Υλικά και μέθοδοι

6. Δοκιμασίες κυτταρικής πρόσληψης

Η εσωτερίκευση των EVs στα κύτταρα παρακολουθήθηκε με πρώτη χρώση των LEV και SEV με λιπόφιλο DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Μετά από επεξεργασία κυττάρων με χρωματισμένα EVs για 1, 3, 6, 12, 24 και 48 ώρες, το μέσο ανάπτυξης αφαιρέθηκε και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (Wako, Ιαπωνία). Προστέθηκε Hoechst 33342 (Invitrogen) και τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να χρωματιστούν οι πυρήνες (μπλε). Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS που περιείχε 1 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού και παρατηρήθηκε φθορισμός (κόκκινο και μπλε) κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία). Επιλέχθηκαν τουλάχιστον τρία πεδία και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

7. Μέτρηση περιεκτικότητας σε μελανίνη

Για την αξιολόγηση της περιεκτικότητας σε μελανίνη, τα κύτταρα μελανώματος B16BL6 εμβολιάστηκαν πρώτα σε 24-τρυβλία φρεατίων (5 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) σε όγκο 500 μL. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταραυποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) μόνο ή 50 μL LEVs και SEVs στα 1, 5 και 10 μg/mL για 48 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με 2,5 τοις εκατό θρυψίνη (Gibco, Thermo Fisher Scientific) για απομόνωση. Οι κυτταρικές μικροσφαίρες διαλύθηκαν σε 1 η διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (Sigma-Aldrich) που περιείχε 1 τοις εκατό DMSO (Sigma-Aldrich) για 1 ώρα στους 80 βαθμούς. Τα κυτταρολύματα μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και η περιεκτικότητα σε μελανίνη προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 405 nm χρησιμοποιώντας δείκτη ενζύμου (BioTek). Η περιεκτικότητα σε μελανίνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη μελανίνης που κατασκευάστηκε από 0-100 μg/mL συνθετικό διάλυμα μελανίνης (Sigma-Aldrich) (εξωκυτταρικά κυστίδια Σχήμα ως εξής). Η περιεκτικότητα σε μελανίνη υπολογίστηκε σε σύγκριση με τους ελέγχους.

8. Δοκιμασία δραστικότητας τυροσινάσης

Η δραστικότητα TYR μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δραστικότητα οξειδάσης L-DOPA. Τα κύτταρα B16BL6 εμβολιάστηκαν σε μέσο -MEM που περιείχε 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 μL) και καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1 × 105 κύτταρα/φρεάτιο σε 24-πλάκες καλλιέργειας φρεατίων. Μετά την επεξεργασία των κυττάρων με 50 μL LEVs και SEVs σε συγκεντρώσεις 10, 50 και 100 μg/mL για 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με 1 τοις εκατό Triton X-100 (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα που υπέστησαν λύση επωάστηκαν σε - 80 βαθμό για 30 λεπτά και στη συνέχεια λυοφιλίστηκαν και αποθηκεύτηκαν σε RT για 10 λεπτά. Τα προκύπτοντα δείγματα διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στους 12,000 × g για 15 λεπτά, μετά τα οποία προστέθηκαν 2 mg/mL L-DOPA (Sigma-Aldrich) και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 1 ώρα. Στη συνέχεια μετρήθηκε η απορρόφηση στα 490 nm χρησιμοποιώντας ενζυμικό δείκτη (BioTek). Η απορρόφηση στη συνέχεια μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας BioTek.

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετετα οφέλη του Cistanche της λεύκανσης του δέρματοςκαιποιες είναι οι επιπτώσεις του Cistanche tubulosa

