ΜΕΡΟΣ Ⅰ:Η λοίμωξη SARS-CoV-2 επηρεάζει ιστούς, συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς και των νεφρών
Mar 18, 2022
για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com
ΜΕΡΟΣ Ⅰ: Η λοίμωξη SARS-CoV-2 στο μοντέλο του συριακού χάμστερ προκαλεί φλεγμονή καθώς και απορρύθμιση της ιντερφερόνης τύπου Ι τόσο σε αναπνευστικούς όσο και σε μη αναπνευστικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς και των νεφρών
Magen Ellen Francis, Una Goncin & et al.
Εισαγωγή
SARS-CoV-2(σοβαρή οξείααναπνευστικόςκορωνοϊός 2) που προκαλεί τον COVID-19 (coronavirus 2019) εμφανίστηκε στα τέλη του 2019 με επακόλουθες τεράστιες επιπτώσεις στη δημόσια υγεία και τις οικονομικές επιπτώσεις[1,2].SARS-CoV-2είναι ένας θετικής αίσθησης, μονόκλωνος ιός RNA της οικογένειας Coronoviridae, του γένους Betacoronavirus[3], και από την εμφάνισή του έχει οδηγήσει σε περισσότερα από 170 εκατομμύρια επιβεβαιωμένα κρούσματα και 3,5 εκατομμύρια θανάτους παγκοσμίως από την 1η Ιουνίου 2021 [4]. Αν και προηγουμένως πιστευόταν ότι οι λοιμώξεις από κορωνοϊό στους ανθρώπους προκαλούν μόνο ήπια συμπτώματα που μοιάζουν με κρυολόγημα, οι πιο πρόσφατοι κοροναϊοί που εμφανίστηκαν, SARS-CoV (σοβαρή οξείααναπνευστικόςcoronavirus) και MERS-CoV (Μέση Ανατολήαναπνευστικόςσύνδρομο κορωνοϊού), σχετίζονται με ένα ευρύ φάσμααναπνευστικόςκαι μη αναπνευστικά συμπτώματα[5,6], που κυμαίνονται από ήπια έως σοβαρά, που οδηγούν σε ανεπάρκεια οργάνων και θάνατο [Z. Έχουν επίσης αναφερθεί ασυμπτωματικά περιστατικά[8]. Δεδομένης της επιβάρυνσης για τη δημόσια υγεία, καθώς και του εύρους της σοβαρότητας της νόσου, η ανάπτυξη ζωικών μοντέλων για τη μελέτηSARS-CoV-2η παθογένεση και ο εντοπισμός αντίμετρων είναι μεγάλης σημασίας. Η in vivo αξιολόγηση της απόκρισης του ξενιστή στην ιογενή λοίμωξη είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό παραγόντων ξενιστή που ρυθμίζουν τη σοβαρή νόσο καθώς και βιοδεικτών που μπορεί να βοηθήσουν στην ενημέρωση των μέτρων υποστηρικτικής φροντίδας του ασθενούς.
Αξιολόγηση της ανταπόκρισης του οικοδεσπότη σεSARS-CoV-2έχει οδηγήσει σε πολύτιμες γνώσεις σχετικά με την εξέλιξη της νόσου και τους πιθανούς ανοσολογικούς μηχανισμούς που οδηγούν σε σοβαρή ασθένεια. Έχει πλέον ευρέως αποδειχθεί ότι οι σοβαρές περιπτώσεις COVID-19 στους ανθρώπους συνοδεύονται συχνά από αυξημένη έκφραση φλεγμονωδών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων της ιντερλευκίνης-6(IL-6), της ιντερλευκίνης-1 βήτα (IL-1βήτα) και Παράγοντας Νέκρωσης Όγκων (TNF) [9-11]. Πριν απόSARS-CoV-2, ήταν γνωστό ότι οι κοροναϊοί ήταν ικανοί να ρυθμίζουν την απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι[12,13]. Αρκετές μελέτες έχουν βρει ότι οι αποκρίσεις ιντερφερόνης τύπου Ι αμβλύνονται σημαντικά κατά τη διάρκειαSARS-CoV-2λοίμωξη που υποδηλώνει ότι αυτό μπορεί επίσης να συμβάλει σε κακά αποτελέσματα για τον COVID-19[14,15]. Αυτά τα κλινικά δεδομένα υποδηλώνουν πιθανούς δείκτες παθογένεσης για περαιτέρω πειραματικές έρευνες.
