Τρισδιάστατη αρχιτεκτονική των νεφρώνων στο φυσιολογικό και κυστικό νεφρό

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Cle´ment Nguyen1, Martine Burtin1, Ger´rard Friedlanderbiola1,6, Terzi1,8 και Marco Pontoglio1,8

Το Cistanche είναι καλό για τα νεφρά

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Κυστική νεφρική νόσος; νεφρό; νεφρώνας; νεφρονοφθίαση;κάθαρση ιστού

Η λειτουργία των νεφρών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη σύνθετη τρισδιάστατη δομή των νεφρώνων. Οποιαδήποτε παραμόρφωση του σχήματός τους μπορεί να οδηγήσει σενεφρική δυσλειτουργία. Οι παραδοσιακές ιστολογικές μέθοδοι παρουσιάζουν σημαντικούς περιορισμούς για την τρισδιάστατη ανακατασκευή ιστών. Εδώ, συνδυάσαμε καθαρισμό ιστού, μικροσκοπία πολλαπλών φωτονίων και ψηφιακή ανίχνευση για την αναδόμηση μεμονωμένων νεφρώνων υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. Σετ απόνεφρώνεςΠροσδιορίστηκαν που διαφέρουν ως προς τη θέση, το σχήμα και το μέγεθος ανάλογα με τη λειτουργία τους. Είναι ενδιαφέρον ότι οι νεφρώνες τείνουν να βρίσκονται σε επίπεδα. Όταν αυτή η τεχνική εφαρμόστηκε σε ένα μοντέλο τουκυστική νεφρική νόσο, οι κύστεις βρέθηκαν να αναπτύσσονται μόνο σε συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα. Κατά μήκος του ίδιου τμήματος, οι κύστεις είναι συνεχόμενες εντός των φυσιολογικών μη διασταλμένων σωληναρίων. Επιπλέον, τα σχήματα των κύστεων διέφεραν ανάλογα με το τμήμα του νεφρώνα. Έτσι, τα ευρήματά μας παρέχουν μια πολύτιμη στρατηγική για την απεικόνιση της πολύπλοκης δομής των νεφρών στο επίπεδο του μεμονωμένου νεφρώνα και, το πιο σημαντικό, παρέχουν μια βάση για την κατανόηση παθολογικών διεργασιών όπως η κυστογένεση.

Μεταφραστική δήλωση

Οι μέθοδοι εκκαθάρισης παρέχουν ένα μοναδικό εργαλείο για την κατανόηση του πώς οι μορφολογικές αλλαγές οδηγούν σε παθολογικές συνέπειες. Οι νεφροί είναι κρίσιμα όργανα που διατηρούν την ομοιόσταση του σώματος μέσω του χειρισμού του νερού, του μεταβολίτη και των ηλεκτρολυτών, τα οποία εξαρτώνται καθοριστικά από τη σύνθετη 3-διαστατική δομή των νεφρώνων. Όταν αυτή η δομική οργάνωση μεταβάλλεται, ακολουθεί η νεφρική παθοφυσιολογία. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια ισχυρή μέθοδο που βασίζεται στην οπτική εκκαθάριση,

Πολυφωτονική μικροσκοπία και ψηφιακή ανίχνευση για τη μελέτη του νεφρού σε επίπεδο μονού νεφρώνα κάτω από φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, παρέχουμε την πρώτη 3-διαστατική ανακατασκευή ενός πολυκυστικού νεφρού στην κλίμακα μεμονωμένων νεφρώνων. Αυτή η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί σε πολλά παθολογικά πλαίσια, επιτρέποντάς μας να κατανοήσουμε καλύτερα τη σύνθετη διαδικασία της νεφρικής φθοράς και, κατά συνέπεια, να αναπτύξουμε πιο στοχευμένες θεραπευτικές στρατηγικές.

Ο νεφρός διατηρεί την ομοιόσταση του σώματος μέσω της σύνθετης δομής του νεφρώνα 3-διαστάσεων (3D). Όταν αυτή η δομική οργάνωση μεταβάλλεται, ακολουθεί η νεφρική παθοφυσιολογία.Χρόνιες νεφρικές παθήσειςχαρακτηρίζονται από την ανάπτυξη νεφρικών βλαβών. Περιέργως, οι παθολόγοι έχουν αναφέρει μια ευρεία ετερογένεια στην κατανομή των βλαβών κατά τη διάρκεια χρόνιων νεφρικών παθήσεων. , είναι άγνωστο. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, είναι υποχρεωτική η ανακατασκευή του τρισδιάστατου σχήματος των νεφρώνων σε παθολογικά πλαίσια.

Εξ όσων γνωρίζουμε,νεφρώνεςέχουν ανακατασκευαστεί πλήρως μόνο χρησιμοποιώντας σειριακές τομές 2D.3–5 Αν και η τυπική ιστολογική τομή παρέχει υψηλή ανάλυση, οι τρισδιάστατες ανακατασκευές είναι επίπονες και δύσκολο να επιτευχθούν. Αυτό οφείλεται κυρίως σε μηχανικές παραμορφώσεις, οι οποίες είναι αναπόφευκτη επίδραση της διαδικασίας τεμαχισμού. Επιπλέον, η τρισδιάστατη ανακατασκευή από εικόνες 2D δεν επιτρέπει την άμεση απεικόνιση τρισδιάστατων δομών σε ιστούς που είναι τοποθετημένοι σε ολόκληρο το σώμα.

Η πολυφωτονική μικροσκοπία έχει βελτιώσει την ικανότητά μας να ανιχνεύουμε μορφολογικές αλλαγές σε παχιές τομές. Ωστόσο, ένας σημαντικός περιορισμός είναι το μικρό προσβάσιμο βάθος λόγω της σκέδασης του φωτός. Ελαχιστοποιώντας τις διαφορές του δείκτη διάθλασης, οι καθαριστικοί παράγοντες έχουν βελτιώσει δραματικά την ικανότητα απεικόνισης βάθους.6,7 Παρά το γεγονός ότι ο πρώτος καθαριστικός παράγοντας εισήχθη πριν από έναν αιώνα,8 μόλις πρόσφατα αναπτύχθηκαν αρκετά πρωτόκολλα καθαρισμού, κυρίως για τον εγκέφαλο. .9–17 Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει τις δυνατότητές τους για απεικόνιση άλλων στερεών οργάνων, όπως το ήπαρ, το πάγκρεας ή τα νεφρά.18–26

κιστάνα για νεφρική νόσο

Πολυκυστική νεφρική νόσο, μια γενετικά ετερογενής διαταραχή που περιλαμβάνει μεταλλάξεις σε πολλά βλεφαρικά γονίδια, είναι η πιο κοινή κληρονομική νόσος των νεφρών.27,28 Η πολυκυστική νεφρική νόσος χαρακτηρίζεται από την ανάπτυξη κύστεων που οδηγούν στην πλήρη καταστροφή του νεφρού. αναπτύσσονται είτε ως "ώθηση προς τα έξω" ενός τμήματος νεφρώνα, όπως σε αυτοσωμικά επικρατή πολυκυστικάΝεφρική Νόσος; ως εκτατική διαστολή συλλεκτικών αγωγών (CDs), όπως σε αυτοσωματικό υπολειπόμενο πολυκυστικόΝεφρική Νόσος; ή αποκλειστικά σε μυελικούς σωληνίσκους, όπως στη νεφρονοφθίση (NPHP).27,29 Ωστόσο, το πώς οι κύστεις αναπτύσσονται τρισδιάστατα και οργανώνονται μεταξύ τους και φυσιολογικά γειτονικά σωληνάρια είναι ακόμα άγνωστο.

Εδώ, συνδυάσαμε την οπτική διαγραφή με τη μικροσκοπία πολλαπλών φωτονίων για να παρέχουμε νέες πληροφορίες για το πώςνεφρώνεςδιαμορφώνονται και οργανώνονται σε φυσιολογικές συνθήκες και πώς τροποποιούνται κατά τη διάρκεια της νόσου, όπως η κυστογένεση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι υπάρχουν 3 τύποι νεφρώνων και ότι τα αγγεία μπορεί να επηρεάσουν τη χωρική οργάνωση των νεφρώνων. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε ότι οι νεφρώνες τείνουν να βρίσκονται σε συγκεκριμένα επίπεδα. Απροσδόκητα, όταν εφαρμόσαμε αυτή την τεχνική σε ποντίκια jck, παρατηρήσαμε ότι οι κύστεις αναπτύχθηκαν μόνο σε συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα με ατρακτοειδείς κύστεις αναμεμειγμένες με φυσιολογικούς σωληνίσκους.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Πειραματική ρύθμιση

Να μελετήσει το σχήμα ολόκληρουνεφρώνεςσε σχέση με το περιβάλλον τους, υιοθετήσαμε μια τεχνική που βασίζεται σε οπτικό καθαρισμό και μικροσκοπία πολλαπλών φωτονίων (Συμπληρωματικό Σχήμα S1A). Συγκρίνοντας διαφορετικά πρωτόκολλα οπτικού καθαρισμού, προσδιορίσαμε ότι για το νεφρό, η βενζυλική αλκοόλη/βενζοϊκό βενζύλιο (BABB) ήταν η καταλληλότερη όσον αφορά την αποτελεσματικότητα (Συμπληρωματικό Σχήμα S1B και C και Συμπληρωματικός Πίνακας S1).

