Διπλές ρυθμιστικές επιδράσεις της διοσμίνης στις διαδικασίες σχηματισμού πέτρας νεφρού οξαλικού ασβεστίου: κρυστάλλωση, ανάπτυξη, συσσωμάτωση, προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων, εσωτερίκευση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και εισβολή μέσω εξωκυτταρικής μήτρας
Mar 16, 2022
για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visith Thongboonkerda,*
aΜονάδα Ιατρικής Πρωτεομικής, Γραφείο Έρευνας και Ανάπτυξης, Ιατρική Σχολή Νοσοκομείο Siriraj, Πανεπιστήμιο Mahidol, Μπανγκόκ 10700, Ταϊλάνδη
bΤμήμα Ιατρικής Τεχνολογίας, Σχολή Συμμαχικών Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Phayao, Phayao 56000, Ταϊλάνδη
cUnit of Excellence in Integrative Molecular Biomedicine, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
Λέξεις κλειδιά: Βιοδραστική ένωση, φλαβονοειδή, αναστολέας, ρυθμιστής, νεφρολιθίαση, υποκινητής, ουρολιθίαση
ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ
Diosminείναι ένας φυσικός γλυκοζίτης φλαβονών (βιοφλαβονοειδές) που βρίσκεται σε φρούτα και φυτά με αρκετές φαρμακολογικές δράσεις. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως συμπλήρωμα διατροφής ή θεραπευτικός παράγοντας σε διάφορες ασθένειες/διαταραχές. Αν και συνιστάται, στοιχεία των προστατευτικών μηχανισμών του έναντινεφρόΗ λιθίαση (νεφρολιθίαση/ουρολιθίαση), ιδιαίτερα το μονοένυδρο οξαλικό ασβέστιο (CaOx) (COM) που είναι ο πιο κοινός τύπος, παρέμεινε ασαφές. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε συστηματικά τις επιπτώσεις τουδιοσμίνη(στα 2,5–160 nM) σε διάφορα στάδια τουνεφρόδιεργασίες σχηματισμού λίθων, συμπεριλαμβανομένης της κρυστάλλωσης COM, της ανάπτυξης κρυστάλλων, της συσσωμάτωσης, της προσκόλλησης κρυσταλλικών κυττάρων, της εσωτερίκευσης σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και της εισβολής μέσω της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότιδιοσμίνηείχε δοσοεξαρτώμενες ρυθμιστικές επιδράσεις σε όλες τις αναφερόμενες διεργασίες πέτρας στα νεφρά COM.Diosminαύξησε σημαντικά τον αριθμό και τη μάζα των κρυστάλλων COM κατά την κρυστάλλωση, αλλά μείωσε το μέγεθος και την ανάπτυξη των κρυστάλλων. Ενώδιοσμίνηπροώθησε τη συσσωμάτωση κρυστάλλων, ανέστειλε την προσκόλληση και την εσωτερίκευση κρυσταλλικών κυττάρων στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Τέλος, η διοσμίνη προώθησε την εισβολή κρυστάλλων μέσω του ECM. Τα δεδομένα μας παρέχουν στοιχεία που καταδεικνύουν τόσο ανασταλτικές όσο και προαγωγικές επιδράσεις της διοσμίνης στο COMνεφρόδιαδικασίες σχηματισμού λίθων. Με βάση αυτές τις διπλές ρυθμιστικές δράσεις της διοσμίνης, ο ρόλος της κατά της ουρολιθίασης είναι αμφίβολος και θα πρέπει να ληφθούν προφυλάξεις για τη χρήση της σενεφρόασθένεια πέτρας.
1. Εισαγωγή
Diosmin(3',5,7-τριυδροξυ-4'-μεθοξυφλαβόνη-7-ραμνογλυκοσίδη) είναι ένα φυσικό βιοφλαβονοειδές που βρίσκεται συνήθως σε διάφορα φυτά και φρούτα, κυρίως Citrus spp. [1,2]. Μπορεί να συντεθεί ή να προέρχεται από το άλλο φλαβονοειδές, την εσπεριδίνη [1,2]. Η διοσμίνη μόνη της ή σε συνδυασμό με εσπεριδίνη χρησιμοποιείται ευρέως ως φλεβοτροπικό φάρμακο για τη θεραπεία φλεβικών και λεμφικών διαταραχών όπως η χρόνια φλεβική ανεπάρκεια και οι αιμορροΐδες [3,4]. Επιπλέον, η διοσμίνη εμφανίζει αρκετές άλλες βιολογικές και φαρμακολογικές δράσεις, συμπεριλαμβανομένων αντιοξειδωτικών και αντιφλεγμονωδών δράσεων [5,6], αντι-μεταλλαξιογόνων και αντινεοπλασματικών ιδιοτήτων [7,8], αντιβιοτικών [9], αντι-υπεργλυκαιμικών ιδιοτήτων [9] 10] και προστατευτικά αποτελέσματα έναντι πολυοργανικών βλαβών, π.χ.
καρδιαγγειακά [11], αμφιβληστροειδή [12],νεφρό, ηπατική και εγκεφαλική βλάβη [13].
ΝεφρόΗ λιθίαση (ή νεφρολιθίαση/ουρολιθίαση) προκαλείται από τους συμπαγείς λίθους που αναπτύσσονται και εναποτίθενται στο εσωτερικό του νεφρού και επηρεάζει τον άνθρωπο σε όλες τις περιοχές του πλανήτη με υψηλό ποσοστό υποτροπής [14-17]. Μεταξύ όλων των διαφόρων αιτιολογικών κρυστάλλων, το οξαλικό ασβέστιο (CaOx), ιδιαίτερα η μονοϋδρική μορφή (COM), είναι το πιο παθογόνο και πιο κοινό κρυσταλλικό συστατικό που βρίσκεται στους σχηματιστές λίθων (ασθενείς με πέτρες στα νεφρά) [18]. Μηχανιστικά, οι κρύσταλλοι COM έχουν την πιο ισχυρή συγκολλητική ικανότητα και τις περισσότερες κυτταροτοξικές επιδράσεις στα επιθηλιακά κύτταρα των νεφρικών σωληναριακών [19,20]. Κατά τη διάρκεια της παθογένεσης των λίθων, τόσο το μοντέλο πλάκας του Randall όσο και η ενδοσωληνική υπόθεση έχουν κοινά χαρακτηριστικά των διαδικασιών σχηματισμού λίθων COM, όπως κρυστάλλωση COM, ανάπτυξη, συσσώρευση, κατακράτηση με επιφανειακή προσκόλληση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα ή νεφρική λεκάνη, εσωτερίκευση στα κύτταρα και εισβολή σε νεφρικό διάμεσο μέσω εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) [21,22].
Πρόσφατα, πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ανακάλυψη φαρμάκων χρησιμοποιώντας φαρμακευτικά φυτά/φρούτα και τις βιοδραστικές ενώσεις τους με στόχο την πρόληψη του νέου ή/και επαναλαμβανόμενου σχηματισμού λίθων. Ορισμένες προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι ορισμένες βιοδραστικές ενώσεις, ιδιαίτερα οι φαινολικές ενώσεις (πολυφαινόλη, φλαβονοειδή, γλυκοζίτη φλαβόνης, κ.λπ.) που εξάγονται από διάφορα φαρμακευτικά φυτά/φρούτα, έχουν προληπτικά αποτελέσματα έναντι των παθογόνων μηχανισμών τουνεφρόλιθίαση τόσο in vitro όσο και in vivo [23-25]. Μεταξύ αυτών των ευεργετικών ουσιών, μερικές αναφορές έχουν προτείνει ότι η διοσμίνη μπορεί να αποτρέψει την εναπόθεση κρυστάλλων CaOx μέσα στον ιστό των νεφρών σε ζωικά μοντέλα [26,27]. Ωστόσο, ο ακριβής ρυθμιστικός του ρόλος (αναστολή ή προαγωγή) και οι μηχανισμοί (στάδια ή διαδικασίες σχηματισμού λίθων) στον σχηματισμό λίθων στα νεφρά COM δεν είχαν διερευνηθεί. Η παρούσα μελέτη αξιολόγησε λοιπόν συστηματικά τις επιδράσεις τουδιοσμίνη(στα 2,5–160 nM) σε διάφορα στάδια τουνεφρόδιεργασίες σχηματισμού λίθων, συμπεριλαμβανομένης της κρυστάλλωσης, της ανάπτυξης κρυστάλλων, της συσσωμάτωσης, της προσκόλλησης κρυσταλλικών κυττάρων, της εσωτερίκευσης σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και της εισβολής μέσω ECM.
