Γιατί το Responder1 του υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος μπορεί να προάγει την ανάπτυξη σπειραματικών παθήσεων;

Το Responder1 του υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος προάγει την ανάπτυξη σπειραματικών ασθενειών μέσω της οδού σηματοδότησης του πυρηνικού παράγοντα-kB

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Mo¨ller-Hackbarth1,2, Dina Dabaghie1,2, Emmanuelle Charrin1,2, Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3, Xidan Li1,3, Annika Wernerson4, Mark Lal5 και Jaakko Patrakka1,2

1 Ολοκληρωμένο Καρδιομεταβολικό Κέντρο KI/AZ, Ινστιτούτο Karolinska στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Karolinska, Huddinge, Στοκχόλμη, Σουηδία. 2 Τμήμα Εργαστηριακής Ιατρικής, Τομέας Παθολογίας, Ινστιτούτο Karolinska στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Karolinska, Huddinge, Στοκχόλμη, Σουηδία. 3 Τμήμα Ιατρικής Huddinge, Karolinska Institutet at Karolinska University Hospital, Huddinge, Στοκχόλμη, Σουηδία. 4 Τμήμα Κλινικών Επιστημών, Παρέμβασης και Τεχνολογίας, Τμήμα Νεφρικής Ιατρικής, Ινστιτούτο Karolinska, Στοκχόλμη, Σουηδία. και 5 Bioscience Renal, Research, and Early Development Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Γκέτεμποργκ, Σουηδία

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Πνευματικά δικαιώματα ª 2021, International Society of Nephrology. Δημοσιεύτηκε από την Elsevier Inc. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης με την άδεια CC BY

Αλληλογραφία: Jaakko Patrakka, Department of Laboratory Medicine, Division of Pathology, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Σουηδία. E-mail: jaakko.patrakka@ki.se Λήψη 27 Ιουλίου 2020. αναθεωρήθηκε στις 11 Μαΐου 2021· αποδεκτό στις 20 Μαΐου 2021· δημοσιεύθηκε διαδικτυακά στις 18 Ιουνίου 2021

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: σπειραματικόενδοθηλιακό κύτταρο; NF-kB; ποδοκύτταρο; Rarres1

Οι φλεγμονώδεις οδοί ενεργοποιούνται στα περισσότερασπειραματικά νοσήματααλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που τα οδηγούν στον νεφρικό ιστό είναι ελάχιστα γνωστοί. Ταυτιστήκαμερετινοϊκό οξύανταποκριτής υποδοχέα 1 (Rarres1) ως πρωτεΐνη υψηλά εμπλουτισμένη σε ποδοκύτταρα σε υγιείς νεφρούς. Μελέτες σε ζώα νοκ-άουτ ειδικά για τα ποδοκύτταρα έδειξαν ότι το Rarres1 δεν χρειαζόταν για την κανονική ανάπτυξη ή διατήρηση του φραγμού διήθησης του σπειράματος και δεν τροποποίησε την έκβαση της νεφρικής νόσου σε ένα μοντέλο σπειραματονεφρίτιδας. Είναι ενδιαφέρον ότι εντοπίσαμε επαγωγή έκφρασης Rarres1 σε σπειραματικά και περισωληνάρια τριχοειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα σε IgA και διαβητική νεφρική νόσο, καθώς και σε αγγειίτιδα που σχετίζεται με το ANCA. Η ανάλυση των διαθέσιμων στο κοινό συνόλων δεδομένων RNA έδειξε ότι η επαγωγή της έκφρασης Rarres1 ήταν ένας κοινός μοριακός μηχανισμός σε χρόνιες νεφρικές παθήσεις. Μια υπό όρους knock-in γραμμή ποντικιού, που υπερέκφραζε το Rarres1 ειδικά σε ενδοθηλιακά κύτταρα, δεν έδειξε εμφανή φαινότυπο νεφρού. Ωστόσο, η υπερέκφραση προώθησε την εξέλιξη της νεφρικής βλάβης σε ένα μοντέλο σπειραματονεφρίτιδας. Σύμφωνα με αυτό, τα ποντίκια υπό όρους knock-out, που δεν είχαν Rarres1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα, προστατεύτηκαν μερικώς στο μοντέλο της νόσου. Μηχανιστικά, το Rarres1 προώθησε τη φλεγμονή και την ίνωση μέσω της οδού σηματοδότησης του παράγοντα μεταγραφής Nuclear Factor-kB ενεργοποιώντας τον υποδοχέα κινάσης τυροσίνης Axl. Έτσι, η επαγωγή της έκφρασης Rarres1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ένας διαδεδομένος μοριακός μηχανισμός στις ανθρώπινες σπειραματοπάθειες και αυτό φαίνεται να έχει παθογόνο ρόλο στην πρόκληση φλεγμονής και ίνωσης μέσω της οδού σηματοδότησης του πυρηνικού παράγοντα-kB.

Μεταφραστική δήλωση

Εντοπίσαμε την ανοδική ρύθμιση τουρετινοϊκό οξύπρωτεΐνη ανταπόκρισης υποδοχέα 1 (Rarres1) σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs) κοινών ανθρώπινων σπειραματοπαθειών. Η επαγωγή φαίνεται να έχει παθογόνο ρόλο σεσπειραματική ασθένειακαθώς η εξέλιξη της σπειραματονεφρίτιδας (i) επιδεινώθηκε σε ένα ποντίκι που υπερέκφραζε το Rarres1 ειδικά σε EC, και (ii) βελτιώθηκε σε μια ειδική για την EC γραμμή νοκ-άουτ Rarres1. Το Rarres1 μπορεί να είναι ένας βιοδείκτης για την ανίχνευση μικροαγγειακής βλάβης σε νεφρικές παθήσεις και ενδεχομένως ένας νέος θεραπευτικός στόχος.

Σπειραματική νόσοςδιεργασίες αποτελούν κύρια αιτία νεφρικής νόσου τελικού σταδίου. Η διαβητική νεφροπάθεια (DN) είναι παγκοσμίως η πιο κοινή αιτία νεφρικής νόσου τελικού σταδίου, ενώ η IgA νεφροπάθεια (IgAN) είναι η πιο επικρατούσα πρωτοπαθής σπειραματονεφρίτιδα (GN).1,2 Ιστολογικά, η σπειραματική βλάβη σε αυτές τις κοινές διαταραχές εκδηλώνεται με πολύ παρόμοια μόδα. Αυτό περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των σπειραματικών ενδοθηλιακών κυττάρων (GECs), την επέκταση της εξωκυτταρικής μήτρας, τον πολλαπλασιασμό των μεσαγγειακών κυττάρων, την καταστροφή των ποδοκυττάρων και τελικά την απώλεια των ποδοκυττάρων.3

Οι παγκόσμιες μελέτες προφίλ μεταγραφής σε βιοψίες νεφρού ανθρώπου έχουν δείξει ισχυρή φλεγμονώδη υπογραφή σε σπειραματικές διαταραχές,4-7 και μελέτες σε ποντίκια έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα-kB (NF-kB) και του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-b (TGF-b) Οι οδοί σηματοδότησης έχουν σημαντικούς ρόλους στην εξέλιξη της νόσου.8,9 Είναι σημαντικό ότι η φαρμακευτική στόχευση της οδού NF-kB έχει επαναπροστατευτικά αποτελέσματα σε ζωικά μοντέλα, υποδεικνύοντας ότι η οδός είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπείασπειραματικά νοσήματα.10,11 Στα ποδοκύτταρα, εντοπίσαμε πρόσφατα συζευγμένο με πρωτεΐνη G υποδοχέα κατηγορίας C ομάδας 5 μέλος Β ως ρυθμιστή της φλεγμονώδους απόκρισης με τη μεσολάβηση NF-kB.12 Ωστόσο, η ενεργοποίηση φλεγμονωδών οδών σε σπειραματοπάθειες πιθανώς καθοδηγείται από πολλούς τύπους κυττάρων . Στην πραγματικότητα, η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης NF-kB ανιχνεύεται σε GECs σε πολλές ασθένειες των ανθρώπινων νεφρών.13,14 Οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του NF-kB στα GECs είναι ελάχιστα κατανοητοί.

Το Responder1 του υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος μπορεί να προάγει την ανάπτυξη τουΣπειραματικά Νοσήματα

Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε τις μοριακές υπογραφές του ανθρώπουσπειραματικά νοσήματακαι προσδιόρισε την επαγωγή τουρετινοϊκό οξύΈκφραση του αποκρινόμενου υποδοχέα 1 (Rarres1) σε GECs ως κοινή μοριακή υπογραφή σε αγγειίτιδα που σχετίζεται με DN, IgAN και αντι-ουδετεροφιλικό κυτταροπλασματικό αυτοαντίσωμα (ANCA). Μελέτες σε σειρές ποντικών με ενεργοποίηση/απενεργοποίηση της έκφρασης Rarres1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs) καταδεικνύουν ότι αυτή η επαγωγή έχει παθογόνο ρόλο σε ένα μοντέλο ποντικού GN. Μηχανιστικά, το Rarres1 ενεργοποιεί τον υποδοχέα κινάσης τυροσίνης Axl, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης NF-kB. Προτείνουμε το Rarres1 ως νέο βιοδείκτη μικροαγγειακής βλάβης που μπορεί να είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος γιασπειραματική ασθένειαδιεργασίες ρυθμίζοντας τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις.

