Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Κάντε κλικ εδώ για πληροφορίες σχετικά με το Μέρος II (Εισαγωγή, υλικά και μέθοδοι ) αυτού του άρθρου.

Σχεδόν μονοκυτταρική πρωτεομική Προσδιορισμός του εγγύς σωληναριακού και σπειραματιού του φυσιολογικού ανθρώπινου νεφρού

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Σουντέσνα Ρόι¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Γινγκ Ζου³, Priyanka Rashmi¹, Άντριου Σρέντερ¹, Ιζαμπέλα Νταμ¹, Σβάστικα Σουρ¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* και Minnie M. Sarwal¹* για την Κοινοπραξία Kidney Precision Medicine Project (KPMP).

¹Division of Multi Organ Transplantation, Department of Surgery, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, Ηνωμένες Πολιτείες

²Εθνικό Εργαστήριο Βορειοδυτικού Ειρηνικού, Τμήμα Βιολογικών Επιστημών, Richland, WA, Ηνωμένες Πολιτείες

³Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Μοριακών Επιστημών, Εθνικό Εργαστήριο Βορειοδυτικού Ειρηνικού, Ρίτλαντ, Ουάσιγκτον, Ηνωμένες Πολιτείες

⁴Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν, Ann Arbor, MI, Ηνωμένες Πολιτείες

Λέξεις-κλειδιά:σπειράματος, φασματομετρία μάζας, ανάλυση ενός κυττάρου, πρωτεϊνική,νεφρό

Οι μοριακές αξιολογήσεις σε επίπεδο μονοκυττάρου μπορούν να επιταχύνουν τη βιολογική έρευνα παρέχοντας λεπτομερείς αξιολογήσεις της κυτταρικής οργάνωσης και της ετερογένειας των ιστών τόσο σε ασθένειες όσο και σε υγεία. Ο άνθρωποςνεφρόέχει πολύπλοκες πολυκυτταρικές καταστάσεις με ποικίλη λειτουργικότητα, πολλές από τις οποίες μπορούν πλέον να αξιοποιηθούν πλήρως με τις πρόσφατες τεχνολογικές εξελίξεις στην πρωτεϊνομική ιστών σε σχεδόν μονοκύτταρο επίπεδο. Συζητάμε τα θεμελιώδη βήματα στην πρώτη εφαρμογή αυτής της μεθόδου πρωτεωμικής βασισμένης στη φασματομετρία μάζας (MS) για την ανάλυση υποτμημάτων του φυσιολογικού ανθρώπουνεφρό, στο πλαίσιο του έργου Kidney Precision Medicine Project (KPMP). Χρησιμοποιώντας ~30–40 νεφρικά κύτταρα που έχουν συλληφθεί με λέιζερ, εντοπίσαμε περισσότερες από 2.500 ανθρώπινες πρωτεΐνες, με εξειδίκευση στηνεγγύς σωληνοειδές(PT; n=25 πρωτεΐνες) και σπειραματικές (Glom; n=67 πρωτεΐνες) περιοχές τουνεφρόκαι τις μοναδικές μεταβολικές τους λειτουργίες. Αυτή η πιλοτική μελέτη παρέχει τον οδικό χάρτη για την εφαρμογή της ροής εργασιών πρωτεομικής σχεδόν μονοκυττάρων για την ανάλυση άλλων νεφρικών μικροδιαμερισμάτων, σε μεγαλύτερη κλίμακα, για την αποκάλυψη διαταραχών της νεφρικής υποκυτταρικής λειτουργίας στον φυσιολογικό νεφρό καθώς και διαφορετικών αιτιολογιών της οξείας και της χρόνιαςΝεφρική Νόσος.

το κιστάνι μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

Εισαγωγή

Οι πρόσφατες εξελίξεις στο μοριακό προφίλ, ειδικά η μεταγραφική ανάλυση σε επίπεδο μονοκυττάρου, μπορούν να αποκαλύψουν σπάνιους κυτταρικούς πληθυσμούς εντός ετερογενών κλινικών ιστών, γεγονός που συμβάλλει στην κατανόησή μας για τη βιολογία των νεφρών και τις μοριακές διεργασίες του (1-7). Υπάρχει μια ανεκπλήρωτη ανάγκη ανάπτυξης μεθόδων που μπορούν να παρέχουν ολοκληρωμένες βιολογικές πληροφορίες σε επίπεδα RNA και DNA και επίσης να επιτρέπουν την ανάλυση μονοκυττάρου πρωτεωμικού ιστού.