Η τρισδιάστατη ανακατασκευή και η ψηφιακή ανίχνευση απαιτούν εικόνες υψηλής ποιότητας με υψηλή ανάλυση και υψηλή αναλογία σήματος προς φόντο. Παρατηρήσαμε ότι το οπτικό σήμα που παρέχεται από τον φυσικό φθορισμό δεν ήταν ομοιόμορφο στις τομές των νεφρών. Συγκεκριμένα, οι εικόνες από το μυελό είχαν μικρή αντίθεση με χαμηλή αναλογία σήματος προς φόντο (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Για να βελτιώσουμε την αναλογία σήματος προς φόντο, χρωματίσαμε τομές με περιοδικό οξύ-Schiff (Συμπληρωματικό Σχήμα S1D), επειδή παρατηρήσαμε εμπειρικά ότι αυτή η χρώση προκάλεσε υψηλή αντίθεση σε λεπτές τομές κατά τη διάρκεια του φθορισμού 2-φωτονίων. Ωστόσο, το σήμα δεν ήταν ομοιόμορφο σε όλες τις παχύρρευστες τομές νεφρού που χρωματίστηκαν με περιοδικό οξύ-Schiff (Συμπληρωματικό Σχήμα S1E). Ως εκ τούτου, χρωματίσαμε τομές νεφρών με λεκτίνες συζευγμένες με φθοριόχρωμα: συγκολλητίνη φυστικιού και συγκολλητίνη φύτρων σίτου, που λερώνουν σπειράματα και σωληνάρια, και Griffonia simplicifolia agglutinin, που σηματοδοτεί τα αιμοφόρα αγγεία. Ο λόγος υποβάθρου αυξήθηκε δραματικά συνολικάτμήματα νεφρών, με σημαντική βελτίωση τόσο στο επίπεδο xy όσο και στον άξονα z (Συμπληρωματικό Σχήμα S1E και Συμπληρωματική ταινία S1).

Οπτικοποίηση 3D τμήματος νεφρώνα

Για να οπτικοποιήσουμε το σχήμα ολόκληρων νεφρώνων, εντοπίσαμε τις διαδρομές τους, ξεκινώντας από τον ουροποιητικό πόλο του σπειράματος και τελειώνοντας στη διασταύρωση CD (Συμπληρωματική ταινία S2). Παρά το γεγονός ότι οι λεκτίνες που χρησιμοποιούνται παγκοσμίως δεσμεύουν όλα τα τμήματα νεφρώνων, παρατηρήσαμε ότι όταν επιθεωρήθηκαν προσεκτικά, αυτές οι λεκτίνες χαρακτηρίζονταν από ένα συγκεκριμένο σχέδιο στον τρόπο με τον οποίο έβαφαν τις βασικές ή αυλικές μεμβράνες στα διάφορα τμήματα νεφρώνων. Με άλλα λόγια, εκμεταλλευτήκαμε το στερεότυπο μοτίβο της χρώσης με λεκτίνη για να αναγνωρίσουμε τα διαφορετικά τμήματα νεφρώνων. Με αυτόν τον τρόπο, θα μπορούσαμε εύκολα να αναγνωρίσουμε 6 οντότητες: εγγύς σωληνάριο (PT), λεπτό άκρο (TL) του βρόχου Henle (HL), παχύ ανιούσα άκρο (TAL) του HL, περιφερικό σωληνάριο (DCT), συνδετικό σωληνάριο (CNT). ), και CD. Η μετάβαση μεταξύ PT και TL χαρακτηρίστηκε από την ξαφνική απώλεια του τυπικού σήματος ορίου βούρτσας PT και από τη μείωση του πλάτους του αυλού, η οποία σχεδόν ουσιαστικά απουσίαζε στην TL (Εικόνα 1α). Αντίθετα, η μετάβαση μεταξύ TL και TAL χαρακτηρίστηκε από μια σημαντική αύξηση στην εξωτερική σωληναριακή διάμετρο και σχετικά σταθερό πλάτος αυλού (Εικόνα 1β). Σε όλανεφρώνες, η μετάβαση του TAL σε DCT βρέθηκε συστηματικά στον αγγειακό πόλο του σπειράματος. Αυτή η μετάβαση χαρακτηρίστηκε από μια ξαφνική μεγέθυνση της εξωτερικής σωληναριακής διαμέτρου που οφειλόταν κυρίως σε μια σημαντική αύξηση στη διάμετρο του αυλού (Εικόνα 1c). Η μετάβαση μεταξύ DCT και CNT χαρακτηρίστηκε από μείωση τόσο της διαμέτρου του σωλήνα όσο και του αυλού (Εικόνα 1δ). Τέλος, η σύνδεση μεταξύ CNT και CD του φλοιού χαρακτηρίστηκε από μια ξαφνική αύξηση τόσο της διαμέτρου του σωληνίσκου όσο και του αυλού (Εικόνα 1e). Ο ποσοτικός προσδιορισμός αυτών των μορφολογικών μεταβάσεων ήταν στατιστικά σημαντικός (Εικόνα 1στ) και η συνάφειά του επαληθεύτηκε με χρώση με συγκεκριμένους σωληνωτούς δείκτες (Συμπληρωματικά Σχήματα S3-S5 και Συμπληρωματική ταινία S3-S5).

Το σχήμα και το μέγεθος των PT διαφέρουν ανάλογα με το βάθος τους

Η χρώση του παχύτμήματα νεφρώνμας επέτρεψε να εντοπίσουμε τις συντεταγμένες της χωρικής εξέλιξης ολόκληρων τμημάτων PT. Είναι ενδιαφέρον ότι ανακαλύψαμε ότι το σχήμα τους ήταν εξαιρετικά μεταβλητό και καθοριζόταν από τη θέση των σπειραμάτων τους στον φλοιό. Σε παγκόσμιο επίπεδο, εντοπίσαμε 3 μοτίβα. Ο πρώτος κορμός ανταποκρίθηκε στους πιο επιφανειακούς νεφρώνες (SNs) (Εικόνα 2α, Συμπληρωματική ταινία S6), που καταλάμβαναν το πιο εξωτερικό μέρος του φλοιού (το πιο εξωτερικό 30 τοις εκατό κοντά στη νεφρική κάψουλα). Τα περίπλοκα μέρη τους σχημάτισαν συμπαγείς δομές με μόνο 6 έως 7 περιελίξεις γύρω από το δικό τους σπείραμα, καταλαμβάνοντας πολύ μικρούς και σφιχτά γεμάτους χώρους. Η συνέλιξη αυτών των SN κατέληγε σε μακρύ και ευθύ ορθό που κατέβαινε στο μυελό. Στο αντίθετο άκρο αυτού του φάσματος, παρατηρήσαμε ένα δεύτερο μοτίβο τουνεφρώνεςπου βρίσκεται στο βαθύτερο τμήμα του φλοιού (40 τοις εκατό περισσότερο εσωτερικό βάθος), δίπλα στον μυελό (παραμυελικοί νεφρώνες [JNs]) (Εικόνα 2α, Συμπληρωματικό Σχήμα S6 και Συμπληρωματική ταινία S6). Τα PTs τους χαρακτηρίζονταν από έναν αρχικό βραχύ βρόχο που κατέβαινε συστηματικά προς τη θηλή και στη συνέχεια το U γύριζε για να ανέλθει προς τη νεφρική κάψουλα. Σε αντίθεση με τα SNs, τα εγγύς σωληνάρια JN χαρακτηρίζονταν από μεγάλα πηνία που εξελίχθηκαν γύρω από το δικό τους σπειράμα και καταλάμβαναν μεγάλες, χαλαρά γεμάτες περιοχές στον παραμυελικό φλοιό. Το σύνθετο τμήμα του PT των JNs είχε 10 έως 15 συνελίξεις, σχηματίζοντας μεγάλες περιοχές. Τέλος, το τρίτο μοτίβο περιελάμβανε νεφρώνες που βρίσκονται στο μεσαίο τμήμα του φλοιού (μεσαίοι νεφρώνες [MNs]) (Εικόνα 2α, Συμπληρωματική ταινία S6). Είναι ενδιαφέρον ότι αυτά τα σωληνάρια είχαν σχήμα και χωρικό προσανατολισμό που αντιπροσώπευε μια μετάβαση μεταξύ SN και JN. Στην πραγματικότητα, περιείχαν 8 έως 9 συνελίξεις με πηνία που ήταν μεγαλύτερα από τα SN, αλλά μικρότερα από τα JN. Επιπλέον, τα MNs είχαν μακρύτερα pars recta από τα JNs. Είναι ενδιαφέρον ότι μια συνολική σύγκριση των σχημάτων των PT έδειξε ότι τα SNs και MNs είχαν ένα ομοιογενές σχέδιο ενώ τα JN ήταν εξαιρετικά ετερογενή (Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Επιπλέον, η χωρική ανακατασκευή αρκετών νεφρώνων αποκάλυψε ότι τα PT δεν αναμειγνύονται ποτέ (Συμπληρωματική ταινία S6), υποδεικνύοντας ότι κάθε νεφρώνας καταλαμβάνει το δικό του ξεχωριστό χώρο στον φλοιό.