Εικόνα 1|(Συνέχεια) (γ) Ανάλυση BackSPIN που δείχνει έκφραση Rarres1 ειδικά σε ποδοκύτταρα (PD) σε δεδομένα RNAseq ιστού νεφρού ποντικού (δεδομένα από Woroniecka et al.6). (δ) Σχετικά επίπεδα mRNA του Rarres1 σε απομονωμένα Tub και Glom από ανθρώπινα δείγματα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως αναδίπλωση της έκφρασης Rarres1 στο Glom σε σύγκριση με το Tub. *P < 0.05="" έναντι="" tub.="" (ε)="" αντιπροσωπευτική="" ομοεστιακή="" φθορίζουσα="" μικροσκοπική="" εικόνα="" fl="" της="" έκφρασης="" rarres1="" (πράσινη)="" από="" ποδοκύτταρα="" σε="" ανθρώπινα="" σπειράματα="" από="" φυσιολογικά="" άτομα.="" (στ)="" αντιπροσωπευτικές="" ομοεστιακές="" μικροσκοπικές="" εικόνες="" που="" δείχνουν="" την="" έκφραση="" του="" rarres1="" σε="" ποδοκύτταρα="" από="" ανθρώπινα="" υποκείμενα.="" η="" βιμεντίνη="" χρησιμοποιήθηκε="" ως="" δείκτης="" για="" τις="" κύριες="" διεργασίες="" και="" η="" νεφρίνη="" ως="" δείκτης="" για="" τις="" διεργασίες="" στα="" πόδια="" των="" ποδοκυττάρων.="" το="" cd31="" χρησιμοποιήθηκε="" ως="" δείκτης="" για="" τα="" ενδοθηλιακά="" κύτταρα="" και="" η="" ακτίνη="" ⍺="" λείου="" μυός="" (⍺sma)="" χρησιμοποιήθηκε="" ως="" δείκτης="" μεσαγγειακών="" κυττάρων.="" μπάρες="50/10" χλστ.="" τα="" δεδομένα="" εκφράζονται="" ως="" μέσοι="" όροι="" ±="" sem.="" χρησιμοποιήθηκε="" το="" t-test="" του="" student="" για="" συγκρίσεις="" μεταξύ="" 2="" ομάδων.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

ΜΕΘΟΔΟΙ

Εκχύλιση RNA και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο

Τα σπειράματα απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Το 15 RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol (Invitrogen) και κιτ RNeasy (Qiagen Inc.). Το iScript cDNA Synthesis Kit χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία cDNA. Η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System με SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Οι χρησιμοποιούμενοι εκκινητές παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-DDCT.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – πλασμίδιο (VectorBuilder Inc. Οι κλώνοι έχουν επεκταθεί υπό την επιλογή πουρομυκίνης (Merck KGaA). Η επιμόλυνση βραχείας παρεμβολής RNA (siRNA) για Axl/Rarres1 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας siRNA από Origene. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30M siRNA ακολουθούμενη από συμπλοκοποίηση με αντιδραστήριο επιμόλυνσης JetPEI (Polyplus-transfection SA) με ή χωρίς ερεθίσματα TGF-b1 (10 ng/ml σε μέσο καλλιέργειας) Ο αναστολέας Axl R428 (Selleck Chemicals) προστέθηκε 1 ώρα πριν από τη θεραπεία (3 mmol/ μεγάλο).

Γιατί το Responder1 του υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος μπορεί να προάγει την ανάπτυξη τουΣπειραματικά νοσήματα;

Western blot

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολής πρωτεάσης/φωσφατάσης (Roche). Πρωτεΐνες από πυρηνικά κλάσματα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ Nuclear Extract (Active Motif Europe). Τα προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν σε γέλη δωδεκυλοθειικού νατρίου τρις-γλυκίνης 4% -12% (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Bio-Rad). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού (Merck). Η επώαση με πρωτογενή αντισώματα διεξήχθη όλη τη νύχτα (αντισώματα στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2). Για την ανίχνευση σημάτων χρησιμοποιήθηκαν δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου και υπόστρωμα Clarity Western ECL (Bio-Rad). Οι αναλύσεις στυπώματος Western πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

Υβριδισμός RNA in situ

Οι αναλύσεις RNAscope πραγματοποιήθηκαν σε ανθρώπινα νεφρά ενσωματωμένα σε παραφίνη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (ACD). Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν NPHS1 - Cat No. 416071-C2, PECAM1 - Cat No. 487381-C3 και RARRES1 - προσαρμοσμένα νουκλεοτίδια στόχευσης ανιχνευτών {{8 }}.

Εκτίμηση νεφρικής βλάβης

Η αναλογία λευκωματίνης ούρων και κρεατινίνης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ELISA Mouse Albumin (Allbuwell M, Ethos Biosciences) και το κιτ QuantiChrom Creatinine Assay (BioAssay Systems). Οι ιστοί των νεφρών στερεώθηκαν σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 10 τοις εκατό και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, ακολουθούμενο από κοπή και χρώση με περιοδικό οξύ-Schiff. Πραγματοποιήθηκε ηλεκτρονική μικροσκοπία σε δείγματα σταθεροποιημένα σε 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη.

Ανοσοχρώσεις

Οι ιστοί ενσωματωμένοι σε παραφίνη σταθεροποιήθηκαν για 24 ώρες σε φορμαλίνη. Τομές πέντε μικρομέτρων αποπαραφινώθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μικροκύματα είτε σε ρυθμιστικό διάλυμα τρις-αιθυλενοδιαμίνης τετραοξικού οξέος (10 mM βάσης Tris, 1 mM ρυθμιστικό διάλυμα αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος, 0.05 τοις εκατό Tween. 20, pH 9.0) ή ρυθμιστικό κιτρικό νάτριο (10 mM κιτρικό νάτριο, 0,05 τοις εκατό Tween 20, pH 6,0), ακολουθούμενο από διαπερατότητα με 0,3 τοις εκατό Triton X-100 και αποκλεισμένο με 10 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας, 3 τοις εκατό υπεροξειδάση υδρογόνου και το Vector Blocking Kit (Vector Laboratories). Οι διαφάνειες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ υποστρώματος υπεροξειδάσης DAB (υπεροξειδάση χρένου), 3,30 -διαμινοβενζιδίνη (Vector Laboratories).

Για κατεψυγμένες τομές, οι τομές σταθεροποιημένες με ακετόνη ήταν διαπερατές με 0.1 τοις εκατό Tween 20 και μπλοκαρίστηκαν με 10 τοις εκατό κανονικό ορό κατσίκας. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Τα δευτερεύοντα αντισώματα Alexa-Fluor για ανοσοφθορισμό ελήφθησαν από Molecular Probes (Life Technologies). Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το συνεστιακό μικροσκόπιο Leica SP8 (Leica Microsystems).

Ανθρώπινα δείγματα

Λήφθηκαν βιοψίες νεφρού από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Karolinska (Στοκχόλμη, Σουηδία). Δείγματα ελέγχου ελήφθησαν από τους υγιείς πόλους των νεφρών ατόμων που υποβλήθηκαν σε νεφρεκτομή όγκου. Η τοπική επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε τη μελέτη (αρ. έγκρισης 2010/579-31/1, Στοκχόλμη, Σουηδία).

έναντι ελέγχου (Ctrl.) ή ***P < {{0}}.001="" έναντι="" si-αρνητικού="" ελέγχου="" (κωδικοποίηση)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (γ)="" αντιπροσωπευτικά="" έγγραφα="" western="" blot="" και="" συνοπτικά="" δεδομένα="" που="" δείχνουν="" τα="" σχετικά="" επίπεδα="" πρωτεΐνης="" του="" pp65="" σε="" απομονωμένα="" πυρηνικά="" κλάσματα="" ποδοκυττάρων="" που="" υποβλήθηκαν="" σε="" επεξεργασία="" με="" 10="" ng/ml="" tgf-b1.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" έναντι="" των="" ποδοκυττάρων="" ελέγχου="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (δ)="" αντιπροσωπευτικά="" έγγραφα="" western="" blot="" και="" συνοπτικά="" δεδομένα="" που="" δείχνουν="" τα="" σχετικά="" επίπεδα="" πρωτεΐνης="" του="" pp65="" σε="" απομονωμένα="" πυρηνικά="" κλάσματα="" ποδοκυττάρων="" που="" υποβλήθηκαν="" σε="" επεξεργασία="" με="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±3="" mmol/l="" r428,="" n="2." (ε)="" αντιπροσωπευτικό="" στύπωμα="" western="" που="" δείχνει="" ότι="" η="" υπερέκφραση="" του="" rarres1="" ενεργοποιεί="" το="" axl="" συστατικά.="" *p="">< 0,05="" (n="2)." (στ)="" σχετικά="" επίπεδα="" mrna="" γονιδίων="" που="" σχετίζονται="" με="" emt="" σε="" ποδοκύτταρα="" που="" υπερεκφράζουν="" rarres1="" (rarres1)="" ή="" ποδοκύτταρα="" ελέγχου="" (ctrl.)="" επιμολυνθέντα="" με="" sirna="" για="" axl="" (siaxl),="" si-αρνητικό="" έλεγχο="" (scramble),="" ##p=""><0,01, ##="" #p="">< 0,001="" έναντι="" αναμετάδοσης,="" n="3" ή="" υποβλήθηκε="" σε="" επεξεργασία="" με="" 3="" mmol/l="" r428.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" έναντι="" ctrl.,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" έναντι="" rarres1,="" *p=""><0,05 έναντι="" rarres1,="" n="4." τα="" δεδομένα="" εκφράζονται="" ως="" μέσοι="" όροι="" ±="" sd.="" χρησιμοποιήθηκε="" το="" τεστ="" t="" student="" για="" συγκρίσεις="" μεταξύ="" 2="" ομάδων.="" ut,="" χωρίς="">

Εικόνα 3|Καθιέρωση ποντικών Rarres1 knockout (CreD/Rarres1flfl/flfl) ειδικών για τα ποδοκύτταρα. (α) Δημιουργία ποντικών με νοκ-άουτ υπό όρους στα οποία το Rarres1 αφαιρείται ειδικά στα ποδοκύτταρα χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασυνδυασμού Cre-LoxP. Το Exon 3 διαγράφεται στον ανασυνδυασμό NPHS2-Cre-mediated. (β) Ο προσδιορισμός του γονότυπου επιβεβαιώθηκε με παρασκευή ουράς και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε ηλικία 4 εβδομάδων. (Συνεχίζεται)