Τα συριακά χάμστερ ήταν ένα από τα λίγα είδη ζώων που εντοπίστηκαν νωρίς κατά τη διάρκεια της πανδημίας ότι μολύνθηκαν παραγωγικά μεSARS-CoV-2και πιθανής χρήσης για προκλινική ανάπτυξη και in vivo ανάλυση[l6]. Τα χάμστερ αρχικά είχαν προσδιοριστεί ότι είναι ευαίσθητα στον SARS-CoV [17] και από τότε έχει αποδειχθεί ότι αποτελούν πρότυπο γιαSARS-CoV-2[18]. Τα χάμστερ είναι σε θέση να υποστηρίξουνSARS-CoV-2αναπαραγωγή εντός του κατώτερουαναπνευστικόςοδού[18-20] με ορισμένες ομοιότητες με τη δυναμική της μόλυνσης και της νόσου με αυτή των ανθρώπων, αν και η χρονική πορεία της μόλυνσης φαίνεται να είναι μικρότερη στα χάμστερ[21]. Τα κουνάβια δεν έχουν αποδειχθεί ότι υποστηρίζουν μόλυνση στον πνεύμονα, καθώς ο ιός έχει ανιχνευθεί μόνο στο άνω μέροςαναπνευστικόςπου προτείνει αυτό το μοντέλο μπορεί να είναι χρήσιμο για μελέτες μετάδοσης[22]. Επιπλέον, τα ποντίκια δεν έχει αποδειχθεί ότι είναι ευαίσθητα στο αρχικό WuhanSARS-CoV-2ιός. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι τα χάμστερ αναπτύσσουν αποτελεσματική απόκριση αντισωμάτων και έχουν χρησιμοποιηθεί τόσο για το εμβόλιο-19 όσο και για μελέτες θεραπείας[19,20,23]. Όπως και με άλλα μη παραδοσιακά ζωικά μοντέλα, υπάρχει έλλειψη βιολογικών αντιδραστηρίων ειδικά για το χάμστερ για τον χαρακτηρισμό των ανοσολογικών αποκρίσεων και των μηχανισμών παθογένεσης[24].
Εδώ, διερευνήσαμε την ανοσολογική απόκριση και την παθογένεια τουSARS-CoV-2μόλυνση σε χάμστερ για τον προσδιορισμό των μηχανισμών της νόσου και της συμμετοχής συγκεκριμένων οργάνων όπως οι πνεύμονες,καρδιά, καινεφρόδεδομένου ότι ο COVID-19 είναι μια πολυσυστηματική ασθένεια.SARS-CoV-2Τα εμβολιασμένα συριακά χάμστερ λήφθηκαν δείγματα κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 15-ημέρας για ιολογική και ανοσολογική ανάλυση με qRT-PCR, ανάλυση μεταγραφομετρίας, προσδιορισμούς τιτλοδότησης ιού και ανοσοϊστοχημεία (IHC). οαναπνευστικόςΗ οδός είχε υψηλό φορτίο αντιγραφής του ιού τόσο στην άνω όσο και στην κάτω περιοχή με ειδική αμβλύτητα της απόκρισης ιντερφερόνης τύπου Ι. Ενώ βρήκαμε ελάχιστα στοιχεία μολυσματικού ιού έξω από τοαναπνευστικόςοδού, το ιικό RNA ήταν παρόν σε πολλά όργανα συμπεριλαμβανομένου τουνεφρά, καρδιά, λεμφαδένα και ήπαρ με ταυτόχρονη έκφραση φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως IL-6, TNF και IL-1βήτα. Ο πνεύμονας, καθώς και τα εξωπνευμονικά όργανα, παρουσίασαν σημάδια διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων που οδηγούσαν σε βλάβη των ιστών. Συνολικά, ορίσαμε το μοντέλο ανοσοπαθογένεσης χάμστερ στο πλαίσιο του COVID-19 το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό συσχετίσεων προστασίας και ασθένειας, για την αξιολόγηση ιατρικών αντεπιμέτρων.
Κάντε κλικ στο cistanche αποτελέσματα για νεφρική νόσο
Αποτελέσματα
SARS-CoV-2-τα εμβολιασμένα χάμστερ έχουν απώλεια βάρους που συσχετίζεται με ιικό φορτίο, μολυσματικό ιό στοαναπνευστικόςοδού και ιικού RNA σε μη αναπνευστικούς ιστούς
Τα συριακά χάμστερ είναι επιρρεπή σε μόλυνση μεSARS-CoV-2υποδηλώνοντας ότι μπορεί να είναι πολύτιμες για τη διερεύνηση της ανοσοπαθολογίας και των μηχανισμών της νόσου[20]. Τα χάμστερ ηλικίας 6-8 εβδομάδων εμβολιάστηκαν ενδορινικάSARS-CoV-2 at 10° TCIDs0. The animals were monitored for temperature and weight throughout the course of the infection. As typical during viral infection in small animals, hamsters began showing a decrease in temperature by day 1 post-inoculation(pi)(S1A Fig)which returned to baseline between day 3 and 7 (S1B Fig). Inoculated hamsters began losing weight on day 2 pi, with weights being significantly different from baseline on days 3 to 7. Weight loss was most severe on day 6 pi where the average body weight of the inoculated animals was 88.26% of the original weight (Fig 1A). After day 6, there was a steady increase in weight over the remaining time course on average recovering to baseline by day 12. Individual animals showed two different trajectories of weight loss: mild (~4%weight loss) and severe(>15 τοις εκατό απώλεια βάρους) (Εικ1Β). Κανένα ζώο δεν έχασε περισσότερο από το 20 τοις εκατό του αρχικού του βάρους και πέτυχε επίσης άλλα κριτήρια για το μη βάναυσο τελικό σημείο, όπως ορίζεται στις μεθόδους κατά τη διάρκεια της μελέτης. Τα ζώα αφαιρέθηκαν από τη μελέτη σε προκαθορισμένες τελικές ημέρες για τη συλλογή δειγμάτων, επομένως δεν εμφανίζονται μεμονωμένα βάρη για όλα τα ζώα.
