Μοριακή ανίχνευση σταδίων ωρίμανσης στον αναπτυσσόμενο νεφρό

edmund.chen@wecistanche.com

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗΟι πρόσφατες εξελίξεις στη βιολογία των βλαστοκυττάρων επέτρεψαν τη δημιουργία νεφρόοργανοειδή in vitro, και περαιτέρω ωρίμανση αυτών των οργανοειδών παρατηρείται μετά από πειραματική μεταμόσχευση. Ωστόσο, τα τρέχοντα οργανοειδή παραμένουν ανώριμα και τα ακριβή στάδια ωρίμανσης τους είναι δύσκολο να προσδιοριστούν λόγω περιορισμένων πληροφοριών σχετικά με τις γονιδιακές εκφράσεις που εξαρτώνται από το αναπτυξιακό στάδιο στονεφρόin vivo. Για να δημιουργήσουμε σχετικές μοριακές συντεταγμένες, πραγματοποιήσαμε αλληλουχία μονοκυττάρου RNA (scRNA-seq) κατά την ανάπτυξηνεφράσε διαφορετικά στάδια στο ποντίκι. Επιλέγοντας γονίδια που εμφάνισαν ανοδική ρύθμιση κατά τη γέννηση σε σύγκριση με την εμβρυϊκή ημέρα 15,5, καθώς και έκφραση ειδική για την κυτταρική σειρά, δημιουργήσαμε λίστες γονιδίων που συσχετίζονται με τα αναπτυξιακά στάδια σε μεμονωμένες κυτταρικές σειρές. Εφαρμογή αυτών των καταλόγων σε μεταμοσχευμένα εμβρυϊκάνεφρά αποκάλυψε ότι οι περισσότεροι τύποι κυττάρων, εκτός από τους αγωγούς συλλογής, εμφάνισαν παρόμοια ωρίμανση μενεφράστο νεογνικό στάδιο in vivo, αποκαλύπτοντας μη σύγχρονη ωρίμανση στις κυτταρικές σειρές. Έτσι, τα δεδομένα scRNA-seq μπορούν να χρησιμεύσουν ως χρήσιμες μοριακές συντεταγμένες για την αξιολόγηση της ωρίμανσης της ανάπτυξηςνεφράκαι τελικά τουνεφρόοργανοειδή.

Λέξεις-κλειδιά:Ανάπτυξη νεφρού, Μονοκυτταρική αλληλουχία RNA, Ωρίμανση, In situ υβριδισμός, Νεφρική

Εισαγωγήονεφρόπροέρχεται από τουλάχιστον δύο τύπους πρόδρομων ουσιών: τους προγονικούς νεφρώνες και τον ουρητηρικό οφθαλμό (Costantini and Kopan, 2010). Οι πρόγονοι του νεφρώνα δίνουν τον νεφρώνα συμπεριλαμβανομένων των σπειραματικών ποδοκυττάρων, των εγγύς σωληνίσκων, των βρόγχων του Henle (LOH) και των περιφερικών σωληναρίων, ενώ ο ουρητηρικός οφθαλμός διακλαδίζεται εκτενώς για να σχηματίσει τους συλλεκτικούς πόρους και τον ουρητήρα (Kobayashietal., 2008) (2008. ροή. Οι πρόγονοι νεφρώνων και ο ουρητηρικός οφθαλμός ξεκινούν την αλληλεπίδρασή τους σε ποντίκια γύρω από την εμβρυονική ημέρα(Ε)11,5. Στο E15,5, καθορίζονται τα συνολικά τμήματα νεφρώνα, αλλά συνεχίζουν να δημιουργούνται νέοι νεφρώνες από τους προγόνους του νεφρώνα. Μετά την σπειραματική αγγείωση, τα ούρα αρχίζουν να ρέουν στο E16.5–E17.5 (Rasouly and Lu, 2013). Εν τω μεταξύ, η εσωτερική (μυελική) περιοχή τουνεφρόεπιμηκύνεται, αντανακλώντας την επιμήκυνση του LOH και των αγωγών συλλογής. Αυτή η ανάπτυξη της μυελικής περιοχής συνεχίζεται μετά την ημέρα γέννησης (P0), ενώ οι πρόγονοι του νεφρώνα σταματούν την αυτοανανέωση και εξαφανίζονται μέσα σε λίγες ημέρες μετά τη γέννηση (Hartmanet al., 2007) (Rumballe et al., 2011) ( Volovelsky et al., 2018).

Οι πρόσφατες εξελίξεις στη βιολογία των βλαστοκυττάρων επέτρεψαν τη δημιουργίανεφρόοργανοειδή in vitro (Morizane et al., 2015; Taguchi et al., 2014; Takasato et al., 2015). Προηγουμένως δημιουργήσαμενεφρόοργανοειδή από πολυδύναμα βλαστοκύτταρα: εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ποντικού (ESC) και πολυδύναμα βλαστοκύτταρα που προκαλούνται από τον άνθρωπο (iPSCs) (Taguchietal., 2014). Ωστόσο, γίνεται σαφές ότι τα οργανοειδή in vitro παραμένουν σε ανώριμα στάδια, ισοδύναμα μενεφράσε περίπου E14.5–E15.5 σε ποντίκια και 10–14 εβδομάδες κύησης σε ανθρώπους (TaguchiandNishinakamura, 2017; Takasatoet al., 2015; Wu et al., 2018). Εμείς και άλλοι αναπτύξαμε επίσης μεθόδους για πειραματική μεταμόσχευσηνεφρόοργανοειδή σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια, επιτρέποντας την οργανοειδή αγγείωση και σύνδεση με την κυκλοφορία του ξενιστή (Bantounas et al., 2018; Sharmin et al., 2016; Subramanian et al., 2019; Tanigawa et al., 2018; van den Berg et al., 2018). Κατά τη μεταμόσχευση, τα σπειραματικά ποδοκύτταρα εντός των οργανοειδών αποκτούν πιο ώριμα μορφολογικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με τη λειτουργία διήθησης, που πιθανώς προκαλούνται από παροχή οξυγόνου και/ή αλληλεπίδραση με αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Ενώ οι ακριβείς μηχανισμοί παραμένουν άλυτοι, η μεταμόσχευση χρησιμοποιείται συχνά για να προκαλέσει την ωρίμανση των οργανοειδών το ερευνητικό πεδίο της βιολογίας των βλαστοκυττάρων.

Παρά αυτές τις προόδους, ο ακριβής προσδιορισμός των σταδίων ωρίμανσης είναι δύσκολος λόγω της έλλειψης μοριακών συντεταγμένων, π.χ. περιεκτικών πληροφοριών σχετικά με τη γονιδιακή έκφραση που εξαρτάται από το στάδιο και την ανάπτυξηνεφρό.Επί του παρόντος, αυτές οι συντεταγμένες δεν είναι διαθέσιμες καν για εμβρυϊκό ποντίκινεφράin vivo. Αυτή η κατάσταση προκύπτει σε μεγάλο βαθμό λόγω του αυξανόμενου αριθμού τύπων κυττάρων κατά τη διάρκειανεφρόανάπτυξη, με κάθε τύπο κυττάρου να περιέχει μικρές ποσότητες κυττάρων. Οι συμβατικές αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης, που απαιτούν μεγάλο αριθμό ομοιογενών κυττάρων, δεν είναι κατάλληλες για ετερογενή ωρίμανσηνεφρά.Η βάση δεδομένων GUDMAP (www.gudmap.org) έχει συσσωρεύσει μεγάλο αριθμό αναλύσεων γονιδιακής έκφρασης στην ανάπτυξηνεφρό, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων συνολικάνεφράκαι μερικά σε ταξινομημένα ή μικροτεμαχισμένα κύτταρα (McMahon et al., 2008). Ωστόσο, ακόμη και η