Κάντε κλικ στοΔοσολογία Cistanche tubulosa για τη νεφρική λειτουργία
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Παρασκευή διοσμίνης
Diosmin(Tokyo Chemical Industry, Τόκιο, Ιαπωνία) διαλύθηκε με 100 τοις εκατό διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) και παρασκευάστηκαν δείγματα εργασίας στις τελικές συγκεντρώσεις 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 και 160 nM για τη διερεύνηση των επιπτώσεών του στους κρυστάλλους COM. Επιπλέον, 100 τοις εκατό DMSO χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος σε όλα τα πειράματα.
2.2. Κυτταρικής καλλιέργειας
MDCK νεφρική σωληναριακή επιθηλιακή κυτταρική σειρά που προέρχεται από το άπω σωληναριακό τμήμα του νεφρώνα (ATCC, Manassas, VA) πολλαπλασιάστηκε στο ελάχιστο απαραίτητο μέσο Eagle (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). 60 U/ml πενικιλλίνη G (Sigma-Aldrich) και 60 ug/ml στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα με 5 τοις εκατό CO2 στους 37 ◦C.
2.3. Δοκιμασία κρυστάλλωσης COM
Η κρυστάλλωση COM πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28,29]. Εν συντομία, 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H2O σε ρυθμιστικό κρυστάλλωσης (που περιέχει 10 mM Tris-HCl και 90 mM NaCl) (ρΗ 7,4) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας φρεατίου 24- (Corning Inc., Corning, NY). ίσος όγκος (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ήδιοσμίνη(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ή 160 nM) αναμίχθηκε με CaCl2. Τέλος, 500 μΙ Na2C2O4 1,0 mM στο ρυθμιστικό κρυστάλλωσης προστέθηκαν για να γίνουν οι τελικές συγκεντρώσεις CaCl2 και Na2C2O4 σε 5 mM και 0,5 mM, αντίστοιχα. Το μίγμα επωάστηκε στους 25 ◦C για 1 ώρα και στη συνέχεια εξετάστηκε. Κρυστάλλινες εικόνες καταγράφηκαν τυχαία από τουλάχιστον 15 πεδία υψηλής ισχύος (HPF) κάτω από το μικροσκόπιο φωτός ανεστραμμένης αντίθεσης φάσης Nikon Eclipse Ti-S (Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία). Το μέγεθος και ο αριθμός των κρυστάλλων μετρήθηκαν από τουλάχιστον 15 HPF για κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας το λογισμικό NIS Element D έκδοση 4.11 (Nikon). Η κρυσταλλική μάζα υπολογίστηκε από τουλάχιστον 100 κρυστάλλους σε 15 HPF χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Κρυσταλλική μάζα (μm2/HPF)=Μέσο μέγεθος κρυστάλλου σε κάθε πεδίο (μm2) × Αριθμός κρυστάλλων σε κάθε πεδίο (/HPF) ( 1)
2.4. Δοκιμασία ανάπτυξης κρυστάλλων COM
Ο προσδιορισμός ανάπτυξης κρυστάλλων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30,31].
Εν συντομία, ίσος όγκος (500 ul) 10 mM CaCl2⋅2H2O και 1,0 mM Na2C2O4 σε ρυθμιστικό κρυστάλλωσης αναμίχθηκαν (1:1) (v/v) σε κάθε φρεάτιο του { {12}}πηγαδάκι. Το μίγμα επωάστηκε στους 25◦C για 1 ώρα για να επιτραπεί η πλήρης κρυστάλλωση. Σε αυτό το σημείο (T0), ίσος όγκος (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ήδιοσμίνη(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 ή 160 ηΜ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και το μίγμα επωάστηκε περαιτέρω για 60 λεπτά (Τ60). Στα T0 και T60, οι κρυσταλλικές εικόνες καταγράφηκαν τυχαία από τουλάχιστον 15 HPFs κάτω από το μικροσκόπιο φωτός ανεστραμμένης αντίθεσης φάσης Nikon Eclipse Ti-S. Τα μεγέθη των κρυστάλλων σε T0 και T60 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό NIS Element D έκδοση 4.11 (Nikon), ενώ η ανάπτυξη κρυστάλλων (που αντιπροσωπεύεται από το μέγεθος Δ Crystal) υπολογίστηκε από τουλάχιστον 100 κρυστάλλους σε 15 HPF χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Μέγεθος κρυστάλλου Δ (μm2)=Μέγεθος κρυστάλλου σε T60 − Μέγεθος κρυστάλλου σε T0 (2)
2.5. Δοκιμασία συσσωμάτωσης κρυστάλλων COM
Η δοκιμασία συσσωμάτωσης κρυστάλλων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32,33]. Οι κρύσταλλοι COM δημιουργήθηκαν όπως αναφέρθηκε παραπάνω στον προσδιορισμό ανάπτυξης κρυστάλλων αλλά με μεγαλύτερο όγκο σε κωνικό σωλήνα 50-ml (Corning Inc.) και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 2000 g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε, ενώ οι κρύσταλλοι COM πλύθηκαν τρεις φορές με μεθανόλη. Μετά από άλλη φυγοκέντρηση στα 2000 g για 5 λεπτά, η μεθανόλη απορρίφθηκε και οι κρύσταλλοι ξηράνθηκαν στον αέρα όλη τη νύχτα στους 25 °C. Κρύσταλλοι COM (1000 μg ξηρού βάρους) επαναιωρήθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού κρυστάλλωσης σε κάθε φρεάτιο της πλάκας του πηγαδιού 6- (Corning Inc.). ίσος όγκος (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ήδιοσμίνη(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ή 160 ηΜ) προστέθηκε στο κρυσταλλικό εναιώρημα COM σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα ανακινήθηκε συνεχώς σε επωαστήρα ανακίνησης (Zhicheng, Shanghai, Κίνα) στις 150 rpm και στους 25 °C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, ο σχηματισμός του συσσωματώματος κρυστάλλου COM (που ορίζεται ως "ένα συγκρότημα τριών ή περισσότερων μεμονωμένων κρυστάλλων COM που ενώνονται στενά μεταξύ τους" [32]) εξετάστηκε και απεικονίστηκε κάτω από το μικροσκόπιο φωτός ανεστραμμένης αντίθεσης φάσης Nikon Eclipse Ti-S. Ο αριθμός των κρυσταλλικών συσσωματωμάτων COM μετρήθηκε από τουλάχιστον 15 τυχαίους HPF ανά φρεάτιο.
2.6. Δοκιμασία πρόσφυσης κρυσταλλικών κυττάρων COM
Η δοκιμασία προσκόλλησης κρυσταλλικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34,35]. Εν συντομία, δημιουργήθηκαν κρύσταλλοι COM όπως αναφέρθηκε παραπάνω σε κωνικό σωλήνα 50-ml και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 2000 g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε, ενώ οι κρύσταλλοι COM πλύθηκαν τρεις φορές με μεθανόλη. Μετά από άλλη φυγοκέντρηση στα 2000 g για 5 λεπτά, η μεθανόλη απορρίφθηκε και οι κρύσταλλοι ξηράνθηκαν στον αέρα όλη τη νύχτα στους 25 °C. Οι κρύσταλλοι απολυμάνθηκαν με ακτινοβολία υπεριώδους φωτός για 30 λεπτά πριν από την παρέμβαση με τα κύτταρα.
Κύτταρα MDCK (σε πυκνότητα 2 χ 105 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν και αναπτύχθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας φρεατίου 6- (Corning Inc.) για 48 ώρες για να ληφθεί συρρέουσα μονοστιβάδα. Το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια ανανεώθηκε πριν από την προσθήκη κρυστάλλων COM (100 μg ξηρού βάρους κρυστάλλων ανά ml μέσου καλλιέργειας). ίσος όγκος (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ήδιοσμίνη(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ή 160 ηΜ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα με 5 τοις εκατό CO2 στους 37 ◦C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν έντονα με PBS πέντε φορές και απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο φωτός ανεστραμμένης αντίθεσης φάσης Nikon Eclipse Ti-S. Ο αριθμός των υπόλοιπων κρυστάλλων COM που προσκολλήθηκαν στην επιφάνεια των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων μετρήθηκε από τουλάχιστον 15 τυχαία πεδία ανά φρεάτιο.
Cistanche για τη λειτουργία των νεφρών
2.7. Δοκιμασία εσωτερίκευσης κρυστάλλων COM
Οι επισημασμένοι με φθορισμό κρύσταλλοι COM δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36,37]. Οι συνθέσεις/συγκεντρώσεις των χημικών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για την κρυστάλλωση ήταν οι ίδιες με αυτές που αναφέρθηκαν παραπάνω για τους απλούς (μη επισημασμένους) κρυστάλλους, αλλά 0.1 μg/ml ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) ήταν προστίθεται σε διάλυμα CaCl2⋅2H2O πριν από την ανάμιξη με Na2C2O4. Τα επόμενα βήματα (κρυστάλλωση και συγκομιδή) έγιναν όπως προαναφέρθηκε, αλλά στο σκοτάδι.