Εικόνα 3|(Συνέχεια) (γ) Αντιπροσωπευτικό στύπωμα Western που δείχνει τη μειωμένη έκφραση του Rarres1 σε απομονωμένα σπειράματα από ποντίκια Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) ειδικά για τα ποδοκύτταρα. (δ) Η ειδική για τα ποδοκύτταρα απώλεια του Rarres1 δεν επηρεάζει τα επίπεδα λευκωματουρίας σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με νεφροτοξικό ορό (NTS) όπως αναλύθηκε με βάση την αναλογία λευκωματίνης προς κρεατινίνη ούρων σε διαφορετικές ομάδες ποντικών (NTS-ctrl., n {{1{{{ 15}}}}–7, NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (ε) Φωτομικρογραφίες και ποσοτικοποιήσεις που δείχνουν τυπικές αλλαγές στη σπειραματική δομή σε διαφορετικές ομάδες ποντικών. Οι σπειραματικές βλάβες αναγνωρίστηκαν σε τομές που χρωματίστηκαν με περιοδικό οξύ-Schiff. #P < 0.0001="" έναντι="" ελέγχου="" χωρίς="" επεξεργασία="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (στ)="" αντιπροσωπευτικές="" μικροφωτογραφίες="" και="" ποσοτικοποιήσεις="" του="" μέσου="" πάχους="" της="" σπειραματικής="" βασικής="" μεμβράνης="" (gbm)="" και="" του="" αριθμού="" των="" σχισμών="" ανά="" mm="" gbm="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών="" με="" αναλύσεις="" ηλεκτρονικής="" μικροσκοπίας="" μετάδοσης.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001,="" ####p="">< 0,0001="" έναντι="" μη="" επεξεργασμένου="" ελέγχου="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." τα="" δεδομένα="" εκφράζονται="" ως="" μέσοι="" όροι="" ±="" sem.="" η="" μονόδρομη="" ανάλυση="" διακύμανσης="" ακολουθούμενη="" από="" το="" μετα-τεστ="" του="" tukey="" για="" πολλαπλές="" συγκρίσεις="" χρησιμοποιήθηκε="" για="" ομάδες="" 3="" ή="" περισσότερων.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

Γραμμές ποντικιού

Τα Floxed Rarres1 ποντίκια με φόντο C57Bl/6J (Rarres1flfl/flfl, Cyagen) ήταν ποδοκίνη (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) και ποντίκια Tie2 cre (B6.Cg-Tg( Tek-cre)12Flv/J) για τη δημιουργία ποντικών νοκ-άουτ ειδικά για κύτταρα. Τα ποντίκια GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J διασταυρώθηκαν με μια γραμμή Tie2-cre για να ενεργοποιηθεί η έκφραση Rarres1 ειδικά σε ECs.17 Η αναπαραγωγή και ο γονότυπος έγιναν σύμφωνα με τα πρότυπα διαδικασίες. Όλες οι μελέτες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σε Προκλινικό Εργαστήριο (Ινστιτούτο Karolinska) σύμφωνα με τις σχετικές οδηγίες και κανονισμούς και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας για την Ερευνητική Φροντίδα Ζώων (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336).

Νεφροπάθεια που προκαλείται από νεφροτοξικό ορό (NTS) σε ποντίκια

Τα ποντίκια ηλικίας επτά έως 9-εβδομάδων έλαβαν 50 ml Πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund (Merck), ακολουθούμενο από ένεση NTS (iv; 6 ml/kg σωματικού βάρους· Probetex Inc.) την ημέρα 4.18 Συλλέχθηκαν ούρα 3, 7 , 10 και 14 ημέρες μετά την ένεση και τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα 14.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism 9.{1}} (GraphPad).

Τα δεδομένα εξετάστηκαν αρχικά για κανονικότητα (δοκιμή Shapiro-Wilk). Όταν η κατανομή ήταν Gaussian, τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα παραμετρικό τεστ (Student's t-test για 2 ομάδες και ανάλυση διακύμανσης με το post-test Tukey για περισσότερες από 2 ομάδες). Όταν η κατανομή δεν ήταν Gaussian, χρησιμοποιήθηκαν μη παραμετρικές δοκιμές (δοκιμή Friedman με μετα-δοκιμή Dunn για περισσότερες από 2 ομάδες και δοκιμή Mann-Whitney U για 2 ομάδες). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν P <>

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Το Rarres1 εκφράζεται από τα ποδοκύτταρα

Αρχικά αξιολογήσαμε το πρότυπο έκφρασης του Rarres1 σε ιστό νεφρού ποντικού και ανθρώπου. Οι αναλύσεις αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης έδειξαν ότι το Rarres1 εκφράζεται σημαντικά υψηλότερα στο σπειραματικό από ό,τι στο σωληναρισιακό κλάσμα του νεφρικού φλοιού ποντικού (Εικόνα 1a και b6). Η ανάλυση αλληλουχίας RNA μονοκυττάρου ιστού νεφρού ποντικού αποκάλυψε ότι το Rarres1 εκφράζεται αποκλειστικά από τα ποδοκύτταρα (Εικόνα 1c). Στους ανθρώπους, το Rarres1 εμπλουτίστηκε επίσης σε σπειραματικό ιστό (Εικόνα 1δ). Στον ανοσοφθορισμό φυσιολογικού ανθρώπινου νεφρικού ιστού, το Rarres1 έδειξε υψηλό σήμα στα σπειράματα (Εικόνα 1e). Οι διπλές χρώσεις έδειξαν ότι το Rarres1 βρισκόταν «εκτός» της αντιδραστικότητας της νεφρίνης στους τριχοειδείς βρόχους, υποδηλώνοντας έκφραση των ποδοκυττάρων (Εικόνα 1στ). Ο εντοπισμός με βιμεντίνη έδειξε εντοπισμό σε κύριες διεργασίες. Δεν παρατηρήθηκε επικαλυπτόμενη αντιδραστικότητα για τον δείκτη EC CD31 ή τον μεσαγγειακό δείκτη -ακτίνη λείου μυός (Εικόνα 1στ).

Το Rarres1 προάγει τη σηματοδότηση NF-kB και TGF-b1 μέσω του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης Axl

Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος του Rarres1 στα ποδοκύτταρα, χειριστήκαμε τα επίπεδα έκφρασής του σε απαθανατισμένα ανθρώπινα ποδοκύτταρα.16 Τα επίπεδα Rarres1 αυξήθηκαν σημαντικά σε ποδοκύτταρα σταθερά διαμολυνθέντα με ανθρώπινο cDNA Rarres1 και ρυθμίστηκαν προς τα κάτω μετά από επιμόλυνση με Rarres{{5}στόχευσης siRNA (Εικόνα 2α). Η υπερέκφραση του Rarres1 ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση, ενώ η καθοδική ρύθμιση του ενδογενούς Rarres1 είχε το αντίθετο αποτέλεσμα (Εικόνα 2β). Καθώς η σηματοδότηση NF-kB έχει σημαντικό ρόλο στην επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση που οδηγεί σε ίνωση και φλεγμονή στο GN,19 μετρήσαμε την επαγόμενη από το TGF-b1 ενεργοποίηση σηματοδότησης NF-kB in vitro. Η υπερέκφραση Rarres1 προκάλεσε αυξημένη ενεργοποίηση της οδού NF-kB κατά την έναρξη και μετά από διέγερση του TGF-b1 (Εικόνα 2γ). Καθώς το Rarres1 έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιεί τον υποδοχέα κινάσης τυροσίνης Axl και με αυτόν τον τρόπο προάγει το μονοπάτι σηματοδότησης NF-kB στον φλεγμονώδη καρκίνο του μαστού20, αξιολογήσαμε εάν το Axl είναι ένας πιθανός λειτουργικός συνεργάτης του Rarres1 στον νεφρικό ιστό. Η επαγόμενη από το TGF-b1 ενεργοποίηση NF-kB θα μπορούσε να ανασταλεί από τον R428, έναν εκλεκτικό μικρομοριακό αναστολέα της κινάσης Axl21,22 (Εικόνα 2d) και η υπερέκφραση του Rarres1 συσχετίστηκε θετικά με τη συστατική ενεργοποίηση της Axl κινάσης (Εικόνα 2). Η εξάντληση της δραστικότητας του Axl με το R428 αλλά όχι η γονιδιακή σίγαση του Axl από το siRNA θα μπορούσε να μειώσει την επαγόμενη από το Rarres1-προκαλούμενη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση, όπως αποδεικνύεται από μειωμένα επίπεδα mRNA (Εικόνα 2στ). Αξίζει να σημειωθεί, ότι δεν ανιχνεύθηκε ενεργοποίηση μη κανονικών μονοπατιών NF-kB (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Έτσι, το Rarres1 προώθησε τη σηματοδότηση NF-kB σε καλλιεργημένα ποδοκύτταρα μέσω ενεργοποίησης της κινάσης Axl.

Γιατί το Responder1 του υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος μπορεί να προάγει την ανάπτυξη σπειραματικών παθήσεων;

Η απενεργοποίηση του Rarres1 στα ποδοκύτταρα δεν οδηγεί σε σπειραματικές ανωμαλίες ούτε ρυθμίζει την έκβαση της νεφροπάθειας σε ένα μοντέλο GN κατά της βασικής μεμβράνης (GBM)

Για να αναλύσουμε τον ρόλο του Rarres1 στα ποδοκύτταρα in vivo, δημιουργήσαμε μια νέα γραμμή ποντικιού Rarres1flfl/flfl (απλωμένη) και τη διασταυρώσαμε με ποντίκια podocin-Cre για να παράγουμε ποντίκια Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) (Εικόνα 3α ). Οι γονότυποι για τα αλληλόμορφα φλοξ/Cre ταυτοποιήθηκαν με γονότυπο του αυτιού (Εικόνα 3β). Η ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης των σωληναριδικών και σπειραματικών κλασμάτων, καθώς και του ηπατικού ιστού, επιβεβαίωσε τη διαγραφή του εξονίου 3 ειδικά στο σπείραμα (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A) και τα επίπεδα πρωτεΐνης Rarres1 μειώθηκαν στα σπειράματα από ποντίκια Creþ/Rarres1flfl/flure (Εικόνα 3γ).

