Το μονοξείδιο του άνθρακα (CO) ανακουφίζει αποτελεσματικά τη διαβητική νεφροπάθεια (DN)
Mar 16, 2022
για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com
Μέρος Ⅰ: Το μονοξείδιο του άνθρακα ανακουφίζει τη γήρανση στη διαβητική νεφροπάθεια βελτιώνοντας την αυτοφαγία
Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & στο al.V
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Διαβητική νεφροπάθεια (DN) είναι μια από τις πιο συχνές και σοβαρές διαβητικές μικροαγγειακές επιπλοκές. Στατιστικά, 20 τοις εκατό -40 τοις εκατό των ασθενών με DN (Διαβητική νεφροπάθεια) θα εξελιχθεί σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου (ESRD) με ρυθμό 14 φορές ταχύτερο από άλλες νεφρικές παθήσεις. Επιπλέον, ο αυξημένος καρδιαγγειακός κίνδυνος DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ασθενείς συμβάλλει σε μεγάλο βαθμό στην υψηλή θνησιμότητα.2Η σύνθετη παθογένεια του DN (Διαβητική νεφροπάθεια)είναι ακόμη ασαφές με την περιορισμένη διαθέσιμη θεραπευτική προσέγγιση. Ως εκ τούτου, είναι επείγουσα η αναγνώριση της παθογένειας και των θεραπευτικών παραγόντων για την πρόληψη της προοδευτικής απώλειας της νεφρικής λειτουργίας του DN (Διαβητική νεφροπάθεια).
Τα γηρασμένα κύτταρα, που χαρακτηρίζονται από μόνιμη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, έχουν προσελκύσει εκτεταμένη προσοχή ως «κύτταρα ζόμπι». Λόγω της αντοχής στην απόπτωση και της συνεχιζόμενης παραγωγής εκκριτικού φαινοτύπου που σχετίζεται με τη γήρανση (SASP), τα γηρασμένα κύτταρα αναγνωρίζονται όλο και περισσότερο ως η κρίσιμη αιτία ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία. Η νεφρική δυσλειτουργία που συνδέεται με τη γήρανση έχει συχνά παρατηρηθεί σε DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ασθενείς και πειραματικά μοντέλα, όπως ποντίκια που προκαλούνται από STZ (διαβήτης τύπου 1 (T1D)) και db/db (διαβήτης τύπου 2 (T2D)). Είναι σημαντικό ότι η κάθαρση των p16-θετικών κυττάρων ηλικιωμένων ποντικών βελτίωσε τη σπειραματοσκλήρωση. Επιπλέον, ο αποκλεισμός του p21 ή του p27 σε ποντίκια T1D ανακούφισε από την πρωτεϊνουρία και τη σπειραματική διαστολή. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η γήρανση παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του DN (Διαβητική νεφροπάθεια). Ωστόσο, η ρύθμιση της γήρανσης στο ΔΝ (Διαβητική νεφροπάθεια)παραμένει ασαφής.
Τα αναδυόμενα στοιχεία έδειξαν ότι η αυτοφαγία, ένας μηχανισμός αποδόμησης του ενδοκυτταρικού περιεχομένου, είναι ένας έγκυρος ρυθμιστής γήρανσης." Η αυτοφαγία αναφέρθηκε ότι παρατείνει τη διάρκεια ζωής των ηλικιωμένων ποντικών και των ηλικιωμένων μυγών.10 Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η εξάλειψη του Atg7 επιδείνωσε τη γήρανση των βλαστοκυττάρων.νεφρόγήρανση.12.13 Έτσι, τα φάρμακα που στοχεύουν την αυτοφαγία για την ανακούφιση της γήρανσης μπορεί να είναι μία από τις πιο ελπιδοφόρες στρατηγικές για την DN (Διαβητική νεφροπάθεια)πρόληψη και θεραπεία.
Μονοξείδιο του άνθρακα (CO) που δημιουργείται μέσω του καταβολισμού της αίμης από τα ένζυμα της οξυγενάσης της αίμης είναι ένα ενδογενώς αέριο μόριο. Ένας αριθμός δημοσιεύσεων αποκάλυψε τις αντιφλεγμονώδεις, αντι-αποπτωτικές και άλλες προστατευτικές ιδιότητες του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα) όταν εφαρμόζεται σε χαμηλές δόσεις.14 Αν και το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)έχει μελετηθεί καλά για να προσφέρει επαναπροστασία στην ισχαιμία-επαναιμάτωση ήνεφρόποντίκια μεταμόσχευσης,15 η επίδραση και ο μηχανισμός του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)είναι ασαφείς. Πρόσφατα, η βιβλιογραφία έδειξε ότι το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)προσέδωσε κυτταροπροστατευτικούς ρόλους ως ενεργοποιητής αυτοφαγίας σε νησίδες που προκαλούνται από υποξία, 16 ποντίκια σήψης7 και ηλικιωμένους αρουραίους με καρδιακή ανακοπή.18 Επιπλέον, η χορήγηση CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ανακούφισε τη γήρανση των ενδοθηλιακών κυττάρων που προκαλείται από την τοξικότητα του φαρμάκου. (Μονοξείδιο του άνθρακα)για τη βελτίωση της γήρανσης.
Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η συσσώρευση γηρασμένων κυττάρων στονεφρότου DN (Διαβητική νεφροπάθεια)τα ποντίκια θα μπορούσαν να αντιστραφούν με CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)μέσω ενεργοποίησης αυτοφαγίας, βελτιώνοντας στη συνέχεια τη νεφρική δυσλειτουργία. Για να ελέγξουμε την υπόθεσή μας και να εξερευνήσουμε τους υποκείμενους μηχανισμούς, εφαρμόσαμε την επεξεργασία του μορίου που απελευθερώνει μονοξείδιο του άνθρακα-2 (CORM-2) in vivo (το πειραματικό DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια) και in vitro (μεσαγγειακά κύτταρα αρουραίου, ανθρώπινα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα και ανθρώπινο ποδοκύτταρο).
Λειτουργία των νεφρών: πώς επηρεάζει το μονοξείδιο του άνθρακα (CO).Διαβητική νεφροπάθεια (DN)
Κάντε κλικ στο Cistanches και προϊόντα Cistanche για νεφρική νόσο
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
2.1|Πειραματικό σχέδιο σε ζώα
Αρσενικά ποντίκια C57BL/6J οκτώ εβδομάδων (Charles River) κρατήθηκαν σε τυπικό κύκλο φωτός/σκότους (12:12 ώρες) με κανονική δίαιτα (ND) ή δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD) (60 τοις εκατό ενέργεια από λίπος ) για 16 εβδομάδες.20 Την εβδομάδα 17 της μελέτης, τα ποντίκια που τρέφονταν με HFD έλαβαν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις STZ (50 mg/kg) για 7 ημέρες, ενώ τα ποντίκια με ND ενέθηκαν με φορέα (ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών, pH=4 .5). Μία εβδομάδα μετά τις ενέσεις, τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα ενός τρυπήματος ουράς μετρήθηκαν δύο φορές σε διάστημα 24 ωρών. Στη συνέχεια, το DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια με επίπεδα γλυκόζης 16,9 mmol/L ή μεγαλύτερα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες τυχαία, με 15 ζώα σε κάθε ομάδα (DN (Διαβητική νεφροπάθεια), DN (Διαβητική νεφροπάθεια)συν CO και DN (Διαβητική νεφροπάθεια)συν iCO): μια ομάδα που ορίζεται ως έλεγχος DN και άλλες ομάδες που έλαβαν θεραπεία με ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις (δύο φορές την εβδομάδα για 16 εβδομάδες) CORM-2 (3 mg/kg) ή σε έγκυρο CORM-2 που ήταν παράγεται με την απελευθέρωση CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)από CORM-2 σε θερμοκρασία δωματίου. Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος με εκπυρήνωση των οφθαλμικών βολβών και οι νεφροί συλλέχθηκαν για ανάλυση. Όλα τα ζώα αντιμετωπίστηκαν σύμφωνα με τις Κατευθυντήριες Αρχές στη Φροντίδα και τη Χρήση των Εργαστηριακών Ζώων που δημοσιεύθηκαν από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ και όλες οι διαδικασίες για τα ζώα εγκρίθηκαν από το Συμβούλιο Ιατρικού Κολλεγίου Tongji για την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων.
2.2|Βιοχημική και ιστολογική ανάλυση πλάσματος
Το πλήρες αίμα και ο ορός που συλλέχθηκαν αποθηκεύτηκαν σε{0}} βαθμό για ανάλυση. Το άζωτο ουρίας αίματος (BUN) μετρήθηκε με εμπορικά διαθέσιμα κιτ δοκιμασίας (Jiancheng Bioengineering Institute, Κίνα). Αφού αφαιρέθηκαν τα νεφρά και η επιφάνεια πλύθηκε με φυσιολογικό ορό. Ο ιστός των νεφρών χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και χρώση τριχρωμίου Masson και τελικά παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο.
2.3|Ηλεκτρονική μικροσκοπία
Μικρά κομμάτια του νεφρικού φλοιού στερεώθηκαν σε γλουταραλδεΰδη (2,5 τοις εκατό) και ενσωματώθηκαν σε αραλδίτη. Ο ιστός πολυμερίστηκε και κόπηκε σε εξαιρετικά λεπτές τομές (80-100 nm) χρησιμοποιώντας έναν υπερμικρότομο (Leica EM UC7). Οι λεπτές φέτες στο πλέγμα χαλκού πλέγματος χρωματίστηκαν και παρατηρήθηκαν κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (Tecnai G220 TWIN).