Οι τελευταίες αναλύσεις συχνά περιέχουν κύτταρα από πολλαπλά στάδια, και επομένως τα δεδομένα δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα για αναλύσεις ωρίμανσης. Η ανάλυση αλληλουχίας RNA μονοκυττάρου (scRNA-seq) επέτρεψε την εξέταση γονιδιακών εκφράσεων σε περίπλοκα και ετερογενή όργανα, συμπεριλαμβανομένων τωννεφρό, και ορισμένα από αυτά τα δεδομένα έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων GUDMAP (Adam et al., 2017a; Combes et al., 2019a, 2019b; Lindstr€ om et al., 2018; Magella et al., 2017; Ransick et al. , 2019· Wanget al., 2018· Wu et al., 2018). Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις προηγούμενες μελέτες ανέλυσαν εμβρυϊκά ή ενήλικανεφράσε ένα μόνο χρονικό σημείο, ή σε σύγκριση

vivoνεφράμε in vitroνεφρόοργανοειδή. Έτσι, λίγες μελέτες έχουν ασχοληθείνεφρόωρίμανση από τα μέσα της κύησης έως τη γέννηση με περιορισμένο τύπο κυττάρων (Chen et al., 2015). Για τον καθορισμό μοριακών συντεταγμένων γιανεφρόωρίμανση στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε scRNA-seq σε αναπτυσσόμενο ποντίκινεφράσε διαφορετικά στάδια και επιλεγμένα γονίδια που εξαρτώνται από την ωρίμανση. Περαιτέρω αξιολογήσαμε την κατάσταση ωρίμανσης των μεταμοσχευμένων εμβρυϊκών νεφρών συγκρίνοντας τα δεδομένα RNA-seq και τις εκφράσεις γονιδίων που εξαρτώνται από την ωρίμανση. Τα δεδομένα μας RNA-seq και οι επιλεγμένες λίστες γονιδίων θα χρησιμεύσουν ως εργαλεία αναφοράς για την ωρίμανση της ανάπτυξηςνεφράκαι τελικά τουνεφρόοργανοειδή.

Αποτελέσματα

scRNA-seq ανάλυση αναπτυσσόμενων νεφρώνΠραγματοποιήσαμε scRNA-seq σε αναπτυσσόμενο ποντίκινεφράσε τρία διαφορετικά στάδια: E15.5, E17.5 και P0. Λήφθηκαν δεδομένα υψηλής ποιότητας, με μέσες αναγνώσεις 4.493, 2,360 και 2467 γονίδια ανά κύτταρο, αντίστοιχα. Μετά από ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιώντας Seurat v3.1.1 (Butler et al., 2018; Stuart et al., 2019a), τα κύτταρα ταξινομήθηκαν σε 45 συστάδες, με μεγαλύτερο αριθμό συμπαγών συστάδων στο P0 από στο Ε15.5 (Εικ. 1Α). Προσδιορίσαμε κυτταρικούς τύπους για τις περισσότερες συστάδες χρησιμοποιώντας δείκτες κυτταρικού τύπου: πρόγονους νεφρώνων (Six2þ, συστάδες 0, 1 και 10), σπειραματικά ποδοκύτταρα (Nphs1þ, ομάδες 8 και 11), σπειραματικά βρεγματικά επιθηλιακά κύτταρα (Claudin1 )þ, σύμπλεγμα 20), εγγύς σωληνάρια (τμήμα S1: Οικογένεια φορέα διαλυμένης ουσίας (Slc) 5a2þ, συστάδες 15 και 31; τμήμα S2: Slc5a2?/Slc34a1þ, ομάδες 13 και 6; τμήμα S3: Aquaporin 1 (Aquaporin 1 (Aqp1) (Lee et al., 2015; Ransick et al., 2019), cluster 37), LOH (λεπτό κατερχόμενο άκρο: Aqp1þ/Slc39a8þ (Lee et al., 2015; Ransick et al., 2019), πυκνή άνοδος 27 άκρο: Uromodulin (Umod)þ/Slc12a1þ, συστάδες 28 και 17), άπω σωληνάρια (Slc12a3þ, σύμπλεγμα 5), άκρες ουρητηρικού οφθαλμού (Retþ, συστάδες 22 και 35) και μίσχοι συλλεκτικών αγωγών (Aqp2s1, þ, c, 41) (Εικ. 1Β, Εικ. S1A). Τα παρεμβαλλόμενα κύτταρα σχημάτισαν ένα σύμπλεγμα που διαχωρίστηκε από τις συστάδες αγωγών συλλογής (Atp6v1g3þ, σύμπλεγμα 39) (Εικ. 1Β). Τα διάμεση κύτταρα ταξινομήθηκαν σε πολλαπλές ομάδες (7, 9, 12, 14, 23, 29, 30, 33 και 34), μεταξύ των οποίων οι ομάδες 9/33, 12 και 34 μπορεί να αντιπροσωπεύουν στρωματικούς προγονικούς (Foxd1þ (Kobayashi et al. , 2014)), μεσαγγειακά κύτταρα (Nt5eþ) και κύτταρα που παράγουν ρενίνη (Ren1þ), αντίστοιχα (Εικ. S1B). Οι συστάδες ενδοθηλιακών κυττάρων (Pecam1þ, συστάδες 3, 19, 24, 25 και 32) περιείχαν κύτταρα Ehd3þ (ομάδα 32, Εικ. S1C), τα οποία πιθανότατα αντιπροσώπευαν σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα (Patrakka et al., 2007). Έτσι, το Seurat v3.1.1, το οποίο χρησιμοποιεί άγκυρες ενσωμάτωσης για να συγκεντρώσει τους πλησιέστερους γείτονες (Stuartet al.,2019b), κατηγοριοποίησε με επιτυχία πολλούς τύπους κυττάρωννεφράσε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια.

Χρονικές αλλαγές στις εκφράσεις των παραγόντων μεταγραφής και στις αναπτυξιακές δραστηριότητες σηματοδότησης κατά τη διάρκειανεφρόωρίμανση

Οι πρόγονοι του νεφρώνα ταξινομήθηκαν σε τρεις ομάδες (Εικ. S1D): το σύμπλεγμα 0 που περιέχει Six2þ/Cited1þ παρθένα κύτταρα, το σύμπλεγμα 10 που περιέχει Six2þ/Cited1þ/Top2a þ πολλαπλασιαζόμενα παρθένα κύτταρα και το σύμπλεγμα 1 που περιέχει Six2þ/Cit{0} }/Wnt4þ εκκινημένα κύτταρα (Boyle et al., 2008; Kobayashiet al., 2008; Self et al., 2006). Κατά τη διάρκεια της προδιαγραφής του τμήματος νεφρώνων, ο πληθυσμός των προγονικών νεφρώνων σχημάτισε αρχικά έναν κλάδο Mafb þ υποκυττάρου,

τα οποία τελικά διαφοροποιήθηκαν σε Nphs1þ ποδοκύτταρα (Εικ. 1Β και 2Α). Οι κλάδοι για τα εγγύς σωληνάρια και τα LOH/απώτερα σωληνάρια σχηματίστηκαν χωριστά από τον κλάδο των ποδοκυττάρων. Πρόδρομα κύτταρα για εγγύς σωληνίσκους