9. Ανάλυση Western blot

Τα επίπεδα πρωτεΐνης που σχετίζονται με την αντι-μελανογόνο οδό προσδιορίστηκαν ενδοκυτταρικά με ανάλυση Western blot εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων. Ένας όγκος 500 μL κυττάρων μελανώματος ποντικού B16BL6 εμβολιάστηκε σε τρυβλία 24- φρεατίων (1 × 105 κύτταρα/φρεάτιο). Τα κύτταρα λύθηκαν με επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Fisher Scientific) για 20 λεπτά παρουσία μίγματος αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Γερμανία) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μL 10, 50 και 100 μg/mL EVs για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα φυγοκεντρήθηκαν στα 17 709 g για 15 λεπτά και η συγκέντρωση πρωτεΐνης στα προκύπτοντα προϊόντα λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας BCA (Thermo Fisher Scientific). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (10-20 ug/δείγμα) φορτώθηκαν στα φρεάτια των πηκτωμάτων Bolt 4-12 τοις εκατό Bis-Tris Plus (Invitrogen) και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (φθοριούχο πολυβινυλιδένιο) (GE Healthcare, Σικάγο, IL, ΗΠΑ). Οι μεμβράνες πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Tris που περιείχε 0,2 τοις εκατό (v/v) ten -20 (TBST), κλείστηκαν με TBST που περιείχε 5 τοις εκατό (w/v) αποβουτυρωμένο γάλα (Gibco, Thermo Fisher Scientific) για 1 ώρα σε RT, και στη συνέχεια επωάστηκε στους 4 βαθμούς σε διάλυμα πρωτογενούς αντισώματος αραιωμένο με 1 τοις εκατό (β/ο) αποβουτυρωμένο γάλα. Η επώαση πραγματοποιήθηκε όλη τη νύχτα. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν αντισώματα anti-TRP-1 (1:1000), anti-TRP-2 (1:1000) και αντι-MITF(1:1000) από την Abcam, Cambridge, UK. αντισώματα anti-TYR (1:500) από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Το αντίσωμα κατά της ακτίνης (1:500, Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκε για τυποποίηση σε επίπεδο πρωτεΐνης. Τα πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύθηκαν με δευτερεύον αντίσωμα επισημασμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (HRP) από την Genetex (Irvine, CA, USA). Οι μεμβράνες πλύθηκαν με TBST και επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT με αραίωση 1:2000 του δευτερογενούς αντισώματος σε TBST. Το σήμα που δημιουργήθηκε μετά το πλύσιμο της μεμβράνης με TBST και την επώαση με αντιδραστήριο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (GE Healthcare) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης γέλης ImageQuant 350 (GE Healthcare).

10. Ανίχνευση ενδοκυτταρικής παραγωγής μελανίνης με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LEV ή SEV και επωάστηκαν για 48 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με επώαση με 200 mM ρυθμιστικό κακοδυλικού που περιείχε 8 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη και 20 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (Wako). Αφού αφυδατώθηκαν με αιθανόλη, παρασκευάστηκαν εξαιρετικά λεπτές τομές χρησιμοποιώντας μικροτόμο Leica EM UC7 (Leica) και συλλέχθηκαν σε ένα πλέγμα χαλκού 200-πλέγματος. Οι τομές χρωματίστηκαν με 1 τοις εκατό οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και οι εικόνες αποκτήθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης JEOL JEM 1010 (JEOL) στα 80 kV.

Εκχύλισμα Cistanche

11. Μέτρηση του λευκαντικού αποτελέσματος χρησιμοποιώντας μοντέλο ανθρώπινου δέρματος

Το μοντέλο ανθρώπινου δέρματος derm-me (Tego Science, Σεούλ, Κορέα) χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή της λευκαντικής επίδρασης των LEV. Ο ανθρώπινος δερματικός ιστός υποβλήθηκε σε θεραπεία με 10 μg/mL lev για 7 ημέρες ως αρνητικός έλεγχος. Η συγκέντρωση της αρβουτίνης ήταν 70 μg/mL. Ο ανθρώπινος ιστός δέρματος διαλύθηκε σε 1 Ν ΝαΟΗ και η απορρόφηση στα 405 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δείκτη ενζύμου (BioTek) για να προσδιοριστεί η περιεκτικότητα σε μελανίνη. Την ημέρα 7, η μελάγχρωση του δέρματος συγκρίθηκε με μικροσκοπική ανάλυση δειγμάτων χρωματισμένων με Fontana - mason. Για τη χρώση Fontana-Masson, τα δείγματα δέρματος σταθεροποιήθηκαν όλη τη νύχτα σε RT σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης (Waco), τεμαχίστηκαν και ενσωματώθηκαν σε κερί παραφίνης. Τα ενσωματωμένα σε παραφίνη τμήματα στη συνέχεια θερμάνθηκαν σε φούρνο στους 60 βαθμούς για 1 ώρα για να στεγνώσουν. Οι τομές στη συνέχεια εμποτίστηκαν τρεις φορές σε ξυλόλιο, δύο φορές σε 95 τοις εκατό αιθανόλη, και δύο φορές σε 100 τοις εκατό αιθανόλη, και στη συνέχεια πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό. Η χρώση Fontana-Masson πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αμμωνιακό διάλυμα αργύρου στους 56 βαθμούς και πλύθηκε με απεσταγμένο νερό. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα χλωριούχου χρυσού 0,2 τοις εκατό και βυθίστηκαν σε διάλυμα θειοθειικού νατρίου 5 τοις εκατό σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι διαφάνειες αφυδατώθηκαν σε φρέσκο ​​οινόπνευμα.

12. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα που λαμβάνονται από τα πειράματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Πραγματοποιήσαμε πειράματα με τέσσερις παρτίδες δραστηριότητας, περιεκτικότητα σε μελανίνη και δραστηριότητα TYR (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και η δοκιμή Dunnett πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA). p < διαφορές; 0.05, p < 0,01, p < 0,001 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά.

Εκχύλισμα Cistanche tubulosa

Συζήτηση

Σε αντίθεση με τα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα, τα φυτά έχουν ένα πολύπλοκο κυτταρικό τοίχωμα, το οποίο αποτελεί σημαντικό εμπόδιο στην κίνηση των εξωσωμάτων. Ως αποτέλεσμα, τα φυτικά κύτταρα απελευθερώνουν εξωσώματα μέσω μιας σειράς πολυκυστιδιακών σωμάτων συγχωνευμένων με την πλασματική μεμβράνη. Τα εκκριτικά προϊόντα που απελευθερώνονται από τις εκκρίσεις των φυτών εναποτίθενται στο περιπλασμικό διάκενο δίπλα στην πλασματική μεμβράνη. καθώς συσσωρεύονται, δημιουργούν μια πίεση που επιτρέπει στο έκκριμα να διασχίσει το φράγμα του κυτταρικού τοιχώματος. Ως αποτέλεσμα, το εκκρινόμενο υλικό, συμπεριλαμβανομένων των εξωσωμάτων, μπορεί να απελευθερωθεί χωρίς την ανάγκη ενέργειας. Τα EV που προέρχονται από φυτά είναι παρόμοια σε μέγεθος ή μεγαλύτερα από τα φυσικώς απαντώμενα εξωσώματα ζωικών κυττάρων και είναι παρόμοια με αυτά που παρατηρούνται στο εξωσωματικό υγρό ηλίανθου (50-200 nm) και στα EV Arabidopsis (50-300 nm). Η αποτελεσματικότητα της κυτταρικής πρόσληψης θεωρείται βασικός καθοριστικός παράγοντας της αποτελεσματικότητας, καθώς οι στόχοι πολλών θεραπευτικών παραγόντων εντοπίζονται ενδοκυτταρικά. Ως εκ τούτου, προσδιορίσαμε τον βέλτιστο χρόνο και τη συγκέντρωση πρόσληψης από κύτταρα μελανώματος και παρατηρήσαμε ταχεία μεταφορά των LEVs και SEVs στα κύτταρα μελανώματος εντός 12 ωρών.

Το TYR είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που καταλύει τη μετατροπή της l-τυροσινάσης σε L-DOPA, το στάδιο περιορισμού του ρυθμού στη σύνθεση μελανίνης. Και τα δύο EV επιδεικνύουν αντι-μελανογόνο δράση, αλλά η αντι-μελανογονική δράση του LEV είναι σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή του SEV.

Η παραγωγή μελανίνης ρυθμίζεται από το -MSH-MC1R και η αναστολή της PKC είναι γνωστό ότι μειώνει τη μελάγχρωση του δέρματος και των μαλλιών. Ωστόσο, πολλές γενετικές, βιοχημικές και φαρμακολογικές μελέτες υποδεικνύουν ότι η οδός σηματοδότησης -MSH-MC1R είναι ο κύριος μοχλός της μελανογένεσης. Αν και τα πειράματά μας δεν έδειξαν άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ MITF και TYR, αποδείχθηκε ότι τα LEV αναστέλλουν τη μελανογένεση μειώνοντας την έκφραση του MITF μέσω της εξαρτώμενης από την υπεριώδη ακτινοβολία οδού -MSHMC1R, το οποίο με τη σειρά του μειώνει την έκφραση του TYR, TRP-1, και TRP{10}}. Υποθέτουμε ότι οι πρωτεΐνες της οικογένειας TRP συνδέονται έμμεσα μεταξύ τους, αλλά μπορεί να απαιτηθούν περαιτέρω πειράματα για να αποδειχθεί μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Επιπλέον, ανακατασκευασμένα μοντέλα ανθρώπινου δέρματος δείχνουν ότι η επαγόμενη από την υπεριώδη ακτινοβολία σύνθεση μελανίνης και η περιεκτικότητα σε μελανίνη αναστέλλονται αποτελεσματικά από τα LEV.