2.4|Ελαστογραφία διατμητικού κύματος
Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν και στάλθηκαν στο εργαστήριο υπερήχων (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Κίνα) για ελαστογραφία διατμητικού κύματος χρησιμοποιώντας ένα σύντομο πεδίο (Supersonic Imagine). Ο μέσος συντελεστής Young (Eman) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της ακαμψίας του νεφρικού παρεγχύματος.
2,5|Χρώση SA- -γαλλ
Παγωμένοςνεφρότμήματα και κύτταρα που σπάρθηκαν σε 6-πλάκα φρεατίου χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της δραστηριότητας SA- - από ένα εμπορικό κιτ (Beyotime Biotechnology) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μπλε κηλίδα θεωρήθηκε ως η περιοχή συσσώρευσης των γηρασμένων κυττάρων.
2.6|Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο για έκφραση mRNA
Σύμφωνα με τις οδηγίες (TaKaRa BIO INC), το RNA νεφρικού ιστού εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRlzol. Η έκφραση του mRNA ποσοτικοποιήθηκε με κιτ gRT-PCR με βάση το πράσινο TB και ειδικούς εκκινητές (Πίνακας 1). Κάθε έκφραση γονιδίου αξιολογήθηκε με τη δική του τυπική καμπύλη και το επίπεδο mRNA του Gapdh ποσοτικοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος.
2.7|Western blotting και ανοσοκαθίζηση
Ο νεφρικός ιστός ή κύτταρο ομογενοποιήθηκε και λύθηκε, στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε με κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (Beyotime Biotechnology). Η πρωτεΐνη διαχωρίστηκε και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στις μεμβράνες PVDF (Millipore). Αφού μπλοκαρίστηκαν, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτογενή αντισώματα (Πίνακας 2). Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα αντίστοιχο δευτερεύον αντίσωμα. Η πυκνότητα κάθε ζώνης στόχου ποσοτικοποιήθηκε από το λογισμικό Image Pro-Plus 6.0 και κανονικοποιήθηκε σε GAPDH ως οπτική πυκνότητα. Όλα τα μεγέθη δειγμάτων ζώων ή κυττάρων ήταν μεγαλύτερα ή ίσα με 3.
Το προϊόν λύσης νεφρικού ιστού φυγοκεντρήθηκε (14 000 g στους 4 βαθμούς C για 30 λεπτά) και το υπερκείμενο υγρό προκαθαρίστηκε με 20 μL σφαιρίδια πρωτεΐνης A/G αγαρόζης για 2 ώρες και επωάστηκε όλη τη νύχτα με Bcl{{{6} } ή αντίσωμα lgG ποντικού. Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν, βράστηκαν και αναλύθηκαν με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας anti-Beclin-1 (Τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης) και αντι-Bcl-2 (Proteintech) όπως περιγράφηκε προηγουμένως .21
ΠΙΝΑΚΑΣ 1 Ποσοτικές αλληλουχίες εκκινητών PCR σε πραγματικό χρόνο
2,8|Ανοσοφθορισμός
Ο νεφρικός ιστός που ήταν ενσωματωμένος στα μέσα OCT κόπηκε σε παγωμένα τμήματα πάχους6-8 μm. Μετά τον αποκλεισμό με 10 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας, οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτογενή αντισώματα. Την επόμενη ημέρα, ο ιστός επισημάνθηκε με δευτερεύοντα αντισώματα. Αφού ξεπλύθηκαν με PBS, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με DAPI και στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus).
2,9|Κυτταρικής καλλιέργειας
Το HBZY-1 διατηρήθηκε σε DMEM (Gibco) και το HK-2 διατηρήθηκε σε DMEM/F12 (Gibco) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 U mL-1 πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (Gibco ) στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα που περιέχει 95 τοις εκατό αέρα και 5 τοις εκατό CO (Μονοξείδιο του άνθρακα). Το HPC που παρέχεται από τον καθηγητή Chun Zhang από το Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας Huazhong διατηρήθηκε στο RPMI 1640 (Gibco). Το HPC αρχικά πολλαπλασιάστηκε στους 33 βαθμούς και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στους 37 βαθμούς για διαφοροποίηση προτού μπορέσει να χρησιμοποιηθεί σε πειράματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως.22
2.10|Δοκιμασία ELIS
Αφού το HPC υποβλήθηκε σε διαφορετική επεξεργασία και καλλιεργήθηκε για 5 ημέρες, το μισό από το υπερκείμενο αφαιρέθηκε για ανίχνευση (απελευθερωμένος VEGF). Τα κύτταρα διασπάστηκαν χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό θραυστήρα κυττάρων (SONICS), επιτρέποντας στις πρωτεΐνες να απελευθερωθούν πλήρως στο υπόλοιπο υπερκείμενο (ολικό VEGF). Στη συνέχεια, οι συγκεντρώσεις VEGF μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ ELISA (MEIMIAN). Η αναλογία του απελευθερωμένου VEGF προς το συνολικό VEGF ήταν ο ρυθμός διαρροής VEGF.