Οι μορφομετρικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν τις μεγάλες διαφορές στο μέγεθος και το σχήμα των SNs και JNs, με μια ενδιάμεση πτυχή για τα MNs. Το PT των JN ήταν περισσότερο από 2-πλάσιο μεγαλύτερο από το PT των SN (Εικόνα 2β). Ωστόσο, η ευθύτητα ήταν μεγαλύτερη στα SNs παρά στα JNs (Εικόνα 2γ), σύμφωνα με την παρατήρηση ότι τα σωληνάρια JN ήταν πολύ πιο ελικοειδή (Εικόνα 2α, Συμπληρωματικό Σχήμα S6).

Εικόνα 1|Μορφολογικά κριτήρια που χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση τμημάτων νεφρώνων. (α–ε) Μορφολογία των διαφορετικών τμημάτων του νεφρώνα σε ποντικούς ελέγχου. Οι νεφρώνες εντοπίστηκαν από τον ουροποιητικό πόλο του σπειράματος στον αγωγό συλλογής (εγγύς σωληνάριο [PT]: τιρκουάζ· λεπτό άκρο [TL] του βρόχου Henle: ανοιχτό γκρι, παχύ ανιόν άκρο [TAL] του βρόχου Henle: σκούρο γκρι. άπω περιελιγμένο σωληνάριο [DCT]: ροζ· συνδετικό σωληνάριο [CNT]: κίτρινο· φλοιώδης αγωγός συλλογής [CCD]: πορτοκαλί). Τα βέλη υποδεικνύουν τη διάμετρο των διαφορετικών τμημάτων νεφρώνων. (Συνεχίζεται)

Εικόνα 1|(Συνέχεια) (στ) Ποσοτικοποίηση της εξωτερικής σωληνοειδούς διαμέτρου των διαφορετικών τμημάτων νεφρώνα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος SEM. Ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey-Kramer: **P < 0.01,="" ***p=""><>

Εικόνα 3|Η τρισδιάστατη (3D) ανακατασκευή νεφρώνων αποκαλύπτει 3 διαφορετικούς τύπους νεφρώνων. (α) Αντιπροσωπευτικές τρισδιάστατες εικόνες ενός ολόκληρου νεφρώνα (αριστερά πλαίσια) από τα σπειράματα έως τον αγωγό συλλογής στον επιφανειακό φλοιό (μπλε), στον μεσαίο φλοιό (πράσινο) και στην παραμυελική περιοχή (κόκκινο) σε ποντικούς ελέγχου. Τμηματοποίηση νεφρώνων (δεξιά πλαίσια) για τους 3 διαφορετικούς τύπους νεφρώνων. Μπάρα ¼ 150 mm. (β) Ποσοτικοποίηση της ενδιάμεσης απόστασης μεταξύ των 2 άκρων του βρόχου Henle για τους 3 τύπους νεφρώνων. (γ) Ποσοτικοποίηση του μήκους νεφρώνων για το (συνέχεια)

Εικόνα 3|(συνέχεια) 3 είδη νεφρώνων. (δ) Ποσοτικοποίηση του μήκους των διαφορετικών τμημάτων του νεφρώνα ανάλογα με τον τύπο του νεφρώνα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος -SEM. Ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey-Kramer: παραμυελικός νεφρώνας (JN) έναντι επιφανειακού νεφρώνα (SN): ###P < 0.001;="" jn="" έναντι="" μέσου="" νεφρώνα="" (mn):="" *="" p="">< 0,05,="" **p=""><0,01, ***p=""><0,001. cnt,="" συνδετικό="" σωληνάριο.="" dct,="" άπω="" περιελιγμένο="" σωληνάριο.="" pt,="" εγγύς="" σωληνάριο;="" tal,="" παχύ="" ανερχόμενο="" άκρο="" του="" βρόχου="" henle.="" tl,="" λεπτό="" άκρο="" του="" βρόχου="">

Το μέγεθος των σπειραμάτων ποικίλλει ανάλογα με το βάθος

Στη συνέχεια αναλύσαμε το βάθος και τη διάμετρο των σπειραμάτων που επιλέχθηκαν τυχαία από καθεμία από τις 3 ζώνες. Οι μορφομετρικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα σπειράματα εντοπίστηκαν κατά μέσο όρο 783 και 355 mm από τη νεφρική κάψουλα σε JNs και SNs, αντίστοιχα. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, παρατηρήσαμε ότι το μέγεθος των σπειραμάτων ποικίλλει ανάλογα με το βάθος τους. Συγκεκριμένα, ο σπειραματικός όγκος των JNs ήταν 3 φορές μεγαλύτερος από αυτόν των SNs και MNs (Εικόνα 2δ).

Τρισδιάστατη ανακατασκευή νεφρώνων

Στη συνέχεια ανιχνεύσαμε τη χωρική εξέλιξη ολόκληρων νεφρώνων από PT σε CNT. Η συνολική άποψη της τρισδιάστατης ανακατασκευής τους επιβεβαίωσε ότι το σχήμα του νεφρώνα διέφερε μεταξύ των SN, MNs και JNs (Εικόνα 3a, Συμπληρωματική ταινία S7). Αυτή η διαφορά οφειλόταν κυρίως στη δομή του PT. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η HL είχε διαφορετική τρισδιάστατη χωρική οργάνωση. Συγκεκριμένα, το TL και το TAL διαχωρίστηκαν πιο απομακρυσμένα στα JNs παρά στα SNs και MNs (Εικόνα 3β). Οι μορφομετρικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα JN ήταν συνολικά 2- φορές μεγαλύτερα από τα SN (Εικόνα 3γ). Το αυξημένο μήκος κατανεμήθηκε αναλογικά σε όλα τα τμήματα, εκτός από τα TAL και DCT, τα οποία έτειναν να έχουν παρόμοιο απόλυτο μήκος σε όλους τους τύπους νεφρώνων (Εικόνα 3δ). Αυτό υποδηλώνει ότι η επιμήκυνση νεφρώνα είναι μια εκπληκτικά ομοιογενώς διαμορφωμένη διαδικασία.

Τα τοξοειδή αγγεία επηρεάζουν την παραμυελική συνέλιξη PT

Για να αποκτήσετε μια πιο ολοκληρωμένη προοπτική τουδομή των νεφρών, εκμεταλλευτήκαμε τη χρώση με συγκολλητίνη Griffonia simplicifolia, η οποία μας επέτρεψε να εντοπίσουμε τα τοξοειδή αγγεία και τους κλάδους τους στα αγγεία ακτινοβολίας του φλοιού (Εικόνα 4α, Συμπληρωματική ταινία S8). Είναι ενδιαφέρον ότι η ταυτόχρονη τρισδιάστατη ανακατασκευή νεφρώνων και αγγείων έδειξε ότι τα τοξοειδή αγγεία τείνουν να βρίσκονται σε μια εκπληκτική παράλληλη χωρική οργάνωση με κοντινούς σωληνίσκους. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι η διαδρομή που ακολουθείται από συγκεκριμένα JN (περιορισμένα JN) τείνει να ακολουθεί τη διαδρομή του κοντινού σκάφους (Εικόνα 4β, Συμπληρωματική ταινία S9). Αξιοσημείωτα, αυτή η μεροληψία (που παρατηρήθηκε μόνο σε ένα υποσύνολο νεφρώνων JN) ευθύνεται για τη μεγάλη ετερογένεια στα σχήματα του PT (Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Οι μορφομετρικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα "περιορισμένα" PT ήταν σημαντικά μακρύτερα και πιο ελικοειδή (μειωμένη ευθύτητα) από τα "μη περιορισμένα" (Εικόνα 4γ και δ). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα σύνθετα μέρη τόσο των SNs όσο και των MNs ήταν τοποθετημένα πάνω από τα τοξοειδή αγγεία και δεν ήταν περιορισμένα.

Τα σωληνάρια τείνουν να βρίσκονται σε επίπεδα

Είναι ενδιαφέρον ότι η επιθεώρηση των τρισδιάστατων σχημάτων των νεφρώνων έδειξε ότι τείνουν να βρίσκονται σε επίπεδα (Εικόνα 5α, Συμπληρωματική ταινία S10). Για να ποσοτικοποιήσουμε αυτήν την παράμετρο και για να αξιολογήσουμε την πιθανή στατιστική προκατάληψη αυτής της διαμόρφωσης, μετρήσαμε τη γενική τάση των σωληναρίων να κάμπτονται έξω από το επίπεδο που ορίζεται από τους βρόχους τους. Οι μετρήσεις μας έδειξαν ότι σε σύγκριση με ένα προσομοιωμένο μοντέλο τυχαίου περπατήματος που δημιουργήθηκε με το ίδιο σύνολο διαδοχικών μετρούμενων γωνιών και μήκους μεταξύ διαδοχικών σημείων (Εικόνα 5β), τα σωληνάρια έτειναν να εξελίσσονται με μικρότερη απόκλιση από ένα επίπεδο (Εικόνα 5γ). Αυτό έδειξε ότι οι σωληνίσκοι έτειναν να περιορίζουν την πορεία τους κατά μήκος ενός επιπέδου. Οι παρατηρούμενες διαφορές ήταν πολύ στατιστικά σημαντικές (P <>

το κιστάνι μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

Η 3D ανακατασκευή νεφρώνα αποκαλύπτει ένα συγκεκριμένο μοτίβο για την ανάπτυξη κύστης