Ο COVID-19 επηρεάζει πολλά συστήματα οργάνων στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένων τωνκαρδιά, νεφρά, ήπαρ, σπλήνα και παχύ έντερο[25,26]. Ως εκ τούτου, μας ενδιέφερε να προσδιορίσουμε τον τροπισμό του ιού και τη σχετική ανοσοπαθολογία σε όλο το σώμα των μολυσμένων χάμστερ για να αποκτήσουμε εικόνα για την ασθένεια. Τα ζώα απομακρύνθηκαν από τη μελέτη τις ημέρες 0, 2,5,8,12 και 15pi για να αξιολογηθούν οι ειδικές για τον ιστό αποκρίσεις για νεκροψία και ανάλυση της ανοσοπαθολογίας. Αίμα, ρινικές πλύσεις και ιστοί (αναπνευστικόςκαι μη αναπνευστικά) συλλέχθηκαν. Ο ιικός τροπισμός αξιολογήθηκε με qRT-PCR για τοSARS-CoV-2γονίδιο φακέλου (Ε) και τιτλοδότηση ιού με μολυσματικές δοκιμές 50(TCIDs0) ιστοκαλλιέργειας (Σχήμα 2). Η ανάλυση έκφρασης του γονιδίου Ε αντιπροσωπεύεται από καφέ κύκλους στα γραφήματα. Ανάλυση τωναναπνευστικόςη οδός αποκάλυψε vRNA που υπήρχε στους ρινικούς κόγχους, την τραχεία και τους τέσσερις πνευμονικούς λοβούς που εξετάστηκαν (δεξιός κρανιακός, δεξιός μέσος, δεξιός ουραίος και βοηθητικός) τις ημέρες 2, 5 και 8 pi. Το ιικό RNA εξακολουθούσε να ανιχνεύεται στον δεξιό μεσαίο πνευμονικό λοβό και στον βοηθητικό πνευμονικό λοβό ενός ζώου την ημέρα 12 pi. Η ανάλυση του ζωντανού τίτλου του ιού, που αντιπροσωπεύεται από τους γκρίζους κύκλους, έδειξε ότι υπήρχε μολυσματικός ιός στους ρινικούς κόγχους τις ημέρες 2 (7,5 TCIDs0/mL(Logl0)) και 5 (6 TCIDs{{ 11}}/mL(Logl0))pi. Ο μολυσματικός ιός κορυφώθηκε στους πνεύμονες την ημέρα 2, σε~9 TCIDs/mL(Log10)στο δεξιό μέσο πνεύμονα και ήταν παρών μέχρι την ημέρα 5. Η τραχεία είχε τα χαμηλότερα επίπεδα ιού από όλα τααναπνευστικόςιστός που υπήρχε μόνο την ημέρα 2 (~3 TCIDso/mL(Logl0)). vRNA ανιχνεύθηκε επίσης σε μη αναπνευστικούς ιστούς συμπεριλαμβανομένωνκαρδιά, νεφρό, το παχύ έντερο και ο μεσοθωρακικός λεμφαδένας σε χαμηλά έως μέτρια επίπεδα. Ο μεσοθωρακικός λεμφαδένας είχε το υψηλότερο επίπεδο vRNA,~5 TCIDs (Log10) και ήταν ο μόνος μη αναπνευστικός ιστός που ήταν θετικός για μολυσματικό ιό.
Εικ. 1. Η ενδορινική μόλυνση από SARS-CoV-2 σε χάμστερ οδηγεί σε σημαντική απώλεια βάρους.Τα συριακά χάμστερ εμβολιάστηκαν ενδορρινικά με το σοβαρό οξύαναπνευστικόςσύνδρομο κορωνοϊός 2 (SARS-CoV-2) στο 105 TCID50. Το βάρος (Α και Β) καταγράφηκε για 15 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Τα μέσα αποτελέσματα (Α) δείχνουν τη μέση τιμή. Τα μεμονωμένα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν κάθε ζώο (Β). υποδεικνύει μια τιμή p<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" standard="" error="">
Για να προσδιορίσουμε εάν η ανάλυση του ιού οφειλόταν στην πρόκληση αντισωμάτων εξουδετέρωσης, στη συνέχεια ποσοτικοποιήσαμε τους τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων σε μολυσμένα χάμστερ καθ' όλη τη διάρκεια του χρόνου (Eig 3A). Το πλάσμα απομονώθηκε από αίμα που συλλέχθηκε στη νεκροψία για να χρησιμοποιηθεί για προσδιορισμούς εξουδετέρωσης σε 100 TCIDs ανά αντίδρασηSARS-CoV-2. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν ήδη από την ημέρα 8 pi, σε τίτλο τελικού σημείου περίπου 63 (γεωμετρικός μέσος όρος). Αυτό αυξήθηκε σε γεωμετρικό μέσο όρο 160 την ημέρα 12 και κορυφώθηκε την ημέρα 15 με γεωμετρικό μέσο όρο 587. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι τα χάμστερ είναι σε θέση να προκαλέσουν υψηλούς τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων μετάSARS-CoV-2μόλυνση. Συλλέχθηκαν ρινικές πλύσεις καθ' όλη τη διάρκεια της μελέτης για να προσδιοριστεί η αποβολή του ιού από το πάνω μέροςαναπνευστικόςtract.vRNA ανιχνεύθηκε στις ρινικές πλύσεις έως και 12 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με ζωντανό ιό που παρατηρήθηκε τις ημέρες 2 και 5, με κορύφωση την ημέρα 2 σε λίγο περισσότερο από 6 TCID5o/mL (Log10). Συγκρίναμε τον τίτλο ζωντανού ιού που βρέθηκε στις ρινικές πλύσεις όλων των ζώων την ημέρα 5 με την αντίστοιχη απώλεια βάρους τους εκείνη την ημέρα (Εικ. 3Β). Μια συσχέτιση Pearson για κανονικά κατανεμημένα δεδομένα χρησιμοποιήθηκε για αυτήν την ανάλυση για να προσδιοριστεί εάν υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ του βάρους των μολυσμένων ζώων και του τίτλου του ιού στις ρινικές πλύσεις την ημέρα 5 μετά τον εμβολιασμό με την ημέρα 5 να είναι μια ημέρα κατά την οποία ορισμένα ζώα αρχίζουν να καθαρίζουν το ιός. Βρήκαμε μια συσχέτιση Pear-son ίση με-0.68, έτσι ώστε καθώς αυξανόταν ο τίτλος του ιού στις ρινικές πλύσεις, τα ζώα είχαν αυξημένη πιθανότητα πιο σοβαρής απώλειας βάρους (p-value =0.00242). Επιπλέον, αξιολογήσαμε τη σχέση μεταξύ του τίτλου του ιού του πνεύμονα και της απώλειας βάρους την ημέρα 5 pi. Δεδομένου ότι μόνο 3 ζώα συλλέγονταν κάθε μέρα, τα σύνολα δεδομένων για την αξιολόγηση μιας συσχέτισης περιορίζονται από το μέγεθος του δείγματός μας. Αν και αυτός ο αριθμός των συνόλων δεδομένων δεν πληροί τον επιθυμητό αριθμό μετρήσεων, πραγματοποιήσαμε συσχέτιση Pearson και βρήκαμε αρνητική, αν και μη σημαντική, συσχέτιση μεταξύ του τίτλου του ιού του πνεύμονα και της απώλειας βάρους την 5η ημέρα μετά τον εμβολιασμό. Με βάση τον τίτλο του ιού από τους αντίστοιχους πνευμονικούς λοβούς που αξιολογήθηκαν σε σύγκριση με το βάρος του ζώου, ο δεξιός κρανιακός πνεύμονας είχε τιμή R -0.91(p-value=0.27), ο δεξιός μέσος πνεύμονας είχε τιμή R -0.92(p-value=0.25)και ο δεξιός ουραίος πνεύμονας είχε τιμή R -0.58 (p-value{{39 }}.61)(S2 Σχ.). Θα πρέπει να γίνει πρόσθετη αξιολόγηση σε περισσότερα ζώα προκειμένου να αποκτηθεί εμπιστοσύνη στη σχέση μεταξύSARS-CoV-2πνευμονικός ιικός τίτλος και απώλεια βάρους ολόκληρου του ζώου.
Εικ. 2. Ο ζωντανός ιός SARS-CoV-2 περιορίζεται στους αναπνευστικούς ιστούς και στους μεσοθωρακικούς λεμφαδένες ενώ το ιικό RNA υπάρχει σε εξωπνευμονικά όργανα.Τα ζώα αφαιρέθηκαν από τη μελέτη την ημέρα 0 πριν από τη μόλυνση καθώς και τις ημέρες 2, 5 8, 12 και 15 μετά τον εμβολιασμό.αναπνευστικόςΟι ιστοί που συλλέχθηκαν περιελάμβαναν τη ρινική κόγχη, την τραχεία και τον πνεύμονα (δεξιός κρανιακός λοβός, δεξιός μεσαίος λοβός, δεξιός ουραίος λοβός, βοηθητικός λοβός). Τα εξωπνευμονικά όργανα που αναλύθηκαν περιελάμβαναν τον μεσοθωρακικό λεμφαδένα,καρδιά, νεφρό, ήπαρ σπλήνα και παχύ έντερο. Όλοι οι ιστοί συλλέχθηκαν για να ποσοτικοποιηθεί ο ιός με ανίχνευση qPCR τουSARS-CoV-2Γονίδιο E σε ισοδύναμα TCID50/mL με βάση μια τυπική καμπύλη ιικού RNA με χρήση RNA που εκχυλίστηκε από ένα απόθεμαSARS-CoV-2με γνωστή συγκέντρωση (TCID50/mL) (Καφέ). Ο μολυσματικός ιός ποσοτικοποιήθηκε με Δοκιμασία Μολυσματικής Δόσης Καλλιέργειας Ιστού και εκφράστηκε σε TCID50/mL (Γκρι). Το TCID50/mL υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Reed and Muench. Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει το όριο ανίχνευσης στη δοκιμασία ζωντανού ιικού φορτίου, με βάση τη χαμηλότερη αραίωση του δείγματος. Το όριο ανίχνευσης για την ανίχνευση qPCR του γονιδίου Ε ήταν 101 TCID50/mL. Τα σημεία δεδομένων αντιπροσωπεύουν μεμονωμένα ζώα και η γραμμή αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο.