2.11|Γονιδιακή σίγαση
Η καταστροφή του Atg7 σε κύτταρα HK-2 επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μια αντίστροφη διαδικασία επιμόλυνσης siRNA που πραγματοποιήθηκε σε πλάκες έξι φρεατίων. Αφού αναπτύχθηκαν σε 70 τοις εκατό συρροή, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ή αναμεταλλώθηκαν siRNA (RiboBio) χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης επαληθεύτηκε με στύπωμα Western για την επικύρωση της αλληλουχίας (ACTCGAGTCTTTCAAGACT).
ΠΙΝΑΚΑΣ 2 Όλες οι λίστες αντισωμάτων
2.12|Παρακολουθήστε την αυτοφαγική ροή
Τα πλασμίδια που περιέχουν φακοϊικό φορέα RFP-GFP-LC3(Genecopoeia) κατασκευάστηκαν και στη συνέχεια συσκευάστηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (GeneCopoeia). Το υπερκείμενο του ιού συλλέχθηκε για να μολύνει κύτταρα HK-2 και HBZY-1 για την παρακολούθηση της ροής της αυτοφαγίας. Αυτός ο ανιχνευτής μπορούσε να διακρίνει τα αυτοφαγοσώματα (GFP*/RFPt, κίτρινα σημεία) και τα αυτολυσοσώματα (GFP-/RFPt, κόκκινα σημεία).
2.13|Ανάλυση δεδομένων
Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism8 και εμφανίστηκαν ως ο μέσος όρος ± SEM. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων προσδιορίστηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης. Η σημασία ορίστηκε ως Π<>
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
3.1|CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)εξασθενημένη νεφρική δυσλειτουργία του DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια
Για να εξερευνήσετε την επαναπροστασία του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα), ένα DN (Διαβητική νεφροπάθεια)Το μοντέλο προκλήθηκε από HFD και STZ (Εικόνα 1Α). Μετά από 34 εβδομάδες πειραματικής σίτισης, η γλυκόζη αίματος, το βάρος, ηνεφρό-μετρήθηκε η αναλογία σώματος, η κρεατινίνη και το BUN. Στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ομάδα,νεφρό-Η αναλογία σώματος, η κρεατινίνη και το BUN αυξήθηκαν, ενώ η θεραπεία του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)αντίστροφες ανωμαλίες (Πίνακας 3). Με συνέπεια, η νεφρική μορφολογία του DN (Διαβητική νεφροπάθεια)Τα ποντίκια ήταν εξαιρετικά διαταραγμένα με απολέπιση των επιθηλιακών κυττάρων, εκφυλισμό κενοτοπίων, μεγέθυνση του σπειραματικού χώρου Bowman και μεσαγγειακή επέκταση (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, η υπερδομή του σπειράματος εμφάνισε πάχυνση της βασικής μεμβράνης και εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού του ποδοκυττάρου (Εικόνα 1Β). Αντίθετα, η CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)Η θεραπεία κανονικοποιήθηκε πάνω από τις αρνητικές μορφολογικές αλλαγές (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, το ινιδικό κολλαγόνο που εναποτέθηκε στον νεφρικό φλοιό (Εικόνα 1C) και η νεφρική σκληρότητα, που μετρήθηκε με ελαστογραφία διατμητικού κύματος, ήταν και τα δύο αυξημένα στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια (Εικόνα 1Δ). Όπως ήταν αναμενόμενο, η CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)βελτιώθηκε σημαντικά η νεφρική δυσλειτουργία του DN (Διαβητική νεφροπάθεια)συμπεριλαμβανομένης της ίνωσης.
ΣΧΗΜΑ 1 CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)εξασθενημένη νεφρική δυσλειτουργία του DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια που προκλήθηκαν από HFD και STZ.
Σχήμα πειραματικού σχεδιασμού. Β, Αντιπροσωπευτικές εικόνες τουνεφρόιστός χρωματισμένος με H&E (ράβδος κλίμακας: 50 μm), PAS (ράβδος κλίμακας: 10 μm) και υπερδομικές αλλαγές στη σπειραματική μορφολογία που αξιολογήθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (ράβδος κλίμακας: 1 μm).
Και τα στατιστικά δεδομένα του λόγου του PAS-θετικού προς τη σπειραματική περιοχή, το πάχος GBM, το πλάτος της διαδικασίας του ποδιού και τον αριθμό των διεργασιών του ποδιού ανά mm GBM (n=3).
Γ, Αντιπροσωπευτικές εικόνες του νεφρικού ιστού χρωματισμένου με τρίχρωμο Masson και τα στατιστικά δεδομένα θετικής περιοχής (n=3). Μπάρα κλίμακας: 25 μm.
