Μεταβολισμός της φλαβονόλης καεμπφερόλης στα νεφρικά κύτταρα

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Ο μεταβολισμός της φλαβονόλης Kaempferol στα κύτταρα των νεφρών απελευθερώνει τον δακτύλιο Β για να εισέλθει στη βιοσύνθεση του συνένζυμου Q

Lucía Fernández-del-Río¹, et al

ΑφηρημένηΠερίληψη: Το συνένζυμο Q (CoQ) είναι βασικό συστατικό της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και σημαντικό αντιοξειδωτικό που υπάρχει σε όλες τις κυτταρικές μεμβράνες. Οι ανεπάρκειες του CoQ είναι συχνές στη γήρανση και σε ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία, και οι τρέχουσες θεραπείες περιορίζονται στη λήψη συμπληρωμάτων CoQ. Οι στρατηγικές που βασίζονται στη συμπλήρωση CoQ υποφέρουν από κακή πρόσληψη και διακίνηση αυτού του πολύ υδρόφοβου μορίου. Σε μια προηγούμενη μελέτη, η διαιτητική φλαβονόλη καεμπφερόλη αναφέρθηκε ότι χρησιμεύει ως πρόδρομος δακτυλίου CoQ και ότι αυξάνει την περιεκτικότητα σε CoQ στονεφρόκύτταρα, αλλά ούτε το τμήμα του μορίου που εισέρχεται στη βιοσύνθεση CoQ ούτε ο μηχανισμός περιγράφηκε. Σε αυτή τη μελέτη, η καμπφερόλη που επισημάνθηκε ειδικά στον δακτύλιο Β απομονώθηκε από τα φυτά Arabidopsis.Νεφρόκύτταραπου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυτή την ένωση ενσωμάτωσε τον Β-δακτύλιο της καμπφερόλης στο προσφάτως συντιθέμενο CoQ, υποδηλώνοντας ότι ο Β-δακτύλιος μεταβολίζεται μέσω ενός μηχανισμού που περιγράφεται στα φυτικά κύτταρα. Η καεμπφερόλη είναι ένα φυσικό φλαβονοειδές που υπάρχει στα φρούτα και τα λαχανικά και έχει αντιοξειδωτικές, αντικαρκινικές και αντιφλεγμονώδεις θεραπευτικές ιδιότητες. Η καλύτερη κατανόηση του ρόλου της καμπφερόλης ως πρόδρομου δακτυλίου CoQ καθιστά αυτήν τη βιοδραστική ένωση πιθανή υποψήφια για το σχεδιασμό παρεμβάσεων με στόχο την αύξηση της ενδογενούς βιοσύνθεσης CoQ και μπορεί να βελτιώσει τους φαινοτύπους με έλλειψη CoQ στη γήρανση και τις ασθένειες.

Λέξεις-κλειδιά φλαβονοειδή; φλαβονόλη; καεμπφερόλη; συνένζυμο Q;νεφρόκύτταρα? πρόδρομος

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

1. Εισαγωγή

Το συνένζυμο Q (CoQ ή ουβικινόνη) είναι ένα μικρό λιπόφιλο μόριο που βρίσκεται παντού στις κυτταρικές μεμβράνες. Δομικά, αποτελείται από έναν δακτύλιο βενζοκινόνης και μια πολυϊσοπρενοειδή ουρά που ποικίλλει σε μήκος μεταξύ των ειδών [1]. Στα θηλαστικά, υπάρχουν CoQ9 (ουρά εννέα ισοπρενίου) και CoQ10 (ουρά δέκα ισοπρενίου), με το CoQ9 να κυριαρχεί στα τρωκτικά και το CoQ10 στους ανθρώπους [1]. Η σύνθεση CoQ λαμβάνει χώρα μέσα στα μιτοχόνδρια μέσω πολλαπλών βημάτων που πραγματοποιούνται από, τουλάχιστον, 14 πρωτεΐνες γνωστές ως πρωτεΐνες COQ [1,2]. Το CoQ παίζει ρόλο σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες [3,4]. Ωστόσο, η κύρια λειτουργία του CoQ είναι να δέχεται ηλεκτρόνια και πρωτόνια από τα αναπνευστικά σύμπλοκα I και II και να τα δωρίζει στο σύμπλοκο III [1,4]. Αυτή η ικανότητα οξειδοαναγωγής επιτρέπει στο CoQ να κυκλώνει μεταξύ τριών διαφορετικών καταστάσεων: ουβικινόνη (οξειδωμένη), ημικινόνη (ημι-οξειδωμένη) και ουμπικινόλη (μειωμένη) [1,5]. Στη μορφή της ουμπικινόλης, το CoQH2 παίζει σημαντικό αντιοξειδωτικό ρόλο και παρέχει προστασία στο DNA, τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια από το οξειδωτικό στρες [6,7].

Η περιεκτικότητα σε CoQ μειώνεται με την ηλικία σε διάφορους ιστούς θηλαστικών, όπως αντανακλάται από έναν μειωμένο ρυθμό βιοσύνθεσης [8-10]. Η δυνατότητα αύξησης της περιεκτικότητας σε CoQ10 μέσω συμπληρωμάτων διατροφής έχει διερευνηθεί ευρέως τις τελευταίες δεκαετίες [6,9]. Αν και απαιτούνται περισσότερες ελεγχόμενες μελέτες για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας του CoQ10 ως αντιγηραντικού φαρμάκου στους ανθρώπους [11], είχε αναφερθεί προηγουμένως ότι τα επίπεδα του CoQ στο πλάσμα στους ηλικιωμένους συσχετίζονται με ενισχυμένη φυσική δραστηριότητα και χαμηλότερη οξειδωτική βλάβη των λιπιδίων. και ότι το συμπλήρωμα CoQ10 βελτιώνει τη ζωτικότητα, τη σωματική απόδοση και την ποιότητα ζωής σε ηλικιωμένα άτομα [9]. Η περίπτωση των ευεργετικών επιδράσεων του συμπληρώματος CoQ10 είναι ισχυρότερη για μια σειρά ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία, όπως καρδιαγγειακές παθήσεις, νευροπάθειες, φλεγμονές, μεταβολικό σύνδρομο, αρθρίτιδα, καρκινογένεση, διαβήτης, οστεοπόρωση και υπερχοληστερολαιμία [3,8,11]. Η συμπλήρωση CoQ10 έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τους φλεγμονώδεις δείκτες, οι οποίοι είναι συνήθως παρόντες σε υψηλά επίπεδα στις προαναφερθείσες ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία [12-14].