Για να αξιολογηθεί η εσωτερίκευση των κρυστάλλων σε νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα, κύτταρα MDCK (σε πυκνότητα 2 × 105 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν και αναπτύχθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας φρεατίου 6- (Corning Inc.) για 48 ώρες για να ληφθούν συρρέουσα μονοστιβάδα. Η κυτταρική μονοστιβάδα επωάστηκε με σημασμένους με FITC κρυστάλλους COM (1000 μg κρυστάλλου/ml μέσου) σε υγροποιημένο επωαστήρα με 5 τοις εκατό CO2 στους 37 ◦C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ για την εξάλειψη των μη εσωτερικοποιημένων (τόσο προσκολλημένων όσο και μη προσκολλημένων) κρυστάλλων. Το ποσοστό των κυττάρων με εσωτερικοποιημένους κρυστάλλους προσδιορίστηκε ποσοτικά από ένα σύνολο 10.000 αποκτηθέντων συμβάντων χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (BD Accuri C6) (BD Biosciences, San Jose, CA). Τα κύτταρα που επωάστηκαν με απλούς (μη επισημασμένους) κρυστάλλους COM χρησιμοποιήθηκαν για την προρύθμιση του θορύβου και του κατωφλίου για το θετικό σήμα φθορισμού. Τα κύτταρα με θετικά σήματα φθορισμού στη συνέχεια μετρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τέτοιο ποσοστό υπολογισμού.
2.8. Εισβολή κρυστάλλου COM μέσω της ανάλυσης ECM
Οι κρύσταλλοι COM παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω για προσδιορισμούς κρυσταλλικής συσσωμάτωσης και προσκόλλησης κρυσταλλικών κυττάρων. Η δοκιμασία εισβολής κρυστάλλων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με πρωτόκολλο που καθιερώθηκε προηγουμένως [38,39]. Εν συντομία, συνολικά 20 μg κρυστάλλων COM επικαλυμμένοι με ρυθμιστικό διάλυμα κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος), λευκωματίνη (Sigma-Aldrich) (θετικός έλεγχος) ήδιοσμίνη(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 ή 160 nM) προστέθηκαν σε 200 ul ΜΕΜ. Στη συνέχεια, 200 μΙ Lys-πλασμινογόνου 0,3 pM (Fitzgerald Industries international, Acton, ΜΑ) σε PBS αναμίχθηκαν και επωάστηκαν με το σύμπλοκο κρυστάλλου-πρωτεΐνης στους 37°C για 1 ώρα. Το μη δεσμευμένο πλασμινογόνο απορρίφθηκε με φυγοκέντρηση στα 2000 g για 5 λεπτά και το ίζημα πλύθηκε με PBS μία φορά. Στη συνέχεια, 100 μΙ ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης 0,15 ρΜ (υΡΑ) (Fitzgerald Industries International) σε PBS αναμίχθηκαν με το σύμπλοκο κρυστάλλου-πρωτεΐνης-πλασμινογόνου/πλασμίνης. Το μίγμα στη συνέχεια προστέθηκε στην κορυφή της γέλης μήτρας εντός του θαλάμου μετανάστευσης ECM και επωάστηκε στους 37 ◦C. Μετά από 24-h επώαση, το διάλυμα που παρέμεινε στο πάνω μέρος του θαλάμου μετανάστευσης αφαιρέθηκε χρησιμοποιώντας μια γάζα ή λεπτό χαρτί. Οι εισβολείς κρύσταλλοι COM μέσα στο πήκτωμα μήτρας απεικονίστηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός με λειτουργία αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC) (Nikon H600L). Η απόσταση εισβολής κρυστάλλων μετρήθηκε και υπολογίστηκε ο μέσος όρος από τουλάχιστον 15 πεδία χαμηλής ισχύος (LPF) εντός του ίδιου θαλάμου χρησιμοποιώντας το λογισμικό NIS Element D έκδοση 4.11 (Nikon).
2.9. Στατιστική ανάλυση
Όλα τα παραπάνω πειράματα έγιναν εις τριπλούν (τρία ανεξάρτητα πειράματα) και τα ποσοτικά δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SEM. Πραγματοποιήθηκαν πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με το post-hoc τεστ Tukey. Πραγματοποιήθηκε δοκιμή συσχέτισης Pearson για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ των μεταβλητών. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με χρήση λογισμικού SPSS (έκδοση 18) (IBM SPSS, Armonk, NY). Η τιμή P μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.
3. Αποτελέσματα
3.1. Επίδραση της διοσμίνης στην κρυστάλλωση COM
Η κρυστάλλωση είναι ένα από τα βασικά πρώτα βήματανεφρόδιαδικασίες σχηματισμού λίθων όλων των τύπων. Μετά από 1-h κρυστάλλωση με ή χωρίςδιοσμίνησε διάφορες συγκεντρώσεις (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ή 160 ηΜ), μετρήθηκαν το μέγεθος και ο αριθμός των κρυστάλλων COM και υπολογίστηκε η κρυσταλλική μάζα. Ρυθμιστικό διάλυμα κρυστάλλωσης και το αραιωτικό DMSO χρησίμευσαν ως τυφλό και αρνητικό έλεγχο, αντίστοιχα. Τα δεδομένα έδειξαν ότι όλες οι δόσεις (2,5–160 nM) δισομίνης μείωσαν σημαντικά το μέγεθος των κρυστάλλων αλλά αύξησαν τον αριθμό των κρυστάλλων με τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση σε σύγκριση με τυφλά και αρνητικά δείγματα ελέγχου (Εικ. 1A–1C). Σε συμφωνία με τον αριθμό των κρυστάλλων, η κρυσταλλική μάζα αυξήθηκε ανάλογα με τη δόση (Εικ. 1D). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η διοσμίνη προάγει την κρυστάλλωση COM (νεοκρύσταλλοι).
3.2. Επίδραση της διοσμίνης στην ανάπτυξη κρυστάλλων COM
Η ρυθμιστική επίδραση τουδιοσμίνησχετικά με την ανάπτυξη κρυστάλλων COM αξιολογήθηκε με μέτρηση της αλλαγής στο μέγεθος των κρυστάλλων (μέγεθος κρυστάλλου Δ) μετά από 60-λεπτή περαιτέρω επώαση μετά την ολοκλήρωση του αρχικού σταδίου κρυστάλλωσης, όταν οι νεοκρύσταλλοι απουσίαζαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλες οι δόσεις (2,5-160 nM) δισομίνης μείωσαν σημαντικά το μέγεθος Δ κρυστάλλου με τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση σε σύγκριση με τον τυφλό και τον αρνητικό έλεγχο (Εικ. 2). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η διοσμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη των κρυστάλλων COM.
3.3. Επίδραση της διοσμίνης στη συσσωμάτωση κρυστάλλων COM
Εκτός από την ανάπτυξη των κρυστάλλων, η συσσώρευση μεμονωμένων κρυστάλλων που προσκολλώνται σφιχτά μεταξύ τους είναι ένα άλλο σημαντικό βήμα κατά τη διάρκειανεφρόπαθογένεια λίθων. Ο υψηλός βαθμός συσσωμάτωσης κρυστάλλων μπορεί τελικά να οδηγήσει σε μεγέθυνση λίθων και απόφραξη του μικρού νεφρικού σωληναριακού αυλού. Συγκρίνοντας με τυφλά και αρνητικά στοιχεία ελέγχου,διοσμίνηστα 10-160 nM δοσοεξαρτώμενος αυξημένος αριθμός των κρυσταλλικών συσσωματωμάτων COM (Εικ. 3). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η διοσμίνη προάγει τη συσσωμάτωση κρυστάλλων COM.
Cistanche για τη λειτουργία των νεφρών
3.4. Επίδραση της διοσμίνης στην προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων COM
Η διατήρηση των αιτιολογικών κρυστάλλων είναι ένα από τα κρίσιμα βήματα γιανεφρόσχηματισμός λίθων και μπορεί να προκληθεί από προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων που εμποδίζει την αποβολή των κρυστάλλων μαζί με την εκροή ούρων. Αξιολογήσαμε έτσι τη ρυθμιστική δραστηριότητα τουδιοσμίνηστην πρόσφυση κρυστάλλου COM. Τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι η διοσμίνη στα 5-160 nM μείωσε σημαντικά την ικανότητα προσκόλλησης των κρυστάλλων COM σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα με τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση σε σύγκριση με τυφλά και αρνητικά μάρτυρες (Εικ. 4). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η διοσμίνη αναστέλλει την προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων COM.