Οι πρωτεομικές τεχνολογίες, σε αντίθεση με τη γονιδιωματική, μπορούν να παρέχουν λειτουργικές πληροφορίες για τις κυτταρικές καταστάσεις και τα ρυθμιστικά δίκτυα (2). Μια τεχνολογική πρόκληση για πρωτεομική που βασίζεται στη φασματοσκοπία μάζας (MS) είναι ο περιορισμός της πρώτης ύλης. Σε αντίθεση με τη μεταγραφική, η πρωτεϊνομική δεν επιτρέπει τη μοριακή ενίσχυση. Αυτό το γεγονός οδήγησε σε ουσιαστικές προσπάθειες για την ενίσχυση της αναλυτικής ευαισθησίας των πρωτεϊνικών που βασίζονται σε MS, συμπεριλαμβανομένης της μικροποίησης τεχνολογίας και υψηλότερης απόδοσης στην πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (8, 9), έτσι ώστε η αναλυτική ευαισθησία να είναι πλέον επαρκής για την ανίχνευση πρωτεϊνών σε ένα μόνο θηλαστικό κύτταρα. Παρά την υψηλή αναλυτική ευαισθησία, οι πρωτεομικές εφαρμογές σε μικρούς όγκους δειγμάτων έχουν εισαγάγει πρόσθετες προκλήσεις, όπως η μη ειδική προσρόφηση πρωτεϊνών και πεπτιδίων στις επιφάνειες των σωλήνων αντίδρασης, η αναποτελεσματική κινητική πέψης, η ανάγκη καθαρισμού και οι προκλήσεις με την παράδοση. Η ομάδα μας ανέφερε πρόσφατα τη μέθοδο σχεδόν ενός κυττάρου πρωτεομικής (nscProteomics) σε κύτταρα HeLa, η οποία παρέχει εξαιρετικά καινοτόμο και ευαίσθητη τεχνολογία για μετρήσεις πρωτεώματος δειγμάτων με ποσότητες πρωτεΐνης κάτω από νανογραμμάρια από μικρό αριθμό κυττάρων (10). Αυτή η μέθοδος απαιτεί εξαιρετικά προσαρμοσμένο εξοπλισμό επεξεργασίας δειγμάτων και είναι δύσκολο να μεταφερθεί σε άλλα ερευνητικά εργαστήρια στην τρέχουσα κατάσταση ανάπτυξής της. Επεξεργασία ανθρώπουνεφρόΟι ιστοί μέσω αυτού του αγωγού χρειάστηκαν ιδιαίτερη προσοχή στην ανάπτυξη πρωτοκόλλου προκειμένου να βελτιστοποιηθεί η διατήρηση των ιστών και η σύλληψη των κυττάρων.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επικεντρωθεί στην παροχή ενός οδικού χάρτη για την επιτυχή μέτρηση της πρωτεομικής ανάκρισης διαφόρων υποδιαμερισμάτωννεφρό, σε σχεδόν μονοκύτταρο επίπεδο, με τα ακόλουθα παραδοτέα: (i) Αξιολόγηση της βέλτιστης συλλογής και αποθήκευσης νεφρικού ιστού για nscProteomics. (ii) Προσδιορισμός του κατάλληλου προτύπου αναφοράς για το nscProteomics. (iii) Βελτιστοποίηση του πάχους του νεφρικού ιστού για μικροτομή σύλληψης με λέιζερ (LCM). (iv) Βελτιστοποίηση των παραμέτρων LCM. (v) Περιγραφή της μεθόδου nscProteomics με χρήση μιας πλήρως αυτοματοποιημένης μεθόδου micro POTS που βασίζεται σε LC-MS (μPOTS; Επεξεργασία σε ένα δοχείο για δείγματα ιχνών) (11). (vi) Αναλύσεις δεδομένων για nscProteomics.