Cistanche dulcis

συμπέρασμα

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι τα LEV είναι υποψήφια για νέα αντιμελανογόνα φάρμακα που μειώνουν τη μελανογένεση αναστέλλοντας την έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μελανίνη. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι τα LEVs μείωσαν το MITF και επομένως μείωσαν τα TRP στα κύτταρα μελανώματος B16BL6. Τα levs και η αρβουτίνη ανέστειλαν το TRY κατά 66 τοις εκατό και 67 τοις εκατό, αντίστοιχα. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη του ανακατασκευασμένου δέρματος που υποβλήθηκε σε αγωγή με LEV μειώθηκε κατά 43 τοις εκατό και 28 τοις εκατό σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα που δεν υποβλήθηκε σε αγωγή και την αρμπουτίνη ως θετικό έλεγχο, αντίστοιχα.

Με βάση τα πρώτα ευρήματα, πιστεύουμε ότι τα ηλεκτρικά φυτικής προέλευσης θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα ως αντιμελανογόνος παράγοντας για την ανάπτυξη φυσικών καλλυντικών. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα στο μέλλον για την ανάπτυξη EVs φυτικής προέλευσης ως αποτελεσματικό συστατικό για τη βελτίωση του δέρματος και είναι απαραίτητο να αποδειχθεί η ασφάλεια των ηλεκτρικών οχημάτων φυτικής προέλευσης σε μοντέλα ανθρώπινου δέρματος. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το EV μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να μειώσει τη μελανίνη και έτσι να φωτίσει το δέρμα. Ωστόσο, το EV μπορεί να έχει τοξικές επιδράσεις στο δέρμα και θα πρέπει να πραγματοποιηθούν άλλα πειράματα, όπως τεστ αλλεργίας ή τεστ Ames.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. Ένας ρόλος για τη φυσαλιδώδη μεταφορά μακρομορίων στα κυτταρικά τοιχώματα στην παθογένεση των μυκήτων. Commun Integr Biol. 2008; 1 (1): 37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Μη συμβατική έκκριση πρωτεΐνης στα φυτά: μια κριτική αξιολόγηση. Πρωτόπλασμα. 2016; 253 (1): 31–43.

[3] Paiva EA. Πώς τα εκκριτικά προϊόντα διασχίζουν το τοίχωμα των φυτικών κυττάρων για να απελευθερωθούν; Μια νέα υπόθεση που περιλαμβάνει κυκλικές μηχανικές δράσεις του πρωτοπλάστη. Ann Bot. 2016; 117(4):533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Μεγιστοποίηση της εξωσωμικής κολλοειδούς σταθερότητας μετά από ηλεκτροδιάτρηση. Anal Biochem. 2014; 448 (1): 41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια που απομονώνονται από τον αποπλάστη των φύλλων φέρουν πρωτεΐνες απόκρισης στο στρες. Plant Physiol. 2017; 173 (1): 728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, et al. Τεχνολογία εξωσωμάτων ως εξευγενισμένες βιολογικές νανοπλατφόρμες για τη χορήγηση φαρμάκων. Acta Pharmacol Sin. 2017; 38 (6): 754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Μηχανισμοί ρύθμισης της μελανογένεσης. Ένα σουτιέν Dermatol. 2013; 88 (1): 76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Η τοπική εφαρμογή ενός αναστολέα πρωτεϊνικής κινάσης C μειώνει τη μελάγχρωση του δέρματος και των μαλλιών. J Invest Dermatol. 2004, 122 (1): 159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Η διαφορική έκφραση των γονιδίων πρωτεΐνης κινάσης C σε φυσιολογικά ανθρώπινα νεογνικά μελανοκύτταρα και μεταστατικά μελανώματα. Καρκινογένεση. 1991, 12(1):105-109.

[10] Borovansky J, Riley PA. Μελανίνες και μελανοσώματα: βιοσύνθεση, βιογένεση, φυσιολογικές και παθολογικές λειτουργίες. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Μονοπάτια σηματοδότησης στη μελανογένεση. Int J Mol Sci. 2016; 17 (7): 1–18.