Ωστόσο, η μακριά αλυσίδα πολυισοπρενοειδούς καθιστά το CoQ10 εξαιρετικά λιπόφιλο και δύσκολο να απορροφηθεί. Τα συμπληρώματα διατροφής CoQ10 θέτουν αρκετές προκλήσεις, συμπεριλαμβανομένης της ειδικής απορρόφησης μέσω της γαστρεντερικής οδού [5], της κυτταρικής πρόσληψης από την πλασματική μεμβράνη, της μεταφοράς μέσω των ενδοκυτταρικών μεμβρανών και της αφομοίωσης από τα μιτοχόνδρια. Όλα αυτά τα βήματα διακίνησης καθιστούν τη διαδικασία εξωγενούς συμπλήρωσης CoQ10 πολύ αναποτελεσματική [3,9]. Από αυτή την άποψη, εναλλακτικά οχήματα για τη χορήγηση CoQ10 βρίσκονται υπό μελέτη (π.χ. κάψουλες με βάση το λάδι, νανοσωματίδια) [3,15,16], καθώς και νέες στρατηγικές που θα μπορούσαν να ενισχύσουν την ενδογενή σύνθεση του CoQ [2,3]. Προηγουμένως, περιγράψαμε την ικανότητα της καμπφερόλης, μιας φλαβονόλης που βρίσκεται σε φρούτα και λαχανικά, να αυξάνει την περιεκτικότητα σε CoQ δρώντας ως νέος πρόδρομος του CoQ σε ποντίκια και ανθρώπους.νεφρόκύτταρα[17]. Ωστόσο, η ακριβής μεταβολική οδός με την οποία η καμπφερόλη συμμετέχει στη βιοσύνθεση του CoQ δεν αναγνωρίστηκε. Προτάθηκαν δύο υποθέσεις: (1) Η καεμπφερόλη θα μπορούσε να είναι ένα άμεσο υπόστρωμα του COQ2 στη βιοσυνθετική οδό του CoQ και στη συνέχεια θα μεταβολιζόταν από τις διαφορετικές πρωτεΐνες COQ μέχρι να φτάσει στην τελική δομή του CoQ. ή εναλλακτικά, (2) η καμπφερόλη θα μπορούσε να μεταβολιστεί στο κύτταρο για να παράγει έναν πιθανό πρόδρομο δακτυλίου CoQ, ο οποίος στη συνέχεια θα ενσωματωθεί στη βιοσυνθετική οδό CoQ [17]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, ο Soubeyrand και οι συνεργάτες του [18] περιέγραψαν ότι, στα φυτά, οι βιοσυνθετικές οδοί των φλαβονοειδών και του CoQ συνδέονται όντως και ότι η καμπφερόλη μπορεί να χρησιμεύσει ως πρόδρομος για τη σύνθεση του CoQ. Απέδειξαν ότι ο Β-δακτύλιος της καμπφερόλης υποβάλλεται σε υπεροξειδωτική διάσπαση, για να δώσει 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ (4HB), έναν κοινό πρόδρομο του δακτυλίου βενζοκινόνης του CoQ [18].

Ο στόχος της παρούσας εργασίας είναι να περιγράψει περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της καμπφερόλης και του CoQ σε κύτταρα θηλαστικών. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι σενεφρόΤα κύτταρα, ο Β-δακτύλιος της καμπφερόλης είναι το μέρος του μορίου που εισέρχεται στη βιοσύνθεση του CoQ, υποδηλώνοντας ότι ο μηχανισμός που περιγράφεται για τα φυτά είναι πιθανό να διατηρηθεί στα σπονδυλωτά.

