Η εξαρτώμενη από το ISG15-ενεργοποίηση του αισθητήρα MDA5 ανταγωνίζεται την πρωτεάση SARS-CoV-2 που μοιάζει με παπαΐνη για να αποφύγει την έμφυτη ανοσία του ξενιστή

Η ενεργοποίηση των υποδοχέων τύπου RIG-I, του επαγόμενου από ρετινοϊκό οξύ γονιδίου Ι (RIG-I) και της πρωτεΐνης 5 που σχετίζεται με τη διαφοροποίηση του μελανώματος (MDA5) δημιουργεί μια κατάσταση κατά του ιού με τη ρύθμιση προς τα πάνω των διεγερμένων από ιντερφερόνη (IFN) γονιδίων (ISGs). Μεταξύ αυτών είναι το ISG15, οι μηχανιστικοί ρόλοι του οποίου στην έμφυτη ανοσία παραμένουν ακόμα αινιγματικοί. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η σύζευξη ISG15 είναι απαραίτητη για τις αντιικές αποκρίσεις IFN που προκαλούνται από τον αισθητήρα ιικού RNA MDA5. Η ISGylation των περιοχών ενεργοποίησης και στρατολόγησης κασπάσης του MDA5 προάγει τον ολιγομερισμό του και ως εκ τούτου ενεργοποιεί την ενεργοποίηση της έμφυτης ανοσίας έναντι μιας σειράς ιών, συμπεριλαμβανομένων των κοροναϊών, των φλαβοϊών και των πικορναϊών. Η εξαρτώμενη από το ISG15-ενεργοποίηση του MDA5 ανταγωνίζεται μέσω της άμεσης απο-ISGylation με τη μεσολάβηση της παπαΐνης πρωτεάσης του SARS-CoV-2, ενός πρόσφατα εμφανισθέντος κοροναϊού που έχει προκαλέσει την πανδημία COVID-19 . Η εργασία μας καταδεικνύει έναν κρίσιμο ρόλο για το ISG15 στην αντιιική απόκριση με τη μεσολάβηση MDA και επίσης προσδιορίζει έναν βασικό μηχανισμό ανοσοδιαφυγής του SARS-CoV-2, ο οποίος μπορεί να στοχεύει στην ανάπτυξη νέων αντιικών και εμβολίων καταπολέμηση του COVID-19.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Η ιογενής διαταραχή της ανοσολογικής ομοιόστασης του ξενιστή παρακολουθείται από το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα, το οποίο βασίζεται σε υποδοχείς που αισθάνονται μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με τον κίνδυνο ή τα παθογόνα (PAMPs)1-3. Οι υποδοχείς τύπου RIG-I (RLRs) RIG-I και MDA5 είναι ζωτικής σημασίας για την ανίχνευση του ιού με την έρευνα του κυτταροπλάσματος για ιικά ή προερχόμενα από τον ξενιστή ανοσοδιεγερτικά RNAs4. Η δέσμευση του RNA με τον Ο-τερματικό τομέα (CTD) και την ελικάση των RIG-I και MDA5 οδηγεί στη διαμόρφωση που εκκινεί με σηματοδότηση που επιτρέπει τη στρατολόγηση πολλών ενζύμων5. Αυτά τα ένζυμα τροποποιούν τα RLRs σε πολλαπλούς τομείς