Το υδρόθειο εξασθενεί την επαγόμενη από νεφρική I/R ενεργοποίηση της φλεγμονώδους απόκρισης και της απόπτωσης μέσω της ρυθμιστικής αναστολής της οδού σηματοδότησης NLRP3 με τη μεσολάβηση Nrf2
Mar 14, 2022
Αφηρημένη. Ο τραυματισμός νεφρικής ισχαιμίας/επαναιμάτωσης (I/R) μπορεί να οδηγήσει σε οξείαΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ, καθυστερημένη λειτουργία μοσχεύματος και απόρριψη μοσχεύματος. Υποδοχέας που μοιάζει με NOD ολιγομερισμού που δεσμεύει νουκλεοτίδια που περιέχει την περιοχή πυρίνης 3 (NLRP3) φλεγμονή συμμετέχει στην ανάπτυξηνεφρώνβλάβη. Το Nrf2 επιταχύνει την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης NLRP3 και ρυθμίζει περαιτέρω τη φλεγμονώδη απόκριση. Επιπλέον, το υδρόθειο έχει προστατευτικό ρόλονεφρική βλάβη; Ωστόσο, ο λεπτομερής υποκείμενος μηχανισμός παραμένει ελάχιστα κατανοητός. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε εάν οι οδοί Nrf2 και NLRP3 συμμετέχουν σε ρυθμιζόμενα με υδρόθειονεφρώνΠροκαλούμενη από I/R ενεργοποίηση της φλεγμονώδους απόκρισης και απόπτωση. Ποντίκια άγριου τύπου και Nrf2-knockout (KO) υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για να προκαλέσουννεφρώνI/R μέσω σύσφιξης του αμφίπλευρουνεφρώνμίσχους. Ένα σύνολο 20 mg/kg MCC950 (ένας αναστολέας NLRP3) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά καθημερινά για 14 ημέρες πριν από τη χειρουργική επέμβαση.Νεφρώνιστός και αίμα συλλέχθηκαν από τα ποντίκια του μοντέλου I/R για να αναλυθούν τα επίπεδα έκφρασης mRNA NLRP3 και Nrf2, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης NLRP3, PYD και CARD που περιέχουν κασπάση-1, IL-1, Nrf2 και οξυγενάση αίμης 1, κυτταρική απόπτωση, την έκκριση των κυτοκινών παράγοντα νέκρωσης όγκου, IL-1 και IL-6 καινεφρώνιστοπαθολογία και λειτουργία.ΝεφρώνΤο I/R ενεργοποίησε τις οδούς σηματοδότησης NLRP3 και Nrf2. Αντίθετα, η θεραπεία με MCC950 ανέστειλε την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης NLRP3 και εμπόδισε την επαγόμενη από I/Rνεφρική βλάβη, την απελευθέρωση κυτοκινών και την απόπτωση σενεφρώνΠοντίκια μοντέλου I/R. Το υδροσουλφίδιο του νατρίου (NaHS) όχι μόνο μείωσε την ανοδική ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης NLRP3, αλλά επίσης ανακούφισενεφρική βλάβη,η απελευθέρωση κυτοκινών και η κυτταρική απόπτωση που προκαλείται από νεφρικό I/R σε ποντικούς άγριου τύπου, αλλά όχι σε ποντικούς Nrf2-KO. Το NaHS ανακούφισε την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3,νεφρική βλάβη,φλεγμονώδης απόκριση και κυτταρική απόπτωση μέσω της οδού σηματοδότησης Nrf2 σε ποντικούς μοντέλου νεφρικού I/R.
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ
Εισαγωγή
Η νεφρική ισχαιμία/επαναιμάτωση (I/R) είναι η κύρια αιτία οξείας νόσουνεφρική βλάβη(ΑΚΙ) που εμφανίζεται συνήθως κατά τη διάρκειανεφρώνχειρουργική επέμβαση και προδιαθέτει τα άτομα σε σοβαρή δυσλειτουργία σε συστήματα πολλαπλών οργάνων. Ο κυτταρικός θάνατος και φλεγμονή που προκαλείται από I/R εντόςνεφρώνΟ ιστός σχετίζεται με πολύπλοκες παθοφυσιολογικές διεργασίες και προάγει την πτώση τουνεφρική λειτουργία,οδηγώντας έτσι στη συσσώρευση μεταβολικών αποβλήτων (1). Εκτός από την ισχαιμία που προκαλείταινεφρώνβλάβη ιστού, η επαναιμάτωση έχει επίσης βρεθεί ότι πυροδοτεί έναν πολύπλοκο παθοφυσιολογικό καταρράκτη που περιλαμβάνει την υπερβολική απελευθέρωση ελεύθερων ριζών και τη συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων, προάγοντας στη συνέχεια τη φλεγμονή και περαιτέρω επιδείνωση της τοπικής ισχαιμίας και κυτταρικής βλάβης (2).