εξέφρασε τα γονίδια του παράγοντα μεταγραφής Osr2 και στη συνέχεια Hnf4a (Εικ. 2Β), το τελευταίο εκ των οποίων ρυθμίζει τα εξαρτώμενα από την ωρίμανση γονίδια σε εγγύς σωληνάρια (Deacon et al., 2019; Marable et al, 2018, 2020; Martovetsky

et al., 2013). Κοινά πρόδρομα κύτταρα για LOH/απώτερα σωληνάρια εξέφρασαν τόσο το Pou3f3 (Nakai et al., 2003) όσο και το Sim1, με επακόλουθη έκφραση των Sim2 και Gata3 μετά από προδιαγραφή LOH ​​και απομακρυσμένων σωληναρίων, αντίστοιχα (Εικ. 2C). Το Tfap2b, που πρόσφατα αναφέρθηκε ότι είναι σημαντικό για την ανάπτυξη του περιφερικού νεφρώνα (Marneros, 2020), ανιχνεύτηκε επίσης στο LOH και στα περιφερικά σωληνάρια (Εικ. S1E). Έτσι, χρονικές μετατοπίσεις στις εκφράσεις των παραγόντων μεταγραφής συμβαίνουν σε μεμονωμένα τμήματα νεφρώνα κατά τη διάρκειανεφρόωρίμανση, και οι συστάδες στα περιφερειακά άκρα των κλαδιών (ομάδες 5,6, 8, 17, 31 και 37) αντιπροσωπεύουν το πιο ώριμο στάδιο σε κάθε γραμμή.

Από την άποψη των αναπτυξιακών σημάτων, ένας δείκτης για τη δραστηριότητα του μονοπατιού σηματοδότησης WNT, το Axin2, ανιχνεύθηκε κυρίως σε αναπτυσσόμενα περιφερικά σωληνάρια, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (Jho et al., 2002). Fgf8 και Etv4, an

δείκτης για τη δραστηριότητα σηματοδότησης FGF (Maoetal., 2009), εκφράστηκαν επίσης σε αναπτυσσόμενα περιφερικά σωληνάρια, αλλά περιορίζονταν σε ένα ανώριμο στάδιο. Αντίθετα, το Bmp7 (Oxburgh et al., 2005) εκφράστηκε σε άπω σωληνάρια τόσο στα ανώριμα όσο και στα ώριμα στάδια καθώς και στα ποδοκύτταρα, ενώ το Bmp4 (Miyazaki et al., 2000) ανιχνεύτηκε κυρίως σε εγγύς σωληνάρια. Σημειώσαμε επίσης ότι οι δραστηριότητες των κύριων οδών σηματοδότησης ήταν καθοδικές-

ρυθμίζεται σε ώριμα κύτταρα στα περισσότερα τμήματα νεφρώνων. Για παράδειγμα, η Axin2 (δείκτης σήματος WNT) και Etv4 (δείκτης σηματοδότησης FGF) απουσίαζαν στα ώριμα ποδοκύτταρα και στα εγγύς και άπω σωληνάρια (Εικ. 2D). Η ίδια τάση παρατηρήθηκε για το Hey1 (δείκτης σηματοδότησης Notch), ενώ το Hes1 ρυθμίστηκε προς τα κάτω μόνο στα ποδοκύτταρα και στα εγγύς σωληνάρια (Εικ. 2Ε). Ένας δείκτης σηματοδότησης BMP, Id1 (Korchynskyi and Ten Dijke, 2002; L' opez-Rovira et al., 2002), μειώθηκε στα ώριμα ποδοκύτταρα και στα περιφερικά σωληνάρια (Εικ. 2F). Έτσι, παρατηρείται ενεργοποίηση αναπτυξιακής σηματοδότησης για το τμήμα νεφρώνα, ακολουθούμενη από προς τα κάτω ρύθμιση, κατά τη διάρκειανεφρόωρίμανση.

Λίστες γονιδίων που εξαρτώνται από το στάδιο ανάπτυξης για μεμονωμένες κυτταρικές σειρές

Η ανάλυσή μας scRNA-seq έδειξε ότι οι ομάδες UMAP που εκφράζουν ορισμένους καθιερωμένους δείκτες διαφοροποίησης περιορισμένης γενεαλογίας υπήρχαν ήδη στο E15.5 (Εικ. 1Β). Για τον εντοπισμό γονιδίων που εξαρτώνται από το στάδιο για μεμονωμένα νεφρονικά τμήματα, πρώτα συγκρίναμε τις γονιδιακές εκφράσεις μεταξύ E15.5 και P0 στις πιο ώριμες ομάδες κάθε γενεαλογίας και συλλέξαμε γονίδια που ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω ή προς τα κάτω στο P{9}} σε σύγκριση με το E15. 5. Ωστόσο, διαπιστώσαμε ότι αυτές οι λίστες περιλάμβαναν γονίδια που σχετίζονται με το κυτταρικό στρες, όπως γονίδια πρωτεΐνης θερμικού σοκ, γονίδια οικογένειας Jun/Fos και γονίδια Gadd45 (Adam et al., 2017a), τα οποία μπορεί να προκληθούν από τις πιο σκληρές διαδικασίες διάστασης κυττάρων που χρησιμοποιούνται για το P0νεφρά. Because these genes were ubiquitously expressed, it was difficult to discriminate them from maturation-dependent genes that were ubiquitously expressed. Thus, we decided to select cell-type specific genes and picked up the upregulated or downregulated genes in the corresponding clusters between the two stages. Most of the upregulated genes at P0 showed consistent results in UMAP plots, while the downregulated genes showed less prominent differences between the two stages. In addition, the downregulated genes were detected in more immature cell clusters at P0, reflecting the repetitive differentiation processes from nephron progenitors. Therefore, we decided to focus on the upregulated genes (fold change, >2.5) και επιμελήθηκε κάθε υποψήφιο γονίδιο για τη χωροχρονική του έκφραση με βάση τα διαγράμματα UMAP. Τα διαγράμματα βιολιού των τελικά επιλεγμένων γονιδίων έδειξαν τις εξαρτώμενες από το στάδιο εκφράσεις τους σε μεμονωμένες κυτταρικές ηλικίες (Εικ. 3Α, Σχήματα S2, S3, S4A, Πίνακας S1). Τα διαγράμματα κουκκίδων επιβεβαίωσαν τις ειδικές για τον κυτταρικό τύπο εκφράσεις τους (Εικ. 3Β), αν και πολλά γονίδια που επιλέχθηκαν για το τμήμα S2 των εγγύς σωληναρίων εκφράστηκαν επίσης στα τμήματα S1 και S3. Αυτές οι επιλεγμένες λίστες γονιδίων περιελάμβαναν την αλυσίδα κολλαγόνου τύπου 4 άλφα3 (Col4a3) και τη σημαφορίνη (Sema) 3g για τα ποδοκύτταρα, το Slc5a12 (μεταφορέας γαλακτικού) και το κυτόχρωμα P450 οικογένειας (Cyp) 27b1 (άλφα υδροξυλάση της βιταμίνης D) για τα εγγύς σωληνάρια E-land και Prostag, υποδοχέας 3 (Ptger3) για LOH, Aqp2 και Aqp3 για συλλεκτικούς αγωγούς και Λιποκαλίνη 2 (Lcn2) για τις άκρες των ουρητηρικών οφθαλμών. Τα περισσότερα από τα γονίδια είχαν ήδη ρυθμιστεί προς τα πάνω στο E17.5

και έδειξε συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης με αυτά στο P0, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να συμβεί σημαντική ωρίμανση μεταξύ E15.5 και E17.5. Ανιχνεύσαμε μόνο λίγα γονίδια για απομακρυσμένα σωληνάρια (Πίνακας S1), επειδή τα περισσότερα από τα ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια σε αυτήν την κυτταρική σειρά εκφράζονται επίσης σε αγωγούς συλλογής. Συνολικά, scRNA-seq ανάλυση της ανάπτυξηςνεφράσε πολλαπλά στάδια ωρίμανσης επέτρεψε την αναγνώριση γονιδίων που εξαρτώνται από το στάδιο και ειδικά για τη γενεαλογία στα περισσότερα τμήματα νεφρώνων.