και θέσεις, και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (PTMs) έχουν μελετηθεί ιδιαίτερα καλά για τους τομείς ενεργοποίησης και στρατολόγησης κασπάσης (CARDs), τις ενότητες σηματοδότησης. Η πρωτεϊνική φωσφατάση 1 (PP1) / αποφωσφορυλιώνει τις RIG-I και MDA5 CARDs6. Στην περίπτωση του RIG-I, η αποφωσφορυλίωση προάγει τη συνδεδεμένη Lys63-πολυουβικιτινίωση των CARD από το TRIM25 (τριμερές μοτίβο που περιέχει 25) και άλλες λιγάσες E37,8, η οποία σταθεροποιεί την ολιγομερή μορφή του RIG-I, επιτρέποντας έτσι μιτοχονδριακά αντιιικά -σύνδεση πρωτεΐνης σηματοδότησης (MAVS). Σε σύγκριση με εκείνα του RIG-I, τα επιμέρους στάδια της ενεργοποίησης του MDA5 και των κρίσιμων PTM που εμπλέκονται είναι λιγότερο καλά κατανοητά. Η ενεργοποίηση RLR επάγει την παραγωγή IFN τύπου Ι και ΙΙΙ, οι οποίες, με τη σειρά τους, διαδίδουν την αντιϊκή σηματοδότηση ρυθμίζοντας προς τα πάνω τα ISGs9,10. Μεταξύ αυτών είναι η ISG15, μια πρωτεΐνη που μοιάζει με ουβικιτίνη που μπορεί να συζευχθεί ομοιοπολικά με υπολείμματα λυσίνης των πρωτεϊνών-στόχων, μια διαδικασία PTM που ονομάζεται ISGylation11. Αν και η σύζευξη ISG15 έχει ευρέως αναγνωριστεί ότι δρα αντιιικά12, οι μηχανισμοί ISGylation της πρωτεΐνης ξενιστή που θα μπορούσαν να εξηγήσουν την ευρεία αντιική περιοριστική δράση του ISG15 είναι επί του παρόντος άγνωστοι. Ο αιτιολογικός παράγοντας της συνεχιζόμενης πανδημίας COVID-19, το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2 (SCoV2), ανήκει στην οικογένεια Coronaviridae που περιέχει πολλά άλλα ανθρώπινα παθογόνα. Οι κοροναϊοί έχουν εξαιρετική ικανότητα να καταστέλλουν τις αντιικές αποκρίσεις που προκαλούνται από την IFN και χαμηλή παραγωγή IFN σε ασθενείς με SCoV{44}}που συσχετίζονται με σοβαρή νόσο13. Μεταξύ των ανταγωνιστών IFN του κορωνοϊού είναι η πρωτεάση που μοιάζει με παπαΐνη (PLpro) η οποία έχει δραστικότητα αποουβικιτινοποίησης και απο-ΙδΓυλίωσης14,15. Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίζουμε έναν ουσιαστικό ρόλο για την ISGylation στην ενεργοποίηση του MDA5. Δείχνουμε περαιτέρω ότι το SCoV2 PLpro αλληλεπιδρά με το MDA5 και ανταγωνίζεται την εξαρτώμενη από το ISG15-ενεργοποίηση του MDA5 μέσω ενεργού απο-ISGylation, αποκαλύπτοντας ότι το SCoV2 έχει ήδη εξελιχθεί για να ξεφύγει από την ανοσολογική επιτήρηση από το MDA5.