Οι υποοικογένειες της περιοχής δέσμευσης νουκλεοτιδίων και της πλούσιας σε λευκίνη οικογένειας που περιέχουν επαναλήψεις διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην ανάπτυξη της φλεγμονώδους απόκρισης (3). Ο τομέας πυρίνης της οικογένειας NLR περιέχει 3 (NLRP3) φλεγμονόσωμα (προηγουμένως γνωστό ως τομείς NACHT, LRR και PYD που περιέχουν πρωτεΐνη 3 και κρυοπυρίνη) είναι το πιο χαρακτηρισμένο φλεγμονώδες σώμα μέχρι σήμερα. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών ανέφερε συσχέτιση μεταξύ NLRP3 καιΡέναl I/R. Στο AKI εμπλέκεται το NLRP3νεφρώνΤραυματισμός I/R (4,5). Για παράδειγμα, η καταστροφή του NLRP3 και του προσαρμογέα του PYD και που περιέχει τομέα CARD (ASC) ανακουφίζει από I/Rνεφρώνδυσλειτουργία και η υπερβολική εισροή ουδετερόφιλων σενεφρικό ιστό(6). Επιπλέον, η καταστροφή του NLRP3 και/ή της κασπάσης-1 προστατεύει τα ποντίκια από το AKI που προκαλείται από σήψη ή λιποπολυσακχαρίτη (7,8). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το φλεγμονώδες NLPR3 μπορεί να διαδραματίσει βασικό ρόλο στην παθογένεση τουνεφρική βλάβη.
Το Nrf2 είναι ένα ενδογενές αντιοξειδωτικό γονίδιο, που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, το οποίο συνδυάζεται με την πρωτεΐνη 1 (Keap) που σχετίζεται με το ECH τύπου Kelch. Μόλις ενεργοποιηθεί, το Nrf2 απελευθερώνεται από το Keep και μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου στη συνέχεια συνδέεται με στοιχεία αντιοξειδωτικής απόκρισης για να ξεκινήσει η μεταγραφή των κατάντη αντιοξειδωτικών και κυτταροπροστατευτικών γονιδίων-στόχων του, όπως η υπεροξειδάση δισμουτάση, η καταλάση, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η γλουταθειόνη-τρανσφεράση. ισοένζυμα, καταλυτικές και τροποποιητικές υπομονάδες λιγάσης γλουταμυλοκυστεΐνης και NADP(H): Οξειδορεδουκτάση κινόνης (9). Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι το Nrf2 σχετίζεται με AKI που προκαλείται από περιβαλλοντική προσβολή, ισχαιμία ή ξενοβιοτικά(10). Εκτός από τον αναφερόμενο προστατευτικό του ρόλο σε τραυματισμό ιστών, προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η υπερέκφραση του Nrf2 καταστέλλει τη δραστηριότητα του φλεγμονώδους NLRP3 και βελτιώνει τον τραυματισμό των ιστών (11-13). Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός της οδού σηματοδότησης Nrf2 και η επίδρασή του στην ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 στονεφρώνΤο I/R παραμένει άγνωστο.Το υδρόθειο (H2S) έχει αναγνωριστεί για την ικανότητά του να ρυθμίζει την ομοιόσταση των θηλαστικών και τις θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες, όπως η αυτοφαγία (14). Ένας αριθμός μελετών έχει αναφέρει ότι το H2S έχει προστατευτικό ρόλο έναντι της απόπτωσης, του οξειδωτικού στρες και της φλεγμονής στηννεφρική βλάβη(15-20). Ωστόσο, ο υποκείμενος προστατευτικός μηχανισμός του H2S σενεφρική βλάβηπου προκαλείται από το I/R παραμένει άγνωστο. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη διερεύνησε τα επίπεδα έκφρασης του NLRP3 και του προσαρμογέα του, ASC, σε ποντικούς νεφρικού μοντέλου I/R και στη συνέχεια προσδιόρισε την επίδραση του Nrf2 στην έκφραση του NLRP3. Η παρούσα μελέτη είχε επίσης στόχο να καθορίσει εάν το H2S προστατεύεινεφρικό ιστόκατάνεφρική βλάβη,φλεγμονή και απόπτωση μέσω αναστολής NLRP3 με τη μεσολάβηση Nrf2.
Λέξεις-κλειδιά:νεφρική ισχαιμία/ βλάβη επαναιμάτωσης, Nrf2, υδρόθειο, απόπτωση, νεφρική βλάβη. ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ
Υλικά και μέθοδοι
Καθιέρωση νεφρικού μοντέλου I/R και ομάδων θεραπείας.Συνολικά 24 αρσενικά ποντίκια άγριου τύπου (βάρος, 20-25 g, ηλικία, 6-8 εβδομάδες) ελήφθησαν από το Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων της Ακαδημίας Στρατιωτικών Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). Επιπλέον, εννέα αρσενικά ποντίκια Nrf2-knockout (KO) (βάρος, 20-25 g, ηλικία, 6-8 εβδομάδες) ελήφθησαν από την Junke Biological Co., Ltd. Όλα τα ζωικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Animal Care and Use Committee του Γενικό Νοσοκομείο του Ιατρικού Πανεπιστημίου Tianjin (αρ. έγκρισης IRB2020‑DW‑04, Tianjin, Κίνα) και καταβλήθηκαν όλες οι προσπάθειες για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων και ο αριθμός των ζώων που χρησιμοποιούνται. Τα ποντίκια εγκλιματίστηκαν στο περιβάλλον για 3 ημέρες πριν από το πείραμα στους 22°C με υγρασία 40-60 τοις εκατό, κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών και ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και τροφή τρωκτικών. Αφού τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή (IP) 50 mg/kg πεντοβαρβιτάλη νατρίου, η αμφοτερόπλευρηνεφρώνΟι μίσχοι απολινώθηκαν για 30 λεπτά χρησιμοποιώντας σφιγκτήρες μικροανευρύσματος. Στη συνέχεια αφαιρέθηκαν οι σφιγκτήρες του μικροανευρύσματος. Στην ομάδα ελέγχου, η χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε με την ίδια διαδικασία. ωστόσο,νεφρώνοι μίσχοι δεν απολινώθηκαν. Μετά τη χειρουργική επέμβαση, χρησιμοποιήθηκε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 τοις εκατό για να βοηθήσει τα ποντίκια να αναρρώσουν. Τα ποντίκια στη συνέχεια θυσιάστηκαν μετά από επαναιμάτωση για 24 ώρες. Συνολικά 24 ποντίκια άγριου τύπου χωρίστηκαν τυχαία στις ακόλουθες έξι ομάδες: i) Ομάδα ελέγχου (Con) (n=9). ii) Ομάδα I/R (n=9); iii) I/R συν ομάδα MCC950 (n=3); και iv) I/R συν ομάδα NaHS (n=3). Συνολικά εννέα ποντίκια Nrf2‑KO χωρίστηκαν τυχαία στις ακόλουθες τρεις ομάδες: i) Ομάδα Con (n=3). ii) Ομάδα I/R (n=3); και iii) I/R συν ομάδα NaHS (n=3).