3.5. Επίδραση της διοσμίνης στην εσωτερίκευση κρυστάλλων COM σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα
Μετά την προσκόλληση, ορισμένοι κρύσταλλοι COM μπορούν να εσωτερικευτούν στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και να προκαλέσουν αρκετές επακόλουθες κυτταρικές αποκρίσεις [37,40]. Η εσωτερίκευση των κρυστάλλων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κρυστάλλους COM σημασμένους με FITC και ποσοτικοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Χρησιμοποιήθηκαν απλοί κρύσταλλοι COM (χωρίς σήμανση) για την αφαίρεση του τεχνικού θορύβου και για να διασφαλιστεί ότι η ένταση φθορισμού ήταν από το σήμα FITC. Σε σύγκριση με τυφλά και αρνητικά δείγματα ελέγχου, το ποσοστό των κυττάρων με εσωτερικοποιημένους κρυστάλλους μειώθηκε σημαντικά κατάδιοσμίνηστα 10–160 nM με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5). Τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η δισομίνη αναστέλλει την εσωτερίκευση των κρυστάλλων COM στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα.
3.6. Επίδραση της διοσμίνης στην εισβολή κρυστάλλων COM μέσω της ECM
Η εισβολή κρυστάλλων μέσω της ECM είναι μια παθογόνος/καταστροφική διαδικασία κατά τη διάρκειανεφρόπαθογένεση λίθων που μπορεί να προκαλέσει διάφορες φλεγμονώδεις αποκρίσεις και καταρράκτες, επιδεινώνοντας έτσι τους μηχανισμούς της νόσου. Εξετάσαμε αυτό το φαινόμενο χρησιμοποιώντας ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο που βασίζεται στη δραστηριότητα πλασμινογόνου-πλασμίνης του συμπλέγματος κρυστάλλου-πρωτεΐνης [38,39]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλες οι δόσεις δισομίνης (2,5–160 nM) ενίσχυσαν σημαντικά την εισβολή κρυστάλλων COM μέσω της ECM με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 6). Με ενδιαφέρο,διοσμίνηστα 160nM θα μπορούσε να προάγει την εισβολή κρυστάλλων COM συγκρίσιμη με την αλβουμίνη, η οποία είναι ο γνωστός ισχυρός προαγωγέας για την εισβολή κρυστάλλων COM [41] (Εικ. 6). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η διοσμίνη προάγει έντονα την εισβολή κρυστάλλων COM μέσω της ECM.
Εικ. 1. Επίδραση τουδιοσμίνηστην κρυστάλλωση COM. Η δοκιμασία κρυστάλλωσης διεξήχθη με ίσο όγκο (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ή διοσμίνης (2,5-160 nM). (Α): Μορφολογία κρυστάλλων σε κάθε κατάσταση μετά από 1- ώρα κρυστάλλωσης. Η αρχική μεγέθυνση ήταν 400× για όλα τα πάνελ. (Β): Μέγεθος κρυστάλλου. (Γ): Κρυσταλλικός αριθμός. (Δ): Η κρυσταλλική μάζα (βλέπε Τύπο 1 στο "Υλικά και Μέθοδοι") αναλύθηκε από τουλάχιστον 100 κρυστάλλους σε 15 HPF. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ±SEM των δεδομένων που προέρχονται από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *=σελ< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Εικ. 2. Επίδραση τουδιοσμίνηγια την ανάπτυξη κρυστάλλων COM. Η δοκιμασία ανάπτυξης κρυστάλλων διεξήχθη μετά την ολοκλήρωση της κρυστάλλωσης (για να αποφευχθεί η νεοκρυστάλλωση) με ίσο όγκο (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ή διοσμίνη (2,5-160nM). (Α): Μορφολογία κρυστάλλων σε κάθε κατάσταση στο T0 και στο T60. Η αρχική μεγέθυνση ήταν 400 × για όλα τα πάνελ. (Β)-(J): Ιστογράμματα μεγεθών κρυστάλλων που μετρήθηκαν από μεμονωμένους κρυστάλλους στα Τ0 και Τ60 σε κάθε ομάδα. (Κ): Δ Μέγεθος κρυστάλλου (βλέπε Τύπο 2 στο "Υλικά και Μέθοδοι") αναλύθηκε από τουλάχιστον 100 κρυστάλλους σε 15 HPF. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM των δεδομένων που προέρχονται από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *= p < 0,05="" έναντι="" κενού="" στοιχείου="" ελέγχου.="" #="p">< 0,05="" έναντι="">
Εικ. 3. Επίδραση τουδιοσμίνησχετικά με τη συνάθροιση κρυστάλλων COM. Η δοκιμασία συσσωμάτωσης κρυστάλλων πραγματοποιήθηκε με ίσο όγκο (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ή διοσμίνης (2,5-160 nM). (Α): Μικρογραφίες των συγκεντρωτικών κρυστάλλων COM (με ετικέτα με διακεκομμένους κύκλους). Η αρχική μεγέθυνση ήταν 400 × για όλα τα πάνελ. (Β): Ο αριθμός των κρυσταλλικών συσσωματωμάτων μετρήθηκε από τουλάχιστον 15 τυχαίους HPF σε κάθε φρεάτιο. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM των δεδομένων που προέρχονται από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *=σελ< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Εικ. 4. Επίδραση τουδιοσμίνηστην πρόσφυση κρυστάλλου COM. Ο προσδιορισμός προσκόλλησης κρυσταλλικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με ίσο όγκο (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ή διοσμίνης (2,5-160 nM). (Α): Μικρογραφίες των υπόλοιπων κρυστάλλων που προσκολλήθηκαν σφιχτά στη μονοστιβάδα του κυττάρου μετά την αφαίρεση των αδέσμευτων κρυστάλλων με έντονες πλύσεις με PBS. Η αρχική μεγέθυνση ήταν 200 × για όλα τα πάνελ. (Β): Ο αριθμός των προσκολλημένων κρυστάλλων μετρήθηκε από τουλάχιστον 15 τυχαία πεδία σε κάθε φρεάτιο. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ±SEM των δεδομένων που προέρχονται από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *= σελ<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Εικ. 5. Επίδραση τουδιοσμίνησχετικά με την εσωτερίκευση κρυστάλλων COM σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Η δοκιμασία εσωτερίκευσης κρυστάλλων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κρυστάλλους COM με σήμανση FITC (FITC-COM), ενώ οι απλοί (μη επισημασμένοι) κρύσταλλοι COM χρησιμοποιήθηκαν για αφαίρεση φόντου/θορύβου. Η δοκιμασία πραγματοποιήθηκε με ίσο όγκο (4 ul) ρυθμιστικού διαλύματος κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος) ή διοσμίνης (2,5–160nM). (Α): Ανάλυση κουκκίδας κυτταρομετρικής ροής του μεγέθους (άξονας γ) και της έντασης φθορισμού FITC (άξονας x) των κυττάρων μετά την αφαίρεση μη εσωτερικοποιημένων κρυστάλλων με 0,1 τοις εκατό θρυψίνη/2,5 mM EDTA. (Β): Ποσοστό των κυττάρων με εσωτερικευμένους κρυστάλλους COM με σήμανση FITC. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM των δεδομένων που προέρχονται από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *= σελ<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Εικ. 6. Επίδραση τουδιοσμίνησχετικά με την εισβολή κρυστάλλων COM μέσω της ECM. Η εισβολή κρυστάλλων μέσω της ανάλυσης ECM πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κρυστάλλους COM επικαλυμμένους με ρυθμιστικό κρυστάλλωσης (τυφλός έλεγχος), DMSO (αρνητικός έλεγχος), λευκωματίνη (θετικός έλεγχος) ή διοσμίνη (2,5-160nM). (Α): Μικρογραφίες των κρυστάλλων COM εισέβαλαν ή μετανάστευσαν μέσω του θαλάμου μετανάστευσης ECM. Η αρχική μεγέθυνση ήταν 100 × για όλα τα πάνελ. (Β): Η απόσταση εισβολής κρυστάλλων μετρήθηκε από τουλάχιστον 15 τυχαία LPF σε κάθε θάλαμο. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ±SEM των δεδομένων που προέρχονται από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *= σελ<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Συζήτηση
Η πέτρα στα νεφρά προκαλείται από το σχηματισμό λίθων στο εσωτερικό τουνεφρόκαι πυελικό σύστημα. Οι συνήθεις διαδικασίες σχηματισμού πέτρας στα νεφρά περιλαμβάνουν κρυστάλλωση COM, ανάπτυξη, συσσώρευση, κατακράτηση με προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων και εισβολή μέσω του νεφρικού διάμεσου ιστού πλούσιου σε ECM [21,22]. Υπάρχουν αρκετές προσπάθειες πρόληψης αυτής της ασθένειας χρησιμοποιώντας μια ποικιλία φαρμάκων ή/και συμπληρωμάτων διατροφής. Πολλές σειρές πρόσφατων στοιχείων έχουν αναφέρει ότι τα φλαβονοειδή, οι γλυκοσίδες φλαβονών και άλλες ενώσεις που εξάγονται από τα εσπεριδοειδή μπορεί να έχουν τα προληπτικά αποτελέσματα στη νόσο της πέτρας στα νεφρά και άλλες διαταραχές [23-25]. Μεταξύ αυτών,διοσμίνη, ένας φυσικός γλυκοζίτης φλαβονών και ένα παράγωγο εσπεριδίνης που βρίσκεται κυρίως στα εσπεριδοειδή [1,2], έχει προταθεί ότι παίζει προληπτικό ρόλο έναντι τραυματισμού και βλάβηςνεφρόιστός [13,42]. Επιπλέον, ο ρόλος του κατά της ουρολιθίασης έχει αναφερθεί σε μερικές προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν ζωικά μοντέλα [26,27]. Ωστόσο, τα ευεργετικά αποτελέσματα και οι υποκείμενοι μηχανισμοί της διοσμίνης στην πρόληψη της πέτρας στα νεφρά παρέμειναν θολά. Εξετάσαμε έτσι τη ρυθμιστική δράση της διοσμίνης σε κρυστάλλους COM. Οι συστηματικές αναλύσεις έγιναν σε διάφορα στάδια του COMνεφρόσχηματισμός λίθων, συμπεριλαμβανομένης της κρυστάλλωσης, της ανάπτυξης κρυστάλλων, της συσσωμάτωσης, της προσκόλλησης κρυσταλλικών κυττάρων, της εσωτερίκευσης σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και της εισβολής μέσω ECM.