Ιστολογική επικύρωση γονιδιακών εκφράσεων αντιπροσωπευτικών γονιδίων που εξαρτώνται από το στάδιο

Για να επιβεβαιώσουμε την εγκυρότητα των καταλόγων γονιδίων με ιστολογική εξέταση, προσδιορίσαμε τις εκφράσεις επιλεγμένων γονιδίων στο E15.5 και το P0νεφράμε συμβατικό in situ υβριδισμό με βάση τη διγοξιγενίνη ή τεχνολογία υψηλής ευαισθησίας RNAscope (Wang et al., 2012). Επειδή ο in situ υβριδισμός, και ειδικά η τεχνολογία RNAscope, περιλαμβάνει εκτεταμένη ενίσχυση σήματος, είναι απίθανο να ανιχνευθούν ανεπαίσθητες διαφορές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Έτσι, επιλέξαμε γονίδια που έδειξαν ελάχιστη έκφραση στο E15.5 και περιορίζονταν σε μία μόνο γενεαλογία στο P{11}} στις γραφικές παραστάσεις UMAP. Τέτοια γονίδια θα ήταν επίσης χρήσιμα για την οικονομική αξιολόγηση των σταδίων ωρίμανσης χρησιμοποιώντας ιστολογικές τομές. Στα ποδοκύτταρα, και τα τέσσερα γονίδια που εξετάστηκαν (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) ανιχνεύθηκαν εύκολα στο P0 και τα επίπεδα έκφρασής τους στο E15.5 ήταν χαμηλότερα από αυτά στο P0 (Εικ. 4Α ). Αντίθετα, το Nphs1 έδειξε συγκρίσιμη έκφραση στα δύο στάδια (Εικ. 4Α). Σε εγγύς σωληνάρια, τρία γονίδια (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) έδειξαν ασθενή ή ελάχιστα σήματα στο E15.5 και ισχυρή έκφραση στο P0 (Εικ. 4Β), ενώ το Slc34a1 έδειξε συγκρίσιμη έκφραση και στα δύο στάδια (Εικ. 4Β). Οι εξαρτώμενες από το στάδιο εκφράσεις τριών γονιδίων επικυρώθηκαν σε LOH (Umod, Ptger3, Car15), σε αντίθεση με τη σχετικά σταθερή έκφραση του Slc12a1 (Εικ. 5Α). Πραγματοποιήσαμε επίσης in situ υβριδισμό για τρία γονίδια (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) στους αγωγούς συλλογής και επιβεβαιώσαμε τις εξαρτώμενες από το στάδιο εκφράσεις τους (Εικ. 5Β). Μεταξύ αυτών, το Aqp2 και το Cdkn2b εκφράστηκαν σε μίσχους συλλογής αγωγών, ενώ το Lcn2 ανιχνεύθηκε σε ουρητηρικές άκρες. Σε αντίθεση, το Retand Wnt7b έδειξε σχετικά σταθερά επίπεδα έκφρασης (Εικ. 5Β). Τα in situ δεδομένα υβριδισμού ήταν σύμφωνα με τα διαγράμματα UMAP, υποστηρίζοντας την αξιοπιστία των δεδομένων scRNA-seq μας.

Ιστολογική επικύρωση γονιδιακών εκφράσεων αντιπροσωπευτικών γονιδίων που εξαρτώνται από το στάδιο

Για να επιβεβαιώσουμε την εγκυρότητα των καταλόγων γονιδίων με ιστολογική εξέταση, προσδιορίσαμε τις εκφράσεις επιλεγμένων γονιδίων στο E15.5 και το P0νεφράμε συμβατικό in situ υβριδισμό με βάση τη διγοξιγενίνη ή τεχνολογία υψηλής ευαισθησίας RNAscope (Wang et al., 2012). Επειδή ο in situ υβριδισμός, και ειδικά η τεχνολογία RNAscope, περιλαμβάνει εκτεταμένη ενίσχυση σήματος, είναι απίθανο να ανιχνευθούν ανεπαίσθητες διαφορές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Έτσι, επιλέξαμε γονίδια που έδειξαν ελάχιστη έκφραση στο E15.5 και περιορίζονταν σε μία μόνο γενεαλογία στο P{11}} στις γραφικές παραστάσεις UMAP. Τέτοια γονίδια θα ήταν επίσης χρήσιμα για την οικονομική αξιολόγηση των σταδίων ωρίμανσης χρησιμοποιώντας ιστολογικές τομές. Στα ποδοκύτταρα, και τα τέσσερα γονίδια που εξετάστηκαν (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) ανιχνεύθηκαν εύκολα στο P0 και τα επίπεδα έκφρασής τους στο E15.5 ήταν χαμηλότερα από αυτά στο P0 (Εικ. 4Α ). Αντίθετα, το Nphs1 έδειξε συγκρίσιμη έκφραση στα δύο στάδια (Εικ. 4Α). Σε εγγύς σωληνάρια, τρία γονίδια (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) έδειξαν ασθενή ή ελάχιστα σήματα στο E15.5 και ισχυρή έκφραση στο P0 (Εικ. 4Β), ενώ το Slc34a1 έδειξε συγκρίσιμη έκφραση και στα δύο στάδια (Εικ. 4Β). Οι εξαρτώμενες από το στάδιο εκφράσεις τριών γονιδίων επικυρώθηκαν σε LOH (Umod, Ptger3, Car15), σε αντίθεση με τη σχετικά σταθερή έκφραση του Slc12a1 (Εικ. 5Α). Πραγματοποιήσαμε επίσης in situ υβριδισμό για τρία γονίδια (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) στους αγωγούς συλλογής και επιβεβαιώσαμε τις εξαρτώμενες από το στάδιο εκφράσεις τους (Εικ. 5Β). Μεταξύ αυτών, το Aqp2 και το Cdkn2b εκφράστηκαν σε μίσχους συλλογής αγωγών, ενώ το Lcn2 ανιχνεύθηκε σε ουρητηρικές άκρες. Σε αντίθεση, το Retand Wnt7b έδειξε σχετικά σταθερά επίπεδα έκφρασης (Εικ. 5Β). Τα in situ δεδομένα υβριδισμού ήταν σύμφωνα με τα διαγράμματα UMAP, υποστηρίζοντας την αξιοπιστία των δεδομένων scRNA-seq μας.