Για την επίτευξη των προαναφερθέντων εργασιών, έχουμε επεξεργαστεί 11 μοναδικούς ανθρώπουςνεφρόβιοψίες και ανέπτυξαν πρωτόκολλα και μεθοδολογίες για τη συλλογή, την επεξεργασία και την ανάκριση της πρωτεωμικής έκφρασης του ανθρώπουνεφρόδείγματα από μPOTS. Όταν συνδυάζεται με εξαιρετικά ευαίσθητο LC-MS, επιδεικνύουμε μια πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδο μPOTS που επιτρέπει την αναπαραγωγιμότητα και παρέχει ποσοτικές πρωτεομικές μετρήσεις ~3,000 πρωτεϊνών από 10 έως 100 νεφρικά κύτταρα που συλλαμβάνονται με λέιζερ. επίπεδο κάλυψης που είχε επιτευχθεί μόνο στο παρελθόν για χιλιάδες κελιά (12–17). Αυτή η μελέτη θα βοηθήσει στον μοριακό χαρακτηρισμό της κυτταρικής ετερογένειας και παθολογίας των ιστών σε βιοψίες νεφρού από ασθενείς με διαφορετικά αίτια οξείας και χρόνιας νεφρικής νόσου. Αυτή η μοναδική τεχνολογία έχει τη δυνατότητα να ξετυλίξει την πρωτεομική ετερογένεια και τους μοναδικούς δείκτες πρωτεΐνης σε διαφορετικάνεφρόυπο-τύπους και υποδομές της νόσου που θα συσχετίζονται με την παθογένεια της νόσου, την πρόγνωση και τη διαστρωμάτωση κινδύνου. Η μελέτη συνοψίζεται στο Σχήμα 1.

Σχήμα 1. Η ροή εργασίας σχεδόν μονοκύτταρου πρωτεομικής (nscProteomics) έχει βελτιστοποιηθεί για την επεξεργασία του ανθρώπουνεφρόιστούς. Η ροή εργασίας περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του βέλτιστουνεφρόσυλλογή και αποθήκευση ιστού, οι ποιοτικοί έλεγχοι για τη μικροτομή σύλληψης με λέιζερ καθιέρωση της μεθόδου nscProteomics για τα νεφρικά κύτταρα.

Πειραματικές διαδικασίες

Σχεδιασμός Μελέτης

Η σχηματική αναπαράσταση των πρωτεομικών μελετών που πραγματοποιήθηκαν σε 11 μοναδικά ανθρώπινα φυσιολογικάνεφράφαίνεται στο Σχήμα 2Α. Πραγματοποιήθηκαν συνολικά 28 δοκιμές φασματομετρίας μάζας (MS) για NScProteomics με μικρο-ανατομή (LCM) σύλληψης με λέιζερ σε ζευγαρωμένες σπειραματικές (Glom) και εγγύς ελικοειδή σωληναριακές τομές (PT). Χαρτομάντηλα από τα δύο πρώτανεφράδιατηρήθηκαν ως FFPE και σε μέσο ένωσης βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής (OCT). Τα προβλήματα νεφρικού ιστού από 9 ακόμη νεφρούς υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο στην OCT (Εικόνα 2Α).

Σχήμα 2. (Α) Περίληψη δειγμάτων και δοκιμασιών της μελέτης. (Β) Το διάγραμμα QC για την αναπαραγωγιμότητα της διαδικασίας χρησιμοποιώντας ιστό OCT. Οι διαφορές φασματικού αριθμού μεταξύ πρωτεϊνών για 2 ξεχωριστές δοκιμές χρησιμοποιώντας ιστό OCT σχεδιάστηκαν έναντι του μέσου φασματικού αριθμού πρωτεϊνών για 1.257 πρωτεΐνες. Στην πλοκή, η μπλε γραμμή απεικονίζει τη μέση διαφορά. οι κόκκινες και πράσινες γραμμές απεικονίζουν όρια 2 SD και 3 SD αντίστοιχα. Το 97,96 τοις εκατό των πρωτεϊνών είναι εντός του υπολογισμένου ορίου αναπαραγωγιμότητας του 13,52, υποδηλώνοντας υψηλό βαθμό αναπαραγωγιμότητας. Φαίνεται επίσης ότι η μεταβλητότητα μεταξύ της διαδικασίας που περιλαμβάνει ιστό OCT είναι χαμηλότερη από εκείνη της διαδικασίας που περιλαμβάνει ιστό FFPE (υπολογισμένο όριο αναπαραγωγιμότητας: 24,43). (Γ) Σύγκριση κατανομών φασματικού αριθμού 374 κοινών πρωτεϊνών σε OCT και FFPE. Ένας μεγαλύτερος αριθμός πρωτεϊνών από ιστό OCT εμφανίζει υψηλές φασματικές μετρήσεις ενώ υψηλότερη υπεροχή χαμηλών φασματικών μετρήσεων παρατηρείται για πρωτεΐνες από ιστό FFPE. (Δ) Σύγκριση κατανομών φασματικού αριθμού 76 μοναδικών πρωτεϊνών στο FFPE και 244 μοναδικών πρωτεϊνών στο OCT. Η μεγαλύτερη υπεροχή πρωτεϊνών χαμηλού φασματικού αριθμού παρατηρείται στον ιστό OCT. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι η τεχνική OCT ιστού είναι καλύτερη για την ανίχνευση πρωτεϊνών με χαμηλή αφθονία στο τρέχον σενάριο. Ο συντελεστής συσχέτισης μεταξύ πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν από κατεψυγμένους ιστούς 2 OCT ήταν 0.96 (P <>