Μετά την από του στόματος λήψηδιοσμίνη, το επίπεδό του στο πλάσμα στους ανθρώπους κυμαίνεται από {{0}},5 έως 200 ng/ml (ή 0,8–300 nM) [43,44]. Η μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα (Cmax) είναι περίπου 50 ng/ml (ή 85 nM) [43,44]. Επομένως, οι δόσεις διοσμίνης που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη μας (2,5–160nM) ήταν στο φαρμακολογικά σχετικό εύρος για τη φαρμακοκινητική της. Επειδή το DMSO χρησιμοποιήθηκε ως το αραιωτικό για την πλήρη διάλυση της διοσμίνης ανά σύσταση, το DMSO χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας σε αυτή τη μελέτη επιπλέον του τυφλού μάρτυρα για να διασφαλιστεί ότι δεν υπήρχαν επιδράσεις από το ίδιο το αραιωτικό που θα μπορούσαν να παρέμβουν στην ερμηνεία των δεδομένων. Σε όλες τις αναλύσεις, τα δεδομένα έδειξαν ότι δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές επιδράσεις από το DMSO και όλα τα ποσοτικά δεδομένα που προέκυψαν από τον αρνητικό έλεγχο ήταν συγκρίσιμα με αυτά του τυφλού μάρτυρα.
Η δοκιμασία κρυστάλλωσης COM αποκάλυψε ότι όλες οι συγκεντρώσεις τουδιοσμίνη(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 και 160 nM) θα μπορούσε να μειώσει το μέγεθος κρυστάλλων COM αλλά, από την άλλη πλευρά, αύξησε τον αριθμό των κρυστάλλων. Καθώς η κρυσταλλική μάζα είναι το τελικό προϊόν τόσο του μεγέθους όσο και του αριθμού των κρυστάλλων και είναι πιο σχετικό για να αντικατοπτρίζει τον βαθμό κρυστάλλωσης COM, στη συνέχεια αξιολογήσαμε εάν η διοσμίνη επηρέασε αυτόν τον κρυσταλλικό δείκτη. Τα δεδομένα έδειξαν ότι όλες οι συγκεντρώσεις διοσμίνης είχαν την προαγωγική επίδραση στην κρυσταλλική μάζα COM, σύμφωνα με τα δεδομένα για τον αριθμό των κρυστάλλων. Μετά την κρυστάλλωση, οι κρύσταλλοι COM μπορούν να αυξηθούν περαιτέρω σε μεγαλύτερο μέγεθος για το επόμενο βήμανεφρόσχηματισμός λίθων.
Σε αντίθεση με την κρυστάλλωση, η διοσμίνη σε όλες τις συγκεντρώσεις επέδειξε την ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των κρυστάλλων COM με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Μερικές προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η διαλυτότητα των κρυστάλλων CaOx μπορεί να αυξηθεί από παράγωγα υδροξυανθρακινονών με γλυκοζυλίωση [45]. Επιπλέον, η παρουσία σακχάρων σε τέτοιες βιοδραστικές ενώσεις μπορεί να συνδεθεί με ελεύθερο ιόν ασβεστίου, πιθανώς λόγω των υδροξυλομάδων στη μοριακή δομή, αναστέλλοντας έτσι τον σχηματισμό κρυστάλλων CaOx [45,46]. Η διοσμίνη μπορεί επίσης να επηρεάσει τη μετάβαση των διαλυτοποιημένων ιόντων ασβεστίου και οξαλικού στα κρυσταλλικά σωματίδια COM στο νεφρικό σωληναριακό υγρό κατά τη διαδικασία κρυστάλλωσης COM με βάση αυτόν τον μηχανισμό.
Ωστόσο, η συσσωμάτωση κρυστάλλων COM προωθήθηκε κατά 10-160nMδιοσμίνη, που υποδηλώνει την ικανότητα της διοσμίνης να δρα ως συνδετικό ή συγκολλητικό μόριο για τη στρατολόγηση μεμονωμένων κρυστάλλων για να συνδεθούν μεταξύ τους για να σχηματίσουν τα κρυσταλλικά συσσωματώματα. Αυτή η δέσμευση έχει επίσης ως αποτέλεσμα την πρόοδο των συγκολλητικών γεφυρών μεταξύ των μεμονωμένων κρυστάλλων και μπορεί να προκαλέσει το σχηματισμό μεγάλης δομής των κρυστάλλων COM, οι οποίοι συμβάλλουν εύκολα στην εναπόθεση λίθινων νημάτων μέσα στονεφρό[32].
Η κατακράτηση κρυστάλλων COM μέσω της προσκόλλησης κρυστάλλων στις επιφάνειες των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων έχει καθιερωθεί ως ένα άλλο σημαντικό βήμα για το σχηματισμό πέτρας στα νεφρά [47]. Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι η διοσμίνη θα μπορούσε να μειώσει την ικανότητα προσκόλλησης των κρυστάλλων COM να συνδέονται με τις κορυφαίες επιφάνειες των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων MDCK. Μερικές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες (ενώσεις πολυσακχαριτών) επικαλυμμένες σε κρυστάλλους CaOx ή εκφρασμένες σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα μπορούν να επηρεάσουν την ικανότητα προσκόλλησης των κρυστάλλων CaOx σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα [48]. Επιπλέον, η έκφραση των κρυσταλλικών υποδοχέων στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα είναι ένας από τους κρίσιμους μηχανισμούς που καθορίζουν την προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων [21]. Ενώ οι κρύσταλλοι CaOx προκαλούν τραυματισμό των κορυφαίων μεμβρανών, ιδιαίτερα των μικρολάχνων, ορισμένες πολυφαινόλες όπως η γαλλική επιγαλλοκατεχίνη (EGCG) μπορούν να αποτρέψουν την προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων και τον κυτταρικό τραυματισμό [49]. Επιπλέον, η φλαβονοειδής ουσία σε διάφορα φυτικά εκχυλίσματα έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι αυξάνει το επίπεδο pH των ούρων, οδηγώντας στην αναστολή της προσκόλλησης των κρυσταλλικών κυττάρων [50,51]. Ισως,διοσμίνημπορεί επίσης να μετριάσει έναν τέτοιο κυτταρικό τραυματισμό που προκαλείται από το COM, μειώνοντας έτσι την προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων.
Η εσωτερίκευση των κρυστάλλων COM έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζεται κυρίως με ενδοκυττάρωση μέσω της οδού μακροπινοκύτωσης που προκαλείται από τον κυτταροσκελετό της ακτίνης [40]. Φλαβονοειδή όπως η κερσετίνη έχει αναφερθεί ότι επηρεάζουν τον κυτταροσκελετό της ακτίνης που απαιτείται για τη μακροπινοκυττάρωση [52,53]. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η διοσμίνη μείωσε σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων MDCK να εσωτερικεύουν τους κρυστάλλους COM. Αυτή η ανασταλτική δράση της διοσμίνης μπορεί να σχετίζεται με τη συναρμολόγηση ή την οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης μέσα στα κύτταρα που επηρεάζει άμεσα την οδό της μακροπινοκύττωσης [54,55].