Αποτελέσματα

Η σηματοδότηση MDA5, αλλά όχι RIG-I, απαιτεί ISG15.

Για τον εντοπισμό PTM των καρτών MDA5 που μπορεί να ρυθμίζουν την ενεργοποίηση του MDA5, υποβάλαμε καθαρισμένη με συγγένεια MDA5-2CARD συντηγμένη με γλουταθειόνη-S-τρανσφεράση (GST-MDA5-2CARD) ή μόνο GST, σε υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC –MS/MS), και διαπίστωσε ότι, συγκεκριμένα, το GST–MDA5–2CARD συν-καθαρίστηκε με το ISG15, το οποίο εμφανίστηκε ως δύο ζώνες που μετανάστευσαν πιο αργά (κατά ~15 και 30 kDa) από το μη τροποποιημένο GST–MDA5– 2CARD (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 1α). Το Immunoblotting (IB) επιβεβαίωσε ότι το GST–MDA5–2CARD τροποποιήθηκε από το ISG15 (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1β). Στη συνέχεια προσδιορίσαμε τη συνάφεια του ISG15 για την επαγόμενη από το MDA σηματοδότηση. Ενώ η έκφραση FLAG-MDA5 σε εμβρυονικούς ινοβλάστες ποντικού άγριου τύπου (WT) επήγαγε RNA και πρωτεΐνη αγγελιοφόρου IFN καθώς και μεταγραφές Ccl5 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, η έκφραση FLAG-MDA5 σε Isg15−/− MEFs οδήγησε σε αφαίρεση έκφραση αντιικού γονιδίου και πρωτεΐνης (Εικ. 1α και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1γ). Ομοίως, η επαγωγή γονιδίου κατά του ιού μειώθηκε σημαντικά στα κύτταρα HeLa (ανθρώπινα) ISG15 knockout (KO) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου WT (Εικ. 1b και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1δ), αποκλείοντας ένα ειδικό αποτέλεσμα για το είδος. Αντίθετα, το FLAG-RIG-I προκάλεσε συγκρίσιμες ποσότητες εκκρινόμενης πρωτεΐνης IFN- καθώς και μεταγραφές Ifnb1 και Ccl5 σε Isg15-/- και WT MEFs (Εικ. 1α και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1γ). Τα μεταγραφήματα IFNB1 και CCL5 καθώς και η παραγωγή πρωτεΐνης IFN από FLAG-RIG-I ήταν παρόμοια ή ελαφρώς ενισχυμένα στα κύτταρα ISG15 KO HeLa σε σύγκριση με τα κύτταρα WT (Εικ. 1b και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1δ), σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές ότι η ISGylation ήταν αρνητική επηρεάζει τη σηματοδότηση RIG-I16,17