Η πνευμονία και η παθολογία των πνευμόνων είναι συχνά το καθοριστικό χαρακτηριστικό τηςαναπνευστικόςιογενής λοίμωξη, με αποτέλεσμα σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα. Για να προσδιοριστεί η έκταση της βλάβης στους πνεύμονες σεSARS-CoV-2μολυσμένα χάμστερ και την ικανότητα των χάμστερ να ανακεφαλαιώνουν τα σοβαράαναπνευστικόςσυμμετοχή σε ανθρώπους με ασθενείς με COVID-19, εξετάσαμε την παθογένεια της νόσου στον αριστερό πνεύμονα των χάμστερ καθ' όλη τη διάρκεια της μόλυνσης (Εικ. 4). Η μικροσκοπική ανάλυση της χρώσης Η&Ε έδειξε αύξηση της βλάβης στον πνεύμονα κατά τη διάρκεια της λοίμωξης, με την πιο σοβαρή παθολογία να σημειώνεται την ημέρα 8 pi η οποία υποχώρησε εν μέρει την ημέρα 15 (Eig 4A). Τα μη μολυσμένα χάμστερ είχαν καθαρό κυψελιδικό χώρο χωρίς ενδείξεις διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων ή αιμορραγίας. Την ημέρα 2 pi, διήθηση μονοπύρηνων κυττάρων ήταν παρούσα στους κυψελιδικούς και περιβρογχικούς χώρους (κίτρινο βέλος). Η κυτταρική διήθηση συνεχίστηκε την ημέρα 5 με αυξημένη διήθηση. Την 8η ημέρα, ο περιβρογχικός χώρος χαρακτηρίστηκε από την παρουσία φλεγμονωδών μονοπύρηνων κυττάρων. Παρατηρήθηκε απομάκρυνση των επιθηλιακών κυττάρων στα βρογχιόλια (μαύρο βέλος) και μπορούσε να παρατηρηθεί αιμορραγία σε όλο τον ιστό (κόκκινο βέλος). Η αιμορραγία επιλύθηκε την ημέρα 12, αν και η υπερπλασία ήταν εμφανής (πράσινο βέλος). Την ημέρα 15 παρατηρήθηκε σχηματισμός υαλικής μεμβράνης (μπλε βέλος) με ταυτόχρονη μείωση της διήθησης των φλεγμονωδών κυττάρων.
Εικ. 3. Η ιική αποβολή του SARS-CoV-2 αυξάνεται με τη σοβαρότητα των κλινικών αποτελεσμάτων, αλλά μειώνεται καθώς τα εξουδετερωτικά αντισώματα είναι ανιχνεύσιμα στο ζωικό πλάσμα.Συλλέχθηκαν ρινικές πλύσεις για να ποσοτικοποιηθεί ο ιός με ανίχνευση qPCR τουSARS-CoV-2Γονίδιο Ε (Καφέ) και εκφράζεται σε ισοδύναμα TCID50/ml. Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ζωντανού ιικού φορτίου (Γκρι) για τον ποσοτικό προσδιορισμό μολυσματικών ιών. Οι μολυσματικοί τίτλοι των ρινικών πλύσεων προσδιορίστηκαν με δοκιμές τιτλοδότησης μολυσματικής δόσης σε καλλιέργεια ιστού και το προκύπτον TCID50/mL υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Reed and Muench. Όριο ανίχνευσης LOD=για δοκιμές ζωντανού ιικού φορτίου. Οι τίτλοι εξουδετέρωσης του ιού προσδιορίστηκαν με τυπικές δοκιμασίες εξουδετέρωσης χρησιμοποιώντας πλάσμα που συλλέχθηκε καθ' όλη τη διάρκεια του χρόνου (Μαύρο) (Α). Ο ζωντανός ιικός τίτλος στις ρινικές πλύσεις συσχετίστηκε αρνητικά με την απώλεια βάρους την 5η ημέρα μετά τη μόλυνση. R-value=-0.68 (p-value=0.00242) (B).
Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων του ιικού φορτίου στον πνεύμονα, καθώς και για την οπτικοποίηση της θέσης του ιού, πραγματοποιήσαμε χρώση IHC του αριστερού λοβού του πνεύμονα για ανίχνευσηSARS-CoV-2πρωτεΐνη ακίδας. Δεν ανιχνεύθηκε ιική πρωτεΐνη σε μη μολυσμένα χάμστερ που υποδηλώνουν την ειδικότητα του χρησιμοποιούμενου αντισώματος. Την ημέρα 2 pi, ο αριστερός πνεύμονας είχε σημαντική χρώση (μαύρο βέλος) που υποδηλώνει συσσώρευσηSARS-CoV-2αντιγόνο ακίδας (Eig 4B). Η χρώση ήταν πιο εμφανής στα επιθηλιακά κύτταρα του βρογχιολίου, με διάχυτη χρώση σε όλα τα επιθηλιακά κύτταρα του κυψελιδικού τοιχώματος. Την ημέρα 5 υπήρχε ελαφριά χρώση (μπλε βέλη) μέσω των αεραγωγών και των κυψελιδικών κυττάρων. Δεν ανιχνεύθηκε χρώση την ημέρα 8 pi, όπου οι εικόνες εμφανίστηκαν παρόμοιες με τις εικόνες του μη μολυσμένου βρογχιολίου.