Για να προσδιορίσουμε εάν το πρωτόκολλό μας επιτρέπει τον εντοπισμό νεφρώνων σε αποδιοργανωμένους παθολογικούς ιστούς, χαρακτηρίσαμε τα σχήματα και τη χωρική κατανομή των κύστεων σε ποντικούς jck, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο NPHP και κυστικής νόσου.31–33 3Οι εικόνες D έδειξαν ότι παρά λόγω της εμφάνισης προεξεχόντων κύστεων, η γενική τρισδιάστατη πορεία των νεφρώνων δεν διέφερε σημαντικά από αυτή των ποντικών ελέγχου (Συμπληρωματική ταινία S11). Ομοίως, οι μορφομετρικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι το συνολικό μήκος των νεφρώνων, ο όγκος του σπειράματος και το μήκος του καθενόςνεφρώναςτο τμήμα ήταν συγκρίσιμο με εκείνο των ποντικών ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα S7). Αξίζει να σημειωθεί ότι λόγω της ανάπτυξης κύστης, δεν μπορέσαμε να διαφοροποιήσουμε το TL από το TAL στο HL. Όλοι οι νεφρώνες ανέπτυξαν ατρακτοειδείς κύστεις (Συμπληρωματικές ταινίες S11 και S12). Ένα από τα πιο εντυπωσιακά χαρακτηριστικά ήταν η παρατήρηση ότι οι ατρακτοειδείς κυστικές διαστολές εμφανίστηκαν σε πολλαπλές θέσεις κατά μήκος του ίδιουνεφρώναςτμήμα (Συμπληρωματικές ταινίες S12 και S13). Περιέργως, παρατηρήσαμε ότι οι κύστεις δεν αναπτύχθηκαν ποτέ σε PTs και HL κατερχόμενα άκρα (Εικόνα 6a, Συμπληρωματική ταινία S12). Αντίθετα, ανιχνεύτηκαν κυρίως σε ανιόντα άκρα HL, DCT, CNT και στο πάνω μέρος των CD, σε συνέχεια με CNT (Εικόνα 6α, Συμπληρωματική ταινία S12). Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι το DCT, καθώς και τα τμήματα CNT, είχαν μια ιδιόμορφα αυξημένη πιθανότητα να αναπτύξουν κύστεις στα αντίστοιχα πιο απομακρυσμένα μέρη τους (Εικόνα 6β). Οι ποσοτικές μορφομετρικές αναλύσεις τρισδιάστατων εικόνων ανακατασκευής αποκάλυψαν ότι ο συνολικός όγκος κύστης ανάνεφρώναςήταν ιδιαίτερα υψηλό σε CNT (Εικόνα 7α). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μεγεθύνσεις των κύστεων σε HL και DCT ήταν μεγαλύτερες σε JNs παρά σε SNs και MNs (Εικόνα 7a, Συμπληρωματική ταινία S12). Επιπλέον, η συχνότητα εμφάνισης κύστης ήταν σημαντικά υψηλότερη στους JNs από ότι στους άλλους τύπους νεφρώνων (Εικόνα 7β). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η μέση σπειραματική διάσταση (υπολογισμένη στα πλησιέστερα 5 σπειράματα) έτεινε να είναι ιδιαίτερα αυξημένη σε κυστικά ποντίκια, ειδικά στον πιο επιφανειακό φλοιό (Συμπληρωματικό Σχήμα S8).

Η τρισδιάστατη ανακατασκευή πολλών κύστεων αποκάλυψε ότι είχαν εξαιρετικά μεταβλητό σχήμα και όγκο (Εικόνα 6γ, Συμπληρωματικές Ταινίες S11 και S13). Στο ανερχόμενο άκρο HL, οι κύστεις είχαν ατρακτοειδές σχήμα με μικρή διάμετρο. Στο DCT, οι κύστεις είχαν μάλλον σφαιρικό και μεγαλύτερο σχήμα και ήταν διάσπαρτες μεταξύ των μη διασταλμένων σωληναρίων. Είναι ενδιαφέρον ότι η μετάβαση μεταξύ DCT και CNT χαρακτηρίστηκε συστηματικά από μια κανονική μη διασταλμένη δομή. Αντίθετα, στη CNT, παρατηρήσαμε συστηματικά μια συνεχόμενη διευρυμένη κυστική δομή απευθείας σε επαφή με το CD. Είναι ενδιαφέρον ότι στο CD, αυτή η δομή συρρικνώθηκε προοδευτικά σε ένα κανονικό μέγεθος σωληναρίου. Πιο περιφερικά, δεν μπορούσαν να ανιχνευθούν περαιτέρω κύστεις στο συνεχόμενο τμήμα του CD. Ένα άλλο σταθερό χαρακτηριστικό ήταν η ιδιόμορφη χωρική οργάνωση των κύστεων στο HL ανιούσα άκρο. Στην πραγματικότητα, αν και οι κύστεις ήταν βαθύτερες και πιο κοντά στον βρόχο στα SNs, ήταν πιο επιφανειακές και πιο κοντά στο DCT στα JNs (Εικόνα 6γ). Και πάλι, οι κύστεις κατέλαβαν μια ενδιάμεση θέση στα ΜΝ (Εικόνα 6γ).

Εικόνα 5|Τα σωληνάρια του νεφρώνα τείνουν να εξελίσσονται ως επίπεδη δομή. (α) Μια τυπική διαδρομή ενός εγγύς σωληνίσκου νεφρώνα. Αυτό το μονοπάτι δείχνει την τάση του να βρίσκεται σε ένα αεροπλάνο. Η επιπεδότητα της εξέλιξης της διαδρομής μπορεί να φανεί καλύτερα όταν περιστραφεί σωστά και ευθυγραμμιστεί με την οπτική γωνία του παρατηρητή (δείτε τη δεξιά αναπαράσταση του ίδιου σωληνωτού τμήματος, το οποίο, στην αριστερή πλευρά, αναπαρίσταται σε διαφορετική γωνία). (β) Σχηματική αναπαράσταση μιας σωληνοειδούς διαδρομής που αποτελείται από 4 τμήματα (μεταξύ 5 σημείων που ορίζουν μια δεδομένη σωληνοειδή διαδρομή που φαίνεται ως παράδειγμα). Ο βαθμός στον οποίο τα μονοπάτια τείνουν να βγαίνουν "έξω από το επίπεδό τους" μπορεί να αναπαρασταθεί από τη γωνία που υποδεικνύεται εδώ ως "βήτα". (Συνεχίζεται)

Εικόνα 5|(Συνέχεια) Αυτή η γωνία μετριέται μεταξύ του τμήματος p3-p4 σε σχέση με το επίπεδο (που ορίζεται από τα αμέσως προηγούμενα σημεία p3, p2 και p1) και αντιπροσωπεύεται από ένα σκούρο γκρι ορθογώνιο στο σχήμα. Στη συνέχεια, ο υπολογισμός των γωνιών βήτα υπολογίστηκε αναδρομικά σε όλο το σύνολο των σημείων σε μια σωληνοειδή διαδρομή. Για να αξιολογήσουμε την έκταση της προκατάληψης αυτών των γωνιών βήτα, προσομοιώσαμε ένα τυχαίο περπάτημα (προσομοίωση Monte Carlo [MCs]) χρησιμοποιώντας το ίδιο σύνολο διαδοχικών γωνιών άλφα κάθε σωληνοειδούς διαδρομής (μετρούμενα μεταξύ όλων των διαδοχικών τμημάτων). Αυτό το τυχαίο βάδισμα δημιούργησε μονοπάτι με πανομοιότυπο σύνολο γωνιών άλφα και τυχαιοποιημένες γωνίες βήτα. (γ) Διαγράμματα βιολιού της συνολικής κατανομής των γωνιών βήτα και του αποτελέσματος των MCs στο εγγύς σωληνάριο (PT), λεπτό άκρο (TL) του βρόχου Henle, παχύ ανοδικό άκρο (TAL) του βρόχου Henle, άπω περιελιγμένο σωληνάριο ( DCT), και συνδετικό σωληνάριο (CNT). MCs, P <>

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Οι παραδοσιακές ιστολογικές μέθοδοι είναι περιορισμένες στην ικανότητά τους να ανιχνεύουν παθολογικές αλλαγές που επηρεάζουν το παγκόσμιο σχήμα των νεφρώνων. Εδώ, παρουσιάζουμε μια ισχυρή προσέγγιση που βασίζεται στον καθαρισμό των ιστών που έχει τη δυνατότητα να αντιμετωπίσει κρίσιμα ερωτήματα σχετικά με την αρχιτεκτονική των νεφρών με άνευ προηγουμένου χωρικές λεπτομέρειες υπό κανονικές και παθολογικές συνθήκες. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν την ύπαρξη 3 τύπων νεφρώνων, οι οποίοι διαφέρουν ως προς τη θέση, το σχήμα και το μέγεθός τους, σύμφωνα με τις λειτουργικές τους ιδιαιτερότητες. Επιπλέον, δείξαμε ότι οι νεφρώνες τείνουν να βρίσκονται σε επίπεδα και να προσαρμόζονται στη χωρική οργάνωση των αγγείων. Είναι ενδιαφέρον, όταν εφαρμόσαμε αυτήν την τεχνική σε ένα μοντέλο τουκυστική νεφρική νόσο, παρατηρήσαμε ότι κύστεις αναπτύσσονται σε όλα

νεφρώνων, αλλά μόνο σε συγκεκριμένα τμήματα. Είναι ενδιαφέρον ότι δείξαμε ότι το σχήμα της κύστης ποικίλλει ανάλογα με το τμήμα του νεφρώνα και ότι κατά μήκος του ίδιου νεφρώνα, οι κύστεις παρεμβάλλονται με φυσιολογικά μη διασταλμένα σωληνάρια. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν τον πρώτο τρισδιάστατο χαρακτηρισμό της χωρικής διάταξης των νεφρώνων και των αγγείων και παρέχουν τη βάση για την κατανόηση μιας παθολογικής διαδικασίας, όπως η κυστογένεση.