Λήψη δείγματος ιστού νεφρού

Ο άνθρωποςιστούς των νεφρώνσυλλέχθηκαν από ένα σύνολο 11 αποπροσδιορισμένων μερικών νεφρεκτομών, που ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια του Σαν Φρανσίσκο (UCSF) και το Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν (UM), με εγκεκριμένο IRB, ως μέρος μιας πιλοτικής μελέτης σκοπιμότητας τεχνολογίας στο NIH Kidney Precision Medicine Έργο (KPMP). Μόνο η υγιής περιοχή τουνεφρόόπως καθορίστηκε από εκπαιδευμένο παθολόγο χρησιμοποιήθηκε για το σκοπό αυτό. Τα δείγματα ήταν ανώνυμα με τη μόνη προειδοποίηση ότι οι ιστοί συλλέχθηκαν από ενήλικες. Για να αξιολογηθεί το βέλτιστο πρωτόκολλο συλλογής δειγμάτων για την τεχνολογία, αρχικά, ~100 mg ιστού από 2 νεφρούς διαιρέθηκε ισόποσα και είτε παρασκευάστηκε ως τομές ιστού με φορμαλίνη ενσωματωμένες σε παραφίνη (FFPE) είτε καταψύχθηκε στο Tissue-Plus™ OCT Compound (Fisher Scientific). Ένα διαδοχικό τμήμα πάχους 5 μm και τρεις διαδοχικές τομές πάχους 10 μm κόπηκαν από κάθε μπλοκ OCT με κρυομικρότομο και τοποθετήθηκαν σε πλάκες μεμβράνης 1,0 τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου (PET) (Zeiss) για σπειραματικά καιεγγύς σωληνάριοανατομή. Το τμήμα πάχους 5 μm χρωματίστηκε με H&E για οπτικοποίηση των κύριων ιστολογικών δομών. Οι υπόλοιπες τομές πάχους 10 μm έμειναν άχρωμες. Όλες οι διαφάνειες αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς μέχρι την ανατομή.

Cistanche για τη βελτίωση της νεφρικής δυσλειτουργίας

Εκτίμηση Επιπτώσεων της Αποστολής και Επεξεργασίας Ιστών στην Πρωτεομική Παραγωγή

Για την αξιολόγηση του αντίκτυπου των καθυστερήσεων στην πρωτεομική ανάλυση κατεψυγμένου ιστού ΥΧΕ,νεφρόtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 ώρες ταξίδι μακριά, και επεξεργασία στο δεύτερο κέντρο, και αντίστροφα. Η μαζική πρωτεομική πραγματοποιήθηκε σε δύο 2 μοναδικάνεφρά(νεφρός #3, #4), προμηθεύτηκε στο Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν και αποστέλλεται σε 2 διαφορετικές τοποθεσίες (Πανεπιστήμιο του Οχάιο και UCSF) για ανάλυση ΣΚΠ, χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο και παραμέτρους MS και στις δύο τοποθεσίες. Τα αποτελέσματα των εκτελέσεων MS συγκρίθηκαν στη συνέχεια μεταξύ των 2 θέσεων.