Σχήμα 4. Τα εμβολιασμένα χάμστερ έχουν σημαντική φλεγμονή στον πνεύμονα που συμπίπτει με τη χρώση με αντιγόνο ακίδων SARS-CoV-2.Ο αριστερός πνεύμονας συλλέχθηκε από κάθε ζώο σε νεκροψία και εγχύθηκε με 10 τοις εκατό φορμαλίνη πριν από την ενσωμάτωση μπλοκ παραφίνης και τη χρώση Η&Ε. Τα κόκκινα βέλη δείχνουν αιμορραγία. τα πράσινα βέλη δείχνουν υπερπλασία. Τα κίτρινα βέλη υποδεικνύουν διήθηση μονοπύρηνων κυττάρων. Τα μαύρα βέλη αντιπροσωπεύουν το ξεφλούδισμα των κυττάρων. Το μπλε βέλος αντιπροσωπεύει το σχηματισμό υαλώδους μεμβράνης (Α). Ο πνεύμονας βάφτηκε για την παρουσία τουSARS-CoV-2πρωτεΐνη ακίδας από IHC χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά της ακίδας. Τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν υψηλές ποσότητες χρώσης ιικού αντιγόνου και τα μπλε βέλη δείχνουν την παρουσία χαμηλών ποσοτήτων χρώσης ιικού αντιγόνου (Β). Ολόκληρος ο πνεύμονας ζυγίστηκε κατά τη νεκροψία και η ακαθάριστη παθολογία του πνεύμονα αντιπροσωπεύτηκε ως ποσοστό του συνολικού σωματικού βάρους του ζώου (C). Τουλάχιστον 3 ζώα ανά χρονικό σημείο αναλύθηκαν. υποδεικνύει μια τιμή p μικρότερη<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" se.="" slides="" were="" visualized="" and="" imaged="" using="" the="" leica="" dmi100="" brightfield="" microscope="" and="" dmc5400="" 20="" mp="" color="" cmos="" camera.="" images="" were="" captured="" and="" 10x="" and="" 40x.="" the="" images="" shown="" are="" representative="" of="" 3="" animals="" per="" group,="" per="" time="">
Για να ποσοτικοποιηθεί η φλεγμονή και η διήθηση των φλεγμονωδών κυττάρων καθώς και το οίδημα στον πνεύμονα, αναλύθηκαν τα βάρη των πνευμόνων κατά τη νεκροψία. Ολόκληρος ο πνεύμονας ζυγίστηκε κατά τη νεκροψία και υπολογίστηκε μια αναλογία προς το σωματικό βάρος του ζώου και στη συνέχεια εκφράστηκε ως ποσοστό (Εικ. 4C). Τις ημέρες 0 και 2 pi, ο πνεύμονας ήταν μικρότερος από το ένα τοις εκατό του σωματικού βάρους του χάμστερ . Αυτό αυξήθηκε σε μια σημαντική αιχμή την 5η ημέρα σε λίγο λιγότερο από το 4 τοις εκατό του σωματικού βάρους κατά μέσο όρο. Το βάρος του πνεύμονα μειώθηκε στο 1 τοις εκατό και παρέμεινε στατιστικά σημαντικό από την έναρξη καθ' όλη την υπόλοιπη χρονική πορεία.
Η έκφραση του γονιδίου ξενιστή και το προφίλ ανοσοπαθολογίας υποδηλώνουν έντονη φλεγμονώδη απόκριση με αμβλύτερη σηματοδότηση ιντερφερόνης τύπου Ι στοαναπνευστικόςέκταση
Δεδομένου ότι τα ανθρώπινα δεδομένα διερεύνησαν τα συστηματικά επίπεδα κυτοκίνης στο αίμα, μας ενδιέφερε να προσδιορίσουμε τις ανοσολογικές αποκρίσεις στο σημείο της μόλυνσης καθώς και σε άλλα προσβεβλημένα όργανα. Διερευνήσαμε τα επίπεδα σχετιζόμενων με την απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN(Ιντερφερόνη)-βήτα, STAT(μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής μεταγραφής)2,IRF (ρυθμιστικός παράγοντας ιντερφερόνης)1, IRF3 και TLR(υποδοχέας που μοιάζει με Toll)3) , σχετιζόμενη με την απόκριση ιντερφερόνης τύπου II (IFN-γάμα,IRF2, STAT1, CXCL10) και έμφυτους/προσαρμοστικούς δείκτες και μεσολαβητές (CD3, CD4, CD8A, CD19, IL-2, TGF (μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας)-βήτα ,IL-21,IL-10,IL-4,IL-5,IL-5R,IL-13,IL-12 ,CD14,PKR, CCR3, CCL20, CCL22, IL-1βήτα, IL-6, TNF).
