές φάσεις για το πείραμα TLC. Η ανίχνευση κηλίδων στην πλάκα TLC πραγματοποιήθηκε με παρατήρηση κάτω από λάμπα UV (Spectroline, μοντέλο ENF-240 C/F, Spectronics Corp., Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) ή με ψεκασμό 10 τοις εκατό υδατικού H2SO4 στο ανεπτυγμένο πλάκα ακολουθούμενη από θέρμανση. Οι οπτικές περιστροφές μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ψηφιακό πολόμετρο JASCO P{10}} (Τόκιο, Ιαπωνία). Τα σημεία τήξεως ελήφθησαν χρησιμοποιώντας συσκευή σημείου τήξεως Fisher-Johns (επιστημονική εταιρεία Fisher, Pittsburgh, PA, USA) με μικροσκόπιο. Τα υπεριώδη φάσματα μετρήθηκαν σε φασματοφωτόμετρο UV{12}} μοντέλου Shimadzu (Shimadzu Corp., Κιότο, Ιαπωνία). Τα φάσματα IR ελήφθησαν από φασματόμετρο Perkin Elmer Spectrum One FT-IR (Buckinghamshire, UK). Τα φάσματα NMR καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA). Η ανάλυση UPLC-QTOF/MS διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια σειρά Waters Xevo G2-S (Waters Corp., Milford, MA, ΗΠΑ) που λειτουργεί στον τρόπο λειτουργίας αρνητικών ιόντων.

3.2. Φυτικά Υλικά

Το Hydroponic Panax ginseng καλλιεργήθηκε στο θερμοκήπιο του Τμήματος Έρευνας Φυτικών Καλλιεργειών που βρίσκεται στο Eumseong της επαρχίας Chungbuk σύμφωνα με το πρωτόκολλο του «τυποποιημένου οδηγού καλλιέργειας GAP GAP» [11,33] που αναπτύχθηκε από τη Διοίκηση Αγροτικής Ανάπτυξης, Δημοκρατία της Κορέας. Ρίζες δενδρυλλίων ginseng ενός έτους με βάρος 0,8 έως 1 g αγοράστηκαν από το Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science (NIHHS), Rural Development Administration (RDA) και αποθηκεύτηκαν σε θάλαμο σε χαμηλή θερμοκρασία (1–2 ◦C) πριν από τη χρήση. Οι ρίζες δενδρυλλίων ginseng μεταμοσχεύθηκαν σε θρεπτικά λουτρά και καλλιεργήθηκαν στο υδροπονικό σύστημα. Μετά από τρεις μήνες καλλιέργειας, τα υδροπονικά τζίνσενγκ τραβήχτηκαν για συγκομιδή. Τα συλλεχθέντα φυτά υδροπονικού τζίνσενγκ πλύθηκαν από τη σκόνη με νερό και ταξινομήθηκαν σε φύλλα και ρίζες, τα οποία στη συνέχεια ξηράνθηκαν για 72 ώρες σε ξηραντήρα ψύξης (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Κορέα). Ένα δείγμα κουπονιού (NIHHS14-03) κατατέθηκε στο ερμπάριο του Τμήματος Έρευνας Φυτικών Καλλιεργειών, NIHHS, RDA, Eumseong, Δημοκρατία της Κορέας.

3.3. Εξαγωγή και απομόνωση

Τα αποξηραμένα και κονιοποιημένα φύλλα υδροπονικού P. ginseng (HPGL, 6 kg) εκχυλίστηκαν με 80 τοις εκατό MeOH (30 L χ 3) σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. Τα εκχυλίσματα διηθήθηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού και εξατμίστηκαν υπό ελαττωμένη πίεση στους 45 ◦C για να δώσουν 1,4 kg εκχυλίσματος. Το εκχύλισμα χύθηκε σε Η2Ο (3 L) και εκχυλίστηκε με EtOAc (3 L x 3) και n-BuOH (2,6 L x 3), διαδοχικά. Κάθε στιβάδα συμπυκνώθηκε υπό μειωμένη πίεση για να ληφθούν κλάσματα EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) και Η2Ο (855 g).