Εικ. 1|Απαιτείται ISGylation για σηματοδότηση MDA5, αλλά όχι RIG-I. a,b, ELISA της IFN- από υπερκείμενα MEFs (WT ή Isg15−/−) (α) και κύτταρα HeLa (WT ή ISG15 KO) (β) παροδικά επιμολυνθέντα με αυξανόμενες ποσότητες MDA5 ή RIG-I με επισήμανση FLAG για 40 ω. Τα προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων (WCLs) διερευνήθηκαν με ΙΒ με αντι-ISG15, αντι-FLAG και αντι-ακτίνη (μάρτυρας φόρτωσης). γ, ELISA IFN- από υπερκείμενα υγρά WT ή Isg15−/− MEF που διεγέρθηκαν ψευδώς ή επιμολύνθηκαν με EMCV RNA (0.1 ή 0.4 μg ml−1), HMW-poly (I: C) (0.5 μg ml−1 ) ή RABVLe (1 pmol ml−1), ή μολυσμένο με SeV (10 μονάδες αιμοσυγκόλλησης (HAU) ml−1 ) για 24 η. d, ανάλυση RT–qPCR των Ifnb1, Ccl5 και Tnf mRNA σε WT και Isg15−/− MEF που διεγείρονται όπως στο c. ε, φωσφορυλίωση IRF3 στα WCL των NHLF που επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNA για 30 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν ψευδώς ή επιμολύνθηκαν με RNA EMCV (0,4 μg ml−1 ) ή RABVLe (1 pmol ml−1 ) για 6 ώρες, που αξιολογήθηκε με IB με anti-pSer396-IRF3 και anti-IRF3. στ, ELISA IFN- από υπερκείμενα NHLF που επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNAs για 30 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν ψευδή ή διαμολύνθηκαν με EMCV RNA (0,4 μg ml−1) ή RABVLe (1 pmol ml−1), ή μολύνθηκαν με SeV (10 HAU ml−1 ) για 16 ώρες. g, ELISA της IFN- από τα υπερκείμενα των PBMCs που μετατράπηκαν για 40 ώρες με τα υποδεικνυόμενα φακοϊικά σωματίδια shRNA και στη συνέχεια μολύνθηκαν με mutEMCV (MOI=10) ή SeV (200 HAU ml−1) για 8 ώρες. h, ανάλυση RT–qPCR του IFNA2 και του IL-6 mRNA σε PBMCs που μετατράπηκαν και μολύνθηκαν όπως στο g. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα (μέσος όρος ± sd n= 3 βιολογικών επαναλήψεων σε a–d και f, και μέσος όρος n= 2 βιολογικών επαναλήψεων σε g και h). *Π< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.