Εικόνα 4|Ανοδική ρύθμιση του Rarres1 σε σπειραματικά και περισωληνάρια τριχοειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα σε ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο. (α) Αναλύσεις της έκφρασης γονιδίων Rarres1, κολλαγόνου1a2 (COL1A2) και νεφρίνης (NPHS1) σε δεδομένα μικροσυστοιχιών σπειραμάτων που απομονώθηκαν από ασθενείς με διαβητική νεφροπάθεια (DN), αγγειίτιδα, IgA νεφροπάθεια (IgAN) και άτομα ελέγχου (Ctrl.). 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" έναντι="" θεμάτων="" ελέγχου.="" (β)="" ποσοτική="" ανάλυση="" αλυσιδωτής="" αντίδρασης="" πολυμεράσης="" για="" τα="" γονίδια="" rarres1,="" col1a2="" και="" nphs1="" σε="" απομονωμένα="" σπειράματα="" από="" ασθενείς="" με="" dn="" (n="5)" και="" ελέγχους="" (n="5)." **p="">< 0.01,="" ***p=""><0.001 έναντι="" των="" υποκειμένων="" ελέγχου.="" (γ)="" αναλύσεις="" της="" έκφρασης="" των="" γονιδίων="" rarres1="" και="" col1a2="" σε="" δεδομένα="" μικροσυστοιχίας="" σωληνοειδούς="" κλάσματος="" που="" απομονώθηκαν="" από="" ασθενείς="" με="" dn,="" αγγειίτιδα,="" igan="" και="" ελέγχους.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001 έναντι="" των="" ατόμων="" ελέγχου.="" (δ)="" αντιπροσωπευτικές="" μικροφωτογραφίες="" της="" ανοσοϊστοχημικής="" χρώσης="" rarres1="" σε="" ανθρώπινο="" νεφρικό="" ιστό="" φλοιού="" από="" μάρτυρες="" και="" ασθενείς="" με="" dn="" (n="" {="5)," αντι-ουδετερόφιλο="" κυτταροπλασματικό="" αυτοαντίσωμα="" (anca)="" αγγειίτιδα="" (n="4)" και="" igan="" (="" n="5)." τα="" βέλη="" υποδεικνύουν="" θετικά="" ποδοκύτταρα="" σπανίων1-(μάρτυρας)="" και="" ενδοθηλιακά="" κύτταρα="" (ecs)="" (dn,="" igan="" και="" αγγειίτιδα).="">

Εικόνα 4|(Συνέχεια) (ε) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν την έκφραση του Rarres1 σε σπειράματα ασθενών με DN. Το CD31 χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για ECs. Μπάρες=50/10 χλστ. (στ) Αντιπροσωπευτικές συνεστιακές εικόνες φθορισμού FL του RNAscope που δείχνουν έκφραση γονιδίου Rarres1 σε κύτταρα που συνεκφράζουν PECAM1-στο σωληναριακό κλάσμα ασθενών με DN. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι±SEM. Χρησιμοποιήθηκε το t-test του student για συγκρίσεις μεταξύ 2 ομάδων. Μπάρες=50/10 χλστ. Για να βελτιστοποιήσετε την προβολή αυτής της εικόνας, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου στη διεύθυνση www.kidney-international.org.

Τα ποντίκια Creþ/Rarres1flfl/flfl γεννήθηκαν με την αναμενόμενη αναλογία κληρονομικότητας του Μεντελίου και ήταν βιώσιμα και γόνιμα (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Τα νεφρά δεν διακρίνονταν από τα γέννα ελέγχου (Cre-/Rarres1flfl/flfl) όπως αναλύθηκε με συνηθισμένη μικροσκοπική εξέταση φωτός και ηλεκτρονίων (Συμπληρωματικό Σχήμα S2B και C). Επίσης, η κατανομή των πρωτεϊνών των ποδοκυττάρων νεφρίνη και συναπτοποδίνη δεν επηρεάστηκε σε ποντίκια Creþ/ Rarres1flfl/flfl (Συμπληρωματικό Σχήμα S2D)

Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος του Rarres1 στη νεφρική βλάβη in vivo, οι Creþ/Rarres1flfl/flfl υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NTS που οδηγεί σε εναποθέσεις IgG στο GBM, λευκωματουρία και προοδευτική GN.23 Τα επίπεδα λευκωματουρίας ήταν παρόμοια τόσο στο Creþ/Rarres1flfl/flfl όσο και στον έλεγχο ποντίκια (Εικόνα 3δ). Η οπτική μικροσκοπική εξέταση δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην αναλογία των προσβεβλημένων σπειραμάτων (Εικόνα 3e). Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο δεν έδειξε διαφορά στο πάχος της εξάλειψης της διαδικασίας GBM ή του ποδιού και τα GEC φάνηκαν να επηρεάζονται παρόμοια και στις δύο ομάδες (Εικόνα 3στ). Οι δείκτες ποδοκυττάρων νεφρίνη, Wt1 και συναπτοποδίνη επηρεάστηκαν με παρόμοιο τρόπο και στις δύο ομάδες (Συμπληρωματικό Σχήμα S3A). Επίσης, η χρώση για ECs χρησιμοποιώντας CD31 δεν έδειξε διαφορές στα σπειράματα ή στα περισωληνάρια τριχοειδή μεταξύ των ομάδων (Συμπληρωματικό Σχήμα S3B και C). Επιπλέον, η έκφραση της ίνωσης και των γονιδίων που σχετίζονται με τη φλεγμονή ήταν παρόμοια αυξημένη και στις δύο ομάδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NTS (Συμπληρωματικό Σχήμα S4).

Η έκφραση Rarres1 προκαλείται σε σπειραματικά και περισωληνάρια τριχοειδικά ECs σε χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ)

Για να διερευνήσουμε τον ρόλο του Rarres1 στη ΧΝΝ, αναλύσαμε την έκφρασή του σε δημόσια διαθέσιμα σύνολα δεδομένων RNA. Παρατηρήσαμε σημαντικά αυξημένα επίπεδα Rarres1 σε σπειράματα που απομονώθηκαν από ασθενείς με DN, σχετιζόμενη με ANCA αγγειίτιδα και IgAN (Εικόνα 4α), 4,6,24-26 ενώ άλλα γονίδια που σχετίζονται με τα ποδοκύτταρα, για παράδειγμα, η νεφρίνη, ήταν σημαντικά μειωμένα ή αμετάβλητα . Η ποσοτική μας ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης των σπειραμάτων που απομονώθηκαν από ασθενείς με DN (n=5) επικύρωσε την επαγωγή της έκφρασης Rarres1 (Εικόνα 4β). Λόγω της απώλειας των ποδοκυττάρων, η έκφραση των γονιδίων των ποδοκυττάρων συνήθως μειώνεται προοδευτικάσπειραματικά νοσήματα,6 και η αναλογία της σπειραματικής έκφρασης Rarres1 προς τη νεφρίνη αυξήθηκε κατά περίπου 20- φορές σε DN έναντι υγιών σπειραμάτων (Εικόνα 4β). Η έκφραση του Rarres1 ρυθμίστηκε επίσης προς τα πάνω σε σύνολα δεδομένων σωληνοειδούς διάμεσου ιστού σε DN, αγγειίτιδα που σχετίζεται με ANCA και IgAN (Εικόνα 4c).8–11

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την έκφραση του Rarres1 ανοσοϊστοχημικά σε βιοψίες νεφρών από ασθενείς με DN (n ¼ 5), IgAN (n ¼ 5) και αγγειίτιδα που σχετίζεται με ANCA (n ¼ 4). Στα άρρωστα σπειράματα, η χρώση Rarres1 φάνηκε να εντοπίζεται στα GECs όπως φαίνεται από την ανοσοαντιδραστικότητα στην εσωτερική επιφάνεια των τριχοειδών τοιχωμάτων (Εικόνα 4δ, ένθετα), ενώ το σήμα από τα ποδοκύτταρα φαινόταν ασθενέστερο. Στον ενδιάμεσο σωληνάριο, η χρώση ανιχνεύθηκε στα περισωληνάρια τριχοειδή αγγεία (Εικόνα 4δ, ένθετα), υποδηλώνοντας έκφραση ΕΚ. Η διπλή ανοσοσήμανση με CD31 επικύρωσε τον εντοπισμό σε ECs τόσο στα σπειράματα όσο και στα περισωληνάρια τριχοειδή αγγεία (Εικόνα 4e). Ομοίως, πειράματα διπλού RNAscope έδειξαν τον εντοπισμό του Rarres1 mRNA με PECAM1 mRNA σε DN (Εικόνα 4f). Συνολικά, η επαγωγή της έκφρασης Rarres1 σε σπειραματικά και περισωληνάρια τριχοειδικά ΕΚ ήταν ένα κοινό φαινόμενο στη ΧΝΝ.

Δημιουργία και χαρακτηρισμός μιας γραμμής ποντικιού που υπερεκφράζει το Rarres1 σε ECs

Καθώς το Rarres1 προκαλείται στην ανθρώπινη ΚΝΝ, δημιουργήσαμε μια νέα διαγονιδιακή γραμμή ποντικού στην οποία το Rarres1 cDNA εισήχθη στον τόπο Rosa26 κάτω από τον προαγωγέα CAG,27 με μια κασέτα lox-STOP-lox μεταξύ των θέσεων αποδέκτη ματίσματος (Εικόνα 5α). Η γραμμή διασταυρώθηκε με μια γραμμή Tie2-cre για να δημιουργηθούν ποντίκια Rarres1_Tie2_ΚΙ και τα ποντίκια ταυτοποιήθηκαν με γονότυπο αυτιού για αλληλόμορφα knockin και Cre (Εικόνα 5α). Τα ποντίκια Rarres1_Tie2_KI εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης Rarres1 στον νεφρικό ιστό (Εικόνα 5β) και η επιτυχημένη στρατηγική knockin επικυρώθηκε περαιτέρω με ανάλυση της έκφρασης mRNA Rarres1 σε GFP-θετικό με ταξινόμηση FACS GECs (Εικόνα 5γ).