D, η ελαστογραφία διατμητικού κύματος ανιχνεύθηκε με ηχογράφημα και ποσοτικοποίηση του συντελεστή του Young ως βαθμός νεφρικής ίνωσης (n=7). *P < .05,="" **p=""><.01, ***p=""><>
ΠΙΝΑΚΑΣ 3 Μεταβολικά δεδομένα ποντικών σε όλες τις ομάδες
3.2|CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ανακουφισμένη γήρανση στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια και νεφρικά κύτταρα που προκαλούνται από υψηλή γλυκόζη
Η γήρανση θεωρείται όλο και περισσότερο η κύρια αιτία της νεφρικής ίνωσης, χαρακτηριστικό γνώρισμα της γήρανσης.23 Για να διερευνηθεί η αντιγηραντική επίδραση του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα), πραγματοποιήσαμε χρώση SA- -γαλλίου στο νεφρό. Τα αυξημένα κύτταρα SA- -gal* και p16* συσσωρεύτηκαν σε όλο τον νεφρικό φλοιό στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ομάδα, ενώ ελέγχου και CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)-οι νεφροί της θεραπείας έδειξαν περιστασιακή θετικότητα (Εικόνα 2Α, Β). Από την ανατομική θέση του νεφρού, η θετική έκφραση του p16 ανιχνεύθηκε στα μεσαγγειακά κύτταρα (κίτρινο βέλος), στα νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (κόκκινο βέλος) και στα ποδοκύτταρα (μαύρο βέλος). Γήρανση που συνέβη στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια υποστηρίχθηκαν περαιτέρω από την προφανή ανοδική ρύθμιση των κλασικών πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη γήρανση, συμπεριλαμβανομένων των p53, p21 και p16 (Εικόνα 2C). Αντίθετα, η χορήγηση CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)μετρίασε την παραπάνω γερασμένη απόδοση.
Ο εκκριτικός φαινότυπος που σχετίζεται με τη γήρανση, το χαρακτηριστικό έκκριμα των γηρασμένων κυττάρων, αναφέρθηκε ότι διαταράσσει το μικροπεριβάλλον και διευκολύνει την εξέλιξη της νόσου.2 Ως εκ τούτου, μετρήθηκαν τα επίπεδα mRNA ορισμένων αντιπροσωπευτικών SASP, συμπεριλαμβανομένων των I-1 , Il-6 , Tgf-, Tnf-a, Vegf, Icam-1 και Vcam-1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μη φυσιολογικές αυξήσεις αυτού του SASP αποφεύχθηκαν από το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)παρέμβαση (Εικόνα 2Δ).
Δεδομένης της κατασταλτικής γήρανσης του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)in vivo, διερευνούμε περαιτέρω την αντιγηραντική του δράση in vitro μοντέλο 3 τύπων νεφρικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των μεσαγγειακών κυττάρων αρουραίου (HBZY-1), των ανθρώπινων σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων (HK-2) και των ανθρώπινων ποδοκυττάρων (HPC). Μετά από έκθεση σε υψηλή γλυκόζη (HG, 35 mmol/L), 3 τύποι κυττάρων εμφάνισαν την αύξηση του SA- -gal με μεγαλύτερη μορφολογία την ημέρα 7 (Εικόνα 2Ε), ημέρα 5 και ημέρα 14 (Εικόνα 2l) , αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, η αύξηση του ρυθμού διαρροής LDH του HBZY-1 έδειξε ότι η γήρανση και η βλάβη των κυττάρων προκαλείται από HG (Εικόνα 2ΣΤ). Προκειμένου να διερευνηθεί η κατάλληλη δόση CO (Μονοξείδιο του άνθρακα), HBZY-1 αντιμετωπίστηκε με διαφορετικές συγκεντρώσεις CORM-2. Με τη μέτρηση του ρυθμού διαρροής των LDH (Εικόνα 2F), των θετικών σε EdU κυττάρων (Εικόνα 2G) και του SA{5}}gal (Εικόνα 2Η), διαπιστώσαμε ότι η συγκέντρωση 1 μmol/L είχε καλύτερο αποτέλεσμα παρέμβασης. Με συνέπεια, η CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)(1μmol/L) μείωσε επίσης τη θετική έκφραση του SA- -gal στο HK-2 και το HPC (Εικόνα 2). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα αποκάλυψαν ότι το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)έπαιξε έναν αξιοσημείωτο αντιγηραντικό ρόλο τόσο in vivo όσο και in vitro.
ΣΧΗΜΑ 2 CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ανακουφισμένη γήρανση στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια και νεφρικά κύτταρα που προκαλούνται από HG.
Α, Αντιπροσωπευτική εικόνα τουνεφρόιστός χρωματισμένος με SA- -gal και τα στατιστικά δεδομένα θετικής περιοχής (n=3). Το σπείραμα υποδεικνύεται με τον κόκκινο διακεκομμένο κύκλο. Μπάρα κλίμακας: 25 μm.