Το κλάσμα n-BuOH (HPGLB, 130 g) εφαρμόστηκε στη στήλη πυριτικής πηκτής (φ 13 × 17 cm) και εκλούστηκε με CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 11{0 L) για να δώσει 20 κλάσματα (HPGLB1 έως HPGLB20). Τα κλάσματα HPGLB3 και HPGLB4 συνδυάστηκαν (18,9 g, Ve/Vt=0.05–{{{{0.12) και κλασματοποιήθηκαν περαιτέρω στη στήλη πυριτικής πηκτής (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) για να δώσει 14 κλάσματα (HPGLB3-1 προς HPGLB3-14). Τα κλάσματα HPGLB3-4 και HPGLB3-5 συνδυάστηκαν (1,27 g, Ve/Vt {{4{0}}.09–0,16) και κλασματοποιήθηκαν περαιτέρω στη στήλη ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) για να δώσει εννέα κλάσματα (HPGLB3-4-1 σε HPGLB3-4-9). Το κλάσμα HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0.14–0,26) κλασματώθηκε περαιτέρω στη στήλη ODS (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) για να δώσει εννέα κλάσματα (HPGLB{3-4-3-1 σε HPGLB{3-4-3-9) συμπεριλαμβανομένης της ένωσης 1 (HPGLB{3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0.42–0,55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Τα κλάσματα HPGLB5 έως HPGLB7 συνδυάστηκαν (24,0 g, Ve/Vt=0,12–0,22) και κλασματοποιήθηκαν περαιτέρω στη στήλη πυριτικής πηκτής (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) για να δώσει 16 κλάσματα (HPGLB5-1 σε HPGLB5-16). Το κλάσμα HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0.28–0,31) κλασματώθηκε περαιτέρω στη στήλη ODS (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) για να δώσει δέκα κλάσματα (HPGLB{5-6-1 σε HPGLB5-6-10) συμπεριλαμβανομένης της ένωσης 2 (HPGLB{5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Φασματοσκοπικά Δεδομένα

Ένωση 1. Λευκή σκόνη, σ.τ.: 138–140 ◦C; [ ] 25 D συν 17,4◦ (c=0,39, MeOH); IR (παράθυρο CaF2): 3377, 2932, 1382 cm−1; αρνητικό QTOF/MS m/z 713,44723 [M συν COOH]- (υπολογ. για C37H64O10, 668,4499). Δεδομένα 1H- και 13C-NMR, βλέπε Πίνακα 1.

Ένωση 2. Λευκή σκόνη, σ.τ.: 133–136 ◦C; [ ] 25 D συν 20,2◦ (c=0,50, MeOH); IR (παράθυρο CaF2): 3359, 2929, 1384 cm−1; αρνητικό QTOF/MS m/z 699,48311 [M συν COOH]- (υπολογ. για C36H62O10, 654,4323); Δεδομένα 1H- και 13C-NMR, βλέπε Πίνακα 1.

3.5. Ποσοτική ανάλυση της νέας ένωσης 1 με χρήση UPLC-QTOF/MS

Ένα πρότυπο διάλυμα αποθέματος της ένωσης 1 παρασκευάστηκε με διάλυση 1,00 mg το καθένα σε 1 mL μεθανόλης για να δώσει συγκέντρωση 1,00 mg/mL και διατηρήθηκε στους 4°C. Το πρότυπο μητρικό διάλυμα (1) αραιώθηκε με μεθανόλη για να ληφθούν διαλύματα βαθμονόμησης με εύρος 0.{{10}}2–{0,8 μg/mL, αντίστοιχα. Ένα γραμμάριο εκχυλίσματος HPGL ζυγίστηκε με ακρίβεια και διαλύθηκε σε σταθερούς όγκους (10 mL) μεθανόλης, διηθήθηκε μέσω διηθητικού χαρτιού 0.2{0 mm και ψύχθηκε στους 4 ◦C . Η UPLC πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας UPLC Waters ACQUITY H-Class (Waters Corp., Milford, ΜΑ, ΗΠΑ) με στήλη ACQUITY BEH C18 (2,1 χ 100 mm, 1,7 μm). Οι κινητές φάσεις αποτελούνταν από νερό (Α) με 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ (ο/ο) και ακετονιτρίλιο (Β) με 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ (ο/ο). Η βαθμίδα έκλουσης ήταν ως εξής: 0–4 λεπτά, Β 10–30 τοις εκατό. 4–15 λεπτά, Β 30–60 τοις εκατό ; 15–16 λεπτά, Β 60–100 τοις εκατό ; 16–19 λεπτά, Β 100–10 τοις εκατό. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,45 mL/min και ο όγκος έγχυσης ήταν 2 μL για κάθε εκτέλεση.

Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάλυση HR-MS χρησιμοποιώντας ένα Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, ΜΑ, ΗΠΑ) που λειτουργεί σε κατάσταση αρνητικού ιόντος. Τα φασματόμετρα μάζας εκτελούσαν εναλλασσόμενες σαρώσεις υψηλής και χαμηλής ενέργειας γνωστές ως λειτουργία λήψης MSE. Λήφθηκαν ακριβείς μετρήσεις μάζας χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σύστημα χορήγησης βαθμονόμησης που περιέχει εγκεφαλίνη λευκίνης, m/z 554.262 (κατάσταση ESI αρνητική) ως εσωτερική αναφορά. Οι βέλτιστες παράμετροι λειτουργίας ορίστηκαν όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.

3.6. Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα μελανοκύτταρα Melan-a είναι μια πολύ χρωματισμένη, απαθανατισμένη, μια φυσιολογική κυτταρική σειρά μελανοκυττάρων ποντικού που προέρχεται από ποντίκια C57BL/6. Τα κύτταρα melan-a που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την Dr. Dorothy Bennett (Νοσοκομείο St. George's, Λονδίνο, UK). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ◦C σε μια ατμόσφαιρα 95 τοις εκατό αέρα, 10 τοις εκατό CO2 σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο σε τελική συγκέντρωση με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό, 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη και 200 ​​nM PMA. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από το κιτ μέτρησης κυττάρων CCK-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Ιαπωνία).

3.7. Δοκιμασία μελανίνης

Τα κύτταρα Melan-a υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενώσεις για 72 ώρες και στη συνέχεια τα κύτταρα διαλύθηκαν σε 1 Ν NaOH στους 60°C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης μετρήθηκαν στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στην περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των προϊόντων λύσης κυττάρων. Τα κυτταρολύματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA).

3.8. Προέλευση και συντήρηση των γονικών ψαριών

Τα ενήλικα ζέβρα ελήφθησαν από έναν εμπορικό αντιπρόσωπο και 10–15 ψάρια διατηρήθηκαν σε ακρυλική δεξαμενή 5 L με τις ακόλουθες συνθήκες: 28,5 ◦C, με κύκλο φωτός/σκότους 14/10 ωρών. Τα ζέβρα ταΐζονταν τρεις φορές την ημέρα, έξι ημέρες την εβδομάδα, με τροφή νιφάδας TetraMin συμπληρωμένη με ζωντανές γαρίδες άλμης (Artemia salina). Τα έμβρυα ελήφθησαν από φυσική ωοτοκία που προκλήθηκε το πρωί με το άναμμα του φωτός. Η συλλογή των εμβρύων ολοκληρώθηκε μέσα σε 30 λεπτά. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα και οι διαδικασίες εγκρίθηκαν και διεξήχθησαν σύμφωνα με τις εγκεκριμένες οδηγίες και κανονισμούς της Επιτροπής Δεοντολογίας των Ζώων του Εθνικού Πανεπιστημίου Chungnam (CNU-00866).

3.9. Θεραπεία ενώσεων και αξιολόγηση βάσει φαινοτύπων

Τα συγχρονισμένα έμβρυα συλλέχθηκαν και ταξινομήθηκαν με σιφώνιο (7–9 έμβρυα ανά φρεάτιο σε 24-πλάκες που περιείχαν 1 mL εμβρυϊκού μέσου). Οι δοκιμαστικές ενώσεις διαλύθηκαν σε 0,1 τοις εκατό DMSO και στη συνέχεια προστέθηκαν στο μέσο του εμβρύου από εννέα έως 72 ώρες μετά τη γονιμοποίηση (hpf) (63 ώρες έκθεσης). Οι επιδράσεις στη μελάγχρωση του zebrafish παρατηρήθηκαν κάτω από το στερεομικροσκόπιο. Περιστασιακή ανάδευση, καθώς και αντικατάσταση του μέσου, γινόταν καθημερινά για να εξασφαλιστεί η ομοιόμορφη κατανομή των ενώσεων. Σε όλα τα πειράματα, 0.2 mM 1-φαινυλ-2-θειουρία (PTU) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία διαφανών ψαριών ζέβρα χωρίς να παρεμβαίνει στην αναπτυξιακή διαδικασία [33] και θεωρήθηκε ως τυπικός θετικός έλεγχος. Οι αξιολογήσεις με βάση το φαινότυπο της μελάγχρωσης του σώματος αποχοριώθηκαν με λαβίδα, αναισθητοποιήθηκαν σε διάλυμα μεθανοσουλφονικής τρικαΐνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ), τοποθετήθηκαν σε 3 τοις εκατό μεθυλοκυτταρίνη σε ένα πιάτο 35 mm (SPL Lifesciences, Pocheon, Korea), και φωτογραφήθηκε κάτω από το στερεομικροσκόπιο MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Γερμανία).