Σύμφωνα με προηγούμενες έρευνες και προκαταρκτικά πειράματα (21,22), 20 mg/kg MCC950 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) εγχύονταν (IP) καθημερινά για 14 ημέρες πριν από την επέμβαση στο I/R συν MCC950 ομάδα. Ένα σύνολο 50 μmol/kg υδροθειώδους νατρίου [NaHS; ip? αραιωμένο σε φυσιολογικό (0,9 τοις εκατό) φυσιολογικό ορό. Sigma-Aldrich; Merck KGaA] εγχύθηκε πριν από τη χειρουργική επέμβαση στην ομάδα I/R συν NaHS. Μόλις ολοκληρώθηκαν όλες οι πειραματικές διαδικασίες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας και συλλέχθηκαν ιστοί και αίμα για επακόλουθη ανάλυση.
Western blotting. Νεφρικός ιστόςσυλλέχτηκε από ποντικούς τύπου I/R μετά από 24ωρη επαναιμάτωση για να αναλυθούν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης. Εν συντομία, η ολική και η νουκλεϊκή πρωτεΐνη εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) και προσδιορίστηκε η συγκέντρωση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κιτ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Συνολικά 40 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα διαχωρίστηκαν μέσω 10 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4˚C: Anti-NLRP3 (1:500; αρ. κατ. ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; αρ. κατ.sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-caspase‑1 (1:200; αρ. κατ. sc‑56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1,000; cat . αρ. ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1,000; αρ. κατ. ab137550; Abcam), αντι-αιμική οξυγενάση (HO)-1 (1:2,000 ; αρ. κατ. ab68477; Abcam), αντι-ακτίνη (1:2,000; αρ. κατ. ab8227; Abcam) και αντι-ιστόνη H3 (1:2,000; γάτα ab176842· Abcam). Μετά την πρωτογενή επώαση αντισωμάτων, οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα αντίστοιχα συζευγμένα με HRP δευτερογενή αντισώματα (1:5,000· cat nos. ab6721 και ab6728· αμφότερα Abcam) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ζώνες πρωτεϊνών οπτικοποιήθηκαν με ένα κιτ βελτιωμένης χημειοφωταύγειας (Thermo Fisher Scientific, Inc.) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Bio-Imaging (Bio-Rad Laboratories, Inc.) και ημι-ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Quantity One (V4.6) (Bio-Rad Laboratories , Inc.). Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν σε -ακτίνη για την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη ή ιστόνη για νουκλεϊκή πρωτεΐνη.
Αντίστροφη μεταγραφή-ποσοτική(RT‑q)PCR.Νεφρικός ιστόςσυλλέχτηκε από ποντικούς τύπου I/R μετά από 24ωρη επαναιμάτωση για να αναλυθούν τα επίπεδα έκφρασης mRNA. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστό χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΡΙζοΙ® (αρ. κατ. 15596026, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Το ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA First Strand RevertAid (αρ. κατ. K1621, Thermo Scientific™, Thermo Fisher Scientific, Inc.) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η qPCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) σε σύστημα PCR πραγματικού χρόνου 7500 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Οι συνθήκες θερμοκυκλοποίησης ήταν οι εξής: Μετουσίωσης στους 95°C για 5 λεπτά. 40 κύκλοι στους 95˚C για 15 δευτερόλεπτα. και επέκταση στους 60˚C για 20 δευτερόλεπτα. Οι ειδικές για το γονίδιο αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα I. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων-στόχων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCq (23) και κανονικοποιήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης GAPDH.