Ο οπτικός καθαρισμός των νεφρών είναι δύσκολος λόγω των υψηλών επιπέδων αυτοφθορισμού και κυτταρικής πυκνότητας. Συγκρίνοντας διαφορετικά πρωτόκολλα εκκαθάρισης, εντοπίσαμε στο BABB μια ισχυρή τεχνική για την υλοποίηση της οπτικοποίησης και ανακατασκευής δομών που βρίσκονται στο βαθύτερο μέρος τουνεφρό, δηλαδή ο μυελός. Επιπλέον, το BABB είναι γρήγορο και επεκτάσιμο και, αφού καθαριστούν, τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν για μήνες πριν από τη λήψη εικόνας. Ένα άλλο βασικό πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι το χαμηλό κόστος της. Οι καθαριστικοί παράγοντες μπορεί να οδηγήσουν σε συρρίκνωση ή μεγέθυνση των δομών.9-17 Ωστόσο, επειδή αυτές οι τροποποιήσεις του μεγέθους των νεφρών είναι ισότροπες, οι σχετικές μετρήσεις δεν αναμένεται να επηρεαστούν ή να προκαταλάβουν την ερμηνεία τους. Ένας από τους πιο σημαντικούς περιορισμούς είναι ο σχολιασμός των δομών που είναι ιδιαίτερα χρονοβόρος. Ωστόσο, υπάρχει ένας αυξανόμενος αριθμός τεχνικών που βασίζονται στη βαθιά μάθηση που θα πρέπει να ξεπεράσουν γρήγορα αυτόν τον περιορισμό.

Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις κλασσικές τεχνικές, η μελέτη μας έδειξε ότι οι νεφρώνες διαφέρουν ως προς το σχήμα και το μήκος τους ανάλογα με τη θέση τους. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι τα JN έχουν πιο ανεπτυγμένα σύνθετα PT και μεγαλύτερα σπειράματα και είναι 2 φορές μακρύτερα από τα SN. Το αυξημένο μήκος είναι αποτέλεσμα μιας αρμονικής διαδικασίας επειδή η επιμήκυνση επηρεάζει αναλογικά όλα τα τμήματα νεφρώνων. Παρατηρήσαμε επίσης ότι τα JN έχουν μεγαλύτερο HL. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ξεκάθαρα ότι η μικροανατομία των SN και JNs είναι σημαντικά διαφορετική και ότι τα MN εμφανίζουν ενδιάμεσα χαρακτηριστικά. Είναι ενδιαφέρον ότι οι φυσιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι νεφρώνες είναι επίσης λειτουργικά διαφορετικοί.2 Τα μορφογενετικά συμβάντα που αποτελούν τη βάση αυτών των διαφορών δεν είναι ακόμη γνωστά. Είναι λοιπόν δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η συγκεκριμένη δομή των JN μπορεί να εξηγεί την ιδιαιτερότητα των λειτουργιών τους.

Είναι ενδιαφέρον ότι, παρέχοντας για πρώτη φορά την τρισδιάστατη ανακατασκευή των νεφρώνων και των γύρω αγγείων τους, ανακαλύψαμε έναν χωρικό περιορισμό μεταξύ των τοξοειδών αγγείων και μιας υποομάδας νεφρώνων. Έτσι, είναι κατανοητό να πιστεύουμε ότι τα σκάφη μπορεί να υπαγορεύουν τον τρόπονεφρώνεςεπιμηκύνονται κατά την ανάπτυξη.34,35 Η επιθεώρηση των τρισδιάστατων σχημάτων των νεφρώνων σε συνδυασμό με υπολογιστικές προσομοιώσεις αποκάλυψε επίσης ότι οι νεφρώνες δεν αναμειγνύονται ποτέ και ότι κάθε νεφρώνας τείνει να βρίσκεται σε ένα επίπεδο. Η λειτουργική σημασία αυτής της παρατήρησης μένει να διευκρινιστεί.

Ανάπτυξη κύστης κατά τη διάρκειαπολυκυστική νεφρική νόσοεξακολουθεί να είναι μια ενδιαφέρουσα διαδικασία. Η NPHP, μια παθολογική κατάσταση που χαρακτηρίζεται από ανάπτυξη κύστεων, είναι η πιο κοινή γενετική νόσος που προκαλεί νεφρική νόσο τελικού σταδίου σε παιδιά και εφήβους. Μέχρι στιγμής έχουν ταυτοποιηθεί είκοσι γονίδια NPHP.36 Μεταξύ αυτών, το NEK8 κωδικοποιεί ένα μέλος της οικογένειας κινασών που δεν σχετίζεται ποτέ με τη μίτωση, η οποία παίζει ρόλο στη λειτουργία των βλεφαρίδων και στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.37 Το Nek8 αρχικά χαρακτηρίστηκε ως το γονίδιο που μεταλλάχθηκε σε jck ποντίκια.32 Σημειωτέον, μια μετάλλαξη στον ίδιο τομέα πρωτεΐνης έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε NPHP9 στους ανθρώπους.38 2Μελέτες D πρότειναν ότι η ανάπτυξη κύστης διαφέρει δραματικά μεταξύ των διαφορετικών μορφών πολυκυστικής νόσου των νεφρών.27,29 Ειδικότερα , στο NPHP, οι κύστεις φαίνεται να προέρχονται αποκλειστικά από CD και DCT.31 Αν και ενημερωτικές, αυτές οι ανοσοϊστοχημικές μελέτες δεν μπορούν να υποστηρίξουν την πιθανότητα ότι η απώλεια συγκεκριμένων σωληναριακών δεικτών39 ευθύνεται τεχνητά για αυτήν την παρατήρηση. Έτσι, η τρισδιάστατη μελέτη μας παρέχει την πρώτη σαφή απόδειξη ότι η ανάπτυξη κύστης είναι μια διαδικασία που μπορεί να περιλαμβάνει μόνο συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και το NIMA (Ποτέ στο γονίδιο Α της μίτωσης)–Σχετική κινάση 8 (NEK8) εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα όλων των τμημάτων νεφρώνα, η έκφρασή του στις βλεφαρίδες περιορίζεται σε DCT και CD. Επειδή μόνο αυτά τα τμήματα είναι επιρρεπή στην ανάπτυξη κύστεων,31 μπορούμε να υποθέσουμε ότι η διαταραχή της ακτινωτής λειτουργίας NEK8 είναι το κρίσιμο γεγονός για το σχηματισμό κύστεων. Περιέργως, έχουμε επίσης παρατηρήσει ότι οι ατρακτοειδείς κύστεις βρίσκονται σε συνέχεια με φυσιολογικά μη διασταλμένα σωληνάρια. Το γεγονός ότι μια υπολειπόμενη βλαστική μετάλλαξη οδηγεί σε παθολογικό φαινότυπο μόνο σε ένα υποσύνολο κυττάρων υποδηλώνει ότι ένα δεύτερο συμβάν μπορεί να πυροδοτήσει την ανάπτυξη κύστης σε αυτά τα κύτταρα, όπως προτείνεται για αυτοσωμικά επικρατή πολυκυστικάΝεφρική Νόσος.40,41

Παρατηρήσαμε επίσης ότι η διεύρυνση της κύστης είναι πιο κυρίαρχη στα JNs παρά στα SNs, τουλάχιστον λαμβάνοντας υπόψη τις κύστεις που εντοπίζονται μεταξύ PT και CNT. Συνεχώς, έχει αναφερθεί ότι στο πλαίσιο της σπειραματοσκλήρωσης, οι σπειραματικές αλλοιώσεις εντοπίζονται συχνότερα σε JNs παρά σε SNs.1,21,42 Είτε η υπερκόπωση λόγω της αυξημένηςνεφρώναςΟι ρυθμοί σπειραματικής διήθησης και οι μεταφορικές/ενζυματικές δραστηριότητες ευθύνονται για την αυξημένη ευαισθησία των JNs να επιδεινωθούν είναι μια ενδιαφέρουσα υπόθεση που αξίζει περαιτέρω έρευνα.

Συνοπτικά, περιγράφουμε μια νέα τεχνική για την απεικόνιση των νεφρών σε 3D με επαρκή μοριακή εξειδίκευση και ανάλυση για την άμεση καταγραφή της χωρικής και ποσοτικής κατανομής των ειδικά επισημασμένων εσωτερικών δομών (νεφρώνες, αγγεία και κύστεις). Δεδομένης της ευκολίας, της ταχύτητας και της ικανότητας για άμεση ποσοτικοποίηση, αναμένουμε ότι αυτή η τεχνική θα γίνει ένα ισχυρό εργαλείο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των νεφρών.