Εκχύλιση και Κατακρήμνιση Πρωτεϊνών

Αυτό διεξήχθη και στις δύο μεθόδους προετοιμασίας ιστού OCT και FFPE για την επιλογή της βέλτιστης μεθόδου για πρωτεομική ιστών. Ο ιστός OCT τεμαχίστηκε σε τμήματα πάχους 10 μm χρησιμοποιώντας κρυομικρότομο. Για να επιλέξετε την ελάχιστη ποσότητα ιστού που απαιτείται για την εκχύλιση πρωτεΐνης για σκλήρυνση κατά πλάκας, τρεις μπούκλες (ένα τμήμα που τοποθετείται σε ένα σωλήνα Eppendorf αντί να απλωθεί στη διαφάνεια) και 5 μπούκλες κατεψυγμένου ιστού κόπηκαν, αποψύχθηκαν και μεταφέρθηκαν σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης που περιέχει ένα σφαιρίδιο από ανοξείδωτο χάλυβα 5 mm (Qiagen), εκτεθειμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων θηλαστικών (συμπεριλαμβανομένου του διαλύματος αναστολέα νουκλεάσης Benzonase® και πρωτεάσης· Qiagen) και ομογενοποιήθηκε σε TissueLyser LT (Qiagen) στους 50 r/s για 3 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε (δοκιμή Bradford, Thermo Scientific) και αποθηκεύτηκε στους -20 βαθμούς μέχρι τη χρήση. Αποθηκευμένος ιστός για<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Πέψη θρυψίνης

Περίπου 150 ug ολικής πρωτεΐνης (~15 τοις εκατό της διαθέσιμης εισροής) εκτέθηκαν σε αναγωγικούς παράγοντες (200 mM DTT και 100 mM Tris-HCl) και αλκυλιωτικά αντιδραστήρια (200 mM ιωδοακεταμίδιο και 100 mM Tris-HCl) και στη συνέχεια αραιώθηκε με νερό χωρίς RNAse/DNAse για να μειωθεί η συγκέντρωση Ουρίας στα 0,6 Μ. Προστέθηκαν τέσσερα ug χοίρου Τρυψίνης (Sigma) και το δείγμα υπέστη πέψη στους 37 βαθμούς. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά (δοκιμή Bradford, ThermoScientific) και 10 ug πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για την MS.

MS for Bulk Proteomics για την αξιολόγηση της βέλτιστης μεθόδου επεξεργασίας ιστού νεφρού

Το μίγμα τρυπτικών πεπτιδίων οξινίστηκε με μυρμηκικό οξύ, καθαρίστηκε με στήλες C18 Monospin και αναλύθηκε στο Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). Το MS/MS διεξήχθη χρησιμοποιώντας Διάσταση C-Trap Higher-Energy (HCD). Τα φάσματα μάζας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Byonic v2.14.27 (Protein Metrics) επιτρέποντας ανοχές μάζας 12 ppm. Επιτράπηκαν μεταβλητές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένης της οξείδωσης, της μεθυλίωσης, της καρβαμυλίωσης και της φωσφορυλίωσης. Οι πρωτεΐνες περιορίστηκαν σε εκείνες που είχαν καλύτερη βαθμολογία από ένα ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης 1 τοις εκατό (FDR). Έγιναν συγκρίσεις αφθονίας πρωτεϊνών και δεδομένων MS για την επιλογή της βέλτιστης μεθόδουνεφρόσυλλογή ιστού μεταξύ FFPE και OCT.

Laser Capture Microdissection

Τα μη λεκιασμένα τμήματα πάχους 5, 10 και 20 μM τοποθετημένα σε αντικειμενοφόρους πλάκες PET τοποθετήθηκαν στη σκηνή του συστήματος μικροδιατομής λέιζερ Zeiss PALM MicroBeam (Zeiss) για να δοκιμαστεί το βέλτιστο πάχος κοπής. Σπειραματική καιεγγύς σωληνάριοΟι περιοχές επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το ελεύθερο εργαλείο και οι ανατομές πραγματοποιήθηκαν σε αντικειμενικό 10Χ. Καταγράφηκαν τομές με εμβαδόν ~4.580 μm2 και πάχος 10 uM, οι οποίες αντιστοιχούσαν σε ~40 σπειραματικά κύτταρα με βάση τον προηγουμένως δημοσιευμένο τύπο για την εκτίμηση των σπειραματικών κυττάρων σε έναν υγιή ενήλικανεφρό(18). Για τοεγγύς σωληνοειδέςκύτταρα, συλλάβαμε ~2.900 μm2 τουεγγύς σωληνοειδέςκύτταρα, τα οποία αντιστοιχούσαν σε ~36 κελιά. Τα κομμένα τμήματα καταπέλθηκαν σε ένα αδιαφανές αυτοκόλλητο καπάκι 200 ​​μL (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς.