Ανθρώπινες κλινικές αναφορές το έχουν δείξειSARS-CoV-2Η λοίμωξη οδηγεί σε απορύθμιση της απόκρισης της ιντερφερόνης[14]. Διερευνήσαμε τις αποκρίσεις IFN τύπου Ι και Ι αξιολογώντας την έκφραση των IFN-βήτα, STAT2, IRF1, IRF3 και TLR3 για την απόκριση τύπου Ι και IFN-γάμα, IRF2, STAT1 και CXCL10 για την απόκριση τύπου II (Εικ. 5) . Η IFN-βήτα ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα κάτω τόσο στους ρινικούς κόγχους όσο και στους δεξιούς κρανιακούς πνεύμονες με τη μεγαλύτερη αναστολή την ημέρα 2. Οι κατάντη ρυθμιστές της απόκρισης IFN τύπου Ι μειώθηκαν επίσης, συμπεριλαμβανομένων των STAT2 και IRF1 που έφτασαν στη μέγιστη αναστολή αργότερα στη χρονική πορεία, όπως καθώς και IRF3 και TLR3 που δεν παρουσίασαν αύξηση στη γονιδιακή έκφραση. Εξετάσαμε επίσης την απόκριση IFN τύπου II, καθώς και γονίδια των οποίων οι αντίστοιχες πρωτεΐνες δρουν και στις δύο οδούς IFN. Η IFN-γάμα, η IFN τύπου II, έδειξε ανοδική ρύθμιση στις ρινικές κόγχες, και πιο εμφανή στον πνεύμονα (Εικ. 5). Και στους δύο ιστούς, υπήρξε μια αύξηση σε μια κορυφή ακολουθούμενη από ανάλυση κατά την ημέρα 15 pi. Τα επίπεδα του ρινικού κόγχου της IFN-γάμα κορυφώθηκαν την 8η ημέρα με αλλαγή πτυχής 12, ενώ τα επίπεδα στον πνεύμονα κορυφώθηκαν την ημέρα 5 με αλλαγή πτυχής 17.αναπνευστικόςστους ιστούς, ο ανταγωνιστής IFN τύπου Ι IRF2 εμφάνισε σημαντικές αυξήσεις, κορυφώνοντας την ημέρα 8 στον ρινικό κόγχο και την ημέρα 2 στον δεξιό κρανιακό πνεύμονα, σε αναδιπλώσεις 24 και 25, αντίστοιχα. Τα μόρια γενικής απόκρισης IFN εμφάνισαν επίσης σημαντικές αυξήσεις. Το STAT1 έδειξε ισχυρή ανοδική ρύθμιση και στους δύο ιστούς τις ημέρες 2 και 5, ενώ το CXCL10 κορυφώθηκε την ημέρα 2 στους ρινικούς κόγχους με μια αναδίπλωση κοντά στο 70. Στον πνεύμονα, το CXCL10 κορυφώθηκε στις ημέρα 8 σε αναδίπλωση 30 αλλά δεν υποχώρησε ξανά στην αρχική τιμή και παρέμεινε σημαντικά αυξημένη σε σχέση με τα αφελή ζώα τις ημέρες 12 και 15 pi. Από αυτά τα δεδομένα, φαίνεται ότι ενώ η απόκριση IFN τύπου II παραμένει ανέπαφη, τα χάμστερ εμβολιάστηκαν μεSARS-CoV-2παρουσιάζουν απορρυθμισμένη απόκριση IIFN τύπου σεαναπνευστικόςιστούς.
Εικ. 5. Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης στους αναπνευστικούς ιστούς των μολυσμένων με SARS-Cov-2 χάμστερ αποκαλύπτει σημαντική απορρύθμιση της ιντερφερόνης με ταυτόχρονες αυξήσεις στους φλεγμονώδεις και ανοσολογικούς μεσολαβητές.Το qRT-PCR διεξήχθη σε RNA που εξήχθη από ρινικό κόγχο και δεξιό κρανιακό πνευμονικό ιστόSARS-CoV-2εμβολιασμένα χάμστερ. Τα δείγματα αξιολογήθηκαν για σχετιζόμενες με την απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN-βήτα, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), σχετιζόμενες με την απόκριση ιντερφερόνης τύπου II (IFN-γάμα, IRF2, STAT1, CXCL10) και εγγενή/ προσαρμοστικοί μεσολαβητές (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL- 10, IL-4, IL{-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικοί για γονίδια χάμστερ (Πίνακας 1). Η αλλαγή πτυχής υπολογίστηκε μέσω ΔΔCt έναντι της γραμμής αναφοράς (Ημέρα 0) με το BACT ως γονίδιο οικιακής φροντίδας. Τουλάχιστον τρία ζώα αναλύθηκαν για κάθε χρονικό σημείο.