4. Συμπεράσματα

Σε αυτή τη μελέτη, η ginsenoside Rh23 (1) απομονώθηκε από υδροφωνικά φύλλα Panax ginseng μαζί με 20-O- -D-glucopyranosyl-3 ,6 ,12,20,25- pentahydroxydammar-23-ene (2). Ήμασταν γενικά επιτυχείς στην προσπάθειά μας να επιτύχουμε την υπο-χρωστική δράση των ενώσεων από το υδροπονικό P. ginseng. Το Ginsenoside Rh23 και το 20-O- -D-glucopyranosyl-3 ,6 ,12,20,25-pentahydroxydammar23-ene έχουν ανασταλτικές δραστηριότητες στη βιοσύνθεση μελανίνης χωρίς κυτταροτοξικές επιδράσεις σε μελαν-ένα κύτταρο. Επιπλέον, η ginsenoside Rh23 ενίσχυσε την αποχρωματισμό του ζέβρα ως εναλλακτικό ζωικό μοντέλο. Η μείωση της περιεκτικότητας σε μελανίνη και της μελάγχρωσης στο σώμα μπορεί να έχει τη δυνατότητα για λευκαντική δραστηριότητα και η μη κυτταροτοξική δράση είναι το πιο ευνοϊκό σημείο, επειδή η ασφάλεια αποτελεί πρωταρχικό μέλημα για τους λευκαντικούς παράγοντες στα καλλυντικά προϊόντα.

Έτσι, με βάση τα τρέχοντα αποτελέσματά μας, είναι σημαντικό οι νέες υδροφωνικές ενώσεις P. ginseng να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δυνητικά αποτελεσματικός παράγοντας φωτισμού του δέρματος. Περαιτέρω μελέτες θα αποσαφηνίσουν τους ακριβείς μηχανισμούς της δράσης της ginsenoside Rh23 στη ρύθμιση της σύνθεσης μελανίνης και τη σχέση μεταξύ των δομικών χαρακτηριστικών της ginsenoside Rh23 και της μελανογένεσης, για να εξακριβωθεί εάν είναι ένας πιθανός λευκαντικός παράγοντας για τη βιομηχανία καλλυντικών. Τα πλεονεκτήματα της υβριδικής φασματομετρίας μάζας Q-TOF περιλαμβάνουν όχι μόνο την ικανότητα ανίχνευσης ποιότητας και την ευαισθησία, αλλά και την ακριβή μέτρηση, καθιστώντας ευκολότερες τις δομικές διευκρινίσεις. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό δευτερευόντων ή νέων ενώσεων, γεγονός που βοηθά στη βελτίωση του ποιοτικού ελέγχου των μπαχαρικών ginseng.

Συμπληρωματικά Υλικά:

Τα φάσματα 1H-NMR και 13C-NMR του 1 είναι διαθέσιμα στα Συμπληρωματικά Υλικά.

Ευχαριστίες:

Αυτή η εργασία διεξήχθη με την υποστήριξη του "Συνεργατικού Ερευνητικού Προγράμματος για την Ανάπτυξη της Επιστήμης και Τεχνολογίας της Γεωργίας" (PJ01136203), Διοίκηση Αγροτικής Ανάπτυξης, Δημοκρατία της Κορέας. Ευχαριστούμε τον Cheol-Hee Kim (Εθνικό Πανεπιστήμιο Chungnam) που μοιράστηκε την εγκατάσταση του ζέβρα.