Φαινοτυπώσαμε τους νεφρούς των ποντικών Rarres1_Tie2_ΚΙ και των ποντικών ελέγχου σε ομάδες που ταιριάζουν με την ηλικία. Με οπτική μικροσκοπική εξέταση, η μορφολογία των νεφρών ήταν δυσδιάκριτη σε ποντίκια Rarres1_Tie2_KI από συγγενείς μάρτυρες (Εικόνα 5δ). Ομοίως, το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έδειξε αμετάβλητο πάχος GBM και πλάτος διεργασίας ποδιού ποδοκυττάρου (Εικόνα 5e). Επιπλέον, η έκφραση των δεικτών ποδοκυττάρων νεφρίνη και συναπτοποδίνη φαινόταν ανεπηρέαστη στα υπερεκφραζόμενα σπειράματα Rarres1 (Εικόνα 5στ). Αξίζει να σημειωθεί ότι άλλα κύρια όργανα δεν εμφάνισαν μακροσκοπικά ή μικροσκοπικά εμφανείς ανωμαλίες (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

Εικόνα 5|Δημιουργία ποντικών Rarres1 knockin (Rarres{3}}Tie2_KI) ειδικών για τα ενδοθηλιακά κύτταρα. (α) Μια γενιά ποντικών knockin υπό όρους στα οποία η έκφραση Rarres1 επάγεται ειδικά σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs) χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασυνδυασμού Cre-LoxP. Tie2-Τα ποντίκια Cre διασταυρώθηκαν με ποντίκια που εκφράζουν το διάνυσμα στόχευσης (Rarres1_κασέταþ), που περιείχε μια κασέτα lox-STOP-lox μεταξύ του ματίσματος (συνέχεια)

Εικόνα 5|(συνέχεια) οι θέσεις δέκτη και το Rarres1 cDNA κάτω από τον προαγωγέα CAG, ο οποίος εισήχθη στον τόπο Rosa26, ταυτοποιήθηκαν με γονότυπο του αυτιού. Ο προσδιορισμός του γονότυπου επιβεβαιώθηκε με παρασκευή αυτιού και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) σε ηλικία 4 εβδομάδων. (β) Αντιπροσωπευτικό στύπωμα Western που δείχνει την αυξημένη έκφραση του Rarres1 στον νεφρικό φλοιό από ποντίκια Rarres1 knockin (Rarres{7}}Tie2_KI) ειδικά για EC. **P < 0.01="" έναντι="" ελέγχου="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" δοκιμή).="" (γ)="" ποσοτική="" pcr="" για="" το="" rarres1="" σε="" απομονωμένα="" ecs.="" **p="">< 0,01="" έναντι="" ελέγχου="" (cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="3," student's="" t-test).="" (δ)="" αντιπροσωπευτικές="" μικροφωτογραφίες="" τμημάτων="" χρωματισμένων="" με="" περιοδικό="" οξύ-schiff="" που="" δείχνουν="" τυπικές="" σπειραματικές="" δομές="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών.="" (ε)="" αντιπροσωπευτικές="" μικροφωτογραφίες="" και="" ποσοτικοποιήσεις="" του="" μέσου="" πάχους="" της="" σπειραματικής="" βασικής="" μεμβράνης="" (gbm)="" και="" του="" αριθμού="" των="" σχισμών="" ανά="" mm="" gbm="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών="" με="" αναλύσεις="" ηλεκτρονικής="" μικροσκοπίας="" μετάδοσης="" (student's="" t-test).="" (στ)="" αντιπροσωπευτικές="" ομοεστιακές="" μικροσκοπικές="" εικόνες="" που="" δείχνουν="" την="" έκφραση="" του="" ειδικού="" για="" τα="" ποδοκύτταρα="" δείκτη="" συναπτοποδίνης="" και="" νεφρίνης="" σε="" ειδικά="" ec="" ποντίκια="" rarres1="" knock-in="" (rarre1_tie2_ki)="" και="" ctrl.="" ποντίκια.="" μπάρες="10" χλστ.="" τα="" δεδομένα="" εκφράζονται="" ως="" μέσοι="" όροι="" ±="" sem.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

Η επαγωγή του Rarres1 σε EC ρυθμίζει την οδό σηματοδότησης NF-kB και την έκβαση της νεφροπάθειας ρυθμίζοντας την ενεργοποίηση του Axl

Για να αξιολογήσουμε εάν η έκφραση Rarres1 στα ECs ρυθμίζει την εξέλιξη της νόσου, επαγάγαμε το GN σε διαγονιδιακά ποντίκια και τα συγγενή τους με μία μόνο ένεση NTS. Τα ποντίκια Rarres1_- Tie2_KI ανέπτυξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα λευκωματουρίας από τους ελέγχους μετά από 3 ημέρες, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην λευκωματουρία στις 7, 10 και 14 ημέρες (Εικόνα 6α). Η ιστολογική ανάλυση 14 ημέρες μετά την επαγωγή έδειξε ότι τα ποντίκια Rarres1_Tie2_KI δεν είχαν περισσότερες σπειραματικές αλλοιώσεις, όπως σκληρωτικές και ημισελήνους αλλοιώσεις (Εικόνα 6β). Η ηλεκτρονική μικροσκοπική αξιολόγηση έδειξε, ωστόσο, ένα σημαντικά παχύτερο GBM και μεγαλύτερη εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού σε ποντίκια Rarres1_Tie2_KI (Εικόνα 6γ). Επιπλέον, τα ποντίκια Rarres1_Tie2_KI εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα ακτίνης λείων μυών στον φλοιό των νεφρών (Εικόνα 6δ). Η ανάλυση των δεικτών ποδοκυττάρων νεφρίνη, συναπτοποδίνη και WT1 έδειξε μια βαθιά μείωση που υποδηλώνει αποδιαφοροποίηση και σημαντική απώλεια ποδοκυττάρων (Εικόνα 6δ). Είναι σημαντικό ότι τα σπειράματα του Rarres1_Tie2_KI έδειξαν λιγότερα WT1-θετικά ποδοκύτταρα σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι το Rarres1 που εκφραζόταν σε EC προήγαγε βλάβη των ποδοκυττάρων. Επίσης, περισσότεροι θρόμβοι ινώδους ανιχνεύθηκαν στα σπειράματα Rarres1_Tie2_KI (Εικόνα 6e). Σύμφωνα με αυτό, η έκφραση διαφορετικών γονιδίων που σχετίζονται με φλεγμονή, ίνωση και νεφρική σωληναριακή βλάβη ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω σε ποντίκια Rarres{1_- Tie2_KI όπως φαίνεται από ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο για Il -1βήτα, Col1a1, TGF-b1 και μόριο νεφρικής βλάβης-128 σε ιστό νεφρικού φλοιού (Εικόνα 6στ). Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές στις τιμές αζώτου ουρίας αίματος και S-κρεατινίνης μεταξύ των ομάδων (Εικόνα 6g). Επίσης, η χρώση για ECs χρησιμοποιώντας CD31 δεν έδειξε διαφορές στα σπειράματα ή στα περισωληνάρια τριχοειδή μεταξύ των ομάδων (Συμπληρωματικό Σχήμα S5A και B). Συνολικά, η ειδική για EC επαγωγή της έκφρασης Rarres1 επιδείνωσε τη σπειραματική παθολογία σε νεφροπάθεια που προκαλείται από NTS.

Μηχανιστικά, αναλύσαμε εάν η υπερέκφραση Rarres1 σε EC προώθησε την ενεργοποίηση της σηματοδότησης Axl και NF-kB in vivo, παρόμοια με τις in vitro παρατηρήσεις μας (Εικόνα 2). Τόσο τα ποντίκια Rarres1_Tie2_KI και τα ποντίκια ελέγχου που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NTS εμφάνισαν ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Axl όπως φαίνεται από την αυξημένη φωσφορυλίωση Axl (Εικόνα 6h). Ωστόσο, αυτή η ενεργοποίηση ήταν πιο σημαντική σε ποντίκια Rarres1_- Tie2_KI (Εικόνα 6h). Αντίστοιχα, η ενεργοποίηση της οδού NF-kB προωθήθηκε σε αυτά τα ποντίκια, όπως φαίνεται από τον αριθμό των θετικών πυρήνων pP στα σπειράματα (Εικόνα 6i). Όταν τα επίπεδα pP65 μετρήθηκαν με στύπωμα Western, εντοπίσαμε μια παρόμοια τάση για την ενεργοποίηση της οδού NF-kB, αν και αυτό δεν ήταν σημαντικό, πιθανώς λόγω μιας ακραίας τιμής (Συμπληρωματικό Σχήμα S5C).

Η αδρανοποίηση του Rarres1 σε ECs μειώνει τη σπειραματική βλάβη στο μοντέλο σπειραματονεφρίτιδας anti-GBM

Για να επικυρώσουμε τον παθογόνο ρόλο του Rarres1 που προέρχεται από EC στη ΧΝΝ, δημιουργήσαμε μια γραμμή ποντικιού στην οποία το Rarres1 διαγράφηκε σε EC χρησιμοποιώντας το Tie2-Cre (Εικόνα 7α). Οι γονότυποι για τα αλληλόμορφα floxed και Cre ταυτοποιήθηκαν με γονότυπο του αυτιού (Εικόνα 7β). Υπήρχε μια τάση για ανοδική ρύθμιση του Rarres1 σε ποντίκια που έλαβαν NTS, η οποία καταργήθηκε στα ποντίκια Rarres{1_Tie2_KO (Εικόνα 7γ). Τα ποντίκια δεν εμφάνισαν εμφανείς νεφρικές ανωμαλίες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ένεση NTS προκάλεσε παρόμοια λευκωματουρία στο Rarres1_Tie2_KO και στους ελέγχους (Εικόνα 7δ). Ωστόσο, η ιστολογική ανάλυση 14 ημέρες μετά την επαγωγή έδειξε λιγότερες σπειραματικές αλλοιώσεις σε ποντικούς Rarres{1_- Tie2_KO (Εικόνα 7e). Στην ηλεκτρονική μικροσκοπία, τα ποντίκια Rarres1_Tie2_KO παρουσίασαν μικρότερη εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού και πάχυνση του GBM (Εικόνα 7στ). Η ανοσοχρώση δεν έδειξε σημαντικές διαφορές για aSMA, νεφρίνη ή συναπτοποδίνη (Εικόνα 7g). Ωστόσο, ο αριθμός των WT1-θετικών ποδοκυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερος στα ποντίκια Rarres{1_Tie2_KO (Εικόνα 7g). Η χρώση για το pP65 έδειξε μειωμένο αριθμό θετικών πυρήνων στα σπειράματα Rarres1_Tie{2_KO υποδηλώνοντας τη συμμετοχή της οδού σηματοδότησης NF-kB (Εικόνα 7h).