Ανοσοϊστοχημεία (IHC). Νεφρικός ιστόςσυλλέχτηκε από ποντικούς μοντέλου I/R μετά από 24ωρη επαναιμάτωση για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης NLRP3 και Nrf2. Εν ολίγοις,νεφρόΟ ιστός σταθεροποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 48 ώρες σε φορμαλίνη 10 τοις εκατό, ενσωματώθηκε σε παραφίνη και κόπηκε σε τμήματα των 5 μm. Οι τομές στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό γάλα στους 37˚C για 30 λεπτά και επωάστηκαν με anti-NLRP3 (1:100; αρ. κατ. ab214185; Abcam) ή αντι-Nrf2 (1:200; αρ. κατ. ab137550; Abcam) πρωτογενή αντισώματα κατά τη διάρκεια της νύχτας. Μετά την αρχική επώαση αντισωμάτων, οι τομές επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα κατά κουνελιού σημασμένο με HRP (1:200, αρ. κατ. ab214880, Abcam) στους 37°C για 30 λεπτά, που αναπτύχθηκε με χρήση διαλύματος διαμινοβενζιδίνης για<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Δοκιμασία νεφρικής λειτουργίας. Συνολικά 2-3 ml αίματος συλλέχθηκε μετά από φυγοκέντρηση στα 3,000 xg για 10 λεπτά στους 4˚C από ποντικούς μοντέλου I/R μετά από 24ωρη επαναιμάτωση. Ο ορός ελήφθη για ανάλυσηνεφρική λειτουργίαμέσω ELISA για τον προσδιορισμό των επιπέδων κρεατινίνης (αρ. κατ. C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) και αζώτου ουρίας αίματος (BUN; αρ. κατ. C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.Κάκωση νεφρούΤα επίπεδα του μορίου-1 (KIM-1) στον ορό μετρήθηκαν με ELISA (αρ. κατ. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη.Νεφρικός ιστόςσυλλέχθηκε από ποντικούς μοντέλου I/R μετά από 24ωρη επαναιμάτωση για αξιολόγησηνεφρώνιστοπαθολογικές αλλαγές. Ο ιστός σταθεροποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 48 ώρες σε 10 τοις εκατό φορμαλίνη και στη συνέχεια ενσωματώθηκε σε παραφίνη. Οι ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές κόπηκαν σε τμήματα πάχους 5 μm και χρωματίστηκαν με 0,5 τοις εκατό αιματοξυλίνη για 5 λεπτά και ηωσίνη για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (25˚C). Η παρουσία αιμορραγίας, σωληναριακής κυτταρικής νέκρωσης, σωληναριακής διάτασης και σχηματισμού κυτταροπλασματικών κενοτοπίων στον ιστό βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, φυσιολογικόνεφρό;1, ελάχιστη ζημιά. 2, μέτρια ζημιά? και 3, σοβαρή ζημιά (24).Νεφρική βλάβηΟι βαθμολογίες υπολογίστηκαν με τυφλό τρόπο από δύο ερευνητές κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός (μεγέθυνση, x200; Biorevo BZ‑9000; Keyence Corporation).
Ανάλυση ELISA των επιπέδων TNF-, IL-1 και IL-6. Αίμα συλλέχθηκε (1 ml) από ποντικούς μοντέλου I/R μετά από 24ωρη επαναιμάτωση. Ο ορός ελήφθη με φυγοκέντρηση στους 3,000 xg για 10 λεπτά στους 4°C. Τα επίπεδα TNF- (αρ. κατ. MTA00b), IL-1 (αρ. κατ. MLB00C) και IL-6 (αρ. κατ. M6000B) στον ορό αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ELISA (R&D Systems, Inc.), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (αρ. κατ. CA94089; Molecular Devices, LLC).
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ
Χρώση TUNEL.Νεφρικός ιστόςσυλλέχθηκε από ποντικούς μοντέλου I/R μετά από 24ωρη επαναιμάτωση για να αξιολογηθεί η κυτταρική απόπτωση χρησιμοποιώντας χρώση TUNEL. Εν συντομία, ο ιστός σταθεροποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 48 ώρες σε φορμαλίνη 10 τοις εκατό, ενσωματώθηκε σε παραφίνη και κόπηκε σε τμήματα πάχους 5 μm. Οι τομές επωάστηκαν με αντιδραστήριο TUNEL σε υγροποιημένο θάλαμο στους 37˚C για 60 λεπτά στο σκοτάδι (Roche Diagnostics) και χρωματίστηκαν με DAPI για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν τυχαία 10 πεδία μικροσκοπίου υψηλής ισχύος και παρατηρήθηκαν σε κάθε τμήμα με μικροσκόπιο φθορισμού (μεγέθυνση, x10).Στατιστική ανάλυση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SD τριών πειραμάτων και αναλύθηκαν από το GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ζευγαρωμένο Student's t-test. Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ περισσότερων από τριών ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από post hoc δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey. Όλα τα δεδομένα κατανεμήθηκαν κανονικά και είχαν ίση διακύμανση. Π<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Αποτελέσματα
Η θεραπεία MCC950 αποτρέπει την επαγόμενη από I/R ενεργοποίηση σηματοδότησης NLRP3 μετά απόνεφρική βλάβησε ποντίκια. Η οδός φλεγμονώδους NLRP3 ενεργοποιείται και διαδραματίζει κρίσιμο ρόλονεφρική βλάβη(25,26). Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε επίσης ότι η σηματοδότηση NLRP3 ενεργοποιείται σε νεφρικό ιστό ποντικών 24 ώρες μετά την επαναιμάτωση (4). Ως εκ τούτου, επιλέχθηκε 24 ώρες μετά την επαναιμάτωση ως το παρόν χρονικό σημείο αξιολόγησης. Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης NLRP3 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω από τη νεφρική βλάβη I/R στην ομάδα I/R σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Con) (Εικ. 1Α και Β). Μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης mRNA του NLRP3 (Εικ. 1C). Επιπλέον, ο αριθμός των NLRP3 θετικών κυττάρων αυξήθηκε στην ομάδα I/R σε σύγκριση με την ομάδα Con, όπως προσδιορίστηκε με χρώση IHC (Εικ. 1D και E).