Β, Η θετική έκφραση του p16 στονεφρόπαρουσιάστηκε με ανοσοϊστοχημεία (n=3). Τα κίτρινα βέλη υποδεικνύουν μεσαγγειακά κύτταρα, τα κόκκινα υποδεικνύουν νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα και τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν ποδοκύτταρα. Μπάρα κλίμακας: 25 μm.
C, Τα πρωτεϊνικά επίπεδα των δεικτών γήρανσης προσδιορίστηκαν με ανοσοκηλίδες και πυκνομετρική ανάλυση των p53, p21 και p16 (n=3).
D, Διπλώστε τις αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του SASP mRNA (Il-1 , Il-6, Tgf-, Tnf-, Vegf, Icam-1 και Vcam-1) (n Μεγαλύτερο ή ίσο με 4).
Το E, HBZY{{0}} που εκτέθηκε σε NG (5 mmol/L) ή HG (35 mmol/L) χρωματίστηκε με SA- -gal από την ημέρα 0 έως την ημέρα 7 και στατιστικά δεδομένα SA - -θετικά σε gal κύτταρα στις 5 και 7 ημέρες (n=3). Μπάρα κλίμακας: 50 μm.
F, Ο ρυθμός απελευθέρωσης LDH του HBZY{{0}} που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CORM-2 (0,1, 1, 10 και 100 μmol/L) (n=6).
Ζ, Η αναλογία του θετικού σε EdU HBZY-1 που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CORM-2 (n=3).
H, χρώση SA- -gal σε HBZY-1 που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CORM-2 (n=3). Μπάρα κλίμακας: 50 μm.
I, Αντιπροσωπευτικές εικόνες SA- -gal του HPC (ημέρα 5) και HK-2 (ημέρα 14) με τη χορήγηση CORM-2 (1μmol/L) και στατιστικά δεδομένα (n { {6}}). Μπάρα κλίμακας: 50 μm. *P < .05,="" **p=""><.01, ***p=""><>
3.3|CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ενεργοποιημένη αυτοφαγία και βελτιωμένη ροή αυτοφαγίας in vivo και in vitro
Ένας αυξανόμενος όγκος ερευνών αποκάλυψε την αρνητική ρύθμιση της αυτοφαγίας στη γήρανση και το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)έχει θεωρηθεί ως ενεργοποιητής αυτοφαγίας. Για να εξερευνήσετε τα αποτελέσματα της αυτοφαγίας COon στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)μετρήθηκε μια σειρά πρωτεϊνών που σχετίζονται με την αυτοφαγία. Σε σύγκριση με τα διαβητικά ποντίκια, το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)Η θεραπεία αύξησε σημαντικά την έκφραση της πρωτεΐνης έναρξης αυτοφαγίας Beclin-1 (Εικόνα 3Α) και μείωσε το υπόστρωμα αυτοφαγίας p62 (Εικόνα 3Β), αλλά μείωσε την αναλογία LC3Il προς LC3l, τον δείκτη του αυτοφαγοσώματος (Εικόνα 3C). Προηγούμενα στοιχεία υποδεικνύουν ότι αυτή η αντίφαση μπορεί να οφείλεται σε παρεμπόδιση της ροής αυτοφαγίας που προκαλείται από τη δυσλειτουργία του λυσοσώματος.25 Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με το λυσόσωμα Καθεψίνη Β και LAMP2 ήταν αυξημένες στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)συν COgroup σε σύγκριση με το DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ομάδα (Εικόνα 3D). Επιπλέον, η ανάλυση συνεντοπισμού των LC3 puncta και LAMP2 υποστήριξε ότι το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)μείωσε σημαντικά τη συσσώρευση αυτοφαγοσωμάτων και αύξησε τον αριθμό των αυτολυσοσωμάτων (Εικόνα 3Ε).
Με συνέπεια, η δυσλειτουργία της αυτοφαγίας και του λυσοσώματος βρέθηκε in vitro, όπως φαίνεται από τα επίπεδα πρωτεΐνης και τους λυσοσωμικούς ανιχνευτές (Εικόνα 3F, G). Περαιτέρω, το HK-2 και το HBZY-1 επιμολύνθηκαν με φακοϊό RFP-GFP-LC3 για παρακολούθηση της ροής αυτοφαγίας. Υπό την προϋπόθεση της HG, τα σημεία των αυτοφαγοσωμάτων αυξήθηκαν και τα αυτολυσοσώματα μειώθηκαν στο HBZY{-1 και το HK-2, το οποίο δεν άλλαξε περαιτέρω με τη θεραπεία με χλωροκίνη (CQ). CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)αύξησε τον αριθμό των αυτολυσοσωμάτων και μείωσε τα αυτοφαγοσώματα, το οποίο ανεστάλη με την προσθήκη CQ (Εικόνα 3Η, Ι). Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ενεργοποιημένη αυτοφαγία και βελτιωμένη ροή αυτοφαγίας in vivo και in vitro.