Μετά την εσωτερίκευση, οι κρύσταλλοι COM αποικοδομήθηκαν από τα ενδολυσοσώματα με αποτέλεσμα την αύξηση των ελεύθερων ιόντων ασβεστίου και οξαλικών στο νεφρικό διάμεσο [37]. Τέτοιες αυξήσεις στα ιόντα ασβεστίου και οξαλικού μπορεί να οδηγήσουν σε νεοκρυστάλλωση COM στο νεφρικό διάμεσο [56,57]. Επιπλέον, η παρουσία ενδιάμεσων κρυστάλλων COM μπορεί να οφείλεται σε ελαττώματα σφιχτής σύνδεσης και παρακυτταρικών φραγμών πρόσφυσης, με αποτέλεσμα αυξημένη παρακυτταρική διαπερατότητα και μετατόπιση κρυστάλλων [58-60]. Αυτοί οι κρύσταλλοι μπορούν στη συνέχεια να εισβάλουν στο νεφρικό διάμεσο μέσω της ECM και στη συνέχεια να προκαλέσουν αρκετές φλεγμονώδεις αντιδράσεις και ιστική βλάβη [58-60]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η εισβολή των κρυστάλλων COM μέσω του θαλάμου μετανάστευσης ECM προκλήθηκε από όλες τις συγκεντρώσεις διοσμίνης. Η διοσμίνη μπορεί να συνδεθεί με τις κρυσταλλικές επιφάνειες COM και να αλληλεπιδράσει με το σύστημα πλασμινογόνου-πλασμίνης που οδήγησε τη μετανάστευση των κρυστάλλων στον θάλαμο μετανάστευσης ECM [38,39].
Cistanche για τα νεφρά
Επειδήδιοσμίνηπροκάλεσε τόσο ανασταλτικά όσο και προαγωγικά αποτελέσματα σε διαφορετικές διάφορες διαδικασίες σχηματισμού λίθων COM, επομένως προσδιορίσαμε τη σχέση τους χρησιμοποιώντας τη δοκιμή συσχέτισης Pearson. Η ανάλυση συσχέτισης αποκάλυψε ότι ο αριθμός των κρυστάλλων συσχετίστηκε αντιστρόφως τόσο με το μέγεθος των κρυστάλλων όσο και με την ανάπτυξη των κρυστάλλων (μέγεθος κρυστάλλου Δ) (Σχ. 7Α και Β). Το μέγεθος των κρυστάλλων συσχετίστηκε ισχυρά με την ανάπτυξη των κρυστάλλων (Εικ. 7C) αλλά αντιστρόφως συσχετίστηκε με την κρυσταλλική μάζα (Εικ. 7D). Τέλος, η κρυσταλλική μάζα συσχετίστηκε ισχυρά τόσο με τον αριθμό των κρυστάλλων όσο και με την κρυσταλλική συσσωμάτωση (Εικ. 7Ε και ΣΤ). Από την ανάλυση συσχέτισης, τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο αριθμός των κρυστάλλων και η κρυσταλλική μάζα είναι πιο σημαντικά για να αντανακλούν την κρυστάλλωση παρά το μέγεθος των κρυστάλλων (Εικ. 7Α, Δ και Ε). Επιπλέον, το μέγεθος των νεοκρυστάλλων κατά την κρυστάλλωση σχετίζεται με την ανάπτυξη των προσχηματισμένων κρυστάλλων (Εικ. 7C), ενώ ο βαθμός κρυστάλλωσης (όπως αντανακλάται από τον αριθμό των κρυστάλλων και την κρυσταλλική μάζα) σχετίζεται στενά με τον βαθμό συσσωμάτωσης των κρυστάλλων (Εικ. 7Ε και ΦΑ). Ωστόσο, αυτές οι συσχετίσεις είναι πιθανότατα ειδικές για τα αποτελέσματα της διοσμίνης, ενώ τα αποτελέσματα από άλλους ρυθμιστές μπορεί να έχουν ή να μην έχουν τους ίδιους συσχετισμούς. Για παράδειγμα, η φιμπρονεκτίνη μειώνει την κρυσταλλική μάζα και αναστέλλει την ανάπτυξη των κρυστάλλων, αλλά προάγει τη συσσωμάτωση των κρυστάλλων [31]. Επιπλέον, το άθικτο βιώσιμο Escherichia coli αυξάνει το μέγεθος και τη μάζα των κρυστάλλων αλλά δεν έχει καμία επίδραση στον αριθμό των κρυστάλλων [33]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι συσχετίσεις μεταξύ των διαφόρων αναλύσεων κρυστάλλων COM δεν είναι καθολικές για όλους τους διαμορφωτές.
Τέλος, συνοψίσαμε τα αποτελέσματα που προέκυψαν από διάφορες αναλύσεις και τα ενσωματώσαμε με τους παθογόνους μηχανισμούςνεφρόλιθίαση (βλ. σχηματικά στο Σχ. 8). Από την ανάλυση συσχέτισης, η διοσμίνη προάγει την κρυστάλλωση (Εικ. 8Α). Μεταξύ κρυστάλλωσης και ανάπτυξης κρυστάλλων,διοσμίνηδιατηρεί μια καλή ισορροπία προάγοντας την κρυστάλλωση αλλά, από την άλλη πλευρά, αναστέλλοντας την ανάπτυξη των κρυστάλλων (Εικ. 8Β). Όσον αφορά όλες τις επιδράσεις μόνο στους κρυστάλλους COM (χωρίς να ληφθούν υπόψη τα κύτταρα και η ECM που επίσης παρεμβαίνουν), η προαγωγική δράση της διοσμίνης είναι πιο εμφανής από την ανασταλτική της δράση στους κρυστάλλους COM, καθώς προάγει τόσο την κρυστάλλωση όσο και τη συσσωμάτωση κρυστάλλων, αλλά αναστέλλει μόνο την ανάπτυξη των κρυστάλλων. Εικ. 8C). Αν και η κρυστάλλωση αυξάνεται, το μέγεθος των κρυστάλλων μειώνεται και σχετίζεται με την αναστολή της ανάπτυξης (Εικ. 7C). Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν από τους Kavanagh et al. [61-63], αποδεικνύοντας ότι η αύξηση της κρυστάλλωσης οδηγεί σε μείωση του υπερκορεσμού των ιόντων ασβεστίου και οξαλικών στο διάλυμα, μειώνοντας έτσι την ανάπτυξη. Ωστόσο, η ανάπτυξη των κρυστάλλων δεν είναι ο μόνος παράγοντας που καθορίζει τονεφρόπαθογένεση λίθων [64], ιδιαίτερα όταν η κρυσταλλική μάζα κατακλύζεται και σχετίζεται με την αύξηση της κρυσταλλικής συσσωμάτωσης (Εικ. 7F) που μπορεί να αυξήσει την πιθανότητα να κολλήσουν κρυσταλλικά υλικά σε μικρά σωληνοειδή τμήματα (στην ενδοσωληνική υπόθεση), αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα σχηματισμού λίθων. Επιπλέον, μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι τα δεδομένα συμφωνούν με τα ευρήματά μας, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση του αριθμού των κρυστάλλων σχετίζεται με την αύξηση της συσσωμάτωσης κρυστάλλων και τη διεύρυνση των λίθων [63].
Εικ. 7. Ανάλυση συσχετίσεων. (A)–(F): Οι συσχετίσεις μεταξύ του αριθμού κρυστάλλων COM, του μεγέθους των κρυστάλλων, του μεγέθους Δ κρυστάλλου, της μάζας κρυστάλλων και ενός αριθμού κρυσταλλικών συσσωματωμάτων αναλύθηκαν με τη δοκιμή συσχέτισης Pearson.
Εικ. 8. Σχήματα που συνοψίζουν τις ρυθμιστικές επιδράσεις τουδιοσμίνηστο COMνεφρόδιαδικασίες σχηματισμού λίθων. (Α): Επιδράσεις της διοσμίνης στην κρυστάλλωση COM. (Β): Επιδράσεις της διοσμίνης στην κρυστάλλωση COM και στην ανάπτυξη κρυστάλλων. (C): Επιδράσεις της διοσμίνης στην κρυστάλλωση, την ανάπτυξη και τη συσσώρευση COM. (D): Επιδράσεις της διοσμίνης σε όλες τις διαδικασίες σχηματισμού πέτρας στα νεφρά COM.