Προκειμένου να προσδιοριστεί ο υποκείμενος μηχανισμός της ενεργοποίησης του φλεγμονώδους NLRP3 και η επίδραση στην κατάντη οδό σηματοδότησης μετά από βλάβη του νεφρικού I/R, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον αναστολέα NLRP3 MCC950. Τα αποτελέσματα Western blotting έδειξαν ότι το I/R ρύθμισε τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης του NLRP3 και του προσαρμογέα του ASC και προώθησε την ωρίμανση από προκασπάση-1 σε κασπάση-1 και pro-IL-1 σε IL-1 στην ομάδα I/R σε σύγκριση με την Ομάδα Con (Εικ. 2A-E). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η νεφρική I/R μπορεί να προκαλέσει ενεργοποίηση της φλεγμονώδους οδού NLRP3 και η θεραπεία με MCC950 μπορεί να μειώσει τα επίπεδα έκφρασης NLRP3, ASC, κασπάσης-1 και IL-1 μετά από βλάβη του νεφρικού I/R.
Επίδραση του φλεγμονώδους NLRP3 στονεφρική βλάβη, φλεγμονή και απόπτωση σε ποντικούς μοντέλου νεφρικού I/R. Ωστε να
προσδιορίστε την επίδραση του NLRP3 στη νεφρική βλάβη, ποντίκια μοντέλου I/R υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον αναστολέα NLRP3 MCC950. Τα ποντίκια μοντέλου νεφρικού I/R εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα BUN, κρεατινίνης ορού και KIM-1, που είναι βιοδείκτης νεφρικής βλάβης (Εικ. 3A-C), υποδεικνύοντας επιτυχή πρόκληση νεφρικής βλάβης I/R. Η ιστολογική εξέταση νεφρικού ιστού από ποντίκια μοντέλου I/R αποκάλυψε αυξημένη ιστολογική βαθμολογία, η οποία αποδείχθηκε από σοβαρή διόγκωση του επιθηλίου των σωληναρίων, σωληναριακή διαστολή και διάμεσο οίδημα, εκφύλιση κενοτοπίων και απώλεια του ορίου της βούρτσας, γεγονός που υποδηλώνει ότι το νεφρικό I/R μπορεί να προάγει σημαντική βλάβη νεφρικού ιστού και αυξημένη ιστολογική βαθμολογία (Εικ. 3Δ και Ε). Η αναστολή του NLRP3 από τη θεραπεία με MCC950 μείωσε σημαντικά τις επαγόμενες από I/R αυξήσεις στα επίπεδα BUN, κρεατινίνης και KIM-1 και μείωσε την ιστολογική βαθμολογία, με τον νεφρικό ιστό να παρουσιάζει λιγότερα σοβαρά τραυματισμένα σωληνάρια (Εικ. 3A-E).
Επιπλέον, τα επίπεδα φλεγμονωδών παραγόντων και αποπτωτικών κυττάρων μετά τη χορήγηση MCC950 αναλύθηκαν σε ποντικούς μοντέλου νεφρικού I/R. Οι δείκτες φλεγμονής, συμπεριλαμβανομένων των TNF-, IL-1 και IL-6, ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω στην ομάδα I/R σε σύγκριση με την ομάδα Con (Εικ. 3F-H). Επιπλέον, σε σύγκριση με την ομάδα Con, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά 24 ώρες μετά την επαναιμάτωση στην ομάδα I/R (Εικ. 3I και J). Σε σύγκριση με την ομάδα I/R, τα εκκριτικά επίπεδα των κυτοκινών, TNF-, IL-1 και IL-6, και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μειώθηκαν με τη θεραπεία MCC950 στην ομάδα I/R συν MCC950 (Εικ. 3F-J ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή του φλεγμονώδους NLRP3 μπορεί να αποτρέψει την απελευθέρωση φλεγμονωδών παραγόντων και την απόπτωση του νεφρικού ιστού που προκαλείται από I/R.