2. Αποτελέσματα

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω πώς η καμπφερόλη λειτουργεί ως πρόδρομος του CoQ σε κύτταρα θηλαστικών, αποφασίσαμε να ελέγξουμε εάν ο δακτύλιος Β της καμπφερόλης είναι το μέρος του μορίου που εισέρχεται στη βιοσυνθετική οδό CoQ, όπως αναφέρθηκε ότι συμβαίνει στα φυτά [18]. Οι προσπάθειές μας να συνθέσουμε χημικά την καμπφερόλη ειδικά με σήμανση 13C στον δακτύλιο Β (13C6-[Β-δακτύλιος]-καεμπφερόλη) ήταν ανεπιτυχείς. Ως εναλλακτική στρατηγική, επιλέξαμε να απομονώσουμε το 13C6-[B-ring]-kaempferol από καλλιέργειες του φυτού Arabidopsis thaliana. Μια τέτοια in vivo σύνθεση σημασμένης καμπφερόλης με δακτύλιο Β είναι δυνατή επειδή τα φυτά προέρχονται από τον δακτύλιο Β της καμπφερόλης αποκλειστικά από το φαινυλικό τμήμα της φαινυλαλανίνης [19]. Αντίθετα, ο δακτύλιος Α και ο δακτύλιος C προέρχονται από το malonyl-CoA [19]. Με τη χορήγηση 13C6-L-φαινυλαλανίνης (13C{6-Phe) σε φυτά Arabidopsis που έχουν αναπτυχθεί σε στείρες συνθήκες, μπορεί κανείς να λάβει καεμπφερόλη ειδικά επισημασμένη στον δακτύλιο Β [18]. Επιπλέον, για να ενισχυθεί η συσσώρευση της καμπφερόλης, η σίτιση με 13C6-Phe πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα νοκ-άουτ φλαβονοειδούς{{29}υδροξυλάσης Arabidopsis, το οποίο δεν μπορεί να μεταβολίσει περαιτέρω την καμπφερόλη σε ανθοκυανίνες [20]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η καμπφερόλη που λαμβάνεται με μια τέτοια μέθοδο αποτελείται από ένα μείγμα 13C6-[Β-δακτυλίου]-καεμπφερόλης καθώς και μη επισημασμένης καμπφερόλης, η οποία υπήρχε στους ιστούς των φυτών πριν από τη σίτιση με 13C{{36 }}Phe. Ο ειδικός εμπλουτισμός της 13C{{38}[Β-δακτυλίου]-καεμπφερόλης στο μείγμα που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματά μας ήταν περίπου το 10 τοις εκατό της συνολικής δεξαμενής καεμπφερόλης (δηλαδή, χωρίς ετικέτα συν επισημασμένη).

Χρησιμοποιώντας 13C6-[B-ring]-kaempferol που εκχυλίστηκε και καθαρίστηκε από Arabidopsis, θεραπεύσαμε ποντίκινεφρόεγγύς επιθηλιακά σωληνάρια (TKPTS) και μετρήθηκε de novo και συνολική περιεκτικότητα CoQ (Εικόνα 1). Μη επισημασμένη καμπφερόλη, καθολικά επισημασμένη με 13C καεμπφερόλη (13C-καεμπφερόλη) και σημασμένη με 13C 4HB(13C6-4HB) χρησιμοποιήθηκαν ως συμπληρωματικές θεραπείες (Εικόνα 1α). Κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με οχήματα αιθανόλης συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχος. Παρατηρήσαμε ότι όσον αφορά το συνολικό CoQ (CoQ συν 13C6-CoQ), τόσο το περιεχόμενο CoQ9 όσο και το CoQ10 αυξήθηκαν με θεραπεία με καμπφερόλη (ανεξάρτητα από την ετικέτα) και 4HB (Εικόνα 1β, γ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως γιανεφρόκύτταρα [17]. Το 13C6-CoQ ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 13C-καεμπφερόλη και 13C6-4HB, κάτι που συμφωνεί με τον ρόλο αυτών των ενώσεων ως πρόδρομων δακτυλίων CoQ [17,21]. Συγκεκριμένα, η θεραπεία με 13C6-[B-ring]-kaempferol οδήγησε επίσης στη σύνθεση του 13C6-CoQ (Εικόνα 1b,c), υποδεικνύοντας ότι ο Β-δακτύλιος της καμπφερόλης είναι το μέρος του μόριο που εισέρχεται στη βιοσύνθεση CoQ. Όπως αναμενόταν, η χαμηλότερη ειδική επισήμανση του δακτυλίου Β στο μείγμα 13C6-[Β-δακτύλιος]-καεμπφερόλης/καεμπφερόλης είχε ως αποτέλεσμα τη χαμηλότερη ποσότητα 13C6-CoQ (Εικόνα 1β, γ)

3. Συζήτηση

Η καεμπφερόλη είναι ένα φυσικό φλαβονοειδές τύπου φλαβονόλης που υπάρχει στο τσάι καθώς και σε πολλά λαχανικά και φρούτα όπως το μπρόκολο, τα σταφύλια, το λάχανο, τις ντομάτες και τα εσπεριδοειδή, μεταξύ άλλων [22,23]. Οι πιο γνωστές ιδιότητες της καμπφερόλης είναι οι αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις της τόσο στην οξεία όσο και στη χρόνια φλεγμονή και ο ρόλος της στην πρόληψη πολλαπλών τύπων καρκίνου [24-26]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει τη λειτουργία του ήπατος και της καρδιάς και προλαμβάνει μεταβολικές και νευροεκφυλιστικές ασθένειες [24,26]. Η Kaempferol πιστεύεται ότι επιτυγχάνει τα ευεργετικά της αποτελέσματα μέσω της ρύθμισης πολλών κυτταρικών οδών [24,26], αλλά η αντιοξειδωτική της λειτουργία μπορεί επίσης να είναι σημαντική. Η καεμπφερόλη μειώνει σημαντικά το οξειδωτικό στρες και την υπεροξείδωση των λιπιδίων και μπορεί να βελτιώσει την αντιοξειδωτική αμυντική δραστηριότητα [26]. Η ομάδα C{12}} υδροξυλίου έχει θεωρηθεί ιδιαίτερα σημαντική για αυτήν την αντιοξειδωτική δράση [27].