Near-Single-Cell-Proteomics (nscProteomics)

Για να διαλυτοποιηθούν οι πρωτεΐνες που συλλέγονται σε πώματα σύλληψης με LCM, προστέθηκε απευθείας στο πώμα ένα σταγονίδιο 10 μL 0,1 τοις εκατό DDM 50 mM Tris pH 8. Τα δείγματα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς σε θερμομίκτη Eppendorf ThermoTop για να μειωθεί η εξάτμιση, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στα 2,000 × g για 1 λεπτό για να μεταφερθεί το προϊόν λύσης στο φιαλίδιο. Οι πρωτεΐνες μειώθηκαν με 5 mM διθειοθρεϊτόλη και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Η αλκυλίωση διεξήχθη σε 10 mM ιωδοακεταμιδίου με επώαση 45 λεπτών στο σκοτάδι στους 25 βαθμούς. Στη συνέχεια, προστέθηκε κλάσμα 10 ng Ls-C που ακολουθήθηκε από επώαση 3 ωρών στους 25 βαθμούς. Στη συνέχεια προστέθηκε ένα κλάσμα 10 ng θρυψίνης που ακολουθήθηκε από ολονύκτια πέψη στους 25 βαθμούς. Τα πεπτίδια που υπέστησαν πέψη αναμίχθηκαν με ένα δείγμα 15 μL 18 MΩ νερού.

Πλατφόρμα LC-MS για τα εξαιρετικά μικρά δείγματα

Τα δείγματα πεπτιδίων (25 μL) διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας στήλη 60 cm, με εσωτερική διάμετρο 50 μm και ενσωματωμένο πομπό (Νέος στόχος). Οι στήλες συσκευάστηκαν εσωτερικά με μέσα Waters BEH διαμέτρου 1,7 μm. Μια 100-λεπτή κλίση παρήχθη χρησιμοποιώντας μια νανοαντλία Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Αυτό το σύστημα συζεύχθηκε με ένα φασματόμετρο μάζας QExactive Plus (Thermo Scientific). Τα φάσματα μάζας συλλέχθηκαν από 300 έως 1.800 m/z, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο απόκτησης εξαρτώμενων από δεδομένα κορυφαίων 12. Τα φάσματα MS1 συλλέχθηκαν με ανάλυση μάζας 35Κ και MS2 με 17,5Κ. Χρησιμοποιήθηκε μέγιστο IT 100 ms για να αυξηθούν οι ταυτοποιήσεις από ιόντα χαμηλής αφθονίας.

Πρωτεομική εξαγωγή δεδομένων

Όλα τα ακατέργαστα αρχεία υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας MaxQuant (έκδοση 1.5.3.30) για ανίχνευση χαρακτηριστικών, αναζήτηση βάσης δεδομένων και ποσοτικοποίηση πρωτεΐνης/πεπτιδίου (19) σύμφωνα με τις ρυθμίσεις που περιγράφηκαν προηγουμένως (10). Τα διαδοχικά φάσματα μάζας αναζητήθηκαν στην ανθρώπινη βάση δεδομένων UniProtKB/Swiss-Prot (λήφθηκε στις 29 Δεκεμβρίου 2018 και περιείχε 20.417 ελεγμένες εγγραφές). Τα δεδομένα MS proteomics για το nscProteomics έχουν κατατεθεί στην κοινοπραξία ProteomeXchange μέσω του αποθετηρίου συνεργατών PRIDE (20) με το αναγνωριστικό δεδομένων PXD015058 και 10.6019/PXD015058.