Το Nrf2 είναι απαραίτητο για τη ρύθμιση της φλεγμονώδους δραστηριότητας του NLRP3 που προκαλείται από το νεφρικό I/R.Μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε ότι το Nrf2 ενεργοποιείται και τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων-στόχων Nrf2 ρυθμίζονται προς τα πάνω σενεφρικό ιστόμετά από κάκωση νεφρικής I/R (27). Παρόμοια ευρήματα προέκυψαν και στην παρούσα έρευνα. Τα επίπεδα έκφρασης νουκλεϊκών, ολικών πρωτεϊνών και mRNA του Nrf2 αναλύθηκαν 24 ώρες μετά τον τραυματισμό I/R του νεφρού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, σε σύγκριση με την ομάδα Con, τα επίπεδα έκφρασης νουκλεϊκών, ολικής πρωτεΐνης και mRNA του Nrf2 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στην ομάδα I/R (Εικ. 4A-D). Επιπλέον, η ανάλυση IHC διαπίστωσε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Nrf2 στον νεφρικό ιστό ήταν αυξημένα, γεγονός που αποδείχθηκε από τον αυξημένο αριθμό των Nrf2-θετικών
κύτταρα που παρατηρήθηκαν στην ομάδα I/R (Εικ. 4Ε και ΣΤ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Nrf2 μπορεί να προκαλέσει μια προστατευτική απόκριση σε ποντικούς μοντέλου νεφρικού I/R. Προκειμένου να επαληθευτεί η επίδραση του Nrf2 στο φλεγμονώδες μονοπάτι του NLRP3 σε νεφρικό I/R, χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια Nrf2-KO σε επόμενα πειράματα. Τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης του Nrf2 και του γονιδίου στόχου του, HO-1, ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα κάτω μετά από νεφρική I/R σε ποντικούς KO σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου (Εικ. 5A-C). Αντίθετα, σε σύγκριση με την ομάδα άγριου τύπου I/R, τα επίπεδα έκφρασης του NLRP3 και του προσαρμογέα του, ASC, κασπάσης-1 και IL-1 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στην ομάδα I/R KO (Εικ. 5A και D-G). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η νεφρική I/R μπορεί να προκαλέσει ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 σε ποντικούς Nrf2-KO.
Το NaHS ανακουφίζει την επαγόμενη από I/R ανοδική ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης NLRP3 σε ποντίκια άγριου τύπου, αλλά όχι σε Nrf2-KO. Το NaHS έχει αποδειχθεί ότι ασκεί αποτελέσματα στην έκφραση του Nrf2 και στην ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 σε διαφορετικά μοντέλα ασθενειών (28-30). Η παρούσα μελέτη διερεύνησε εάν η επίδραση του NaHS στην ενεργοποίηση της οδού NLRP3 εμφανίζεται μέσω της οδού σηματοδότησης Nrf2 αναλύοντας τα επίπεδα έκφρασηςπρωτεϊνών που σχετίζονται με το φλεγμονώδες Nrf2 και NLRP3 σε ποντίκια άγριου τύπου και KO.Σε ποντίκια άγριου τύπου, σε σύγκριση με την ομάδα Con, τα επίπεδα έκφρασης των Nrf2, NLRP3, κασπάσης-1 και IL-1 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω λόγω βλάβης του νεφρικού I/R. Επιπλέον, η θεραπεία NaHS ρύθμισε περαιτέρω την έκφραση Nrf2 και μείωσε τα επίπεδα έκφρασης NLRP3, κασπάσης-1 και IL-1 στην ομάδα I/R συν NaHS σε σύγκριση με την ομάδα I/R (Εικ. 6A-E). Σε ποντικούς Nrf2-KO, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης Nrf2, NLRP3, κασπάσης-1 και IL-1 μεταξύ των ομάδων I/R και I/R συν NaHS (Εικ. 6A-E). Στην ομάδα I/R συν NaHS, τα επίπεδα έκφρασης Nrf2 μειώθηκαν σημαντικά, ενώ τα επίπεδα έκφρασης NLRP3, κασπάσης-1 και IL-1 ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω στα ποντίκια Nrf2-KO σε σύγκριση με τα ποντίκια άγριου τύπου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το NaHS μπορεί να μειώσει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 μέσω της οδού σηματοδότησης Nrf2 σε νεφρική βλάβη I/R
Το NaHS ανακουφίζει τη νεφρική βλάβη, τη φλεγμονή και την απόπτωση μέσω της οδού σηματοδότησης Nrf2 σε ποντικούς μοντέλου νεφρικού I/R. Το NaHS διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη νεφρική βλάβη σε μοντέλα AKI, I/R και άλλα νοσήματα (31). Το NaHS ανακούφισε την ιστοπαθολογική βλάβη που προκλήθηκε από νεφρική I/R, η οποία καταδείχθηκε από μειωμένο οίδημα του επιθηλίου των σωληνώσεων, σωληναριακή διαστολή και διάμεσο οίδημα καινεφρόιστολογικές βαθμολογίες στην ομάδα I/R συν NaHS σε σύγκριση με την ομάδα I/R σε ποντίκια άγριου τύπου (Εικ. 7Α και Β). Οι δείκτες νεφρικής λειτουργίας, συμπεριλαμβανομένης της κρεατινίνης, του BUN και του KIM-1, μειώθηκαν επίσης από τη θεραπεία με NaHS στην ομάδα I/R συν NaHS σε σύγκριση με την ομάδα I/R σε άγριου τύπου
ποντίκια (Εικ. 7C-E). Ωστόσο, σε ποντικούς Nrf2-KO, το NaHS δεν μπόρεσε να μειώσει την αύξησηνεφρόιστολογική βαθμολογία και επίπεδα δεικτών νεφρικής λειτουργίας που προκαλούνται από νεφρική I/R. Επιπλέον, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων και η απελευθέρωση κυτοκινών, TNF-, IL-1 και IL-6, μειώθηκαν όλα μετά από θεραπεία NaHS στο I/R συν NaHSη ομάδα συγκρίθηκε με την ομάδα I/R σε ποντίκια άγριου τύπου (Εικ. 7F‑J). Ωστόσο, το NaHS δεν μπόρεσε να ασκήσει προστατευτική δράση έναντι της απόπτωσης και της υπερβολικής απελευθέρωσης φλεγμονωδών παραγόντων μετά από επαναιμάτωση νεφρικού ιστού στην ομάδα I/R συν NaHS ποντικών Nrf2-KO σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου I/R συν NaHS (Εικ. 7F‑J). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το NaHS μπορεί να ανακουφίσει τη νεφρική βλάβη, τη φλεγμονή και την απόπτωση σε νεφρικά I/R ποντίκια άγριου τύπου, αλλά όχι σε ποντίκια Nrf2-KO.