Το 2015, οι Xie ​​et al. [21] περιέγραψε ότι η διαιτητική ένωση ρεσβερατρόλη, η οποία έχει συνδεθεί με πολλαπλά οφέλη για την υγεία [28], μπορεί να χρησιμεύσει ως πρόδρομος δακτυλίου στη βιοσύνθεση του CoQ σε Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae και κύτταρα θηλαστικών. Σε μια μεταγενέστερη μελέτη, η καμπφερόλη περιγράφηκε επιπλέον ότι δρα ως πρόδρομος δακτυλίου CoQ και αυξάνει την περιεκτικότητα σε CoQ σε κύτταρα θηλαστικών [17]. Η αύξηση του CoQ που προκαλείται από την καμπφερόλη αποδείχθηκε ότι είναι ισχυρότερη από την επίδραση που ασκούν άλλες πολυφαινόλες, συμπεριλαμβανομένης της ρεσβερατρόλης. Στην πραγματικότητα, η κερκετίνη, η ναρινγενίνη, η λουτεολίνη και η πικεαταννόλη δεν έδειξαν καμία επίδραση [17]. Αυτές οι μελέτες συνέδεσαν τα φυσικά προϊόντα που υπάρχουν γενικά στη διατροφή με τη βιοσύνθεση CoQ, αν και ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την ενσωμάτωση δεν είχε προσδιοριστεί. Πρόσφατα, περιγράφηκε ότι η σύνθεση των φλαβονοειδών συνδέεται πράγματι με τη σύνθεση του CoQ στα φυτά [18]. Επιπλέον, οι συγγραφείς έδειξαν ότι στα φυτά, ο Β-δακτύλιος της καμπφερόλης διασπάται από άγνωστες ακόμη υπεροξειδάσες που παράγουν 4HB που εισέρχεται απευθείας στην οδό βιοσύνθεσης του CoQ[18].

Εδώ, επιβεβαιώσαμε ότι παρόμοια ένζυμα μπορεί να υπάρχουν σε θηλαστικά, κύτταρα που επιτρέπουν την εμφάνιση ενός συγκρίσιμου μηχανισμού. Αν και απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για να καθοριστεί εάν η διάσπαση της καμπφερόλης στα θηλαστικά παράγει 4HB, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι ο δακτύλιος Β της φλαβονόλης είναι το μέρος του μορίου που εισέρχεται στη βιοσυνθετική οδό CoQ (Εικόνα 2). Αυτά τα συγκεκριμένα ένζυμα πρέπει να μοιράζονται σε φυτά και κύτταρα θηλαστικών, αλλά φαίνεται να απουσιάζουν στο S. cerevisiae, τουλάχιστον στο γενετικό υπόβαθρο BY4741, αφού η ζύμη περιγράφηκε ότι ενσωματώνει πολύ οριακά την 13C-καεμπφερόλη [17]. Στα φυτά, η χημεία της αντίδρασης απαιτεί την ταυτόχρονη παρουσία ενός διπλού δεσμού μεταξύ C-2 και C-3 και μιας ομάδας υδροξυλίου στο C-3 [18], καθώς η διυδροκαεμπφερόλη (αρ. C2-Διπλός δεσμός C3) και ναρινγενίνη (χωρίς διπλός δεσμός C2-C3 ούτε C-3 -OH) απέτυχαν να είναι υποστρώματα της υπεροξειδωτικής διάσπασης. Η προηγούμενη ανεξάρτητη παρατήρηση ότι η απιγενίνη (χωρίς διπλό δεσμό C2-C3) και η ναρινγενίνη απέτυχαν να ενισχύσουν το περιεχόμενο του CoQ στονεφρόκύτταρα [17] υποστηρίζει την υπόθεση ότι τα φυτά και τα θηλαστικά μοιράζονται έναν παρόμοιο μηχανισμό.

Δεδομένης της περιορισμένης βιοδιαθεσιμότητας των συμπληρωμάτων CoQ10, η διέγερση της ενδογενούς σύνθεσης του CoQ έχει βρεθεί στο επίκεντρο πολλών μελετών [1,9]. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο η καμπφερόλη ενισχύει τη βιοσυνθετική οδό CoQ είναι εξαιρετικής σημασίας, καθώς η ικανότητά της να αυξάνει το ενδογενές περιεχόμενο CoQ έχει ισχυρή δυνατότητα να βελτιώσει τις ανεπάρκειες CoQ που σχετίζονται με τη γήρανση ή την ασθένεια. Επιπλέον, οι ασθενείς θα μπορούσαν να βρουν πρόσθετα οφέλη, καθώς η τακτική κατανάλωση φλαβονοειδών σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία, όπως περιγράφεται παραπάνω [24-26]. Αν και η βιοδιαθεσιμότητα της καμπφερόλης είναι αρκετά χαμηλή [29], η αύξηση του CoQ σενεφρόκύτταραπαρατηρήθηκε σε δόσεις που μπορούν να επιτευχθούν φυσιολογικά, με από του στόματος συμπληρώματα ή με κατανάλωση τροφών που περιέχουν φλαβονοειδή [27], και ακόμη και μια ελαφρά συμπληρωματική ποσότητα προδρόμων CoQ θα μπορούσε να μετακινήσει τη μεταβολική ροή υπέρ της σύνθεσης CoQ.

Απαιτείται πρόσθετη έρευνα για να χαρακτηριστεί η καεμπφερόλη ως αποτελεσματική ένωση για τη θεραπεία των ελλείψεων του CoQ. Περαιτέρω in vitro και in vivo μελέτες είναι απαραίτητες για την πλήρη κατανόηση της σχέσης μεταξύ της καμπφερόλης και του CoQ, για την εύρεση της καταλληλότερης σύνθεσης της βιοδραστικής ένωσης και για τον εντοπισμό του/των ενζύμου/ων που ευθύνονται για την υπεροξειδωτική διάσπαση.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Χημικά και Αντιδραστήρια