Ανάλυση δεδομένων

Τα δεδομένα MS ελήφθησαν από πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο PNNL (nscProteomics) και στο Πανεπιστήμιο Stanford (μαζική πρωτεϊνική). Για χύμα πρωτεϊνική. Για την επιλογή της βέλτιστης χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες στατιστικές μέθοδοινεφρόμέθοδος συλλογής ιστού, είτε κατεψυγμένη σε OCT είτε επεξεργασμένη ως FFPE, όπως αξιολογήθηκε με ποσοτική πρωτεϊνική χύδην ιστού, (i) Υπολογίστηκε η απόδοση πρωτεΐνης/mg ισοδύναμου ιστού εισόδου. (ii) Η αναπαραγωγιμότητα του MS δοκιμάστηκε στην έξοδο MS από τμήματα FFPE και OCT από καθένα από τους 2 νεφρούς, που παρασκευάστηκαν από το ίδιο άτομο χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο, αναλύθηκαν στο ίδιο όργανο MS χρησιμοποιώντας ένα καθορισμένο πρωτόκολλο, με διαφορά λίγων ημερών (21). Ένα όριο αναπαραγωγιμότητας (22) χρησιμοποιήθηκε για να παρέχει ένα κατά προσέγγιση όριο στις διαφορές μέτρησης μεταξύ διαδοχικών εκτελέσεων μιας μεμονωμένης διαδικασίας, καθώς και μια εκτίμηση της ακρίβειας για σύγκριση μεταξύ διεργασιών. Υπολογίστηκε ο συντελεστής συσχέτισης, ο οποίος παρείχε τον βαθμό συμφωνίας μεταξύ διαδοχικών δοκιμών (χρησιμοποιώντας τον ίδιο ιστό). (iii) Η αφθονία πρωτεΐνης και η κατανομή μεγέθους πεπτιδικών θραυσμάτων υπολογίστηκαν για να αξιολογηθούν οι παραλλαγές που προέρχονται από αποικοδόμηση πρωτεΐνης, διασύνδεση λόγω φορμαλίνης, κ.λπ.νεφρόαναφορά και (v) υπολογισμός μεροληψίας. Αυστηρή ποσοτική ανάλυση και ταυτοποίηση μοναδικών πρωτεϊνών χρησιμοποίησε δεδομένα μόνο με πρωτεΐνες με φασματικές μετρήσεις μεγαλύτερες από ή ίσες με 5 (23). Το ακριβές τεστ Fisher χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του εμπλουτισμού κοινών και μοναδικών πρωτεϊνών που χαρτογραφήθηκαν μεταξύ δύο φυσιολογικών ανθρώπινων νεφρών, (#1 και #2). Με βάση την παραπάνω ανάλυση (βλ. αποτελέσματα), ο κατεψυγμένος ιστός OCT επιλέχθηκε ως μέθοδος συλλογής για όλες τις επόμενες αναλύσεις.

Το επόμενο βήμα της εστίασης της ανάλυσης δεδομένων ήταν ο εντοπισμός, η ποσοτικοποίηση και η επικύρωση σετ πρωτεϊνών εμπλουτισμένων ή ειδικών για τα ~10-100 κύτταρα που λαμβάνονται από καθένα από τα δύο επιλεγμένανεφρόυποδιαμερίσματα—περιοχές Glom και PT, που λαμβάνονται από το ίδιονεφρό, χύμα και LCM OCT κατεψυγμένονεφρικό ιστό(n=9; νεφροί #3–11) και εκτελείται από την nscProteomics.