Οι μεταμοσχευμένοι εμβρυϊκοί νεφροί παρουσιάζουν ωρίμανση κοντά στο νεογνικό στάδιο

Για να προσδιορίσετε εάν μεταμοσχεύθηκενεφράακολουθώντας τη διαδικασία φυσιολογικής ωρίμανσης, πραγματοποιήσαμε πειράματα μεταμόσχευσης χρησιμοποιώντας εμβρυϊκό ποντίκινεφράως ιστοί δότη. Επειδή η μεταμόσχευση του

απομονωμένο εμβρυϊκόνεφράπροκάλεσαν υδρονέφρωση που πιθανότατα οφείλεται σε κακή σύνδεση του ουροποιητικού συστήματος (Εικ. S5A), χρησιμοποιήσαμε ένα πρωτόκολλο που αναφέρθηκε προηγουμένως το οποίο δυνητικά διατηρεί ανέπαφη τη ροή των ούρων (Yokote et al., 2015). Για αυτό, μεταφυτεύσαμε Ε12.5νεφράσυνδέεται με την κλοάκα, πρόδρομο της ουροδόχου κύστης, στο λίπος της επιδιδυμίδας των ενήλικων ποντικών-ξενιστών (Εικ. 6Α). Όταν συγκομίζεται στις 12 ημέρες μετά τη μεταφύτευση, τονεφράείχε αυξηθεί σε μέγεθος (3,29 ? 0,35 mm 2 έναντι 0.23 ? 0.02 mm 2, n¼ 3, p < 0,05) και ανιχνεύθηκαν ούρα στην ουροδόχο κύστη (Εικ. 6Α), υποδηλώνοντας ότι η ροή των ούρων μέσω τηςνεφρό-η σύνδεση της ουροδόχου κύστης διατηρήθηκε. Η ιστολογική ανάλυση έδειξε ότι ο νεφρικός μυελός σχηματίστηκε με φλοιομυελικό μοτίβο (Εικ. 6Α). Η χρώση των ειδικών για τον κυτταρικό τύπο δεικτών έδειξε ότι η συνολική κατανομή των εγγύς σωληναρίων LTL þ, των ουρητηρικών μπουμπουκιών SLC12A1þ LOH και KRT8þ διατηρήθηκε (Εικ. 6Β) και ότι τα σπειράματα με τα ποδοκύτταρα NPHS1þ αγγειώθηκαν με τα ενδοθηλιακά κύτταρα PECAM1þ S55B (Εικ. , το οποίο σπάνια παρατηρείται κατά την in vitro καλλιέργεια εμβρυϊκών νεφρών (Halt et al., 2016). Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ανάλυση scRNA-seq μεταμοσχευμένου εμβρυϊκούνεφράκαι συνέκρινε τα δεδομένα με αυτά που ελήφθησαν από εμβρυϊκούς νεφρούς in vivo. Τα διαγράμματα UMAP των μεταμοσχευμένων νεφρών έδειξαν παρόμοια μοτίβα συστάδων με αυτά των νεογνικών νεφρών in vivo (Εικ. 6C), αλλά οι ομάδες που αντιπροσωπεύουν τους προγονικούς νεφρούς και τις άκρες των ουρητηρικών οφθαλμών έλειπαν στους μεταμοσχευμένους νεφρούς (Εικ. 6C, Σχ. S5C και ΡΕ). Αν και ο λόγος για αυτή την απροσδόκητη εξάντληση της νεφρογόνου θέσης παραμένει άγνωστος, μπορεί να εξηγήσει το μικρότερο μέγεθος των μεταμοσχευμένων νεφρών σε σύγκριση με τους νεφρούς in vivo, όπως θα συζητήσουμε σε επόμενη ενότητα. Παρόλα αυτά, οι άλλοι πληθυσμοί κυττάρων συγκεντρώθηκαν σε παρόμοια μοτίβα με εκείνα των νεφρών στο νεογνικό στάδιο (Εικ. 6C). Τα επίπεδα έκφρασης των περισσότερων εξαρτώμενων από την ωρίμανση γονιδίων στα ποδοκύτταρα και τα εγγύς σωληνάρια στους μεταμοσχευμένους νεφρούς ήταν συγκρίσιμα με εκείνα στους νεφρούς P0 (Εικ. 6D, Εικ. S6, Πίνακας S2). Ωστόσο, πολλά γονίδια στους συλλεκτικούς πόρους εκφράστηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα από εκείνα στους νεφρούς P{{1{0}}, συμπεριλαμβανομένου του Cdkn2b (Εικ. 6D, Σχ. S6, Πίνακας S2). Αντίθετα, οι εκφράσεις Aqp2 και Aqp3 διατηρήθηκαν σχετικά σε συγκρίσιμα επίπεδα με εκείνα στους νεφρούς P0 (Εικ. 6D). Επιπλέον, τα Wnt9b και Hoxd3, τα οποία ρυθμίστηκαν προς τα κάτω στο P0 in vivo, παρέμειναν υψηλά στους μεταμοσχευμένους νεφρούς (Εικ. S4A). Έτσι, οι αγωγοί συλλογής στους μεταμοσχευμένους νεφρούς ήταν πιθανό να είναι πιο ανώριμοι από τους νεφρούς στο P0. Παρόμοια τάση, αν και σε μικρότερο βαθμό, παρατηρήθηκε στο LOH (Εικ. 6D, Εικ. S6). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ωρίμανση δεν συμβαίνει απαραίτητα συγχρονισμένα σε όλες τις κυτταρικές σειρές.

ΣυζήτησηΗ ωρίμανση των οργάνων είναι μια από τις πιο σημαντικές πτυχές στην αναπτυξιακή-ψυχοβιολογία. Στη βλαστοκυτταρική βιολογία, η μεταμόσχευση χρησιμοποιείται συχνά για να προκαλέσει την ωρίμανση πολυδύναμων οργανοειδών που προέρχονται από βλαστοκύτταρα, συμπεριλαμβανομένωννεφρόοργανοειδή. Ωστόσο, ο ακριβής προσδιορισμός των σταδίων ωρίμανσης είναι δύσκολος λόγω της έλλειψης μοριακών συντεταγμένων για ωρίμανση. Έτσι, πραγματοποιήσαμε ανάλυση scRNA-seq εμβρυϊκού ποντικούνεφράσε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια, τα οποία επέτρεψαν την ταυτοποίηση γονιδίων που έδειξαν έκφραση εξαρτώμενη από το στάδιο σε ωρίμανση εμβρυϊκώννεφρά. Εφαρμόζοντας αυτές τις πληροφορίες σε δεδομένα scRNA-seq σε μεταμοσχευμένους εμβρυϊκούς νεφρούς, διαπιστώσαμε περαιτέρω ότι η διαδικασία ωρίμανσης μετά τη μεταμόσχευση προχώρησε κοντά στο νεογνικό στάδιο, αλλά μη συγχρονισμένα μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Σε αντίθεση με τη μαζική αλληλούχιση, το scRNA-seq ήταν σε θέση να αξιολογήσει τις γονιδιακές εκφράσεις στα πιο ώριμα κλάσματα κάθε κυτταρικής γενεαλογίας, επιτρέποντας έτσι ακριβείς συγκρίσεις με τους αντίστοιχους υποπληθυσμούς σε αναπτυσσόμενους νεφρούς καθώς και σε μεταμοσχευμένουςνεφρόμικρό. Οι επιλεγμένες λίστες γονιδίων για εκφράσεις που εξαρτώνται από το στάδιο αποδείχθηκε ότι λειτουργούν ως μοριακές συντεταγμένες για την αξιολόγηση των σταδίων ωρίμανσης μεμονωμένων σειρών. Η προσθήκη δεδομένων scRNA seq σε μεταγεννητικούς νεφρούς σε διαφορετικά στάδια και σε νεφρούς ενηλίκων θα δημιουργούσε περαιτέρω χρήσιμους πόρους για την αξιολόγηση της ωρίμανσης.