Συνεισφορές συγγραφέα:

Οι DYL και N.-IB συνέλαβαν και σχεδίασαν τα πειράματα. Τα H.-GK και Y.-GL απομόνωσαν τις ενώσεις. Η DYL διευκρίνισε τις δομές. Ο I.-BJ συνέβαλε στην προετοιμασία των φυτικών υλικών. Η JHK πραγματοποίησε τη βιολογική ανάλυση και βοήθησε στην προετοιμασία του χειρογράφου. Οι JWL και B.-RC πραγματοποίησαν τα NMR και UPLC-QTOF/MS των δειγμάτων. Ο G.-SK βοήθησε στην αναθεώρηση του χειρογράφου. και η DYL έγραψε την εργασία και διαχειρίστηκε το ερευνητικό έργο. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Σύγκρουση συμφερόντων:

Οι συγγραφείς δεν δηλώνουν σύγκρουση συμφερόντων. Οι ιδρυτικοί χορηγοί δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης. συλλογή, αναλύσεις ή ερμηνεία των δεδομένων· συγγραφή του χειρογράφου· ή την απόφαση δημοσίευσης των αποτελεσμάτων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Ben, EW; Michael, W. Φαρμακευτικά φυτά του κόσμου. Στο Shinilbooks? Timber Press Inc.: Portland, OR, USA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Βιολογικές δραστηριότητες και χημεία σαπωνινών από την Panax ginseng CA Meyer. Phytochemistry 2005, 4, 159-175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Η επίδραση ενίσχυσης του ανοσοποιητικού του ginseng φόρεμα βουνού, του ginseng που καλλιεργείται στο βουνό και του Panax ginseng. J. Orient. Neuropsychiatry 2004, 15, 89-101.