3.4|CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ανακούφισε τη γήρανση μέσω της βελτίωσης της αυτοφαγίας in vitro
Για περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της αυτοφαγίας στον μηχανισμό κατά της γήρανσης του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα), ένας συνδυασμός CORM-2 και αναστολέων αυτοφαγίας χρησιμοποιήθηκε σε νεφρικά κύτταρα που εκτέθηκαν σε HG. Δύο τύποι αναστολέων, η wortmannin (WORT) για τον αποκλεισμό της έναρξης της αυτοφαγίας και η CQ για την εκ νέου καταπόνηση της ροής της αυτοφαγίας, ανέστρεψαν αποτελεσματικά τη μείωση της SA- -gal από CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)σε 3 τύπους νεφρικών κυττάρων (Εικόνα 4Α). Με συνέπεια, η CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)αύξησε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων EdU, το οποίο ανεστάλη από δύο αναστολείς στο HBZY-1(Εικόνα 4Β) και το HK-2(Εικόνα 4C). Στο HBZY-1, το αποτέλεσμα ανακούφισης της γήρανσης της CO (Μονοξείδιο του άνθρακα), που φαίνεται από τη μειωμένη έκφραση των ρ53, ρ21 και ρ16, απουσίαζε μετά την προσθήκη αναστολέων αυτοφαγίας (Εικόνα 4Δ). Ομοίως, η ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι οι αναστολείς αυτοφαγίας εμπόδισαν τις μειώσεις των p{4}} και p{5}}θετικών κυττάρων από το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)σε HK-2 (Εικόνα 4印) και HPC (Εικόνα 4F). Επιπλέον, η σιωπή του Atg7 (Εικόνα 4G) εμπόδισε τις προστατευτικές επιδράσεις του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα), φαίνεται από αυξημένα κύτταρα SA- -galt και μειωμένα κύτταρα EdU* στο HK-2(Εικόνα 4Η). Τα προαναφερθέντα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)κατέστειλε τη γήρανση βελτιώνοντας την αυτοφαγία.
3,5|Η ενεργοποιημένη αυτοφαγία μπορεί να υποβαθμίσει το SASP στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ποντίκια
Εξερευνήσαμε περαιτέρω τη συγκεκριμένη σχέση μεταξύ αυτοφαγίας και γήρανσης. Η έρευνα έδειξε ότι η αυτοφαγία ανακούφισε τη γήρανση με την επιλεκτική υποβάθμιση του GATA4, το οποίο ρύθμισε θετικά το NF-KB για να απελευθερώσει SASP.26Σύμφωνα με αυτό, μια μεγάλη ποσότητα SASP αναπτύχθηκε στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ομάδα (Εικόνα 2Δ), και η έκφραση και η πυρηνική μετατόπιση του ρ65 αυξήθηκαν (Εικόνα 5Α). Ωστόσο, το επίπεδο πρωτεΐνης του GATA4 παρέμεινε αμετάβλητο, υποδηλώνοντας ότι το GATA4 μπορεί να μην μεσολαβεί στη δημιουργία του SASP σε κατάσταση υψηλής γλυκόζης (Εικόνα 5Β). Επιπλέον, μελέτες αποκάλυψαν ότι το διαμέρισμα χωρικής σύζευξης TOR-αυτοφαγίας (TASCC) που σχηματίστηκε από το συνδυασμό mTOR, όψιμου αυτοφαγοσώματος και λυσοσώματος επιτάχυνε τη γήρανση αυξάνοντας την έκκριση του SASP.27 Ωστόσο, τα αποτελέσματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι δεν υπήρχε τριπλός εντοπισμός mTOR,LC3 , και LAMP2, υποδεικνύοντας τον αποτυχημένο σχηματισμό TASCC στους νεφρούς (Εικόνα 5Γ).
Όπως γνωρίζουμε, η αυτοφαγία λειτουργεί στην αποικοδόμηση των συστατικών του κυτοσολίου, η οποία πραγματοποιείται κυρίως από το αυτολυσόσωμα που σχηματίζεται από τη σύντηξη αυτοφαγοσώματος και λυσοσώματος. Η αυτοφαγία έχει αναφερθεί ότι μειώνει την έκκριση της IL-1 με την αποικοδόμηση της pro-IL-1 σε μακροφάγα που διεγείρονται από LPS.28 Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι η IL-1 (πράσινη) ταυτίστηκε με LC3 puncta (κόκκινο) και LAMP2 (ροζ) στο CON και το DN (Διαβητική νεφροπάθεια)συν CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ομάδες (Εικόνα 5D, το κόκκινο βέλος), που υποδεικνύει τη διασταύρωση μεταξύ SASP και υποβάθμισης της αυτοφαγίας. Ομοίως, σε σύγκριση με το DN (Διαβητική νεφροπάθεια)ομάδα, άλλες κυτοκίνες του SASP συμπεριλαμβανομένων των IL-6, TGF- και VEGF είχαν επίσης μέτρια αλλά εμφανή συνεντοπισμό με LC3 puncta και LAMP2 στο CON και DN συν CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ομάδες (Εικόνα 5E-G, το κόκκινο βέλος), μεταξύ των οποίων ο VEGF συνεντοπίστηκε με αυτολυσοσώματα προφανώς (Εικόνα 5G). Ωστόσο, η επικαλυπτόμενη κίτρινη χρώση στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια)Η ομάδα έδειξε ότι το SASP εντοπιζόταν μόνο με LC3 puncta (Εικόνα 5D-G, το λευκό βέλος). Επιπλέον, το επίπεδο πρωτεΐνης του VEGF μετρήθηκε σε HPC μετά την προσθήκη αγωνιστών αυτοφαγίας (ABT737 και ραπαμυκίνη) ή CORM-2. Αν και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο συνολικό επίπεδο πρωτεΐνης του VEGF (Εικόνα 5Η), η παρουσία και των αγωνιστών αυτοφαγίας και του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)μείωσε σημαντικά την απελευθέρωση του VEGF σε HPC που προκαλείται από HG (Εικόνα 5I, J). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάποιο SASP αποικοδομείται μέσω αυτοφαγίας.