Εικόνα 6|(συνέχεια) ποσοτικοποίηση του μέσου πάχους της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (GBM) και του αριθμού των σχισμών ανά mm GBM σε διαφορετικές ομάδες ποντικών με τομές ανάλυσης ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=12). (δ) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν τις εκφράσεις της νεφρίνης, της συναπτοποδίνης, της ακτίνης ⍺ λείων μυών (⍺Sma) και του WT1 στο νεφρό από διαφορετικές ομάδες ποντικών. Μπάρες {{10}}/10 χλστ. Η ⍺Sma-θετική περιοχή μετρήθηκε ανά διατομή του φλοιού και η WT1 μετρήθηκε ανά σπειράμα (Ctrl., n {= 2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Ισο2_KI, n {{20}}). (ε) Παρουσία θρόμβων ινώδους στα σπειράματα όπως ανιχνεύεται με χρώση τριχώματος (μετράται ανά σπειραματική διατομή) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Ισο2_ΚΙ, ν=5). (στ) Σχετικά επίπεδα mRNA διαφορετικών γονιδίων που σχετίζονται με φλεγμονή, ίνωση και νεφρική σωληναριακή βλάβη στον νεφρικό φλοιό ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NTS (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10· NTS-Rarres1_Ισο2_KI, n=6–10). (ζ) Επίπεδα κρεατινίνης ορού και αζώτου ουρίας αίματος (BUN) σε NTS-ctrl. (n=3) και NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3) ποντίκια. (η) Αντιπροσωπευτικά έγγραφα Western blot και συνοπτικά δεδομένα που δείχνουν τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του Paxil στον νεφρικό φλοιό σε διαφορετικές ομάδες ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NTS (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Ισοπαλία2_KI, n=5). (i) Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες ανοσοϊστοχημικής χρώσης pP65 σε ιστό νεφρικού φλοιού από διαφορετικές ομάδες ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NTS. pP65-θετικοί πυρήνες ανά σπειράματα ποσοτικοποιήθηκαν στις διαφορετικές ομάδες ποντικών (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). Ειδικά EC Rarres1 knock-in ποντίκια (Rarres1_Tie2_KI ποντίκια); ποντίκια με κασέτα Rarres1 και χωρίς έκφραση Cre (Ctrl.) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. #P < 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" έναντι="" μη="" επεξεργασμένου="" μάρτυρα="" (ctrl.),="" *p="">< 0,05="" έναντι="" ελέγχου="" που="" έχει="" υποστεί="" επεξεργασία="" με="" nts="" (nts-ctrl.).="" τα="" δεδομένα="" εκφράζονται="" ως="" μέσοι="" όροι="" ±="" sem.="" χρησιμοποιήθηκε="" το="" t-test="" του="" student="" για="" συγκρίσεις="" μεταξύ="" 2="" ομάδων.="" η="" μονόδρομη="" ανάλυση="" διακύμανσης="" ακολουθούμενη="" από="" το="" μετα-τεστ="" του="" tukey="" για="" πολλαπλές="" συγκρίσεις="" χρησιμοποιήθηκε="" για="" ομάδες="" 3="" ή="" περισσότερων.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Το Rarres1 αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά σε καλλιέργειες δερματικών σχεδίων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ταζαροτένη29 και έχει αποδειχθεί ότι δρα ως καταστολέας εισβολής σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. . Αναλυτικά, το Rarres1 σταθεροποιεί το Axl αναστέλλοντας την εξαρτώμενη από πρωτεάσωμα αποδόμηση του Axl. Επιπλέον, η εξάντληση του Rarres1 στα κύτταρα SUM149 μειώνει την έκφραση του Axl και απενεργοποιεί το NF-kB, οδηγώντας σε μειωμένη εισβολή των φλεγμονωδών καρκινικών κυττάρων του μαστού. προτείνεται σε ένα μοντέλο ίνωσης πνεύμονα αρουραίου και κατά τη διάρκεια της ινωτικής ενεργοποίησης των ηπατικών αστερικών κυττάρων.31 Συνολικά, προηγούμενες in vitro μελέτες υποδηλώνουν ένα ρόλο για το Rarres1 στην ίνωση, τη φλεγμονή και την εισβολή του καρκίνου.

Αρχικά, το Rarres1 κέντρισε το ενδιαφέρον μας καθώς ήταν ιδιαίτερα εμπλουτισμένο σε κύτταρα ποδοκυττάρων. Θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι το Rarres1 προήγαγε φλεγμονώδη και πλεονασματική σηματοδότηση στα ποδοκύτταρα μέσω της ενεργοποίησης της οδού NF-kB με τη μεσολάβηση Axl. Από την άλλη πλευρά, τα ζώα νοκ-άουτ ειδικά για τα ποδοκύτταρα απέτυχαν να δείξουν καμία προφανή διαφορά σε σύγκριση με τους μάρτυρες υπό υγιείς συνθήκες καθώς και σε ένα μοντέλο ποντικού GN. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε αντισταθμιστικούς μηχανισμούς καθώς η οδός σηματοδότησης NF-kB ρυθμίζεται από έναν αριθμό μορίων και βιολογικών διεργασιών.

Το μοριακό προφίλ ασθενών με διαβήτη έδειξε ότι το Rarres1 προκλήθηκε σε σπειραματικά και περισωληνάρια τριχοειδικά ECs στο DN. Είναι σημαντικό ότι η έκφραση Rarres1 δεν ανιχνεύθηκε σε ΕΚ σε διαβητικούς ασθενείς χωρίς νεφροπάθεια. Ως εκ τούτου, εικάζουμε ότι το Rarres1 θα μπορούσε να είναι ένας νέος δείκτης για τη διαβητική μικροαγγειακή νόσο και οι μελέτες σε δείγματα πλάσματος και ούρων ενδείκνυνται για τη διερεύνηση της σκοπιμότητας του Rarres1 ως μη επεμβατικού βιοδείκτη. Προσδιορίσαμε την επαγωγή του Rarres1 επίσης σε ασθενείς με IgAN και αγγειίτιδα. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι το Rarres1 έχει παθογόνο ρόλο σε αυτές τις σπειραματοπάθειες και συμβάλλει στην εξέλιξη της νόσου. Λειτουργικά, δείξαμε ότι η επαγωγή του Rarres1 στα ECs αύξησε τη νεφρική βλάβη σε ένα μοντέλο ποντικού GN, ενώ η απενεργοποίηση του Rarres1 σε ECs βελτίωσε τον τραυματισμό. Η φαινοτυπική ανάλυση έδειξε ότι τα ποδοκύτταρα επηρεάστηκαν σε ποντικούς που υπερέκφραζαν το Rarres1 σε ECs. Αυτό μπορεί να είναι μια άμεση επίδραση του Rarres1 στα ποδοκύτταρα καθώς έχει περιγραφεί μια διαλυτή μορφή του Rares.32 Εναλλακτικά, ο τραυματισμός των ποδοκυττάρων μπορεί να είναι δευτερογενής ως προς τη βλάβη του φραγμού διήθησης του σπειράματος.

Προηγουμένως, η ενεργοποίηση του ενδοθηλίου NF-kB είχε αποδειχθεί ότι παίζει παθογόνο ρόλο στην ανάπτυξη νεφρικής νόσου στην αγγειίτιδα.13 Σημειωτέον, η αναστολή της ενδοθηλιακής οδού NF-kB σε ένα μοντέλο μισοφέγγαρου GN ακύρωσε την εξέλιξη. Οι αναστολείς Axl έχουν αποδειχθεί ότι είναι ωφέλιμοι στην πειραματική νεφρίτιδα κατά της GBM. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τον πιο εκλεκτικό αναστολέα μικρού μορίου, το R428, έδειξαν σημαντική διατήρηση της νεφρικής λειτουργίας και μειωμένη φλεγμονώδη παραγωγή κυτοκίνης.33 Αυτό δείχνει ότι η οδός θα μπορούσε να είναι μια θεραπευτική επιλογή γιασπειραματική ασθένειαδιαδικασίες. Ωστόσο, καθώς τόσο το Axl όσο και το NF-kB διαμορφώνουν έναν αριθμό διαφορετικών κυτταρικών διεργασιών σε όλο το σώμα, είναι απίθανο να είναι καλός υποψήφιος για φαρμακευτική στόχευση στη ΧΝΝ. Το Rarres1 μπορεί να παρέχει έναν στόχο που σχετίζεται περισσότερο με τα νεφρά.

Το Tie2-Cre έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί την έκφραση σε έναν υποπληθυσμό αιμοποιητικών κυττάρων.34 Ορισμένα από αυτά τα κύτταρα ενδέχεται να ρυθμίζουν τη φλεγμονώδη απόκριση στο μοντέλο που προκαλείται από NTS και επομένως δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι το Rarres1 που προέρχεται από αιμοποιητικά κύτταρα συμβάλλει στην εξέλιξη της νόσου στις γραμμές Tie2-Cre. Ωστόσο, καθώς δεν εντοπίσαμε κάποια εμφανή έκφραση Rarres1 σε διεισδυτικά ανοσοκύτταρα, πιστεύουμε ότι αυτό είναι λιγότερο πιθανό.

Ενώ αυτό το χειρόγραφο ήταν υπό προετοιμασία, ο Chen et al.32 ανέφερε μια διαλυτή μορφή του Rarres1 που προάγεισπειραματική ασθένειαπροχώρηση. Εντόπισαν, παρόμοια με εμάς, την ανοδική ρύθμιση του Rarres1 σε κοινές ανθρώπινες σπειραματικές ασθένειες. Η μελέτη υποστηρίζει το εύρημα μας ότι μια αυξημένη έκφραση Rarres1 συσχετίζεται με μείωση της νεφρικής λειτουργίαςανθρώπινη σπειραματική ασθένεια. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η ανοδική ρύθμιση του Rarres1 οφειλόταν στην υπερέκφραση στα ποδοκύτταρα. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε αυτή την πιθανότητα, αλλά εντοπίσαμε σε ανθρώπινες ασθένειες μια ξεχωριστή επαγωγή της έκφρασης Rarres1 σε ECs. Ένας μηχανισμός που εξηγεί τα ευρήματά μας θα μπορούσε να είναι ότι η διαλυτή μορφή του Rarres1 που παράγεται από τα ποδοκύτταρα προσλαμβάνεται από τα GECs. Ωστόσο, τα αποτελέσματα ότι εντοπίσαμε το Rarres1 mRNA σε ECs με in situ υβριδισμό και ότι το Rarres1 προκλήθηκε επίσης σε περισωληνάρια τριχοειδών ECs υποστηρίζουν έντονα την ιδέα ότι η έκφραση του Rarres1 σε νεφρικές παθήσεις είναι κυρίως ενδοθηλιακής προέλευσης.