Επιπλέον, αξιολογήσαμε επίσης την εγγενή και προσαρμοστική γονιδιακή ρύθμιση. Συνολικά, αυτά τα γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω τόσο στους ρινικούς κόγχους όσο και στους δεξιούς κρανιακούς πνεύμονες, με τους ρινικούς κόγχους να παρουσιάζουν συνήθως υψηλότερη έκφραση (Εικ. 5). Οι ρινικοί κόγχοι είχαν μέγιστη γονιδιακή έκφραση IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-4, IL-5R, IL{-13 και CCR3 την ημέρα 5 pi, με την υψηλότερη έκφραση να προέρχεται από το TGF-betal σε μια αναδίπλωση 97, και το IL-13 στο 45. Η έκφραση IL-10 κορυφώθηκε την ημέρα 2 με μια αλλαγή πτυχής 38 αλλά παρέμεινε ρυθμισμένη προς τα πάνω καθ' όλη τη διάρκεια του χρόνου, σημαντικά τις ημέρες 5 και 10. Η έκφραση της IL-5 κορυφώθηκε την ημέρα 12 με μια πολλαπλή αλλαγή 21. Εντός του πνεύμονα, η υψηλότερη έκφραση ανά γονίδιο διέφερε: TGF-βήτα, IL{ {25}} και IL-13 παρουσίασαν την υψηλότερη ανοδική ρύθμιση την ημέρα 5. IL-10, IL{-4 και IL-5 την ημέρα 8. και IL-2 την ημέρα 12. Η IL-4 και η IL-13 παρουσίασαν τη μεγαλύτερη ανοδική ρύθμιση, στις 25 και 18 τις αντίστοιχες ημέρες αιχμής. Οι ειδικοί για τα Τ κύτταρα δείκτες ήταν υψηλότεροι στους ρινικούς κόγχους, με κορυφαία γονιδιακή έκφραση την ημέρα 12 και παραμένοντας υψηλή την ημέρα 15. Αυτό υποδηλώνει εμπλεκόμενη απόκριση Τ κυττάρων η οποία υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την ανοδική ρύθμιση των Th2 κυτοκινών (IL-4 , IL-5 και IL-13), οι κυτοκίνες (που εμφανίστηκαν προηγουμένως IL-12 και IFN-γάμα), καθώς και οι ρυθμιστικές Τ και οι κυτοκίνες Th17 (IL{-10 και TGF-betal), υποδεικνύοντας μια συνολική απόκριση Τ κυττάρων σεSARS-CoV-2μόλυνση. Επομένως, πραγματοποιήσαμε IHC για να προσδιορίσουμε την παρουσία κυττάρων CD3 plus και CD20 plus εντός τουαναπνευστικόςοδού (S3 Σχήμα). Η χρώση CD3 συν συγκεντρώθηκε σε αιμοφόρα αγγεία (κόκκινα βέλη) στον μη μολυσμένο πνευμονικό ιστό χωρίς χρώση εντός των κυψελιδικών διαστημάτων. Η παρουσία των κυττάρων CD3 plus (Σχήμα S3A, μαύρα βέλη) αυξήθηκε στον κυψελιδικό χώρο καθ' όλη τη διάρκεια του χρόνου φτάνοντας στη μέγιστη χρώση την ημέρα 8 μετά τον εμβολιασμό και στη συνέχεια μειώθηκε σε ένταση σήμερα 15. Η χρώση CD20 δεν ανιχνεύθηκε σε μη μολυσμένο ιστό. Μικροί αριθμοί κυττάρων CD20 plus ανιχνεύθηκαν τις ημέρες 2,5 και 8 μετά τον εμβολιασμό (Σχήμα S3B, που υποδηλώνεται με μαύρα βέλη) που μειώθηκαν τις ημέρες 12 και 15 όπως υποδεικνύεται με γκρι βέλη.
Η ανάλυση των φλεγμονωδών δεικτών εντός των ρινικών κόγχων έδειξε σημαντικές παροδικές αυξήσεις όλων των φλεγμονωδών στόχων που υποχωρούν τις ημέρες 12 και 15. Η IL-1βήτα έφθασε τα μέγιστα επίπεδα την ημέρα 2 pi με μια πολλαπλή αλλαγή 4{{7 }} συγγενείς σήμερα 0μη μολυσμένα ζώα(Εικ. 5). Τα IL-6, IL-12 και TNF έφτασαν στην κορυφή της ημέρας 5 pi (πλάσιες αλλαγές 66,20 και 26, αντίστοιχα). Η αντίστοιχη σημασία βρίσκεται στον Πίνακα S1. Αντίθετα, αυτές οι μεταγραφές έφτασαν στην κορυφή μεταξύ 2 και 5 ημερών, αλλά με μικρότερη αλλαγή πτυχής σε σύγκριση με τον πνεύμονα. Τόσο στις ρινικές κόγχες όσο και στον πνεύμονα, αρκετές φλεγμονώδεις κυτοκίνες παρέμειναν αυξημένες σε σύγκριση με την αρχική τιμή μέχρι την ημέρα 12 pi. Συνολικά, τα σημεία μόλυνσης έδειξαν μια σαφή αύξηση στους φλεγμονώδεις δείκτες, ιδιαίτερα την IL-6 στους ρινικούς κόγχους και τον TNF στον πνεύμονα.