Εικόνα 6|Η τρισδιάστατη (3D) ανακατασκευή νεφρώνα αποκαλύπτει ότι οι κύστεις αναπτύσσονται μόνο σε συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα. (α) Αντιπροσωπευτικές τρισδιάστατες εικόνες με απόδοση όγκου κύστης ενός ολόκληρου νεφρώνα (αριστερά πλαίσια) από τα σπειράματα στον αγωγό συλλογής στον επιφανειακό φλοιό (μπλε), στον μεσαίο φλοιό (πράσινο) και στην παραμυελική περιοχή (κόκκινο) σε ποντικούς jck. Τμηματοποίηση νεφρώνων (δεξιά πλαίσια) για τους 3 διαφορετικούς τύπους νεφρώνων. Μπάρα ¼ 150 mm. (β) Πιθανότητα ανάπτυξης κύστεων στα διαφορετικά τμήματα νεφρώνων σε ποντικούς jck. (Συνεχίζεται)

Εικόνα 6|(Συνέχεια) Ο οριζόντιος άξονας είναι ένα κανονικοποιημένο μήκος νεφρώνων που αντιστοιχεί σε 50 κάδους (εγγύς σωληνάριο [PT], τιρκουάζ, βρόχος Henle [HL], λευκό, άπω περιελιγμένο σωληνάριο [DCT], ροζ, συνδετικό σωληνάριο [CNT], κίτρινο) . (γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες αναδόμησης 3D κύστεων με απόδοση όγκου κύστης του ανιόντος άκρου του HL (αριστερά πλαίσια), των DCT (μεσαία πλαίσια) και των CNTs και των φλοιικών αγωγών συλλογής (CCD) (δεξιά πλαίσια) σε επιφανειακά (πάνω πάνελ), μεσαία (μεσαία πλαίσια) και παραμυελικοί (κάτω πάνελ) νεφρώνες σε ποντίκια jck. Μπάρα ¼ 50 mm.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Των ζώων

Όλες οι διαδικασίες για τα ζώα εγκρίθηκαν από τις «Services Vetérinaires de la Préfecture de Police de Paris» και από την επιτροπή δεοντολογίας του Université Paris Descartes. Ποντίκια FVB/N δύο μηνών (n¼ 20) χρησιμοποιήθηκαν για τη ρύθμιση της πειραματικής συνθήκης για την εκκαθάριση των νεφρών. Στη συνέχεια, η μελέτη διεξήχθη σε αρσενικά ποντίκια jck εβδομάδων 2- (n ¼ 4) και συγγενείς μάρτυρες (n ¼ 3).

Προετοιμασία νεφρικών ιστών

Πριν από τη θανάτωση, τα ποντίκια εγχύθηκαν, μέσω ενδοκαρδιακού καθετηριασμού, με 25 ml ηπαρινισμένου αλατούχου ορού (1000 IU/l) ακολουθούμενα από 75 ml 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Τα πειράματα διεξήχθησαν υπό αναισθησία ξυλαζίνης (Rompun 2 τοις εκατό, Bayer, Leverkusen, Γερμανία, 6 mg/g σωματικού βάρους) και κεταμίνης (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Γαλλία, 120 mg/g σωματικού βάρους).

Για μελέτες καθαρισμού, οι νεφροί σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης για 4 ώρες και ενσωματώθηκαν σε 4 τοις εκατό αγαρόζη και τομές πάχους 1.{4}}mm που περιβάλλουν το νεφρικό χείλος κόπηκαν και αποθηκεύτηκαν σε PBS στους 4 C.Τομές νεφρώνπρώτα βάφτηκαν και μετά καθαρίστηκαν.

Για ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε λεπτές τομές,νεφράστερεώθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης όλη τη νύχτα και κόπηκαν τμήματα ενσωματωμένα σε παραφίνη και 4-mm.

Χρώση

Περιοδικό οξύ-Χρώση Schiff. Οι τομές νεφρού 1,5-mm επωάστηκαν σε καθαρό ή 1:100 PBS-αραιωμένο περιοδικό οξύ-Schiff για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τον καθαρισμό.

Ανοσοϊστοχημεία σε λεπτές τομές ενσωματωμένες σε παραφίνη. Τμήματα τεσσάρων μικρομετρικών νεφρών ενσωματωμένων σε παραφιφίνη θερμάνθηκαν για ανάκτηση αντιγόνου και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 C με λεκτίνες συζευγμένες με φθοριοχρωματικό για να εντοπιστούν τα σωληνάρια (συγκολλητίνη ροδαμίνης φιστικιού [RL-1072-5] και ροδαμίνη σιτάρι [RL{{agglutinin 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, αραιωμένο στο 1:200) και ειδικό για το τμήμα πρωτογενές αντίσωμα για την απεικόνιση διακριτών σωληνοειδών τμημάτων (βιοτινυλιωμένη λεκτίνη Lotus tetragonolobus [B-1325], Vector Laboratories, αραιωμένη σε 1: 100, ποντίκι anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Germany, αραιωμένο στο 1:200, κατσίκα anti AQP2 [C-17], Santa Cruz, αραιωμένο σε 1:200) . Την επόμενη μέρα, οι τομές επωάστηκαν με το δευτερεύον αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (Alexa Fluor 488 conjugate [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; Anti-mouse Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA, όλα αραιώθηκαν στο 1:500) πριν χρωματιστούν με 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη. Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν με μικροσκόπιο Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Γαλλία) και προετοιμάστηκαν με χρήση λογισμικού FiJi (έκδοση 1.50).

Χρώση λεκτίνης σε παχιά τμήματα. Οι τομές νεφρού πάχους 1,5-mm επωάστηκαν στους 4 C για 1 μήνα σε λεκτίνες Texas Red ή συζευγμένες με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη: συγκολλητίνη φυστικιού (RL-1072-5) και συγκολλητίνη φύτρων σίτου (RL{{6} }), αραιωμένο σε 1:100 σε 0,1 τοις εκατό αζίδιο PBS και 0,1 τοις εκατό Triton-X. Οι τομές στη συνέχεια πλύθηκαν κάθε μέρα για 2 εβδομάδες με PBS πριν τον καθαρισμό.

Οπτική εκκαθάριση

Για καθαρισμό ζυγαριάς, τομές νεφρού 1,5-mm επωάστηκαν σε ScaleA2 (4 M ουρία, 0.1 τοις εκατό Triton X-100, 10 τοις εκατό γλυκερόλη) ή ScaleB4 (8 Μ ουρία, 0,1 τοις εκατό Triton X-100) για 2 εβδομάδες, έως 1 έτος, στους 4 C.

Για κάθαρση BABB, τμήματα νεφρού 1,5-mm αφυδατώθηκαν σε διαδοχικές εκπλύσεις αιθανόλης σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν σε BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) σε αναλογία 1:2 για τουλάχιστον 2 ημέρες στους 4 C.

Λήψη εικόνας με μικροσκοπία δύο φωτονίων

Οι ιστοί απεικονίστηκαν με υδατική γέλη σε ένα ανεστραμμένο πολυφωτονικό μικροσκόπιο (LaVision BioTec) εξοπλισμένο με λέιζερ Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Συμπληρωματικό Σχήμα S1A). Το μήκος κύματος διέγερσης ήταν 815 nm στο 8 τοις εκατό της ισχύος. Χρησιμοποιήσαμε έναν αντικειμενικό στόχο εμβάπτισης 20 στο νερό (XLUMPLFL20XW, Olympus [Τόκιο, Ιαπωνία]· αριθμητικό διάφραγμα, 0,95· απόσταση εργασίας, 2,0 mm). Για την απόκτηση φθορισμού, χρησιμοποιήσαμε έναν μη σαρωμένο ανιχνευτή στο 80 τοις εκατό με φίλτρο ζώνης 593/40 nm.

Το πρώτο βήμα συνίστατο σε λήψη εικόνας μωσαϊκού 2D στη μεσαία στοίβα z με τη χρήση παραμέτρων μη βέλτιστης λήψης (400 mm 400 mm και 1011 1011 pixel, με 10 τοις εκατό επικάλυψη και μια γραμμή με μέσο όρο 2) για να καθοδηγήσει την επιλογή των πιο σχετικών κεντρικών πεδίων (Συμπληρωματικό Σχήμα S9A). Μόλις ορίστηκαν τα πεδία ενδιαφέροντος xy και z, οι παράμετροι προσαρμόστηκαν για να αποκτήσουν εικόνες υψηλής ποιότητας. Μια τέτοια προσέγγιση μείωσε την περιοχή ενδιαφέροντος σε 5 12 fifields ανά z στοίβα. Στη συνέχεια, αποκτήσαμε στοίβες/οπτικές φέτες 850 z (1-μέγεθος βήματος mm) που περιβάλλουν τον νεφρικό χιτώνα στο μεσαίο τμήμα τουτμήμα νεφρού.