Στη συνέχεια δοκιμάσαμε την επίδραση της διαγραφής του γονιδίου ISG15 στην ενεργοποίηση των ενδογενών MDA5 και RIG-I από τους αντίστοιχους υποκαταστάτες τους. Παραγωγή IFN καθώς και γονιδιακή έκφραση IFNB1, CCL5 και TNF που προκαλείται από τη διαμόλυνση του RNA του ιού της εγκεφαλομυοκαρδίτιδας (EMCV) ή του πολυ(I: C) υψηλού μοριακού βάρους (HMW), τα οποία και τα δύο ανιχνεύονται κυρίως από το MDA5, ήταν βαθιά εξασθενημένα στα κύτταρα Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa και ISG15 KO HAP-1 σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου τους (Εικ. 1c,d και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ. 1e–g). Είναι σημαντικό ότι η κατάλυση επαγωγής γονιδίου κατά του ιού από EMCV RNA ή HMW-poly(I:C) σε κύτταρα ISG15 KO δεν οφειλόταν σε καταργημένη έκφραση γονιδίου MDA5. Αντίθετα, η έκφραση MDA5 mRNA ενισχύθηκε σε κύτταρα ISG15 KO σε σύγκριση με κύτταρα WT (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1f,g). Σε αντίθεση με τη διέγερση με αγωνιστές MDA5, η διέγερση των κυττάρων Isg15−/− MEFs και ISG15 KO HeLa από επιμόλυνση RNA (RABVLe) οδηγού ιού λύσσας ή μόλυνση από τον ιό Sendai (SeV), που είναι ερεθίσματα RIG-I, οδήγησε σε παραγωγή IFN και έκφραση αντιικού γονιδίου συγκρίσιμη με κύτταρα WT (Εικ. 1c,d και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1e). Για να αποκλείσουμε πιθανές κλωνικές επιδράσεις που θα μπορούσαν να σχετίζονται με κύτταρα που έχουν διαγραφεί από το γονίδιο ISG15, πραγματοποιήσαμε πειράματα παροδικής σίγασης γονιδίων σε πρωτογενείς φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες πνεύμονα (NHLFs). Η σίγαση ISG15, παρόμοια με την ανακοπή MDA5, οδήγησε σε σχεδόν πλήρη απώλεια φωσφορυλίωσης του ρυθμιστικού παράγοντα 3 (IRF3) της IFN - χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης σήματος RLR - μετά από διέγερση με EMCV RNA αλλά όχι με RABVLe παραγωγή IFN καθώς και έκφραση μεταγραφής κατά του ιού σε NHLF που έχουν διαμολυνθεί με RNA EMCV, αλλά όχι σε κύτταρα που διεγείρονται με RABVLe ή SeV (Εικ. 1f και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1h). Η σίγαση του ISG15 ή του MDA5 με τη μεσολάβηση μικρής φουρκέτας (sh)RNA σε πρωτογενή μονοπύρηνα κύτταρα ανθρώπινου περιφερικού αίματος (PBMCs) μείωσε επίσης σημαντικά την έκφραση αντιικών πρωτεϊνών και μεταγραφής μετά από μόλυνση με ανασυνδυασμένο μεταλλαγμένο EMCV (mutEMCV) ανεπαρκές σε ανταγωνισμό MDA518,19, σε σύγκριση με μολυσμένα PBMC που μετεγκαταστάθηκαν με shRNA ελέγχου μη στόχευσης (Εικ. 1g,h και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1i). Αντίθετα, η εξάντληση του ISG15 ή του MDA5 δεν επηρέασε τις αποκρίσεις κυτοκίνης στα PBMC μετά τη μόλυνση με SeV (Εικ. 1g,h και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1i). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ISG15 είναι απαραίτητο για την ανοσολογική σηματοδότηση από το MDA5, αλλά όχι το RIG-I. Οι κάρτες MDA5 είναι ISGylated στα Lys23 και Lys43.

Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Για να επιβεβαιώσουμε την ανάλυσή μας MS που αναγνώρισε την ISGylation MDA5-2CARD, δοκιμάσαμε πρώτα εάν το ενδογενές MDA5 τροποποιείται επίσης από το ISG15. Το ενδογενές MDA5 ISGυλιώθηκε σθεναρά σε κύτταρα επιμολυνθέντα με HMW-poly(I: C) ή μολυσμένα με ιούς δάγκειου πυρετού (DENV) ή Zika (ZIKV) που ανιχνεύονται από το MDA5 (αναφ. 5) (Εικ. 2a). Αξιοσημείωτα, το ενδογενές MDA5 ISGυλιώθηκε επίσης σε μη μολυσμένα κύτταρα, αν και σε πολύ χαμηλά επίπεδα (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 2α), κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα ότι πολλές πρωτεΐνες ξενιστές είναι επίσης ISGυλιωμένες σε χαμηλά επίπεδα σε κανονικές (μη μολυσμένες) συνθήκες20. Σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-IFNAR2 για να αποκλειστεί η ανοδική ρύθμιση ISG που προκαλείται από σηματοδότηση IFNAR, η σίγαση ISG15 ή MDA5 οδήγησε σε συγκρίσιμη μείωση της έκφρασης του γονιδίου IFNB1 μετά από μόλυνση από mutEMCV (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 2β), υποδεικνύοντας ότι εξαρτάται από το ISG15- Η σηματοδότηση MDA5 εμφανίζεται ακόμη και απουσία σηματοδότησης IFNAR.

t MDA5Δ2CARD (που περιέχει ελικάση και CTD), είναι η κύρια θέση της MDA5 ISGylation που δείχνει δύο εξέχουσες ζώνες για το ISGylated 2CARD (Εικ. 2β). Η ανασύσταση των κυττάρων ISG15 KO HeLa είτε με WT ISG15 είτε με μη συζευγμένο μετάλλαγμα ISG15 στο οποίο οι δύο γλυκίνες που απαιτούνται για τη σύζευξη αντικαταστάθηκαν με αλανίνη (ISG15-AA)21, έδειξε ομοιοπολική σύζευξη ISG15 (Εικ. 2γ) . Μετάλλαξη μεμονωμένων υπολειμμάτων λυσίνης στο GST-MDA5-2CARD σε αργινίνη αποκάλυψε ότι η μετάλλαξη μιας θέσης των Lys23 και Lys43 μείωσε αισθητά την ISGylation (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 2c), ενώ η συνδυασμένη μετάλλαξή τους (Lys23Arg/Lys43Arg2) σχεδόν καταργήθηκε (Εικ. ). Το πλήρους μήκους FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg έδειξε επίσης σημαντικά μειωμένη ISGylation (Εικ. 2e και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 2δ). η υπολειπόμενη ISGylation που παρατηρείται στο FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg πιθανότατα οφείλεται σε επιπλέον δευτερεύουσες θέσεις στο 2CARD και/ή στο Δ2CARD. Αξίζει να σημειωθεί, ότι η μετάλλαξη Lys23Arg/Lys43Arg δεν επηρέασε την MDA5-2CARD SUMOylation5 (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 2e). Επιπλέον, ενώ το RIG-I-2CARD υποβλήθηκε σε ισχυρή ουμπικουϊτινοποίηση (που αντιπροσωπεύει την ομοιοπολική ουβικουϊτινοποίηση με συνδεδεμένη Lys{{41}7 ), ούτε το MDA5–2CARD WT ούτε το μετάλλαγμα Lys23Arg/Lys43Arg παρουσίασαν ανιχνεύσιμα επίπεδα ουμπικιτινίωσης (Εικ. 2). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι MDA5 CARD υφίστανται ISGylation σε δύο κύριες τοποθεσίες, Lys23 και Lys43.

Η CARD ISGylation απαιτείται για την ενεργοποίηση του MDA5.