Για να προσδιορίσουμε εάν μπορούν να επιτευχθούν παρόμοια αποτελέσματα χρησιμοποιώντας τα προϋπάρχοντα σύνολα δεδομένων, αναλύσαμε εκ νέου τα δημοσιευμένα δεδομένα scRNA-seq στα E14.5 και P1νεφρά(Adam et al., 2017a; Magella et al., 2017). Ωστόσο, οι γραφικές παραστάσεις UMAP έδειξαν ότι οι ομάδες που αντιπροσωπεύουν τους ώριμους πληθυσμούς των περισσότερων τύπων κυττάρων στο P1 απουσίαζαν στα δεδομένα E14.5 (Εικ. S7A και B), εμποδίζοντάς μας έτσι να συγκρίνουμε την έκφραση γονιδίων στο

αντίστοιχες συστάδες μεταξύ των δύο σταδίων. Η μόνη εξαίρεση ήταν οι άκρες των ουρητηρικών οφθαλμών. Τα συμπλέγματα Ret þ ανιχνεύθηκαν και στα δύο στάδια και το Lcn2 ρυθμίστηκε προς τα πάνω στο P1 (Εικ. S7C), σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας. Έτσι, τα προϋπάρχοντα δεδομένα ήταν περιορισμένης χρήσης, υπογραμμίζοντας τη σημασία των δεδομένων scRNA-seq και των καταλόγων γονιδίων στην παρούσα μελέτη. Δείξαμε ότι τα ποδοκύτταρα και τα εγγύς σωληνάρια στα μεταμοσχευμένανεφράωρίμασε κοντά στο νεογνικό στάδιο, ενώ οι αγωγοί συλλογής παρέμειναν σχετικά ανώριμοι. Οι βαθύτεροι λόγοι για την εξασθένιση της ωρίμανσης των αγωγών συλλογής μένουν να διευκρινιστούν. Μια μείωση της φυσικής δύναμης που προκαλείται από τη ροή των ούρων μπορεί να είναι ένας πιθανός λόγος, επειδή οι αγωγοί συλλογής βρίσκονται πιο μακριά κατάντη στο ουροποιητικό σύστημα. Μεταφυτεύσαμε εμβρυϊκόνεφράμε την κλοάκα, με στόχο την καλύτερη διατήρηση της ροής των ούρων σε σύγκριση με τη συμβατική μεταμόσχευση μεμονωμένων νεφρών (Εικ. S5). Ωστόσο, παραμένει πιθανό ότι η ροή των ούρων ήταν ανεπαρκής για την προώθηση της ωρίμανσης του κάτω μέρους των τμημάτων του νεφρώνα. Εναλλακτικά, οι αγωγοί συλλογής μπορεί ήδη να έχουν υποστεί μηχανική βλάβη που προκαλείται από αντίστροφη ροή από την κύστη, αν και δεν παρατηρήθηκε εμφανής υδροουρητήρας ή υδροέφρωση τη στιγμή της ανάλυσης. Η επακόλουθη σύνδεση της κύστης που προέρχεται από τον δότη με τον ουρητήρα του ξενιστή ήταν

Εικ. 6. Ωρίμανση μεταμοσχευμένουνεφράκοντά στο νεογνικό στάδιο. (Α) Όψη πλήρους βάσης ενός E12.5νεφρόμε την κλοάκα πριν από τη μεταμόσχευση (ημέρα 0). Ολόκληρη όψη και ιστολογική ανάλυση με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης του μεταμοσχευμένου νεφρού με την κύστη που συλλέγεται την ημέρα 12 μετά τη μεταμόσχευση. Κόκκινο βέλος: παρουσία ούρων στην ουροδόχο κύστη. Μπάρα κλίμακας: 500 μ m. (Β) Ανοσοχρώση τουνεφρότην ημέρα 12 μετά τη μεταμόσχευση με δείκτες για εγγύς σωληνάρια (LTL: πράσινο), βρόχους Henle (SLC12A1: κόκκινο) και αγωγούς συλλογής (KRT8: γκρι). Γραμμή κλίμακας: 200 μ m. (Γ) Διαγράμματα UMAP εμβρυϊκών νεφρών in vivo (Ε15.5 και Ρ0) και μεταμοσχευμένων εμβρυϊκών νεφρών (ημέρα 12 μετά τη μεταμόσχευση). Βέλος: πρόγονος νεφρών (NP); αιχμή βέλους: άκρη ουρητηρικού οφθαλμού (UB). POD: ποδοκύτταρο; PEC: σπειραματικό βρεγματικό επιθηλιακό κύτταρο. DN: διαφοροποιητικός νεφρώνας. PT: εγγύς σωληνάριο. LOH: βρόχος του Henle. DT: άπω σωληνάριο; CD: αγωγός συλλογής. CD-IC: παρεμβαλλόμενη κυψέλη του αγωγού συλλογής. IC; διάμεσο κύτταρο? EC: ενδοθηλιακό κύτταρο; UT: ουρητήρας; π.Χ.: κύτταρο αίματος. (Δ) Διαγράμματα βιολιού γονιδίων που εξαρτώνται από το στάδιο σε μεταμοσχευμένανεφράσε σύγκριση με τους εμβρυϊκούς νεφρούς in vivo (Ε15.5 και Ρ0).

αναφέρθηκε ότι αναστέλλει την υδρονέφρωση και βοήθησε στην περαιτέρω ανάπτυξη (Yokote et al., 2015), επομένως θα ήταν κατατοπιστικό να αναλύσουμε τις εκφράσεις των γονιδίων δεικτών ωρίμανσης σε τέτοιες μεταμοσχεύσεις. Ενώ απαιτούνται περαιτέρω μελέτες, οι λίστες γονιδίων μας αποδείχθηκαν χρήσιμες για την αξιολόγηση της κατάστασης ωρίμανσης μεμονωμένων σειρών στην ανάπτυξηνεφράκαθώς και σε μεταμοσχευμένονεφρά. Τα δεδομένα μας RNA-seq θα χρησιμεύσουν επίσης ως χρήσιμες συντεταγμένες για την αξιολόγηση της κατάστασης ωρίμανσης τουνεφρόοργανοειδή που προέρχονται από πολυδύναμα βλαστοκύτταρα. Τα τρέχοντα νεφρικά οργανοειδή αντιπροσωπεύουν εκείνα σε εμβρυϊκά στάδια (Taguchi και Nishinakamura, 2017; Takasato et al., 2015; Wu et al., 2018) και απαιτείται περαιτέρω ωρίμανση για τη μοντελοποίηση της νόσου και τελικά για τη δημιουργία μεταμοσχευμένων νεφρών. Επί του παρόντος, λίγες μέθοδοι είναι διαθέσιμες για τη μέτρηση των σταδίων ωρίμανσης των οργανοειδών, εκτός από τις μορφολογικές αναλύσεις. Έτσι, τα αποτελέσματά μας θα χρησιμεύσουν ως βάση για τη μοριακή ανίχνευση της οργανοειδούς ωρίμανσης. Ενώ το συμβατικόνεφρόΤα οργανοειδή αποτελούνται κυρίως από νεφρώνες (σπειράματα καινεφρώνσωληνάρια), αναφέραμε πρόσφατα τη δημιουργία δομών νεφρών υψηλότερης τάξης, που περιλαμβάνουν διακλαδισμένα ουρητηρικά μπουμπούκια με νεφρώνες κατανεμημένους γύρω από τις άκρες του ουρητηρικού οφθαλμού (Taguchi and Nishinakamura, 2017). Το πετύχαμε αυτό συνδυάζοντας προγονικούς νεφρώνα προερχόμενους από ESC ποντικού και ουρητηρικούς οφθαλμούς με εμβρυϊκούς στρωματικούς προγόνους και θα πρέπει να είναι θεωρητικά δυνατό στο εγγύς μέλλον να δημιουργηθούν οργανοτυπικέςνεφρόδομές αποκλειστικά από ESC ποντικιού και τελικά από ανθρώπινα iPSC. Έτσι, το επόμενο βήμα θα ήταν η μεταμόσχευση οργανοειδών για περαιτέρω ωρίμανση. Τα δεδομένα scRNA-seq μας θα χρησιμεύσουν ως χρήσιμα εργαλεία αναφοράς για την αξιολόγηση των σταδίων ωρίμανσης των μεταμοσχευμένων οργανοειδών.