4. Gillis, CN Panax ginseng φαρμακολογία: Ένας σύνδεσμος νιτρικού οξειδίου; Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, Ν.; Kim, HY; Yokozawa, T. Επίδραση του εκχυλίσματος μεθανόλης του ήλιου ginseng σε ηπατική βλάβη που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες σε αρουραίους. Phytomedicine 2007, 14, 840-845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, Η.; Xu, G.; Han, Χ.; Du, Ρ.; An, L. Επιδράσεις της ένωσης Κ στην υπεργλυκαιμία και την αντίσταση στην ινσουλίνη σε αρουραίους με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Επιδράσεις της ginsenoside Rg3 και Rh2 στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Αψίδα. Pharm. Res. 2004, 27, 429-435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, Ε.; Amato, Μ.; Izzo, AA Οι αφροδισιακές και προσαρμογόνες ιδιότητες του ginseng. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Αντιοξειδωτικές και αντικαρκινικές δραστηριότητες του εκχυλίσματος μεθανόλης του θερμικά επεξεργασμένου ginseng. Cancer Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; Όχι, HJ; Kwon, Η.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Επιδράσεις φυσικών βιοδραστικών προϊόντων στην ανάπτυξη και τα περιεχόμενα ginsenoside του Panax ginseng που καλλιεργείται σε ένα αεροπονικό σύστημα. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, ΥΜ; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Σύγκριση περιεχομένων ginsenoside και φαινολικών συστατικών σε φύλλα, φρούτα και ρίζες ginseng που καλλιεργούνται υδροπονικά. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, Η.; Nakamura, S.; Kubo, M. Μελέτες φαρμάκων για την επιδερμίδα από φυσικές πηγές. II. Ανασταλτικές επιδράσεις των φυτών Prunus στη βιοσύνθεση μελανίνης. Biol. Pharm. Ταύρος. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Επίδραση του νιτρώδους νατρίου, του χλωριούχου νατρίου και του νιτρικού νατρίου στη βλάστηση και την ανάπτυξη αναερόβιων σπορίων. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, Κ.; Yasutake, S.; Kondo, R. Ένα νέο στιλβένιο με ανασταλτική δράση τυροσινάσης από το Chlorophora υπερέχει. Chem. Pharm. Ταύρος. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Park, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Yoo, ID? Park, KC Terrin: Ένας νέος αναστολέας μελανογένεσης και ο μηχανισμός του. Κύτταρο. ΜοΙ. Life 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Son, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Ανασταλτικές επιδράσεις του κινναμωμικού οξέος στη βιοσύνθεση μελανίνης στο δέρμα. Biol. Pharm. Ταύρος. 2008, 31, 946-948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Ποσοτική ανάλυση φαινολικών ενώσεων σε διάφορα μέρη του Panax ginseng CA Meyer και η ανασταλτική του επίδραση στη βιοσύνθεση μελανίνης. Κορεάτης J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Επίδραση του radix ginseng και του radix trichosanthis στη μελανογένεση. Biol. Pharm. Ταύρος. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO Σύγκριση των περιεχομένων σε φαινολικές ενώσεις μεταξύ λευκού και κόκκινου ginseng και της ανασταλτικής τους δράσης στη βιοσύνθεση μελανίνης. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Τραγούδι, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Ανάλυση χαμηλών πολικών ginsenosides σε ατμό Panax ginseng σε υψηλή θερμοκρασία με HPLC-ESI-MS/MS. Chem. Res. Πηγούνι. Παν. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Χημικοί μετασχηματισμοί Luo, GA που προκαλούνται από τον ατμό και ολιστική αξιολόγηση της ποιότητας του κόκκινου ginseng που προέρχεται από το Panax ginseng χρησιμοποιώντας δακτυλικό αποτύπωμα ποσοτικοποίησης πολλαπλών συστατικών βασισμένο σε HPLC-ESI-MS/MSn. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MY; Yang, Β.; Jin, YR Τρεις νέες τριτερπενικές σαπωνίνες τύπου dammarane από τα φύλλα του Panax ginseng CA Meyer. J. Asian Nat. Κέντρο. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, Τ.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Υ.; Liang, X. Comprehensive HILIC x RPLC με ανίχνευση φασματομετρίας μάζας για την ανάλυση σαπωνινών στο Panax notoginseng. Αναλυτής 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Love, DR; Pichler, FB; Dodd, Α.; Copp, BR; Greenwood, DR Technology για οθόνη υψηλής απόδοσης: Το παρόν και το μέλλον με χρήση zebrafish. Curr. Γνώμη. Biotechnol. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, Η.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Έμβρυα Zebrafish ως εναλλακτική λύση στα πειράματα σε ζώα-Ένα σχόλιο σχετικά με τον ορισμό της έναρξης του σταδίου προστατευμένης ζωής στους κανονισμούς για την καλή διαβίωση των ζώων. Αναπαραγωγή. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, το TJ Zebrafish ως νέο μοντέλο για τον έλεγχο με βάση το φαινότυπο των μελανογόνων ρυθμιστικών ενώσεων. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Ελσαλήνη, ΟΑ; Η Rohr, KB Phenylthiourea διαταράσσει τη λειτουργία του θυρεοειδούς κατά την ανάπτυξη του ζέβρα. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Όχι, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Το δυναμικό των δευτερευόντων ginsenosides που απομονώνονται από τα φύλλα του Panax ginseng ως αναστολείς της μελανογένεσης. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, Μ.; Teoh, Η.; Man, οι σαπωνίνες RY Panax quinquefolium προστατεύουν τις λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας από την οξείδωση. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosides σε ρίζες και φύλλα αμερικανικού ginseng. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717-720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Αντιοξειδωτικές ιδιότητες διαφόρων διαλυτικών εκχυλισμάτων από φύλλα άγριου ginseng. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. Εθνικό Ινστιτούτο Επιστήμης Καλλιεργειών. Ginseng GAP Πρότυπη Οδηγία Καλλιέργειας. National Institute of Crop Science, Rural Development Administration: Suwon, Κορέα, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Generating transparent zebrafish: Μια εκλεπτυσμένη μέθοδος για τη βελτίωση της ανίχνευσης της γονιδιακής έκφρασης κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Mar. Biotechnol. 2001, 3, 522-527. [CrossRef] [PubMed]

Διαθεσιμότητα δείγματος:

Δείγματα των ενώσεων 1 και 2 είναι διαθέσιμα από τους συγγραφείς.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 and Nam-In Baek 2,*

1 Τμήμα Έρευνας Φυτικών Καλλιεργειών, Εθνικό Ινστιτούτο Οπωροκηπευτικών και Επιστήμης Βοτάνων, RDA, Eumseong 27709, Κορέα; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Τμήμα Βιοτεχνολογίας Ανατολικής Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Kyung Hee, Yongin 17104, Κορέα; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Λήψη: 28 Νοεμβρίου 2017; Αποδοχή: 26 Ιανουαρίου 2018; Δημοσίευση: 29 Ιανουαρίου 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com