Κατά τη σύγκριση της ικανότητάς τους να μεταφέρουν σήμα, τα μεταλλαγμένα μονοθέσιας MDA5-2CARD Lys23Arg και Lys43Arg έδειξαν μερικώς μειωμένη ενεργοποίηση προαγωγέα IFN σε σύγκριση με το WT MDA5-2CARD, ενώ το μετάλλαγμα Lys23Arg/Lys43Arg είχε μια βαθιά μειωμένη δραστηριότητα σηματοδότησης. όπως αυτή των μεταλλαγμάτων με ελαττωματική σηματοδότηση Ser88Glu και Ser88Asp6 (Εκτεταμένα δεδομένα Σχ. 2g). Αντίθετα, ένα μετάλλαγμα στο οποίο το Lys68, το οποίο είναι το υπόλειμμα λυσίνης που βρίσκεται πιο κοντά στα Lys43 και Lys23, αντικαταστάθηκε με αργινίνη (Lys68Arg) έδειξε συγκρίσιμη σύζευξη ISG15 και ικανότητα σηματοδότησης με το WT 2CARD (Εκτεταμένα δεδομένα, Σχήμα 22c). Το MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, σε αντίθεση με το WT MDA5–2CARD, απέτυχε επίσης να προκαλέσει διμερισμό IRF3 (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 2h). Τα FLAG–MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg ή Lys23Arg/Lys43Arg έδειξαν επίσης μειωμένες ή σχεδόν καταργημένες ικανότητες ενεργοποίησης του προαγωγέα IFN, σε σύγκριση με το FLAG–MDA5 WT (Εικ. 2στ). Το MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg εμφάνισε ένα βαθύ ελάττωμα σηματοδότησης ακόμη και όταν εκφραζόταν σε υψηλές ποσότητες, ενώ το WT MDA5 επήγαγε αντιιικά μεταγραφήματα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2g). Σε συμφωνία, η φωσφορυλίωση STAT1, χαρακτηριστικό της σηματοδότησης IFNAR, καθώς και η έκφραση πρωτεΐνης ISG προκλήθηκαν σε μεγάλο βαθμό από το MDA5 WT, αλλά όχι από το Lys23Arg/Lys43Arg (Εικ. 2h). Η συμπλήρωση ανθρώπινων αστροκυττάρων που έχουν επεξεργασθεί με γονίδιο MDA (SVGAs) με MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ή Ser88Glu οδήγησε σε σημαντικά μειωμένα μεταγραφήματα IFNB1, CCL5 και ISG σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν WT MDA5 (Εικ. 2i και Extended) . Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ISGylation στα Lys23 και Lys43 είναι απαραίτητη για τις αποκρίσεις κυτοκίνης με τη μεσολάβηση MDA5-.

Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Η αποφωσφορυλίωση με PP1 ρυθμίζει την MDA5 ISGylation.

Παρόμοια με το RIG-I, το MDA5 φωσφορυλιώνεται εντός των CARD σε μη μολυσμένα κύτταρα, γεγονός που εμποδίζει την αυτοενεργοποίηση. η αποφωσφορυλίωση του RIG-I και του MDA5 από το PP1 / είναι ζωτικής σημασίας για την απελευθέρωση των RLR από τις καταστάσεις καταστολής της σηματοδότησης6,22-24. Η αποφωσφορυλίωση του RIG-I επιτρέπει την Lys{10}}συνδεδεμένη ουβικουϊτινοποίηση των CARD, η οποία προάγει τον πολυμερισμό και τη σηματοδότηση RIG-I5. Οι λεπτομέρειες σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο η αποφωσφορυλίωση CARD (στο Ser88) ενεργοποιεί την ενεργοποίηση του MDA5 παρέμειναν ασαφείς και επομένως δοκιμάσαμε εάν η αποφωσφορυλίωση ρυθμίζει την ISGylation MDA5. Σίγαση της PP1 / έντονα μειωμένη ISGylation MDA5–2CARD (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 3α). Επιπλέον, οι φωσφομιμητικές μεταλλάξεις Ser88Glu και Ser88Asp είχαν μειωμένη ISGylation, ενώ η φωσφομηδενική μετάλλαξη Ser88Ala έδειξε ισχυρότερη ISGylation από το WT MDA5-2CARD (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 3β). Αντίστροφα, το MDA5 WT και το Lys23Arg/Lys43Arg είχαν συγκρίσιμη φωσφορυλίωση Ser88 (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 3γ). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αποφωσφορυλίωση MDA5 στο Ser88 προηγείται της CARD ISGylation. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε την πρωτεΐνη V του ιού της ιλαράς (MeV-V), η οποία ανταγωνίζεται την αποφωσφορυλίωση MDA5 Ser88 μέσω PP1/ανταγωνισμού25. Η έκφραση του MeV-V ενίσχυσε τη φωσφορυλίωση Ser88 (ενδεικτική αποφωσφορυλίωσης με κατάργηση) του GST-MDA5-2CARD ή του FLAG-MDA5 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, όπως φαίνεται προηγουμένως25. Ενισχυμένη φωσφορυλίωση με MeV-V συσχετίστηκε με μείωση της ISGylation (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 3d,e). Σε αντίθεση με το WT MeV-V, ένα μεταλλαγμένο MeV-V που έχει καταργήσει τη δέσμευση PP και τον ανταγωνισμό αποφωσφορυλίωσης του MDA (MeV-VΔtail)25, επέδειξε μικρή επίδραση στην ISGylation MDA5-2CARD (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 3στ), ενισχύοντας την αναστολή της ISGylation που οφείλεται κυρίως στην αναστολή PP1, και όχι σε άλλες ανταγωνιστικές επιδράσεις, από το MeV-V. Οι πρωτεΐνες V από τους ιούς Nipah και Hendra (NiV-V και HeV-V) ενίσχυσαν επίσης τη φωσφορυλίωση MDA5 Ser88 και, αντίστοιχα, αμβλύνουν την ISGylation MDA5 (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 3g,h), υποδηλώνοντας ότι αρκετές παραμυξοϊικές πρωτεΐνες V αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του MDA5 ISG της φωσφορυλίωσης Ser88, αν και οι ακριβείς μηχανισμοί για μεμονωμένες πρωτεΐνες V απομένουν να προσδιοριστούν. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η MDA5 CARD ISGylation εξαρτάται από την αποφωσφορυλίωση στο Ser88.