Η εξάντληση της νεφρογόνου κόγχης στο μεταμοσχευμένονεφράήταν απροσδόκητο. Αν και δεν είναι το κύριο αντικείμενο της παρούσας μελέτης που επικεντρώνεται στην ωρίμανση, αυτή η εξάντληση μπορεί να εξηγήσει το μικρότερο μέγεθος των μεταμοσχευμένων νεφρών σε σύγκριση με τους νεφρούς in vivo. Οι πρόγονοι νεφρώνων σε ποντίκια συνεχίζουν να δημιουργούν νεφρώνες μέχρι αρκετές ημέρες μετά τη γέννηση (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky

et al., 2018) και η πρόωρη εξάντληση των προγονικών νεφρώνων οδηγεί σε μικρότερου μεγέθους νεφρούς (Kanda et al., 2014; Self et al., 2006). Μένει να καθοριστεί ποιοι παράγοντες συντήρησης λείπουν στη μεταμόσχευσηνεφράκαι εάν η απώλεια των προγονικών νεφρών ή των άκρων των ουρητηρικών οφθαλμών είναι η κύρια αιτία αυτού του φαινομένου. Η επίλυση αυτών των αινιγμάτων θα οδηγήσει τελικά στην ανάπτυξη των μεταμοσχευμένωννεφρόοργανοειδή σε α

συγκρίσιμο μέγεθος μενεφράin vivo. Συνολικά, έχουμε αποδείξει ότι τα δεδομένα scRNA-seq και οι λίστες γονιδίων μας μπορούν να χρησιμεύσουν ως μοριακές βάσεις για την αξιολόγηση των σταδίων ωρίμανσης των εμβρυϊκών και μεταμοσχευμένων νεφρών και θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε οργανοειδή νεφρού που προέρχονται από iPSC. Αν και επικεντρωθήκαμε στην ανάπτυξη και ωρίμανση νεφρώνων στην παρούσα μελέτη, οι λεπτομερείς αναλύσεις άλλων γενεών, όπως τα στρωματικά και ενδοθηλιακά κύτταρα, χρησιμοποιώντας τα δεδομένα scRNA-seq θα παρέχουν περισσότερες πληροφορίες γιανεφρόωρίμανση.

Υλικά και μέθοδοι

scRNA-seq αναλύσειςΟι νεφροί διαχωρίστηκαν με ένα πρωτόκολλο τροποποιημένο από μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως (Tanigawa et al., 2016) και χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις scRNA-seq. Ποντίκια C57BL/6N (CLEA Japan Inc.) χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις E15.5 και E17.5 και Foxd1GFPCreER. tdTomato και Tbx18MerCreMer: TdTomato ποντίκια σε μικτό γενετικό υπόβαθρο C57BL/6N και ICR χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις P0 (Grisanti et al., 2013; Kobayashi et al., 2014). Εξινεφράστο E15,5 χωνεύτηκαν για 10 λεπτό σε 0,25 τοις εκατό θρυψίνη/EDTA. Ε17,5 και Ρ0 θηλυκόνεφρά were minced roughly with forceps, digested with dissociation buffer comprising 2 mg/ml collagenase (Sigma; Cat# 9407), 2.4 U/ml dispase (Gibco; Cat# 17105-041), 2 mM CaCl 2 (Wako; Cat# 031–00435), 50 μ g/ml DNase I (Sigma; Cat# 11284932001), and 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma; Cat# 172012) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Sigma; Cat# D5796) for 15 min at 37? C, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and treated with 0.25% trypsin/EDTA for 10 min. Trypsin was inactivated by addition of DMEM/10%FCS containing50 μ g/mlDNaseI,andthecells werewashed with HEPES-buffered saline solution (Thermo; Cat# 14185-052) containing 2% FCS, 50 μ g/ml DNase I, 1 mM CaCl 2 , and 0.035% NaHCO 3 (Wako; Cat# 191–01305). Cells were resuspended in 0.04% BSA/PBS, filtered through a 40- μ m-pore strainer (Falcon; Cat# 352340), and evaluated for their cell number and viability (>90 τοις εκατό ) χρησιμοποιώντας έναν αυτοματοποιημένο μετρητή κυψελών Countess (Thermo; Cat# C10227). Συνολικά 5000 διαχωρισμένα κύτταρα το καθένα από τα E15.5 και E17.5 και δύο δείγματα (5000 κύτταρα ανά δείγμα) από P0 εφαρμόστηκαν στον ελεγκτή Chromium (10x Genomics) . Ένα Chromium Single Cell 3 0 Library & Gel Beads Kit v2 (10x Genomics) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία βιβλιοθηκών cDNA με oligo-dT, οι οποίες στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν από ένα Illumina HiSeq 3000 (14.000 αναγνώσεις για E15.5, 7000 αναγνώσεις για E17,5· 14.000 αναγνώσεις για P0). Οι αναγνώσεις RNA βάσης Q30 (βαθμολογίες Q που υποδεικνύουν ποιότητα αλληλουχίας) των δειγμάτων ήταν 86,2 τοις εκατό για το Ε15.5, 63,8 τοις εκατό για το Ε17.5 και 93,6 τοις εκατό για το Ρ0.