Όταν λαμβάνονται υπόψη οι αλληλεπιδράσεις με νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και ECM, η συνολική εικόνα των διπλών επιδράσεων τουδιοσμίνηστο COM ο σχηματισμός πέτρας στα νεφρά γίνεται πολύ πιο ξεκάθαρος (Εικ. 8D). Η διοσμίνη αναστέλλει την προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων, μειώνοντας έτσι την εσωτερίκευση των κρυστάλλων στα κύτταρα. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί ότι το μικρότερο μέγεθος των κρυστάλλων COM έχει μικρότερη συγκολλητική ικανότητα να δεσμεύει τα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα σε σύγκριση με τα μεγαλύτερα όπως αναφέρθηκε στην πρόσφατη μελέτη μας [34] και σε προηγούμενη μελέτη από άλλη ομάδα [65]. Η μικρότερη ικανότητα συγκόλλησης των μικρότερων κρυστάλλων COM οφείλεται στη λιγότερη συγκολλητική τους δύναμη στην επιφάνεια του κυττάρου και στους λιγότερους αριθμούς των κρυσταλλικών υποδοχέων COM που συνδέονται με αυτούς, όπως προσδιορίζεται από μικροσκοπία ατομικής δύναμης και ανάλυση πρωτεώματος, αντίστοιχα [34]. Η διοσμίνη αναστέλλει επίσης την εσωτερίκευση των κρυστάλλων. Σημειώστε ότι η διαδικασία εσωτερίκευσης είναι ένα δίκοπο μαχαίρι που χρειάζεται προσεκτική ερμηνεία. Η εσωτερίκευση ή ενδοκυττάρωση σε έναν από τους αμυντικούς μηχανισμούς που χρησιμοποιούσαν τα κύτταρα για την αποβολή των κρυστάλλων από τα ενδολυσοσώματα. Ωστόσο, η αποικοδόμηση των ανέπαφων κρυστάλλων δημιουργεί ελεύθερα ιόντα ασβεστίου και οξαλικών που μπορούν να μετακινηθούν από το ενδοκυτταρικό διαμέρισμα στο νεφρικό διάμεσο, όπου μπορούν να δημιουργήσουν νεοκρυστάλλους [56,57]. Από την άλλη πλευρά, η διοσμίνη προάγει την εισβολή των κρυστάλλων μέσω της ECM, η οποία είναι ένας από τους μηχανισμούς σημαντικούς για την παθογένεση των λίθων στα νεφρά (ιδιαίτερα στο μοντέλο της πλάκας του Randall) [58-60]. Συνολικά, το Σχήμα 8D συνοψίζει όλες τις διπλές ρυθμιστικές επιδράσεις της διοσμίνης στο COMνεφρόδιαδικασίες σχηματισμού λίθων. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ισορροπία αυτών των επιδράσεων προώθησης και αναστολής δεν μπορεί να υπολογιστεί με ακρίβεια (σε αντίθεση με μια μαθηματική εξίσωση). Επιπλέον, υπάρχουν αρκετοί άλλοι ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες που μπορούν επίσης να παρέμβουν στις διαδικασίες σχηματισμού λίθων. Τέλος, η διοσμίνη εμφανίζει επίσης αρκετές έμμεσες επιδράσεις στον σχηματισμό πέτρας στα νεφρά, συμπεριλαμβανομένων των αντιοξειδωτικών και αντιφλεγμονωδών ιδιοτήτων της [5,6] που πρέπει να ληφθούν υπόψη. Ως εκ τούτου, το τελικό αποτέλεσμα αυτών των διπλών ρυθμιστικών επιδράσεων τουδιοσμίνηστο COMνεφρόΟ σχηματισμός λίθων χρειάζεται περαιτέρω in vivo διερεύνηση και προοπτική μελέτη μεγάλης κοόρτης.
5. Συμπεράσματα
Συνοπτικά, αναφέρουμε εδώ τις διπλές επιδράσεις της διοσμίνης στη διαμόρφωση των κρυστάλλων COM με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Ενώ αναστέλλει την ανάπτυξη κρυστάλλων COM, την προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων και την εσωτερίκευση στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα,διοσμίνηπροωθεί την κρυστάλλωση, τη συγκέντρωση και την εισβολή COM μέσω του ECM. Ως εκ τούτου, ο ρόλος του κατά της ουρολιθίασης είναι αμφίβολος και πρέπει να ληφθούν προφυλάξεις για τη χρήση του σε πέτρες στα νεφρά.
Δήλωση συνεισφοράς συγγραφής CRediT
Supaporn Khamchun: Εννοιολόγηση, Μεθοδολογία, Λογισμικό, Επικύρωση, Τυπική ανάλυση, Διερεύνηση, Επιμέλεια δεδομένων, Συγγραφή – πρωτότυπο προσχέδιο, Οπτικοποίηση, Sunisa Yoodee: Εννοιολόγηση, Μεθοδολογία, Λογισμικό, Επικύρωση, Τυπική ανάλυση, Διερεύνηση, Επιμέλεια δεδομένων, Συγγραφή – πρωτότυπο προσχέδιο, Οπτικοποίηση, Επίσκεψη στο Thongboonkerd: Εννοιολόγηση, Μεθοδολογία, Λογισμικό, Επικύρωση, Πόροι, Συγγραφή – αναθεώρηση και επεξεργασία, Επίβλεψη, Διαχείριση Έργου, Απόκτηση Χρηματοδότησης.
Δήλωση σύγκρουσης συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ΟΧΙ σύγκρουση συμφερόντων.
Ευχαριστίες
Είμαστε ευγνώμονες για την τεχνική βοήθεια της Kittiya Suwannakud. Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Συμβούλιο Πολιτικής Έρευνας και Καινοτομίας για την Επιστήμη της Ανώτατης Εκπαίδευσης (NXPO) μέσω του PMU-B και του Ταμείου Έρευνας της Ταϊλάνδης (IRN60W0004). Το VT υποστηρίζεται επίσης από το Grant "Chalermphrakiat", Faculty of Medicine Siriraj Hospital.
βιβλιογραφικές αναφορές
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– τεχνικές απομόνωσης, προσδιορισμός σε φυτικό υλικό και φαρμακευτικά σκευάσματα και κλινική χρήση, Nat. Κέντρο. Commun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Μεταβολισμός και φαρμακολογικές δραστηριότητες της φυσικής ένωσης διοσμίνης που είναι ευεργετική για την υγεία, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: αξιολόγηση των επιπτώσεων στην ποιότητα ζωής στη χρόνια φλεβική ανεπάρκεια, Angiology 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Micronised purified flavonoid fraction: μια ανασκόπηση της χρήσης του σε χρόνια φλεβική ανεπάρκεια, φλεβικά έλκη και αιμορροΐδες, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Αντιφλεγμονώδης, η αντιοξειδωτική και αντι-αποπτωτική δράση της διοσμίνης στην ελκώδη κολίτιδα που προκαλείται από οξικό οξύ, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin καταστέλλει τους προφλεγμονώδεις μεσολαβητές σε μακροφάγους RAW264.7 που προκαλούνται από λιποπολυσακχαρίτες μέσω οδών σήματος NF-kappaB και MAPKs, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin επάγουν απόπτωση μέσω διαμόρφωσης της σηματοδότησης STAT-3 στο 7,12 dimethylbenz(a)anthracene inducer βλαβερών παρειακών σακουλών καρκινογένεσης, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmin-induced senescence, απόπτωση και αυτοφαγία σε καρκινικά κύτταρα του μαστού διαφορετικής κατάστασης p53 και δραστηριότητας ERK, Toxicol. Κάτοικος της Λατβίας. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Συνδυασμός επαναχρησιμοποιημένου φαρμάκου διοσμίνης με αμοξικιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ προκαλεί συνεργιστική αναστολή της ανάπτυξης μυκοβακτηριδίων, Sci. Απ. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Η αντιυπεργλυκαιμική δράση της διοσμίνης, ενός φλαβονοειδούς εσπεριδοειδών, επάγεται μέσω της ενδογενούς βήτα-ενδορφίνης σε διαβητικούς αρουραίους τύπου Ι, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminη προκαταρκτική θεραπεία βελτιώνει την καρδιακή λειτουργία και καταστέλλει το οξειδωτικό στρες στην καρδιά του αρουραίου μετά από ισχαιμία/επαναιμάτωση, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin προστατεύει τον αμφιβληστροειδή αρουραίων από τραυματισμό ισχαιμίας/επαναιμάτωσης, J. Ocul. Pharm. Εκεί. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Προστατευτικές επιδράσεις της εσπεριδίνης και της διοσμίνης έναντι του ήπατος, των νεφρών που προκαλούνται από ακρυλαμίδιο, και οξειδωτική βλάβη του εγκεφάλου σε αρουραίους, Environ. Sci. Ρύπανση. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, Κανόνας AD, Καθορισμός του πραγματικού βάρουςνεφρόνόσος των λίθων, Nat. Αιδ. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nephrolithiasis, Prim. Care 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Renal stones, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Σύνθεση λίθων και αγγειακές ασβεστώσεις σε ασθενείς με νεφρολιθίαση, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Stone analysis, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Απόκριση νεφρικών σωληναριακών κυττάρων σε διαφορικούς τύπους και δόσεις κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου: ολοκληρωμένη ανάλυση δικτύου πρωτεώματος και λειτουργικές έρευνες, Proteomics 19 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Ανάλυση δικτύου πρωτεΐνης και λειτουργικές μελέτες κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από κρυστάλλους οξαλικού ασβεστίου σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρικών σωληναριακών, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Νεφρολιθίαση: μοριακός μηχανισμός σχηματισμού νεφρικών λίθων και ο κρίσιμος ρόλος που παίζουν οι διαμορφωτές, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mechanisms of stone formation, Clin. Αναθ. Bone Miner. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Protective roles of flavonoids and flavonoid-rich plant extracts against urolithiasis: a review, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Dietary plants for the prevention and management ofνεφρόλίθοι: προκλινικά και κλινικά στοιχεία και μοριακόι μηχανισμοί, Int. J. ΜοΙ. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, The mechanistic insight of polyphenols in calcium oxalate urolithiasis mitigation, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Evaluation of protective effect of diosmin (a citrus flavonoid) in chemical-induced urolithiasis in πειραματικοί αρουραίοι, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminμειώνει την εναπόθεση οξαλικού ασβεστίου και τον εκφυλισμό των ιστών στη νεφρολιθίαση σε αρουραίους: μια στερεολογική μελέτη, Κορεάτης J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Παράγοντες που καθορίζουν τους τύπους και τις μορφολογίες των κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου: μοριακές συγκεντρώσεις, ρυθμιστικό διάλυμα, pH, ανάδευση και θερμοκρασία, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Proteomic analysis of calcium oxalate monohydrate-induced crystal-induced cytotoxicity in distal renal tubular κύτταρα, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Συντελεστής επιμήκυνσης Tu on Escherichia coli που απομονώνεται από τα ούρα ασθενών με πέτρες στα νεφρά προάγει την ανάπτυξη και τη συσσώρευση κρυστάλλων του οξαλικού ασβεστίου, Sci. Απ. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Modulatory effect of fibronectin on οξαλικό ασβέστιο κρυστάλλωση, ανάπτυξη, συσσωμάτωση, προσκόλληση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και εισβολή μέσω εξωκυτταρικής μήτρας, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Καθορισμός και συστηματική ανάλυση των δεικτών συσσωμάτωσης για την αξιολόγηση του βαθμού συσσωμάτωσης κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου, Εμπρός. Chem. 5 (2017) 113.