Εικόνα 7|Η ειδική για το ενδοθηλιακό αφαίρεση του Rarres1 εξασθενεί τη νεφρική βλάβη σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με νεφροτοξικό ορό (NTS). (α) Δημιουργία ποντικών με νοκ-άουτ υπό όρους στα οποία το Rarres1 αφαιρείται ειδικά σε ενδοθηλιακά κύτταρα χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασυνδυασμού Cre-LoxP. Το Exon 3 διαγράφεται στον ανασυνδυασμό Tie2-Cre-mediated. (β) Ο γονότυπος επιβεβαιώθηκε με προετοιμασία ουράς και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης στο (συνέχεια)

Εικόνα 7|(συνέχεια) ηλικίας 4 εβδομάδων. (γ) Αντιπροσωπευτικά έγγραφα Western blot και συνοπτικά δεδομένα που δείχνουν τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του Rarres1 στον νεφρικό φλοιό σε διαφορετικές ομάδες ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NTS (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Δέστε2_KO, n=4) και ποντίκια χωρίς θεραπεία (Control [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (δ)="" uacr="" (αναλογία="" λευκωματίνης="" ούρων="" προς="" κρεατινίνη)="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών="" σε="" θεραπεία="" με="" nts="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}-8).="" (ε)="" φωτομικρογραφίες="" και="" ποσοτικοποιήσεις="" που="" δείχνουν="" τυπικές="" αλλαγές="" στη="" σπειραματική="" δομή="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών.="" οι="" σπειραματικές="" βλάβες="" αναγνωρίστηκαν="" σε="" τομές="" χρωματισμένες="" με="" περιοδικό="" οξύ-schiff="" (ctrl.,="" n="3·" έλεγχος="" με="" θεραπεία="" με="" nts="" [nts-ctrl.],="" n="12·" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (στ)="" αντιπροσωπευτικές="" μικροφωτογραφίες="" και="" ποσοτικοποιήσεις="" του="" μέσου="" πάχους="" της="" σπειραματικής="" βασικής="" μεμβράνης="" (gbm)="" και="" του="" αριθμού="" των="" σχισμών="" ανά="" mm="" gbm="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών="" με="" τομές="" ανάλυσης="" ηλεκτρονικής="" μικροσκοπίας="" μετάδοσης="" (ctrl.,="" n="6·" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="16)." (ζ)="" αντιπροσωπευτικές="" ομοεστιακές="" μικροσκοπικές="" εικόνες="" που="" δείχνουν="" τις="" εκφράσεις="" της="" νεφρίνης,="" της="" συναπτοποδίνης,="" της="" ακτίνης="" των="" λείων="" μυών="" (sma)="" και="" του="" wt1="" στο="" νεφρό="" από="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών.="" ράβδοι="50/10" χλστ.="" η="" θετική="" σε="" sma="" περιοχή="" μετρήθηκε="" ανά="" διατομή="" του="" φλοιού="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (η)="" αντιπροσωπευτικές="" μικροφωτογραφίες="" ανοσοϊστοχημικής="" χρώσης="" pp65="" σε="" ιστό="" νεφρικού="" φλοιού="" από="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών="" που="" έλαβαν="" nts.="" pp65-θετικοί="" πυρήνες="" ανά="" σπειράματα="" ποσοτικοποιήθηκαν="" στις="" διαφορετικές="" ομάδες="" ποντικών="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0,001="" έναντι="" ctrl="" χωρίς="" επεξεργασία,="" *p="">< 0,05="" έναντι="" nts-ctrl.="" τα="" δεδομένα="" εκφράζονται="" ως="" μέσοι="" όροι±="" sem.="" χρησιμοποιήθηκε="" το="" t-test="" του="" student="" για="" συγκρίσεις="" μεταξύ="" 2="" ομάδων.="" η="" μονόδρομη="" ανάλυση="" διακύμανσης="" ακολουθούμενη="" από="" το="" μετα-τεστ="" του="" tukey="" για="" πολλαπλές="" συγκρίσεις="" χρησιμοποιήθηκε="" για="" ομάδες="" 3="" ή="" περισσότερων.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

Υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη που πρέπει να αναγνωριστούν. Πρώτον, in vitro μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σε ποδοκύτταρα, ενώ in vivo χειριστήκαμε την έκφραση σε ECs. Επομένως, δεν μπορούμε να συνδέσουμε απευθείας το Rarres1 με την ενεργοποίηση του Axl σε EC. Δεύτερον, ενώ μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε μια επαγόμενη από το Rarres1- (εξαρτώμενη από το Axl) ενεργοποίηση της σηματοδότησης NF-kB στα ποδοκύτταρα, δεν διερευνήσαμε τον μοριακό μηχανισμό πίσω από αυτήν τη διαδικασία. Απαιτούνται περισσότερες μελέτες για να διερευνηθεί το προηγούμενο εύρημα ότι το Rarres1 προάγει την ενεργοποίηση του Axl αναστέλλοντας την αποικοδόμησή του που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα. Τέλος, προκαλέσαμε τα νοκ-άουτ/-στα ζώα μας μόνο με το μοντέλο νεφροπάθειας που προκαλείται από NTS. Ως εκ τούτου, ενδείκνυνται περισσότερες μελέτες σε ζωικά μοντέλα για να διαπιστωθεί εάν το Rarres1 έχει παθογόνο ρόλο και σε άλλες διαδικασίες ασθένειας.

Συνοψίζοντας, η μελέτη μας δείχνει ότι σε κοινές ανθρώπινες σπειραματοπάθειες, η εμπλουτισμένη με ποδοκύτταρα πρωτεΐνη Rarres1 προκαλείται στα ECs, οδηγώντας σε φλεγμονή, τραυματισμό των ποδοκυττάρων και ίνωση. Αυτό δυνητικά προκαλείται από την ενίσχυση της οδού σηματοδότησης NF-kB μέσω της ενεργοποίησης της κινάσης τυροσίνης υποδοχέα Axl (Εικόνα 7). Το Rarres1 είναι ένας νέος βιοδείκτης μικροαγγειακής βλάβης και θα μπορούσε δυνητικά να είναι ένας νέος θεραπευτικός στόχος για την καταστολή της φλεγμονής και της ίνωσης στη ΧΝΝ

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ

Η ML είναι υπάλληλος της AstraZeneca, στο Γκέτεμποργκ, Σουηδία. Η έρευνα της JP υποστηρίζεται από την AstraZeneca. Όλοι οι άλλοι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τον KM-H από το Diabetes Wellness Sverige και τον JP από το KI/AZ Integrated Metabolic Center, το Marianne och Marcus Wallenberg Foundation, το Swedish Diabetes Foundation, το Swedish Kidney Foundation και το Center for Innovative Medicine.

ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΕΣ ΣΥΓΓΡΑΦΕΩΝ

Οι KM-H, ML και JP σχεδίασαν την έρευνα. Οι KM-H, DD, EC, SZ και GG πραγματοποίησαν την έρευνα. Οι KM-H και XL ανέλυσαν τα δεδομένα. Η AW παρείχε ανθρώπινα δείγματα. και οι KM-H και JP έγραψαν την εργασία.

Γιατί το Responder1 του υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος μπορεί να προάγει την ανάπτυξη σπειραματικών παθήσεων;

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Συμπληρωματικό αρχείο (PDF)

Πίνακας S1. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ζεύγη εκκινητών γονιδίων-στόχων για RT-PCR σε πραγματικό χρόνο.

Πίνακας S2. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα. Συμπληρωματικό αρχείο (PowerPoint)

Εικόνα S1. Η υπερέκφραση Rarres1 δεν ενεργοποιεί τη μη κανονική οδό σηματοδότησης NF-kB. Αντιπροσωπευτικό έγγραφο Western blot και συνοπτικά δεδομένα που δείχνουν ότι η υπερέκφραση του Rarres1 δεν ενεργοποιεί το p100/p52 σε ποδοκύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 ng/ml TGF-b1 (n=2). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD. Το τεστ t του μαθητή χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων. UT, χωρίς θεραπεία.

Εικόνα S2. Καθιέρωση ποντικών Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) ειδικών για τα ποδοκύτταρα. (Α) Συμβατική ανάλυση PCR σε σωληναριακά και σπειραματικά κλάσματα, καθώς και σε ηπατικό ιστό. (Β) Ιστολογική εξέταση (PAS-χρώση) παθολογίας των νεφρών σε ποντίκια Cre– /Rarres1flfl/flfl και Creþ/Rarres1flfl/flfl. (Γ) Αντιπροσωπευτικές ηλεκτρονιακές μικρογραφίες μετάδοσης (TEM) και ποσοτικοποίηση του μέσου πάχους της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (GBM) και του αριθμού των σχισμών ανά mm GBM σε διαφορετικές ομάδες ποντικών (n=3). (Δ) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν την έκφραση των ειδικών για τα ποδοκύτταρα δεικτών, της συναπτοποδίνης και της νεφρίνης, σε ποντίκια Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) και ελέγχου (Cre–/Rarres1flfl/flfl) ειδικά για ποδοκύτταρα. Μπάρα=10 χλστ.

Εικόνα S3. Τα επίπεδα έκφρασης δεικτών ποδοκυττάρων και CD31 στους νεφρούς ποντικών που έλαβαν NTS. (Α) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν την έκφραση της νεφρίνης, της WT-1 και της συναπτοποδίνης σε ποδοκύτταρα από ποντίκια νοκ-άουτ ειδικά για τα ποδοκύτταρα Rarres1 που έλαβαν θεραπεία με NTS (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) και συγγενείς ελέγχου (Cres1-/R flfl ). Μπάρα=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=5). (Β) Αναλογία CD31-θετικών τριχοειδών αγγείων στις περισωληνώδεις περιοχές. Τριάντα περισωληναριακές περιοχές αξιολογήθηκαν ανά ποντίκι. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Τεστ μαθητή. (Γ) Ημιποσοτική βαθμολόγηση του σήματος CD31 στα σπειράματα: 0=χωρίς σήμα, 1=ασθενές σήμα, 2=μέτριο σήμα, 3=ισχυρό σήμα. Δέκα σπειράματα αξιολογήθηκαν από κάθε ποντίκι (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Τεστ μαθητή.