Η μη επισημασμένη καμπφερόλη ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). 13C6-4HB από την Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA, ΗΠΑ). και 13C-καεμπφερόλη από την Isolife (Wageningen, Ολλανδία). Τα πρότυπα CoQ9 και CoQ10 ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (San Luis, MO, ΗΠΑ). Το διπροποξυ-CoQ10 συντέθηκε ουσιαστικά όπως περιγράφεται από τον Edlund [30] για το διαιθοξυ-Q10, με τη διαφορά ότι η 1-προπανόλη αντικατέστησε την αιθανόλη ενώ διατηρήθηκαν τα άλλα αντιδραστήρια και οι συνθήκες. Η 13C6-[Β-δακτύλιος]-καεμπφερόλη παρασκευάστηκε από in vitro καλλιέργειες φλαβονοειδών{{18}υδροξυλάσης νοκ-άουτ φυτών Arabidopsis thaliana που τροφοδοτήθηκαν για 48 ώρες με δόσεις 250 μΜ 13C6-L-φαινυλαλανίνης ( Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA, ΗΠΑ) [18]. Τα φύλλα (~1,5 g) ομογενοποιήθηκαν με χρήση μύλου Pyrex σε 5 χ 900 μL μεθανόλης και τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στους 18,{30}}x g για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα (5 × ~ 800 μL) συνενώθηκαν και αναμίχθηκαν σε ίσο όγκο 2 Μ HCl και επωάστηκαν στους 70 ◦C για 40 λεπτά προκειμένου να υδρολυθούν τα συζεύγματα γλυκοζυλ-καεμπφερόλης. Δείγματα προϊόντος υδρόλυσης (200 μL) αναμίχθηκαν με ίσο όγκο 100 τοις εκατό μεθανόλης και φυγοκεντρήθηκαν στους 18,{40}}× g για 15 λεπτά. Δείγματα (100 μL το καθένα) χρωματογραφήθηκαν σε στήλη Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm, 3,5 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) που κρατήθηκε στους 30 ◦C χρησιμοποιώντας 25-min γραμμική κλίση εκκίνησης από 10 mM μυρμηκικό αμμώνιο ρΗ 3,5 έως 100 τοις εκατό μεθανόλη με ρυθμό ροής 0,8 mL/min. Η καεμπφερόλη (18,7 λεπτά) συλλέχθηκε παρακολουθώντας την απορρόφηση στα 365 nm, εξατμίστηκε μέχρι ξηρού με αέριο άζωτο και στη συνέχεια επαναιωρήθηκε σε 100 τοις εκατό μεθανόλη για ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας μοριακό συντελεστή απόσβεσης 21.242 M−1cm−1. Οι αναλύσεις MS/MS έδειξαν ότι το παρασκεύασμα αποτελείτο από ~10 τοις εκατό σημασμένη με 13C καεμπφερόλη (Μ συν 6) και ~90 τοις εκατό μη επισημασμένη καμπφερόλη.

4.2. Συνθήκες και θεραπείες κυτταρικής καλλιέργειας

Ποντίκινεφρόεγγύς επιθηλιακά σωληνάρια (TKPTS) [31], παρέχονται από την Dr. Elsa Bello-Reuss (Texas Tech University Health Science Center, Lubbock, TX, ΗΠΑ) και την Dr. Judit K. Magyesi (το Πανεπιστήμιο του Αρκάνσας για τις Ιατρικές Επιστήμες, Little Rock, AR, ΗΠΑ). Τα κύτταρα TKPTS αναπτύχθηκαν σε DMEM/F12 που περιείχε 4,5 g/L γλυκόζη και συμπληρώθηκαν με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη και γενταμικίνη-αμφοτερικίνη Β (125 μg/mL και 5 mg /mL, αντίστοιχα). Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ◦C σε υγρή ατμόσφαιρα με 5 τοις εκατό CO2. Για τους προσδιορισμούς του CoQ, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12-πλάκες φρεατίων με αρχική ποσότητα 60,{000 κύτταρα/φρεάτιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ καεμπφερόλης, 13C-καεμπφερόλης, 13C6-[Β -δακτύλιος]-καεμπφερόλη, ή 1 μΜ 4ΗΒ για 48 ώρες. Στην προηγούμενη δημοσίευση όπου περιγράψαμε την καμπφερόλη ως νέο πρόδρομο CoQ, έγιναν πειράματα με 10 μΜ 13C-καεμπφερόλης [17]. Ωστόσο, η περιορισμένη ποσότητα 13C{{31}[Β-δακτυλίου]-καεμπφερόλης που είναι διαθέσιμη μας οδήγησε στη μείωση της χρησιμοποιούμενης συγκέντρωσης, αν και οι συνθήκες εξακολουθούν να βρίσκονται στο εύρος όπου αναφέρθηκε ότι η καμπφερόλη αυξάνει την περιεκτικότητα σε CoQ [17]. Προστέθηκε αιθανόλη στον έλεγχο καθώς το όχημα διατηρήθηκε κάτω από το 0,05 τοις εκατό του τελικού όγκου. Τα κύτταρα επωάστηκαν υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας (37◦C, 5 τοις εκατό CO2). Μετά τον καθορισμένο χρόνο, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 1Χ αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS), αποσπάστηκαν από τις πλάκες καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τρυψίνη-EDTA (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας (περίπου 1000x σολ). Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και τα σφαιρίδια κυττάρων αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς μέχρι τη χρήση.

4.3. Εκχύλιση Λιπιδίων

Τα σφαιρίδια κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε 100 μL 1Χ PBS. Πριν από την εκχύλιση λιπιδίων, κλάσματα 10 μL αποθηκεύτηκαν για να ποσοτικοποιηθεί η συγκέντρωση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bradford [32]. Στη συνέχεια, το διπροποξυ-CoQ10 προστέθηκε στα υπόλοιπα 90 μL ως εσωτερικό πρότυπο. Για να ξεκινήσει η εκχύλιση, προστέθηκαν δύο mL μεθανόλης. Το κυτταρικό εναιώρημα στροβιλίστηκε και προστέθηκαν δύο mL πετρελαϊκού αιθέρα. Το ανώτερο στρώμα πετρελαϊκού αιθέρα (που περιέχει όλα τα μη σαπωνοποιήσιμα λιπίδια, συμπεριλαμβανομένου του CoQ) μεταφέρθηκε σε καθαρό σωλήνα. Άλλα δύο mL πετρελαϊκού αιθέρα προστέθηκαν στο αρχικό στρώμα μεθανόλης και τα δείγματα στροβιλίστηκαν ξανά. Το ανώτερο στρώμα αφαιρέθηκε, συνδυάστηκε με το προηγούμενο, και η συνδυασμένη οργανική φάση ξηράνθηκε κάτω από ένα ρεύμα αερίου αζώτου. Παρασκευάστηκε μια σειρά προτύπων CoQ9 και CoQ10 που περιείχαν ισοπροποξυ-CoQ10 και εκχυλίστηκαν λιπίδια ταυτόχρονα με τα κυτταρικά δείγματα για να κατασκευαστούν πρότυπες καμπύλες CoQ9 και CoQ10.