[33] Οι R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum είναι υπεύθυνοι για την προώθηση των επιδράσεων της βιώσιμης Escherichia coli στην κρυστάλλωση του οξαλικού ασβεστίου, την ανάπτυξη των κρυστάλλων και τη συσσωμάτωση κρυστάλλων, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Differential bond proteins and adhesive capabilities of calcium oxalate monohydrate crystals with διάφορα μεγέθη, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 χρησιμεύει ως δυνητικός υποδοχέας για κρύσταλλο οξαλικού ασβεστίου στην κορυφαία μεμβράνη των νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Μη ραδιενεργή επισήμανση κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου για έρευνες αλληλεπίδρασης και εσωτερίκευσης κρυστάλλου-κυττάρου, Anal. Methods 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Οι κρύσταλλοι μονοένυδρου οξαλικού ασβεστίου που εσωτερικεύονται σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα αποικοδομούνται και διαλύονται από τα ενδολυσοσώματα, Chem. Biol. Αλληλεπιδρώ. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Μια νέα δοκιμασία για την αξιολόγηση των επιδράσεων προώθησης των πρωτεϊνών στην εισβολή κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου μέσω εξωκυτταρικής μήτρας με βάση τη δραστηριότητα πλασμινογόνου/πλασμίνης, Talanta 101 (2012) 240-245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Οι κρύσταλλοι οξαλικού ασβεστίου αύξησαν την έκκριση ενολάσης-1 από νεφρικά σωληναριακά κύτταρα που στη συνέχεια ενίσχυσαν την εισβολή κρυστάλλων και μονοκυττάρων μέσω του νεφρικού διάμεσου ιστού, Sci. Απ. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Η μακροπινοκύττωση είναι ο κύριος μηχανισμός για την ενδοκυττάρωση των κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: μια βάση δεδομένων γιανεφρόρυθμιστικές πρωτεΐνες λίθων με πειραματικά στοιχεία, Sci. Απ. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, The effect of diosmin on aflatoxin-induced liver and νεφρική βλάβη, Environ. Sci. Ρύπανση. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Συγκριτική βιοδιαθεσιμότητα δύοδιοσμίνησκευάσματα μετά από χορήγηση από το στόμα σε υγιείς εθελοντές, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Pharmacokinetics of flavanone glycosides after ingesting of single doses of fres-squeezed χυμού πορτοκαλιού έναντι του εμπορικά επεξεργασμένου χυμού πορτοκαλιού σε υγιείς ανθρώπους, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Synthesis of glycoside παράγωγα της υδροξυανθρακινόνης με ικανότητα διάλυσης και αναστολής του σχηματισμού κρυστάλλων του οξαλικού ασβεστίου. Πιθανές ενώσεις στη θεραπεία πέτρας στα νεφρά, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Study of a myo-inositol hexaphosphate-cream to prevent dystrophic calcinosis cutis, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Πρωτεομική των αλληλεπιδράσεων κρυστάλλου-κυττάρου: ένα μοντέλο για την έρευνα για τις πέτρες στα νεφρά, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Κατακράτηση κρυστάλλων στη νόσο των νεφρικών λίθων: ένας κρίσιμος ρόλος για την υαλουρονική γλυκοζαμινογλυκάνη; Μαρμελάδα. Soc. Nephrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Microvillar τραυματισμός σε νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα που προκαλούνται από κρύσταλλο οξαλικού ασβεστίου και ο προστατευτικός ρόλος της επιγαλλοκατεχίνης, FASEB J. 31 (2017) –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Total flavonoids of Desmodium styracifolium attenuates the formation of hydroxy- Ουρολιθίαση οξαλικού ασβεστίου που προκαλείται από L-προλίνη σε αρουραίους, Urolithiasis 46 (2018) 231-241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Συστηματική αξιολόγηση για επιδράσεις του pH ούρων στην κρυστάλλωση οξαλικού ασβεστίου, προσκόλληση κρυσταλλικών κυττάρων και εσωτερίκευση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, Sci. Απ. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Ανασταλτική επίδραση στη φαγοκυττάρωση του Candida albicans που προκαλείται από προεπεξεργασία με κερκετίνη μέσω παρεμβολής κυτταροσκελετών ακτίνης, J. Tradit. Πηγούνι. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin αναστέλλει τη μετανάστευση μακροφάγων που προκαλείται από LPS καταστέλλοντας την οδό iNOS/FAK/παξιλλίνη και ρυθμίζοντας τον κυτταροσκελετό, τις κυτταρικές προσκολλήσεις . Μετανάστης 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Η ανακύκλωση μεμβράνης με τη μεσολάβηση μακροπινοκυττάρωσης οδηγεί τη μετανάστευση της νευρικής κορυφής παρέχοντας F- ακτίνη στο φυλλίδιο, Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, The F-actin-binding RapGEF GflB is απαραίτητη για αποτελεσματική μακροπινοκύττωση στο Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalence, pathophysiological μηχανισμοί και παράγοντες που επηρεάζουν την ουρολιθίαση, Int. Urol. Nephrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Μηχανισμοί σχηματισμού λίθων στα νεφρά, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία καινεφρόπέτρινη νόσος, Εμπρός. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Ιστολογικές πτυχές του μοντέλου "σταθερού σωματιδίου" σχηματισμού λίθων: μελέτες σε ζώα, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Πώς σχηματίζονται οι πέτρες; Είναι δυνατή η ενοποίηση των θεωριών για το σχηματισμό λίθων; Αψίδα. Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Μέθοδοι για τη μελέτη της κρυστάλλωσης οξαλικού ασβεστίου και η εφαρμογή τους στην έρευνα για την ουρολιθίαση, Scanning Microsc. 6 (1992) 685-704, συζήτηση 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Κινητική κρυστάλλωσης οξαλικού ασβεστίου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ανθρώπινων και τεχνητών ούρων, με σταθερή αναλογία ασβεστίου προς οξαλικό, Urol. Res. 27 (1999) 231-237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, κρυσταλλουρία και συσσωμάτωση: βασικά συστατικά για τη μεγέθυνση λίθων, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissov, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverse engineering the کلیه: modeling calcium oxalate monohydrate crystallization in the nephron, Med. Biol. Eng. Υπολογιστής. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Η επίδραση της ενδοκρυσταλλικής και επιφανειακά δεσμευμένης οστεοποντίνης στην προσκόλληση κρυστάλλων διένυδρου οξαλικού ασβεστίου σε κύτταρα σκύλου Madin-Darby (MDCK) σε υπερδιηθημένα ανθρώπινα ούρα, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