Τα δεδομένα της ακατέργαστης αλληλουχίας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την εντολή μέτρησης ranger κυττάρων του Cell Ranger (έκδοση 3.0.2; 10x Genomics) για τη δημιουργία πινάκων μέτρησης μοναδικών μοριακών αναγνωριστικών (UMIs) για κάθε γονίδιο ανά κύτταρο. Αρχικά, ενσωματώσαμε τα δύο P0 δείγματα χρησιμοποιώντας την εντολή cell ranger aggr του Cell Ranger για να δημιουργήσουμε ένα μόνο συνδυασμένο δείγμα P0. Σε αυτό το σημείο, λάβαμε 4.158, 5.551 και 10.810 κύτταρα για τα δείγματα E15.5, E17.5 και P0 με αναγνώσεις μέσου 4.493, 2.360 και 2467 γονιδίων ανά κύτταρο, αντίστοιχα. Αυτά τα τρία μεμονωμένα δημιουργημένα σύνολα δεδομένων ενσωματώθηκαν χρησιμοποιώντας την εντολή cell ranger aggr. Όλες οι επόμενες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στη γλώσσα στατιστικού προγραμματισμού R (R Core Team, 2018). Το πακέτο Seurat (έκδοση 3.1.1) χρησιμοποιήθηκε για αναλύσεις που περιλαμβάνουν ποιοτικό έλεγχο, κανονικοποίηση δεδομένων, κλιμάκωση δεδομένων και οπτικοποίηση (Butler et al., 2018) (Stuart et al., 2019a). Για ποιοτικό έλεγχο, κύτταρα που εξέφρασαν<200 genes,="">8000 genes (possibly representing doublets), or >20 τοις εκατό των μιτοχονδριακών γονιδίων φιλτραρίστηκαν. Το τελικό σύνολο δεδομένων περιείχε 20.672 γονίδια και 3.441, 4.592 και 8161 κύτταρα στα δείγματα E15.5, E17.5 και P0, αντίστοιχα (σύνολο: 16.194 κύτταρα). Μια ανάλυση κύριου συστατικού χρησιμοποιήθηκε για τη μείωση της διάστασης με τιμή διάστασης 74 που προσδιορίζεται από τη συνάρτηση JackStrawPlot (Chung and Storey, 2015). Τα κορυφαία 2000 εξαιρετικά μεταβλητά γονίδια επιλέχθηκαν από τη συνάρτηση FindVariableFeatures και χρησιμοποιήθηκαν μαζί με πληροφορίες διαστάσεων για ομαδοποίηση. Η κατάτμηση συμπλέγματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τιμή ανάλυσης 2,4. Η εντολή FindClusters δημιούργησε συνολικά 45 συστάδες που διακρίνονταν εύκολα με γονίδια δεικτών ειδικά για ομάδες που ελήφθησαν με τη λειτουργία FindMarkers του πακέτου Seurat. Το Cluster26 πιθανότατα αποτελούταν από νεκρά κύτταρα που διέφυγαν από τις παραμέτρους φιλτραρίσματος, επειδή δεν εμφάνιζε συγκεκριμένα γονίδια δεικτών, χαμηλά γονίδια μίτοχονδρου σχετικά μικρός αριθμός χαρακτηριστικών. Τα διαγράμματα ομοιόμορφης προσέγγισης πολλαπλής και προβολής για μείωση διαστάσεων (UMAP) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο uwot (Becht et al., 2019). Οι συντεταγμένες UMAP, οι συντεταγμένες συμπλέγματος Seurat και οι δείκτες ειδικοί για το σύμπλεγμα που ελήφθησαν εξήχθησαν ως αρχεία csv για ανάλυση επιβεβαίωσης χρησιμοποιώντας το λογισμικό Loupe Cell Browser (10x Genomics). Τα δεδομένα scRNA-seq κατατέθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Βιοτεχνολογίας Πληροφοριών Gene Expression Omnibus (GSE149134).

Επιλογή υποψηφίων γονιδίων που εξαρτώνται από το στάδιο ανάπτυξης

Για να επιλέξουμε υποψήφια γονίδια που εξαρτώνται από το αναπτυξιακό στάδιο σε κάθε σύμπλεγμα, χρησιμοποιήσαμε τη συνάρτηση FindMarkers για να συλλέξουμε γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στο P0 σε σύγκριση με το E15.5 (π.χ. σύγκριση μεταξύ συστάδας

8 at P0 and cluster 8 at E15.5 for podocytes). Subsequently, we utilized the AverageExpression function to add the average gene expression data for each cluster at each stage for stage-dependent comparisons (log-fold change >1 και p-value<0.05). to="" determine="" segment-specific="" genes,="" we="" compared="" the="" target="" cluster="" with="" all="" other="" clusters="" at="" p0="" and="" selected="" the="" genes="" with="" low="" p-values="" (p="" <="" 0.05)="" and="" low="" expression="" rates="" in="" other="" clusters="" (pct2=""><0.11). after="" selecting="" the="" overlapping="" genes,="" we="" verified="" them="" in="" umap="" plots="" to="" finalize="" the="" lineage-specific="" stage-dependent="">

Ανοσοϊστοχημική ανάλυσηΤομές παραφίνης υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου σε κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και μπλοκαρίστηκαν με επώαση με 1 τοις εκατό BSA σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτογενή αντισώματα στους 4°C. C, ακολουθούμενη από επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με βαφές Alexa Fluor για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλ-ινδόλη (Roche; Cat# 10236276001). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: βιοτινυλιωμένο LTL (Vector Laboratories; B-1325), αντι-SLC12A1 κουνελιού (StressMarq Bioscience; SPC-401D), αντι-KRT8 επίμυων (Develop-mental Studies Hybridoma Bank, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Troma-I), ινδικό χοιρίδιο αντι-NPHS1 (Progen; GP-N2); και αντι-CD31 κουνελιού (Abcam; ab28364). Οι εικόνες φθορισμού καταγράφηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο LSM780 (Carl Zeiss) ή ομοεστιακό μικροσκόπιο FV3000 (Olympus).

Υβριδισμός in situΠραγματοποιήθηκε ανάλυση RNAscope 10 τοις εκατό τμημάτων παραφίνης σταθεροποιημένων με φορμαλίνη χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντιδραστηρίων φθορισμού RNAscope Multiplex v2 (ADC, Cat# 323100). Η ενίσχυση του σήματος πραγματοποιήθηκε με TSA συν φθοροφόρα (Thermo Fisher Scientific). Λεπτομέρειες για τους ανιχνευτές RNAscope παρέχονται στον Πίνακα S3. Ο επί τόπου υβριδισμός του Kap με βάση τη διγοξιγενίνη πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται (Kaku et al., 2013) χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σύστημα Discovery (Roche), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Ο ανιχνευτής Kap κλωνοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S3) και επισημάνθηκε με διγοξιγενίνη χρησιμοποιώντας πολυμεράση RNA. Δύο έως τρία δείγματα σε κάθε εμβρυϊκό στάδιο εξετάστηκαν για κάθε ανιχνευτή και έδειξαν συνεπή αποτελέσματα.

Μεταμόσχευση εμβρυϊκών νεφρών ποντικούΈγκυα θηλυκά ποντίκια C57BL/6N (E12.5) και ενήλικα αρσενικά ποντίκια (8–12 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την CLEA Japan Inc. και στεγάστηκαν σε μια συγκεκριμένη εγκατάσταση ζώων χωρίς παθογόνα. Ενήλικα ποντίκια-ξενιστές αναισθητοποιήθηκαν με περιτοναϊκή χορήγηση φυσιολογικού ορού που περιείχε 0.75 mg/kg μεδετομιδίνης, 4.{{10}} mg/kg μιδαζολάμη και 5.0 mg/kg μιδαζολάμης και 5.0 mg. /kg βουτορφανόλης. Οι εμβρυϊκοί νεφροί ποντικού με την κλοάκα στο E12.5 μεταμοσχεύθηκαν στο λίπος της επιδιδυμίδας των ποντικών-ξενιστών (Yokote et al., 2015). Μετά την επέμβαση, η ατιπαμεζόλη χορηγήθηκε ως αναισθητικός ανταγωνιστής. Οι μεταμοσχευμένοι εμβρυϊκοί νεφροί συλλέχθηκαν 12 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση. Για ανάλυση scRNA-seq, οι νεφροί διαχωρίστηκαν παρόμοια με τους νεφρούς P0. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του ιδρύματός μας και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Κουμαμότο (#A2019-113).

Επανάλυση των δημοσίως διαθέσιμων δεδομένων scRNA-seqΤα δεδομένα scRNA-seq για E14.5 εμβρυϊκό ποντίκινεφρόκαι P1νεφρό(Adam et al., 2017b; Magella et al., 2017) λήφθηκαν από το Gene Expression Omnibus (Accession Numbers, GSE94333 και GSE104396, αντίστοιχα). Όλες οι επόμενες αναλύσεις αυτών των δεδομένων πραγματοποιήθηκαν στη γλώσσα στατιστικού προγραμματισμού R (R Core Team, 2018) και το πακέτο Seurat (έκδοση 3.2.2) χρησιμοποιήθηκε για αναλύσεις που περιλαμβάνουν ποιοτικό έλεγχο, κανονικοποίηση δεδομένων, κλίμακα δεδομένων και οπτικοποίηση όπως περιγράφεται στην Ενότητα 4.1.