Ραφή εικόνας, επεξεργασία και ανίχνευση

Κάθε στοίβα επιστρώθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε από τους Preibisch et al., 43, η οποία επιτρέπει τη συρραφή μιας μεγάλης συλλογής εικόνων χρησιμοποιώντας το πρόσθετο "Grid/Collection stitching" του λογισμικού των Φίτζι (http:// fifiji.sc/Fiji) . Επειδή παρατηρήσαμε μια σημαντική μετατόπιση μεταξύ 2 γειτονικών εικόνων μετά τη συρραφή, γράψαμε ένα προσαρμοσμένο πρόγραμμα αντιστοίχισης στην Python. Αυτό το πρόγραμμα αντισταθμίζει τη μετατόπιση της εικόνας, επιτρέποντάς μας να ευθυγραμμίσουμε σωστά τις εικόνες (Συμπληρωματικό Σχήμα S9B). Οι ραμμένες-διορθωμένες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Imaris έκδοση 8.4.2 (Bitplane, Ζυρίχη, Ελβετία). Τα σωληνάρια και τα αγγεία εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας τη χειροκίνητη λειτουργία του πακέτου ανίχνευσης νηματίων του Imaris και ενώθηκαν με ένα Imaris Xtension που αναπτύξαμε με το MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Εγγραφή{{12 }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (Συμπληρωματικό Σχήμα S9C). Τα σπειράματα και οι κύστεις ανακατασκευάστηκαν τρισδιάστατα χρησιμοποιώντας τη χειροκίνητη λειτουργία της επιφανειακής συσκευασίας του Imaris. Η 3D χωρική οργάνωση σπειραμάτων εμφανίστηκε χρησιμοποιώντας τη χειροκίνητη λειτουργία του πακέτου σποτ της Imaris.

Μορφομετρία

Το μήκος του σωληνοειδούς τμήματος, το μήκος του νεφρώνα και η ευθύτητα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συσκευασία ιχνηλάτη νηματίων του Imaris. Σύμφωνα με το λογισμικό Imaris, η ευθύτητα ποσοτικοποιήθηκε ως η αναλογία μεταξύ της απόστασης μεταξύ 2 σημείων και του μήκους της διαδρομής του τμήματος νεφρώνων. Τριάντα ένα PTs και 12 ολόκληροι νεφρώνες ανακατασκευάστηκαν και μετρήθηκαν σε 3 ποντίκια άγριου τύπου, ενώ 37 PTs και 17 ολόκληροι νεφρώνες ανακατασκευάστηκαν και μετρήθηκαν σε 4 ποντίκια jck. Κύστη και

Οι σπειραματικοί όγκοι προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την «επιφανειακή συσκευασία» του Imaris. Τριάντα ένα και 34 σπειράματα μετρήθηκαν σε ποντίκια άγριου τύπου και jck, αντίστοιχα. Εβδομήντα τέσσερις κύστεις μετρήθηκαν συνολικά.

Οι γωνίες "εκτός επιπέδου" των σωληνοειδών στροφών (που υποδεικνύονται ως "βήτα") μετρήθηκαν μεταξύ του επιπέδου (που ορίζεται από 3 διαδοχικά σημεία) και της κατεύθυνσης με το επόμενο διαδοχικό τέταρτο σημείο στο διάστημα (Εικόνα 5β). Για να αξιολογήσουμε τη στατιστική σημασία της παρατηρούμενης μεροληψίας, προσομοιώσαμε την κατανομή των γωνιών βήτα με μια τυχαία περιστροφή των γωνιών βήτα (προσομοίωση Monte Carlo) σε δομές που αποτελούνταν από τα ίδια τμήματα με το ίδιο σύνολο γωνιών άλφα.

Για τον υπολογισμό της πιθανότητας ανάπτυξης κυστικής βλάβης κατά μήκοςνεφρώναςτμήματα, αντιπροσωπεύσαμε κάθε νεφρώνα με ένα σύνολο σημείων στο χώρο. Κάθε σημείο σημειώθηκε σε σχέση με την παρουσία κύστης έναντι της φυσιολογικής δομής και τον τύπο του τμήματος. Η πιθανότητα σε κάθε τυποποιημένο μήκος (που ορίζεται σε 50 bins) υπολογίστηκε ως η αναλογία μεταξύ του αριθμού των σημείων με κυστικό σχολιασμό και του συνολικού αριθμού σημείων στον κάδο.

Για τον υπολογισμό της μέσης σπειραματικής ενδιάμεσης απόστασης, θεωρήσαμε για κάθε σπείραμα τη μέση σπειραματική διάσταση που υπολογίζεται στα πλησιέστερα 5 σπειράματα.

Αναλύσεις δεδομένων και στατιστικές

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος SEM. Οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης που ακολουθήθηκε, όταν ήταν σημαντικές (P < {{0}}.05),="" με="" τη="" δοκιμή="" tukey-kramer.="" όταν="" συγκρίθηκαν="" μόνο="" 2="" ομάδες,="" χρησιμοποιήθηκε="" το="" τεστ="" mann-whitney.="" οι="" στατιστικές="" αναλύσεις="" πραγματοποιήθηκαν="" χρησιμοποιώντας="" το="" λογισμικό="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" έκδοση="">

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ

Όλοι οι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Ευχαριστούμε το Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative de Recherche Necker για την τεχνική βοήθεια. Ευχαριστούμε τους Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler και Nicolas Kuperwasser για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου. Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Βασιλεία , Ελβετία), και Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Παρίσι, Γαλλία).

ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΕΣ ΣΥΓΓΡΑΦΕΩΝ

Οι TB, NG και MZ σχεδίασαν και πραγματοποίησαν τα πειράματα και ανέλυσαν τα δεδομένα. Οι FB, LT, MGT και SG πραγματοποίησαν επίσης κάποια πειράματα και ανέλυσαν τα δεδομένα. Οι MB και CN πραγματοποίησαν τα πειράματα με ποντίκια. Η TB και η MZ συνέβαλαν επίσης στη συγγραφή του χειρογράφου. Ο GF αναθεώρησε το χειρόγραφο. Οι FT και MP παρείχαν το εννοιολογικό πλαίσιο και σχεδίασαν τη μελέτη, επέβλεψαν το έργο και έγραψαν την εργασία.

Το κιστάνι μπορεί να τονώσει τα νεφρά

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Συμπληρωματικό αρχείο (PDF)

Εικόνα S1. Πειραματική εγκατάσταση, διαδικασία λήψης και επεξεργασία εικόνας.

Εικόνα S2. Όρια σήματος αυτοφθορισμού σε αναλύσεις xy και z.

Εικόνα S3. Δισδιάστατη εικόνα της μετάβασης μεταξύ PT και TL σε τμήματα νεφρού 4-mm ενσωματωμένα σε παραφίνη.

Εικόνα S4. Δισδιάστατη εικόνα της μετάβασης μεταξύ TAL και DCT σε τμήματα νεφρού 4-mm ενσωματωμένα σε παραφίνη.

Εικόνα S5. Δισδιάστατη εικόνα της μετάβασης μεταξύ DCT και CNT σε τμήματα νεφρού 4-mm ενσωματωμένα σε παραφίνη.

Εικόνα S6. Η τρισδιάστατη ανακατασκευή αποκαλύπτει 3 διαφορετικά σχήματα εγγύς σωληναρίων.

Εικόνα S7. Η τρισδιάστατη ανακατασκευή αποκαλύπτει ότι το μήκος και η κατάτμηση των νεφρώνων δεν επηρεάζονται από τις κύστεις.

Εικόνα S8. Πυκνότητα σπειραμάτων σε νεφρούς ελέγχου και κυστικού νεφρού.

Εικόνα S9. Διαδικασία λήψης και επεξεργασία εικόνας μετά τη θεραπεία.

Πίνακας S1. Σύγκριση μεθόδων εκκαθάρισης. Συμπληρωματικό αρχείο (Ταινίες)

Ταινία S1. Η χρώση με λεκτίνη βελτιώνει σημαντικά την ανάλυση και την αναλογία σήματος προς φόντο.

Ταινία S2. Ανίχνευση της διαδρομής ενός σωληνίσκου.

Ταινία S3. Τρισδιάστατη ανακατασκευή ενός καθαρού νεφρού που δείχνει τη διασταύρωση μεταξύ του εγγύς σωληνίσκου και του λεπτού άκρου του βρόχου Henle.

Ταινία S4. Τρισδιάστατη ανακατασκευή ενός καθαρού νεφρού που δείχνει τη διασταύρωση μεταξύ του παχύ ανιόντος άκρου του βρόχου Henle και του άπω περιελιγμένου σωληναρίου.

Ταινία S5. Τρισδιάστατη ανακατασκευή ενός καθαρού νεφρού που δείχνει τη διασταύρωση μεταξύ του άπω περιελιγμένου σωληναρίου και του συνδετικού σωληναρίου.

Ταινία S6. Το σχήμα και το μέγεθος των εγγύς σωληναρίων διαφέρουν ανάλογα με το βάθος τους.

Ταινία S7. Τρισδιάστατη ανακατασκευή νεφρώνων σε ποντίκια ελέγχου.

Ταινία S8. Ανίχνευση της διαδρομής ενός αγγείου από ένα τοξοειδές αγγείο σε ένα αγγείο φλοιώδους ακτινοβολίας.

Ταινία S9. Τα τοξοειδή αγγεία διαμορφώνουν το σχήμα των παραμυελών εγγύς σωληναρίων.

Ταινία S10. Οι νεφρώνες τείνουν να βρίσκονται σε ένα αεροπλάνο.

Ταινία S11. Η τρισδιάστατη ανακατασκευή νεφρώνα δείχνει ένα συγκεκριμένο μοτίβο για την ανάπτυξη κύστης.