4.4. Ανάλυση CoQ

Το επισημασμένο και μη επισημασμένο περιεχόμενο CoQ9 και CoQ10 από εκχυλίσματα λιπιδίων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας HPLC-MS/MS όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα δείγματα επαναιωρήθηκαν σε 200 μL αιθανόλης που περιείχε 1 mg/mL βενζοκινόνης προκειμένου να οξειδωθούν όλα τα λιπίδια πριν από την ανάλυση. Χρησιμοποιήθηκε 4000 QTRAP γραμμικό φασματόμετρο MS/MS από την Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Το λογισμικό Applied Biosystem, Analyst έκδοση 1.4.2, χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση και την επεξεργασία δεδομένων. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη Luna 5 μm PFP(2) 100Α (100 × 4,6 mm, 5 μm· Phenomenex, Torrance, CA, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας μια κινητή φάση που αποτελείται από 90 τοις εκατό διαλύτη Α (95:5 μίγμα μεθανόλης: ισοπροπανόλη που περιέχει 2,5 mM μυρμηκικό αμμώνιο) και 10 τοις εκατό διαλύτη Β (ισοπροπανόλη που περιέχει 2,5 mM μυρμηκικό αμμώνιο) με σταθερό ρυθμό ροής 1 mL/min. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν σε πολλαπλούς τρόπους παρακολούθησης αντίδρασης. Οι μεταβάσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: m/z 795,6/197,08 (CoQ9 συν Η), m/z 812,6/197,08 (CoQ9 συν NH3), m/z 801,6/203,08 (13C-CoQ9 συν Η), m/z 818,6/203C. -CoQ9 συν NH3), m/z 863.6/197,08 (CoQ10 συν Η), m/z 880,6/197,08 (CoQ10 συν NH3), m/z 869.6/203,08 (13C -CoQ10 συν Η), m/z 886,6/203,08 (13C-CoQ10 συν NH3), m/z 919,7/253,1 (διπροποξυ-CoQ10 συν Η), m/z 936,7/253,1 (διπροποξυ-CoQ10 συν NH3). Η περιοχή κάθε κορυφής, κανονικοποιημένη με την αντίστοιχη τυπική καμπύλη και το εσωτερικό πρότυπο, αναφέρθηκε ως η αρχική ποσότητα πρωτεΐνης.

4.5. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα που εμφανίζονται σε αυτήν την εργασία αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές αναλύσεις και γραφικά με Graphpad Prism 8 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA). Οι διαφορές στο περιεχόμενο του CoQ σε σύγκριση με τον έλεγχο αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας παραμετρική μονόδρομη ANOVA, διορθώνοντας πολλαπλές συγκρίσεις με το μετα-τεστ του Dunnett. Οι σημαντικές διαφορές αναφέρθηκαν ως * p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001="" και="" ****="" p=""><>

5. Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας το δείχνουννεφρικά κύτταραμπορεί να διασπάσει τον δακτύλιο Β της διατροφικής φλαβονόλης καεμπφερόλης για να παράγει πιθανούς πρόδρομους δακτυλίους της βιοσύνθεσης CoQ, πιθανότατα 4HB. Αυτός ο μεταβολισμός της καμπφερόλης αυξάνει τη βιοσύνθεση του CoQ και αυξάνει την περιεκτικότητα σε CoQ. Αυτή η ικανότητα της καμπφερόλης θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί στο σχεδιασμό πιο αποτελεσματικών συμπληρωμάτων για την ανακούφιση των συμπτωμάτων των ελλείψεων CoQ στη γήρανση και τις ασθένειες. Θα απαιτηθούν πρόσθετες φυσιολογικές μελέτες για να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα του συμπληρώματος καμπφερόλης για την ενίσχυση της βιοσύνθεσης της ουβικινόνης σε ολόκληρο τον οργανισμό.

Συνεισφορές συγγραφέα:Conceptualization, LF-d.-R., ES, GJB και CFC; μεθοδολογία, LF-d.-R., ES, GJB και CFC; λογισμικό, LF-d.-R.; επικύρωση, LF-d.-R., ES, GJB και CFC. επίσημη ανάλυση, LF-d.-R.; έρευνα, LF-d.-R., and ES; πόρους, LF-d.-R., ES, GJB και CFC. επιμέλεια δεδομένων, LF-d.-R., ES, GJB και CFC. γραφή — προετοιμασία πρωτότυπου σχεδίου, LF-d.-R.; συγγραφή — κριτική και επεξεργασία, LF-d.-R., GJB και CFC. οπτικοποίηση, LF-d.-R., ES, GJB και CFC. εποπτεία, GJB και CFC. διαχείριση έργου, GJB και CFC. απόκτηση χρηματοδότησης, GJB και CFC Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση:Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το National Science Foundation Grant MCB-1330803 (CFC) και το MCB-1712608 (GJB).