Εικόνα S4. Τα επίπεδα έκφρασης για δείκτες ίνωσης, φλεγμονής και σωληναριακής βλάβης στους νεφρούς ποντικών που έλαβαν NTS. (Α) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν τις εκφράσεις του -Sma στο νεφρό από ποντίκια νοκ-άουτ ειδικών για ποδοκύτταρα Rarres1 που έλαβαν NTS (Creþ/Rarres1flfl/flfl) και συγγενείς μάρτυρες (Cre–/Rarres1flfl/flfl). Μπάρα=100 mm. (Β) Σχετικά επίπεδα mRNA διαφορετικών γονιδίων που σχετίζονται με φλεγμονή, ίνωση και νεφρική σωληναριακή βλάβη στον νεφρικό φλοιό ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NTS. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" έναντι="" ελέγχου="" (ctrl.);="" τα="" δεδομένα="" εκφράζονται="" ως="" μέσοι="" όροι="" ±="" sem.="" το="" student's="" t-test="" χρησιμοποιήθηκε="" για="" συγκρίσεις="" μεταξύ="" 2="" ομάδων="" (sham="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl="" ,="" n="3">

Εικόνα S5. Η έκφραση του C31 και του ενεργοποιημένου P65 σε νεφρούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NTS. (Α) Η αναλογία των CD31-θετικών τριχοειδών αγγείων στις περισωληναριακές περιοχές. Τριάντα περισωληναριακές περιοχές αξιολογήθηκαν ανά ποντίκι (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Student's t-test. (Β) Ημιποσοτική βαθμολόγηση του σήματος CD31 στα σπειράματα: 0=χωρίς σήμα, 1=ασθενές σήμα, 2=μέτριο σήμα, 3 =ισχυρό σήμα. Δέκα σπειράματα αξιολογήθηκαν από κάθε ποντίκι (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Student's t-test. (Γ) Αντιπροσωπευτικά έγγραφα Western blot και συνοπτικά δεδομένα που δείχνουν τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του pP65 στον νεφρικό φλοιό σε διαφορετικές ομάδες ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NTS και ελέγχους χωρίς θεραπεία (ctrl.) (ctrl., n=3· NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=10). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Χρησιμοποιήθηκε το t-test του student για συγκρίσεις μεταξύ 2 ομάδων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Μοριακοί μηχανισμοί της διαβητικής νεφρικής νόσου. J Clin Invest. 2014, 124:2333–2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F, et αϊ. Νεφροπάθεια IgA. Nat Rev Dis Primers. 2016; 2:16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Κατανόηση της βιολογίας των ποδοκυττάρων για την ανάπτυξη νέων νεφρικών θεραπευτικών. Μπροστινή Ενδοκρινόλη (Λωζάνη). 2018; 9:409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F, et al. Καθορισμός της ειδικότητας κυτταρικού τύπου σε μεταγραφικό επίπεδο σε ανθρώπινες ασθένειες. Genome Res. 2013, 23:1862–1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S, et αϊ. Αναγνώριση του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα ως βιοδείκτη της χρόνιας νεφρικής νόσου βάσει ιστικού μεταγραφώματος. Sci Transl Med. 2015; 7:316ra193.

6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T, et al. Μεταγραφική ανάλυση της ανθρώπινης διαβητικής νεφρικής νόσου. Διαβήτης. 2011; 60:2354–2369.

7. Wiggins JE, Patel S, Shedden Κ, et αϊ. Το NFkappaB προάγει τη φλεγμονή, την πήξη και την ίνωση στο γερασμένο σπείραμα. J Am Soc Nephrol. 2010; 21:587-597.

8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R, et al. Η περιστίνη που προκαλείται από το NFkappaB ενεργοποιεί τη σηματοδότηση της ιντεγκρίνης-βήτα3 για την προώθηση της νεφρικής βλάβης στο GN. J Am Soc Nephrol. 2017, 28:1475–1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Transforming growth factor-beta1 and diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F689–F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB, et al. Ενεργοποίηση πυρηνικού παράγοντα-κάπα Β από ποδοκύτταρα στην αυτόλογη φάση της παθητικής νεφρίτιδας Heymann. Kidney Int. 2001; 59:923-931.

11. Tomita T, Takano M, Tomita R, et al. Το δόλωμα του μεταγραφικού παράγοντα για το NFkappaB αναστέλλει τις εκφράσεις κυτοκίνης και μορίου προσκόλλησης σε αρθρικά κύτταρα που προέρχονται από ρευματοειδή αρθρίτιδα. Ρευματολογία (Οξφόρδη). 2000; 39:749-757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth Κ, Li X, et αϊ. Το GPRC5b ρυθμίζει τη φλεγμονώδη απόκριση στοσπειραματικά νοσήματαμέσω της οδού NF-kappaB. J Am Soc Nephrol. 2019; 30:1573–1586.

13. Choi Μ, Schreiber Α, Eulenberg-Gustavus C, et al. Ο αποκλεισμός του ενδοθηλίου NF-kappaB καταργεί το GN που προκαλείται από το ANCA. J Am Soc Nephrol. 2017; 28:3191- 3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. In situ σπειραματική έκφραση του ενεργοποιημένου NF-kappaB σε νεφρίτιδα ανθρώπινου λύκου και σε άλλη μη πολλαπλασιαστική πρωτεϊνουρική σπειραματοπάθεια. Virchows Arch. 2006; 448:172-183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J, et al. Μεγάλης κλίμακας ταυτοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και λειτουργία του νεφρικού σπειράματος. EMBO J. 2006; 25:1160-1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J, et al. Μια υπό όρους απαθανατισμένη ανθρώπινη κυτταρική γραμμή ποδοκυττάρων που δείχνει έκφραση νεφρίνης και ποδοκίνης. J Am Soc Nephrol. 2002; 13:630-638.

17. Kisanuki YY, Emoto Ν, Ohuchi Τ, et al. Χαμηλή αρτηριακή πίεση σε ποντίκια με νοκ-άουτ ενδοθηλιακά κύτταρα ενδοθηλίνης 1. Υπέρταση. 2010; 56:121-128.

18. McAdoo SP, Pusey CD. Αντι-σπειραματική νόσος της βασικής μεμβράνης. Clin J Am Soc Nephrol. 2017, 12:1162–1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX, et al. Το FK506 μειώνει τη λευκωματουρία μέσω της βελτίωσης της έκφρασης της νεφρίνης των ποδοκυττάρων και της ποδοκίνης σε διαβητικούς αρουραίους. Inflamm Res. 2016; 65:103-114.

20. Wang X, Saso Η, Iwamoto Τ, et al. Το TIG1 προάγει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του φλεγμονώδους καρκίνου του μαστού μέσω της ενεργοποίησης της κινάσης Axl. Cancer Res. 2013; 73:6516-6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C, et al. Το R428, ένας εκλεκτικός μικρομοριακός αναστολέας της κινάσης Axl, εμποδίζει την εξάπλωση του όγκου και παρατείνει την επιβίωση σε μοντέλα μεταστατικού καρκίνου του μαστού. Cancer Res. 2010;70:1544–1554.

22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. Αναστολείς AXL στον καρκίνο: μια προοπτική ιατρικής χημείας. J Med Chem. 2016, 59:3593–3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Πειραματική μεμβρανώδης σπειραματονεφρίτιδα σε αρουραίους. Ποσοτικές μελέτες σχηματισμού σπειραματικής ανοσοαπόθεσης σε απομονωμένα σπειράματα και ολόκληρα ζώα. J Clin Invest. 1980; 66:71-81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et αϊ. Η ανάλυση μεταγραφικού δικτύου μεταξύ ειδών ορίζει κοινές φλεγμονώδεις αποκρίσεις στη νεφρίτιδα ποντικού και ανθρώπινου λύκου. J Immunol. 2012; 189:988-1001.

25. Grayson Ρ, Eddy S, Taroni J, et αϊ. Μεταβολικά μονοπάτια και ανοσομεταβολισμός σε σπάνιες νεφρικές παθήσεις. Ann Rheum Dis. 2018, 77: 1226–1233.

26. Liu P, Lassen Ε, Nair V, et αϊ. Το μεταγραφικό και πρωτεομικό προφίλ παρέχει μια εικόνα για τη λειτουργία των μεσαγγειακών κυττάρων στη νεφροπάθεια IgA. J Am Soc Nephrol. 2017, 28:2961–2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Αποτελεσματική επιλογή για μορφομετατροπείς υψηλής έκφρασης με έναν νέο ευκαρυωτικό φορέα. Γονίδιο. 1991; 108:193-199.

28. Loefffller I, Wolf G. Μετάβαση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό στη διαβητική νεφροπάθεια: γεγονός ή φαντασία; Κύτταρα. 2015; 4:631–652.

29. Nagpal S, Patel S, Asano Α, et αϊ. Γονίδιο 1 που προκαλείται από ταζαροτένιο (TIG1), ένα νέορετινοϊκό οξύγονίδιο που ανταποκρίνεται στους υποδοχείς στο δέρμα. J Invest Dermatol. 1996, 106:269-274.

30. Jing C, El-Ghany Μ, Beesley C, et αϊ. Έκφραση του γονιδίου 1 (TIG1) που προκαλείται από ταζαροτένη σε καρκινώματα προστάτη και η σχέση του με την ογκογένεση. J Natl Cancer Inst. 2002; 94:482-490.

31. Teufel Α, Becker D, Weber SN, et al. Προσδιορισμός του RARRES1 ως ρυθμιστή πυρήνα στην ηπατική ίνωση. J Mol Med (Berl). 2012, 90:1439–1447.

32. Chen Α, Feng Υ, Lai Η, et αϊ. Το διαλυτό RARRES1 επάγει την απόπτωση των ποδοκυττάρων για να προωθήσεισπειραματική ασθένειαπροχώρηση. J Clin Invest. 2020; 130:5523–5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Η στοχευμένη αναστολή της κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα Axl βελτιώνει την επαγόμενη από αντι-GBM νεφρίτιδα που μοιάζει με λύκο. J Αυτοάνοσο. 2018; 93:37–44.

34. Tang Υ, Harrington Α, Yang Χ, et αϊ. Η συμβολή της γενεαλογίας Tie2þ σε πρωτόγονα και οριστικά αιμοποιητικά κύτταρα. Γένεση. 2010; 48:563-567