Ταινία S12. Η τρισδιάστατη κατάτμηση νεφρώνων αποκαλύπτει ότι οι κύστεις αναπτύσσονται σε συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα.

Ταινία S13. Χωρική διάταξη και αλληλοσυσχέτιση νεφρώνων και αγγείων σε πολυκυστικό νεφρό

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Πλούσιο AR. Μια άγνωστη μέχρι τώρα ευπάθεια των παραμυελικών σπειραμάτων στη λιποειδή νέφρωση. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957, 100:173-186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Ετερογένεια της ανατομίας του νεφρώνα. Kidney Int Suppl. 1987, 20: S25–S39.

3. Christensen ΕΙ, Grann Β, Kristoffersen ΙΒ, et al. Τρισδιάστατη ανακατασκευή του νεφρώνα του αρουραίου. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn Η, Jensen KB, et αϊ. Ψηφιακή τρισδιάστατη ανακατασκευή και υπερδομή του εγγύς σωληναρίου του ποντικιού. J Am Soc Nephrol. 2003; 14:611-619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn Η, et αϊ. Τρισδιάστατη ανακατασκευή του νεφρώνα του ποντικού. J Am Soc Nephrol. 2006; 17:77–88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Μπορούμε να δούμε καθαρά τώρα: οπτική κάθαρση και μορφομετρία των νεφρών. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017; 26:179–186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Τεχνικές εκκαθάρισης και επισήμανσης για βιολογικούς ιστούς μεγάλης κλίμακας. ΜοΙ Cells. 2016; 39:439–446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Λειψία, Γερμανία: S. Hierzel; 1914.

9. Hama Η, Kurokawa Η, Kawano Η, et αϊ. Κλίμακα: μια χημική προσέγγιση για απεικόνιση φθορισμού FL και ανακατασκευή διαφανούς εγκεφάλου ποντικιού. Nat Neurosci. 2011; 14:1481–1488.

10. Ertürk Α, Becker Κ, Jährling Ν, et al. Τρισδιάστατη απεικόνιση οργάνων που έχουν καθαριστεί με διαλύτη χρησιμοποιώντας 3DISCO. Nat Protoc. 2012; 7:1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali Ρ, et al. ClearT: μέθοδος καθαρισμού χωρίς απορρυπαντικά και διαλύτες για νευρωνικούς και μη νευρωνικούς ιστούς. Ανάπτυξη. 2013, 140:1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. Οπτικός καθαρισμός σταθεροποιημένων δειγμάτων εγκεφάλου χρησιμοποιώντας SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014; 66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY για χαρτογράφηση του νευρικού συστήματος. Μέθοδοι Nat. 2013; 10:508–513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY για γρήγορη και υψηλής ανάλυσης απεικόνιση ανέπαφων ιστών. Nat Protoc. 2014; 9:1682–1697.

15. Yang Β, Treweek JB, Kulkarni RP, et αϊ. Φαινότυπος μονοκυττάρου εντός διαφανούς ανέπαφου ιστού μέσω καθαρισμού ολόκληρου του σώματος. Κύτταρο. 2014, 158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Απεικόνιση ολόκληρου του εγκεφάλου με ανάλυση ενός κυττάρου με χρήση χημικών κοκτέιλ και υπολογιστικής ανάλυσης. Κύτταρο. 2014; 157:726-739.

17. Alanentalo Τ, Asayesh Α, Morrison Η, et αϊ. Τομογραφική μοριακή απεικόνιση και τρισδιάστατη ποσοτικοποίηση σε όργανα ενηλίκου ποντικού. Μέθοδοι Nat. 2007; 4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et αϊ. Πολυφωτονική μικροσκοπία καθαρισμένων οργάνων ποντικιού. J Biomed Opt. 2010; 15:036017.

19. Renier Ν, Wu Z, Simon DJ, et αϊ. iDISCO: μια απλή, γρήγορη μέθοδος για την ανοσοσήμανση μεγάλων δειγμάτων ιστού για απεικόνιση όγκου. Κύτταρο. 2014, 159: 896–910.

20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Βελτιωμένη εφαρμογή της ηλεκτροφορητικής τεχνολογίας καθαρισμού ιστών, CLARITY, σε άθικτα στερεά όργανα, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, του παγκρέατος, του ήπατος, των νεφρών, των πνευμόνων και του εντέρου. BMC Dev Biol. 2014; 14:1–7.

21. Iversen BM, Amann Κ, Kvam FI, et al. Η αυξημένη σπειραματική τριχοειδική πίεση και το μέγεθος προκαλούν σπειραματοσκλήρωση στον παραμυελικό φλοιό SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Απεικόνιση του νεφρού: από το φως στη μικροσκοπία υπερ-ανάλυσης. Μεταμόσχευση Nephrol Dial. 2021; 36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Επικύρωση τρισδιάστατης μεθόδου μέτρησης και ταξινόμησης ποδοκυττάρων σε ολόκληρα σπειράματα. J Am Soc Nephrol. 2016; 27:3093–3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Ο ρόλος της τρισδιάστατης αρχιτεκτονικής στον μηχανισμό συγκέντρωσης ούρων του εσωτερικού μυελού του νεφρού αρουραίου. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Η οπτική κάθαρση στο νεφρό αποκαλύπτει την αναδιαμόρφωση των σωληναρίων με τη μεσολάβηση του καλίου. Cell Rep. 2018; 25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel Μ, Platonova Ε, et αϊ. Η συνδυασμένη δομική και λειτουργική απεικόνιση του νεφρού αποκαλύπτει σημαντικές αξονικές διαφορές στην ενδοκυττάρωση του εγγύς σωληναριού. J Am Soc Nephrol. 2018; 29:2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et αϊ. Πολυκυστική νεφρική νόσο. Nat Rev Dis Prim. 2018; 4:50.

29. Wilson PD. Πολυκυστική νεφρική νόσο. N Engl J Med. 2004; 350:151-164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Αλλαγές στο πρότυπο γλυκοζυλίωσης κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του νεφρού ποντικού όπως αποκαλύπτεται με συζυγή λεκτίνης. J Histochem Cytochem. 1987; 35:55-65.

31. Smith LA, Bukanov ΝΟ, Husson Η, et al. Ανάπτυξη πολυκυστικής νεφρικής νόσου σε νεαρά ποντίκια κυστικού νεφρού: πληροφορίες για την παθογένεση, τις ανωμαλίες των βλεφαρίδων και τα κοινά χαρακτηριστικά με την ανθρώπινη ασθένεια. J Am Soc Nephrol. 2006; 17:2821-2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T, et αϊ. Ένα ελάττωμα σε μια νέα κινάση της οικογένειας Nek προκαλεί κυστική νεφρική νόσο στο ποντίκι και στο ζέβρα. Ανάπτυξη. 2002; 129:5839-5846.

33. Franke Μ, Baeßler Β, Vechtel J, et al. Χαρτογράφηση μαγνητικού συντονισμού T2 και απεικόνιση με στάθμιση διάχυσης για έγκαιρη ανίχνευση κυστεογένεσης και ανταπόκρισης στη θεραπεία σε μοντέλο ποντικού πολυκυστικής νεφρικής νόσου. Kidney Int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Μοριακοί καθοριστικοί παράγοντες της αγγειακής εξειδίκευσης του νεφρώνα στο νεφρό. Nat Commun. 2019; 10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Επικοινωνία ενδοθηλίου-επιθηλίου στην πολυκυστική νεφρική νόσο: ρόλος της σηματοδότησης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα. Σήμα κυψέλης. 2020; 72: 109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Πολλά γονίδια-ένα ασθένεια; Γενετική της νεφρονοφθίσεως (NPHP) και διαταραχών που σχετίζονται με NPHP. Εμπρός Παιδιατρ. 2017; 5:287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου από την οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών ΝΕΚ. J Cell Sci. 2012; 125:4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Οι μεταλλάξεις NEK8 επηρεάζουν τον ακτινωτό και τον κεντροσωματικό εντοπισμό και μπορεί να προκαλέσουν νεφρονοφθίαση. J Am Soc Nephrol. 2008; 19:587-592.

39. Wilson PD. Αρικοβασική πολικότητα στο επιθήλιο πολυκυστικής νεφρικής νόσου. Biochim Biophys Acta. 2011; 1812: 1239-1248.

40. Happé Η, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Ο τοξικός σωληναριακός τραυματισμός σε νεφρούς από ποντίκια διαγραφής Pkd1-επιταχύνει την κυστεογένεση συνοδευόμενη από απορρυθμισμένη επίπεδη πολικότητα κυττάρων και κανονικές οδούς σηματοδότησης Wnt. Hum Mol Genet. 2009, 18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Ένας κρίσιμος αναπτυξιακός διακόπτης καθορίζει την κινητική του σχηματισμού νεφρικής κύστης μετά από απώλεια Pkd1. Nat Med. 2007, 13:1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Μηχανισμός της μοναδικής ευαισθησίας των βαθιών φλοιωδών σπειραμάτων των νεφρών που ωριμάζουν σε σοβαρή εστιακή σπειραματική σκλήρυνση. Pediatr Res. 1990; 28:270-276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Παγκόσμια βέλτιστη συρραφή των κεραμιδιών 3D μικροσκοπικών λήψεων εικόνων. Βιοπληροφορική. 2009, 25: 1463–1465.