Μια {{0}}βήμα ημισυντηρητική προσέγγιση φιλτραρίσματος υιοθετήθηκε για την αντιμετώπιση ζητημάτων ελλιπών/ελλιπών δεδομένων και χρησιμοποιήθηκε το G-test (24) για να προσδιοριστεί εάν τα δεδομένα λείπουν τυχαία (MAR) ή Δεν λείπει τυχαία (MNAR). Η επιπρόσθετη αξιολόγηση της αξιοπιστίας των δεδομένων έγινε με αυστηρή επιλογή πρωτεϊνών που παρατηρήθηκαν σε ποσοστό μεγαλύτερο από ή ίσο με το 50 τοις εκατό όλων των δειγμάτων. Το T-test χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό πρωτεϊνών με σημαντικό εμπλουτισμό σε glomming ή PT και εφαρμόστηκε διόρθωση πολλαπλών δοκιμών (Benjamini-Hochberg FDR) με ουδό σημαντικότητας 0,1. Για τους σκοπούς της ανάλυσης, τα δεδομένα σχετικής έντασης MS (log 2 μετασχηματισμένο) που ελήφθησαν από Glom, PT και ογκώδη κλάσματα από ένα μόνονεφρόθεωρήθηκαν ζευγαρωμένα. Προσδιορίσαμε πρωτεΐνες εμπλουτισμένες σε Glom (με χαμηλά επίπεδα σε PT/χύμα) και μοναδικές σε Glom (απουσία σε PT) καθώς και πρωτεΐνες εμπλουτισμένες σε PT (με χαμηλά επίπεδα σε Glom/χύμα) και μοναδικές σε PT (απούσα σε Glom) . Η ανάλυση εμπλουτισμού έγινε μόνο σε δεδομένα χωρίς να λείπουν τιμές σε κάθε ομάδα για να αυξηθεί η εμπιστοσύνη. Η συσχέτιση μεταξύ των τιμών αφθονίας κοινών πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του βαθμού συμφωνίας μεταξύ των εμπλουτισμένων πρωτεϊνών υποδιαμερίσματος μεταξύ χωριστών σειρών του ίδιου πειράματος. Πραγματοποιήσαμε επίσης διασταυρούμενη επικύρωση σημαντικώς εμπλουτισμένων πρωτεϊνών σε κάθε διαμέρισμα αναλύοντας αυτές τις συγκρίσεις από μοναδικά σύνολα δειγμάτων μεταξύ 2 διαφορετικών σειρών, της εκτέλεσης 1 και της εκτέλεσης 2. Η βιολογική επικύρωση για σετ πρωτεϊνών εμπλουτισμένων υποδιαμερισμάτων (Glom και PT) πραγματοποιήθηκε από ρωτώντας εάν γνωστές εμπλουτισμένες πρωτεΐνες υποδιαμερίσματος θα μπορούσαν να εντοπιστούν πίσω στις συγκεκριμένες περιοχές τους σε δημόσια δεδομένα από τον Άτλαντα ανθρώπινης πρωτεΐνης (https://www.proteinatlas.org/) (25).

Cistanche για συμπτώματα νεφρικής ανεπάρκειας

Σύγκριση/Ενσωμάτωση δεδομένων Cross-Omics

Για την αξιολόγηση της συμφωνίας της πρωτεϊνικής έκφρασης σε επίπεδο RNA, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα που δημιουργήθηκαν από την αλληλουχία μονοκυττάρου RNA (scRNA Seq) που πραγματοποιήθηκε σε 10 φυσικές νεφρεκτομές, 9 από τις οποίες αλληλεπικαλύπτονταν με τηννεφράχρησιμοποιείται στο nscProteomics. Για αυτό, χρησιμοποιήθηκε πλατφόρμα 10x Genomics Chromium με χημεία v3 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που έχει βελτιστοποιηθεί στο εργαστήριο Sarwal ως Ιστότοπος Ανάκρισης Ιστών (TIS) της KPMP Consortium (ένα χειρόγραφο που περιγράφει λεπτομερώς τη μέθοδο και τα αποτελέσματα είναι υπό προετοιμασία). Για αυτήν την ανάλυση cross-omics, χρησιμοποιήσαμε δεδομένα μεταγραφής από 45.411νεφρόκύτταρα που αναλύονται σε εννέα κύριους τύπους κυττάρων: Ποδοκύτταρα, μεσαγγειακά κύτταρα, σπειραματικό ενδοθήλιο, στρώμα/διάμεσο, ανοσοκύτταρα,εγγύς σωληνάριο, παχύ ανερχόμενο άκρο του βρόχου του Henle, άπω/συνδετικό σωληνάριο και αγωγός συλλογής. Η ανάλυση των δεδομένων μιας κυψέλης έγινε χρησιμοποιώντας την έκδοση 2.3.4 του πακέτου Seurat R. Πιο εις βάθος ανάλυση αυτών των δεδομένων βρίσκεται υπό ανάπτυξη (26).

Από: «Σχεδόν μονοκυτταρική πρωτεομική προφίλ τουΕγγύς ΣωληνοειδήςκαιΣπειράματοτου Κανονικού ΑνθρώπουΝεφρόαπό Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastikai Swastikai Yang4, Wei-Jun Qian2* και Minnie M. Sarwal1* για τοΝεφρόΚοινοπραξία Precision Medicine Project (KPMP).

---ΠΡΩΤΟΤΥΠΟ ΕΡΕΥΝΑ Μπροστινό άρθρο. Med., 17 Σεπτεμβρίου 2020 |