Ευχαριστίες:Ευχαριστούμε τον Anish Nag για τη σύνθεση του διπροποξυ-CoQ10. Η Elsa Bello-Reuss (Texas Tech University Health Science Center, Lubbock, TX, USA) και η Judit K. Magyesi (το Πανεπιστήμιο του Αρκάνσας για τις Ιατρικές Επιστήμες, Little Rock, AR, ΗΠΑ) παρείχαν ευγενικά το ποντίκινεφρόεγγύς επιθηλιακά σωληνάρια (TKPTS). Ευχαριστούμε τον Jorge Torres που έκανε διαθέσιμες εγκαταστάσεις κυτταροκαλλιέργειας. Ευχαριστούμε το UCLA Molecular Instrumentation Core proteomics εγκατάσταση. Yu Chen, για τη χρήση του QTRAP4000 για ανάλυση λιπιδίων. και η Anna Block στο USDA-ARS-CMAVE για αναλύσεις MS/MS.

Συγκρούσεις συμφερόντων: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

---Journal Molecules (Βασιλεία, Ελβετία), 25(13) ISSN 1420-3049 Συγγραφείς: Fernández-Del-Río et al.
DOI 10.3390/μόρια25132955

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Wang, Y.; Hekimi, S. Η πολυπλοκότητα της παρασκευής ουβικινόνης. Τάσεις Endocrinol. Metab. 2019, 30, 923–943.[CrossRef] [PubMed]

2. Awad, AM; Bradley, MC; Fernandez-del-Rio, L.; Nag, Α.; Tsui, Η.; Clarke, CF Ανεπάρκεια συνενζύμου Q10: Μονοπάτια σε ζυμομύκητες και ανθρώπους. Δοκίμια Biochem. 2018, 62, 361–376. [CrossRef] [PubMed]

3. Gutierrez-Mariscal, FM; Yubero-Serrano, EM; Villalba, JM; Lopez-Miranda, J. Coenzyme Q10: From bench to clinic in aging disease, a translational review. Κριτ. Rev. Food Sci. Nutr. 2018, 59, 2240–2257. [CrossRef] [PubMed]

4. Bentinger, Μ.; Tekle, Μ.; Dallner, G. Coenzyme Q-biosynthesis, and functions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010, 396, 74–79. [CrossRef]

5. Stefely, JA; Pagliarini, DJ Biochemistry of mitochondrial coenzyme Q biosynthesis. Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 824–843. [CrossRef]

6. Diaz-Casado, ME; Quiles, JL; Barriocanal-Casado, E.; Gonzalez-Garcia, P.; Battino, Μ.; Lopez, LC; Varela-Lopez, A. Το παράδοξο του συνενζύμου Q10 στη γήρανση. Nutrients 2019, 11, 2221. [CrossRef]

7. Bentinger, Μ.; Brismar, Κ.; Dallner, G. Ο αντιοξειδωτικός ρόλος του συνενζύμου q. Mitochondrion 2007, 7, S41–S50.[CrossRef]

8. Barcelos, IP; Haas, RH CoQ10 και γήρανση. Βιολογία (Βασιλεία) 2019, 8, 28. [CrossRef]

9. Hernández-Camacho, JD; Bernier, Μ.; López-Lluch, G.; Navas, P. Συμπλήρωμα συνενζύμου Q10 στη γήρανση και τις ασθένειες. Εμπρός. Physiol. 2018, 9, 1–11. [CrossRef]

10. Kalén, Α.; Appelkvist, EL; Dallner, G. Αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία στις λιπιδικές συνθέσεις των ιστών αρουραίου και ανθρώπου. Lipids 1989, 24, 579-584. [CrossRef]

11. Varela-López, Α.; Giampieri, F.; Battino, Μ.; Quiles, J. Coenzyme Q και ο ρόλος του στη διαιτητική θεραπεία κατά της γήρανσης. Molecules 2016, 21, 373. [CrossRef] [PubMed]

12. Fan, L.; Feng, Υ.; Chen, GC; Qin, LQ; Fu, CL; Chen, LH Επιδράσεις της συμπλήρωσης συνενζύμου Q10 σε δείκτες φλεγμονής: Συστηματική ανασκόπηση και μετα-ανάλυση τυχαιοποιημένων ελεγχόμενων δοκιμών. Pharmacol. Res. 2017, 119, 128–136. [CrossRef] [PubMed]

13. Zhai, J.; Bo, Υ.; Lu, Υ.; Liu, C.; Zhang, L. Επιδράσεις του συνενζύμου Q10 σε δείκτες φλεγμονής: Συστηματική ανασκόπηση και μετα-ανάλυση. PLoS ONE 2017, 12, e0170172. [CrossRef] [PubMed]

14. Sharma, Α.; Fonarow, GC; Butler, J.; Ezekowitz, JA; Felker, GM Coenzyme Q10 και καρδιακή ανεπάρκεια: Μια ανασκόπηση αιχμής. κυκλ. Καρδιακή ανεπάρκεια. 2016, 9, e002639. [CrossRef]

15. Lee, JS; Suh, JW; Kim, ES; Lee, HG Παρασκευή και χαρακτηρισμός βλεννοπροσφυτικών νανοσωματιδίων για την ενίσχυση της κυτταρικής πρόσληψης του συνενζύμου Q10. J. Agric. Food Chem. 2017, 65, 8930–8937. [CrossRef]

16. Lopez-Lluch, G.; Del Pozo-Cruz, J.; Sanchez-Cuesta, A.; Cortes-Rodriguez, AB; Navas, P. Η βιοδιαθεσιμότητα των συμπληρωμάτων συνενζύμου Q10 εξαρτάται από τα λιπίδια-φορείς και τη διαλυτοποίηση. Nutrition 2018, 57, 133–140.[CrossRef]