Συζήτηση
Η φλεγμονή είναι μια βασική παθογόνος διαδικασία της ΑΚΙ που προκαλείται από I/R (4). Το φλεγμονώδες NLRP3 και η σηματοδοτική οδός Nrf2 συμμετέχουν στη ρύθμιση της φλεγμονής σενεφρική βλάβη(32). Η παρούσα μελέτη διαπίστωσε ότι το AKI που προκαλείται από I/R ενεργοποίησε το φλεγμονώδες NLRP3 και ο προσαρμογέας του, ASC, προώθησε την ωρίμανση της προκασπάσης-1 και του προ-IL-1 και επιτάχυνε την υπερβολική απελευθέρωση κυτοκινών και την απόπτωση, η οποία κατέληξε σε σοβαρή νεφρική δυσλειτουργία. Η αναστολή του φλεγμονώδους NLRP3 με τη θεραπεία MCC950 βελτίωσε τη νεφρική λειτουργία, τα επίπεδα φλεγμονής και την απόπτωση στον νεφρικό ιστό. Εκτός από την ενεργοποίηση του NLRP3, το νεφρικό I/R ενεργοποίησε επίσης το μονοπάτι σηματοδότησης Nrf2. Ωστόσο, η απουσία Nrf2 σε ποντικούς Nrf2-KO οδήγησε σε περαιτέρω ρύθμιση προς τα πάνω του φλεγμονώδους NLRP3 και του προσαρμογέα του. Η θεραπεία με NaHS βρέθηκε ότι ανακουφίζει τη δραστηριότητα του φλεγμονώδους NLRP3 μέσω της οδού σηματοδότησης Nrf2. Επιπλέον, η νεφρική βλάβη, η φλεγμονή και η απόπτωση μειώθηκαν με τη θεραπεία με NaHS μέσω της μεσολαβούμενης από Nrf2 αναστολής της ενεργοποίησης του φλεγμονώδους NLRP3.
Ο τραυματισμός του νεφρικού I/R είναι ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα και κύρια αιτία της ΑΚΙ, η οποία οδηγεί σε αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης χρόνιαςΝεφρική Νόσος(33). Η φλεγμονή είναι ένα σημαντικό παθολογικό χαρακτηριστικό της ισχαιμικής βλάβης και εμφανίζεται ως συνέπεια της ενεργοποίησης των ανοσοκυττάρων μέσω της αναγνώρισης των μοριακών προτύπων που σχετίζονται με το παθογόνο και τη βλάβη (34). Επιπλέον, αναφέρθηκε προηγουμένως ότι το φλεγμονώδες NLRP3 παίζει ρόλο σε μια σειρά απόνεφρικές παθήσειςρυθμίζοντας τη φλεγμονή, την πυρόπτωση, την απόπτωση και την ίνωση (35). Το φλεγμονώδες NLRP3 είναι ένα πρωτεϊνικό σύμπλεγμα που περιλαμβάνει NLRP3, την πρωτεΐνη προσαρμογέα του, ASC και κασπάση-1. Η κασπάση-1 διασπά τις pro-IL-1 και pro-IL-18 σε ώριμες, ενεργοποιημένες εκκριτικές μορφές. Η νεφρική βλάβη που προκαλείται από διαφορετικές παθολογίες, συμπεριλαμβανομένης της ισχαιμίας (33), ενεργοποιεί το φλεγμονώδες σύμπλεγμα, ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του NLRP3 και προάγει την επακόλουθη ωρίμανση του pro-IL-1 (36). Το NLRP3 KO χρησιμοποιώντας μικρό παρεμβαλλόμενο RNA σε ποντίκια ή νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ασκεί προστατευτική δράση έναντι βλάβης νεφρικού ιστού που προκαλείται από ισχαιμία ή κυτταρικό τραυματισμό απουσία γλυκόζης (37). Τα παρόντα αποτελέσματα έδειξαν ότι η νεφρική I/R προκάλεσε ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3, ενώ η αναστολή του NLRP3 με χρήση MCC950 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης NLRP3 και ASC και την ωρίμανση της προ-κασπάσης-1 και του προ-IL-1 στο νεφρικό I/R. μοντέλο τραυματισμού. Επιπλέον, η αναστολή του NLRP3 από το MCC950 βελτίωσε τη νεφρική δυσλειτουργία και μείωσε την ιστοπαθολογική βλάβη και τη βαθμολογία, την υπερβολική απελευθέρωση κυτοκινών και τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του NLRP3 μπορεί να διαδραματίσει βασικό ρόλο στη νεφρική βλάβη και η αναστολή του NLRP3 μπορεί να ασκήσει προστατευτική δράση έναντι τραυματισμού ιστού και δυσλειτουργίας που προκαλείται από νεφρική Ι/Ρ.
Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι το Nrf2 συμμετέχει στη φλεγμονώδη απόκριση (10-12). Επιπλέον, το Nrf2 έχει βασικό αντιφλεγμονώδες, αντιοξειδωτικό ή αντιαποπτωτικό ρόλο σε ισχαιμικές καταστάσεις. Η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης του στοιχείου απόκρισης Nrf2/αντιοξειδωτικής απόκρισης εξασθενεί τη φλεγμονή και την απόπτωση στον νεφρικό ιστό ποντικών που προκαλούνται από κυκλοφωσφαμίδη (38). Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η ενεργοποίηση του Nrf2 από τη σουλφοραφάνη αναστέλλει τη δραστηριότητα του μονοπατιού σηματοδότησης NF-κB, ανακουφίζοντας έτσι τη φλεγμονή στον δυστροφικό μυϊκό ιστό (39). Επιπλέον, η καταστροφή του Nrf2 προάγει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 και οδηγεί σε ενεργοποίηση της IL-1 σε ένα μοντέλο ισχαιμίας (11). Τα παρόντα δεδομένα υποστήριξαν τα ευρήματα ότι η νεφρική I/R μπορεί να επάγει το μονοπάτι σηματοδότησης Nrf2 και την έκφραση των κατάντη γονιδίων στόχων του, όπως το HO‑1. Τα ποντίκια Nrf2-KO προώθησαν περαιτέρω την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3, γεγονός που έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης NLRP3, ASC, κασπάσης-1 και IL-1 ήταν αυξημένα στο μοντέλο νεφρικής I/R. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Nrf2 άσκησε ανασταλτική επίδραση στην ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 σε νεφρική βλάβη I/R.
Προηγούμενη έρευνα έχει αναφέρει ότι τονεφρόπαράγει H2S (40). Επιπλέον, το H2S αυξάνει τη νεφρική ροή του αίματος και προάγει τη λειτουργία κάθαρσης τουνεφρό, όπως αποδεικνύεται από έναν αυξημένο ρυθμό σπειραματικής διήθησης (41). Επιπλέον, το H2S όχι μόνο ανακουφίζει τη φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες, αλλά διαδραματίζει επίσης κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας και της υπέρτασης (28). Το H2S συμμετέχει στη ρύθμιση ασθενειών που σχετίζονται με τους νεφρούς, όπως ο τραυματισμός I/R και η αποφρακτική και διαβητική νεφροπάθεια (42), ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν ελάχιστα κατανοητοί. Το NHS έχει χρησιμοποιηθεί ως εξωγενής δότης H2S στην έρευνα (43). Στην παρούσα μελέτη, η παροχή του H2S ήταν με τη μορφή NaHS. Τα παρόντα αποτελέσματα έδειξαν ότι το NaHS βελτίωσε τον τραυματισμό των ιστών,νεφρόδυσλειτουργία, υπερβολική απελευθέρωση κυτοκινών και απόπτωση που προκαλείται από νεφρική I/R. Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι το NaHS αποτρέπει την ενεργοποίηση των μικρογλοίων και τη φλεγμονή που προκαλείται από τραυματισμό νεύρων μέσω της ρύθμισης της οδού σηματοδότησης Nrf2 (44). Σε συμφωνία με την υπόθεση ότι το NaHS ρυθμίζει τη φλεγμονή μέσω της οδού σηματοδότησης Nrf2, τα παρόντα αποτελέσματα έδειξαν ότι το NaHS ρύθμισε προς τα πάνω τα επίπεδα έκφρασης Nrf2 και ανέστειλε τα επίπεδα έκφρασης του NLRP3 σε ποντικούς μοντέλου νεφρικού I/R. Επιπλέον, το Nrf2 KO κατάργησε τις ρυθμιστικές επιδράσεις του NaHS στο Nrf2 και στο φλεγμονώδες NLRP3. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε επίσης το ρόλο του Nrf2 στη νεφρική βλάβη και λειτουργία μετά από θεραπεία με NaHS. η αναστολή του Nrf2 όχι μόνο ανέστρεψε εν μέρει την προστατευτική επίδραση του NaHS σενεφρική βλάβηκαι δυσλειτουργία, αλλά επίσης ανέστρεψε την ανασταλτική επίδραση του NaHS στη φλεγμονώδη απόκριση και την απόπτωση μετά από νεφρική Ι/Ρ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το Nrf2 μπορεί να απαιτείται για την προστατευτική επίδραση του NaHS στο AKI που προκαλείται από I/R και το NaHS μπορεί να ασκήσει τον προστατευτικό του ρόλο έναντι τραυματισμού ιστού μέσω της αναστολής φλεγμονώδους NLPR3 με τη μεσολάβηση Nrf2. Συμπερασματικά, η νεφρική βλάβη που προκλήθηκε από I/R ενεργοποίησε το μονοπάτι σηματοδότησης του φλεγμονώδους NLRP3 και του Nrf2 και η αναστολή του φλεγμονώδους NLRP3 προστατεύει από νεφρική βλάβη. Το Nrf2 ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 και ανακουφίζει από το NaHSνεφρική βλάβηκαι δυσλειτουργία, απόπτωση και φλεγμονώδη απόκριση μέσω αναστολής φλεγμονώδους NLRP3 με τη μεσολάβηση Nrf2. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν νέα εικόνα για έναν πιθανό μελλοντικό στόχο για τη θεραπεία της νεφρικής ισχαιμικής βλάβης.