ΣΧΗΜΑ 4 CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ανακούφισε τη γήρανση μέσω της βελτίωσης της αυτοφαγίας in vitro. Τα HBZY-1, HPC και HK-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με HG, CORM{-2 και αναστολείς αυτοφαγίας (WORT: 200nM και CQ: 5 μmol/L).
A, Η χρώση και τα θετικά κύτταρα SA- -gal σε 3 είδη νεφρικών κυττάρων (n=3). Μπάρα κλίμακας: 25 μm.
B, C, κυτταρικός πολλαπλασιασμός που αξιολογήθηκε με χρώση EdU σε HBZY-1 και HK-2 και ποσοτικοποίηση της αναλογίας θετικών κυττάρων (n=3). Μπάρα κλίμακας: 50 μm.
D, Έκφραση πρωτεΐνης που σχετίζεται με τη γήρανση (p53, p16 και p21) σε HBZY-1 (n=5).
E, F, Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοφθορισμού των p53 και p16 και ποσοτικοποίηση της αναλογίας θετικών κυττάρων σε HK-2 και HPC (n=3). Μπάρα κλίμακας: 50 μm.
G, Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του Atg7 στο HK-2 αποσιωπήθηκαν με siRNA (τρεις αλληλουχίες).
H, Αντιπροσωπευτικές εικόνες SA- -gal (Γραμμή κλίμακας: 50 μm) και χρώση EdU (Γραμμή κλίμακας: 25 μm) και ποσοτικοποίηση της αναλογίας θετικών κυττάρων στο HK-2 (n {{4 }}). *P < .05,="" **p=""><.01, ***p=""><>
3.6|CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ενεργοποίησε την αυτοφαγία εν μέρει με διάσπαση του συμπλέγματος Beclin-1-Bcl-2
Η διάσταση του συμπλέγματος Beclin-1-Bcl-2 έχει αναφερθεί ότι βελτιώνει την αυτοφαγία καθώς και αποτρέπει την πρόωρη γήρανση, συμπεριλαμβανομένων των νεφρικών αλλαγών που σχετίζονται με την ηλικία.21 Επιπλέον, το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)ενεργοποιημένη αυτοφαγία μέσω Beclin-1 στα ποντίκια σήψης.1/Επομένως, διερευνήσαμε εάν η διάσταση του συμπλέγματος μεσολάβησε στην ενεργοποίηση της αυτοφαγίας από το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα). Τα αποτελέσματα της ταυτόχρονης ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι το CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)μειωμένη σύνδεση Beclin-1-Bcl-2 στο DN (Διαβητική νεφροπάθεια) ποντίκια (Εικόνα 6Α). Επιπλέον, σε σύγκριση με τη θεραπεία των HG και CO (Μονοξείδιο του άνθρακα), η συνδυασμένη χρήση HG, CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)και ο παράγοντας διάστασης συμπλόκου Beclin-1-Bcl{-2 ABT737 ενεργοποίησε περαιτέρω την αυτοφαγία του HBZY-1, όπως αποδεικνύεται από το αμετάβλητο LAMP2, τη μειωμένη p62 και την αυξημένη αναλογία LC3ll/LC3l (Εικόνα 6Β). Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνδυασμένη χρήση CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)και το ABT737 μείωσαν περαιτέρω την έκφραση των p53,p21 και p16 στο HBZY-1 (Εικόνα 6C) και μείωσαν το SA- -galt cell στο HBZY-1, HK{{9} } και HPC (Εικόνα 6D), υποδεικνύοντας ότι το ABT737 ενίσχυσε την αντιγηραντική δράση του CO (Μονοξείδιο του άνθρακα). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η CO (Μονοξείδιο του άνθρακα)θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την αυτοφαγία με διάσπαση του συμπλέγματος Beclin-1-Bcl-2 για την ανακούφιση της γήρανσης.