17. Fernandez-Del-Rio, L.; Nag, Α.; Gutierrez Casado, Ε.; Ariza, J.; Awad, AM; Joseph, AI; Kwon, Ο.; Verdin, Ε.; de Cabo, R.; Schneider, C.; et al. Η καεμπφερόλη αυξάνει τα επίπεδα του συνενζύμου Q στα νεφρικά κύτταρα και χρησιμεύει ως πρόδρομος βιοσυνθετικός δακτύλιος. Free Radic. Biol. Med. 2017, 110, 176–187. [CrossRef]

18. Soubeyrand, Ε.; Johnson, TS; Latimer, S.; Block, Α.; Kim, J.; Colquhoun, TA; Butelli, Ε.; Martin, C.; Wilson, ΜΑ; Basset, G. Η υπεροξειδωτική διάσπαση της καμπφερόλης συμβάλλει στη βιοσύνθεση του βενζινοειδούς τμήματος της ουβικινόνης στα φυτά. Φυτό. Cell 2018, 30, 2910–2921. [CrossRef]

19. Kreuzaler, F.; Hahlbrock, K. Ενζυματική σύνθεση αρωματικών ενώσεων σε ανώτερα φυτά: Σχηματισμός ναριγγενίνης (5,7,4-τριυδροξυφλαβανόνης) από p-κουμαροϋλ συνένζυμο α και μαλονυλ συνένζυμο α. FEBS Lett. 1972, 28, 69–72. [CrossRef]

20. Schoenbohm, C.; Martens, S.; Eder, C.; Forkmann, G.; Weisshaar, Β. Ταυτοποίηση του γονιδίου 3'-υδροξυλάσης φλαβονοειδούς Arabidopsis thaliana και λειτουργική έκφραση του κωδικοποιημένου ενζύμου p450. Biol. Chem. 2000, 381, 749-753. [CrossRef]

21. Xie, LX; Williams, KJ; He, CH; Weng, Ε.; Khong, S.; Rose, TE; Kwon, Ο.; Bensinger, SJ; Marbois, BN; Clarke, CF Resveratrol και παρα-κουμαρικό άλας χρησιμεύουν ως πρόδρομοι δακτυλίου για τη βιοσύνθεση του συνενζύμου Q. J. Lipid Res. 2015, 56, 909–919. [CrossRef] [PubMed]

22. Calderon-Montano, JM; Burgos-Moron, Ε.; Perez-Guerrero, C.; Lopez-Lazaro, M. A review on the dietary flavonoid kaempferol. Mini Rev. Med. Chem. 2011, 11, 298–344. [CrossRef] [PubMed]

23. Devi, KP; Malar, DS; Nabavi, SF; Sureda, Α.; Xiao, J.; Nabavi, SM; Dahlia, M. Kaempferol και φλεγμονή: Από τη χημεία στην ιατρική. Pharmacol Res. 2015, 99, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

24. Ren, J.; Lu, Υ.; Qian, Υ.; Chen, Β.; Wu, Τ.; Ji, G. Πρόσφατη πρόοδος σχετικά με την καεμπφερόλη για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Exp. Εκεί. Med. 2019, 18, 2759–2776. [CrossRef] [PubMed]

25. Imran, Μ.; Salehi, Β.; Sharifi-Rad, J.; Aslam Gondal, T.; Saeed, F.; Imran, Α.; Shahbaz, Μ.; Tsouh Fokou, PV; Umair Arshad, Μ.; Khan, Η.; et al. Kaempferol: Βασική έμφαση στις αντικαρκινικές της δυνατότητες. Molecules 2019,24, 2277. [CrossRef]

26. Imran, Μ.; Rauf, Α.; Shah, ZA; Saeed, F.; Imran, Α.; Arshad, MU; Ahmad, Β.; Bawazeer, S.; Atif, Μ.; Peters, ΓΔ; et al. Χημειοπροληπτική και θεραπευτική επίδραση του διαιτητικού φλαβονοειδούς καεμπφερόλης: Μια ολοκληρωμένη ανασκόπηση. Phytother Res. 2019, 33, 263–275. [CrossRef]

27. Kozlowska, Α.; Szostak-Wegierek, D. Φλαβονοειδή–πηγές τροφίμων και οφέλη για την υγεία. Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 2014, 65, 79–85.

28. Kursvietiene, L.; Staneviciene, Ι.; Mongirdiene, Α.; Bernatoniene, J. Πολλαπλότητα των επιδράσεων και των οφελών για την υγεία της ρεσβερατρόλης. Medicine (Kaunas) 2016, 52, 148–155. [CrossRef]

29. Zabela, V.; Sampath, C.; Oufir, Μ.; Moradi-Afrapoli, F.; Butterweck, V.; Hamburger, M. Φαρμακοκινητική της διαιτητικής καμπφερόλης και του μεταβολίτη της 4-υδροξυφαινυλοοξικό οξύ σε αρουραίους. Fitoterapia 2016, 115, 189–197. [CrossRef]

30. Edlund, PO Προσδιορισμός συνενζύμου Q10, άλφα-τοκοφερόλης και χοληστερόλης σε βιολογικά δείγματα με υγρή χρωματογραφία συζευγμένης στήλης με κουλομετρική και υπεριώδη ανίχνευση. J. Chromatogr. Β Biomed. Sci. Appl. 1988, 425, 87–97. [CrossRef]

31. Ernest, S.; Bello-Reuss, Ε. Έκφραση και λειτουργία της p-γλυκοπρωτεΐνης σε μια κυτταρική σειρά νεφρού ποντικού. Είμαι. J. Physiol. 1995, 269, C323–C333. [CrossRef] [PubMed]

32. Stoscheck, CM Quantitation of protein. Μέθοδοι Enzymol. 1990, 182, 50–68. [CrossRef] [PubMed] Διαθεσιμότητα δείγματος: Μη διαθέσιμο.