Το ISGylation προωθεί συγκροτήματα MDA5 υψηλότερης τάξης.

Η ενεργοποίηση του RLR απαιτεί δέσμευση RNA, ολιγομερισμό RLR και μετατόπισή τους από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια για αλληλεπίδραση με το MAVS5. Για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο η ISGylation επηρεάζει τη δραστηριότητα του MDA5, εξετάσαμε πρώτα εάν η ISGylation επηρεάζει τη δέσμευση RNA. Το ενδογενές MDA5 που καθαρίστηκε από WT ή Isg15−/− MEFs αλληλεπιδρά εξίσου καλά με το HMW-poly(I: C) in vitro (Εκτεταμένα δεδομένα Σχήμα 4α). Τα MDA5 WT και Lys23Arg/Lys43Arg έδειξαν συγκρίσιμη δέσμευση με το HMW-poly(I: C), υποδεικνύοντας ότι η ISGylation δεν επηρεάζει την ικανότητα δέσμευσης RNA του MDA5 (Εκτεταμένα δεδομένα Σχήμα 4β). Όταν παρακολουθήσαμε τη μετατόπιση του MDA5 από το κυτοσόλιο στα μιτοχόνδρια μετά από διέγερση RNA EMCV, διαπιστώσαμε ότι η σίγαση ISG15, αλλά όχι τόσο η επιμόλυνση C, κατάργησε τη μετατόπιση MDA5 (Εικ. 3α). Αντίθετα, η μετατόπιση RIG-I μετά τη διαμόλυνση RABVLe ήταν αποτελεσματική τόσο σε ISG15-εξαντλημένο όσο και σε si. C-μορφομετατραπέντα κύτταρα (Εικ. 3b). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η ISGylation ρυθμίζει τη μετατόπιση του MDA5 ή ένα βήμα πριν από αυτήν. Καθώς η μετατόπιση του MDA5 από κυτοσόλιο σε μιτοχόνδρια απαιτεί αλληλεπίδραση με το 14-3-3η26, συγκρίναμε τη δέσμευση 14-3-3η του WT και του μεταλλαγμένου MDA5. Η ικανότητα του MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg να δεσμεύει το 14-3-3η ήταν παρόμοια με αυτή του WT MDA5 ή του μεταλλάγματος Lys68Arg (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 4γ). Ωστόσο, ενώ η διέγερση RNA EMCV προκάλεσε αποτελεσματικά ολιγομερισμό MDA5 σε WT MEF, ο σχηματισμός ολιγομερών MDA5 καταργήθηκε σε MEF με ανεπάρκεια ISG{{38} (Εικ. 3γ). Το knockdown ISG15 σε κύτταρα 293Τ κατάργησε επίσης τον ολιγομερισμό του FLAG-MDA5-2CARD (Εικ. 3δ). Αντίθετα, η συνέκφραση των εξαρτημάτων του μηχανήματος ISGylation, Ube1L και UbcH8, ενίσχυσε έντονα τον ολιγομερισμό MDA5-2CARD στο si. C-μορφομετατραπέντα κύτταρα, αλλά όχι σε ISG15-απορριπτόμενα κύτταρα (Εικ. 3d), υποδεικνύοντας ότι απαιτείται ISGylation για το σχηματισμό ολιγομερούς MDA5. Προς υποστήριξη αυτής της ιδέας, το FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg έδειξε σχεδόν καταργημένο ολιγομερισμό, ενώ το WT MDA5 ολιγομερίστηκε αποτελεσματικά (Εικ. 3e). Συγκρίναμε επίσης το αποτέλεσμα της μετάλλαξης Lys23 Arg/Lys43Arg με αυτό των μεταλλάξεων που διαταράσσουν τον ολιγομερισμό που εντοπίζονται είτε στη διεπιφάνεια μεταξύ μονομερών MDA5 και εμποδίζουν τη διαμεσολαβούμενη από δέσμευση RNA νηματοποίηση MDA5 (Ile841Arg/Glu842Arg και Asp828749Alahe, Asp828749AlaP) ή στις ΚΑΡΤΕΣ (Gly74Ala/Trp75Ala) και διακόπτουν τον ολιγομερισμό 2CARD27. Σε αντίθεση με το WT MDA5, το μετάλλαγμα Lys23Arg/Lys43Arg, παρόμοιο με το MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, έδειξε ανεπαρκή ολιγομερισμό και, σύμφωνα με αυτό, κατάργησε την ικανότητα ενεργοποίησης του προαγωγέα IFN (Εικ. 3f,g). Η εισαγωγή του Lys23Arg/Lys43Arg στο υπόβαθρο Ile841Arg/Glu842Arg ή Asp848Ala/Phe849Ala, καθένα από τα οποία από μόνο του μείωσε τον ολιγομερισμό και τη σηματοδότηση του MDA5, επίσης κατάργησε τον σχηματισμό ολιγομερούς MDA5 και την επαγωγή IFN-3, Εικ. Καθώς το LGP2 διευκολύνει τον πυρήνα του MDA5 σε δίκλωνο RNA και ως εκ τούτου τον ολιγομερισμό του MDA529,30, συγκρίναμε τη σύνδεση LGP2 του MDA5 WT και του Lys23Arg/Lys43Arg. Το MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg αλληλεπίδρασε με το LGP2 τόσο αποτελεσματικά όσο το WT MDA5 (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 4δ), ενισχύοντας την πρόταση ότι η CARD ISGylation προάγει τον ολιγομερισμό του MDA5 ανεξάρτητα από τη διαμεσολάβηση της νηματοποίησης που προκαλείται από δέσμευση RNA. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η ISGylation διευκολύνει τον ολιγομερισμό CARD και τα συγκροτήματα MDA5 υψηλότερης τάξης.

Εικ. 2|Η ενεργοποίηση του MDA5 απαιτεί ISGylation στα Lys23 και Lys43. μια ενδογενής MDA5 ISGylation σε NHLF που υποβλήθηκαν σε ψευδή αγωγή, επιμολύνθηκαν με HMW-poly(I: C) (0.1 μg ml−1 ) για 40 ώρες (αριστερά) ή μολύνθηκαν με DENV ή ZIKV (MOI {{ 10}} για καθένα) για 48 ώρες (δεξιά), που προσδιορίζεται με IP με anti-MDA5 (ή μάρτυρα ισοτύπου IgG) και IB με anti-ISG15. β, ISGylation του MDA5-2CARD και του MDA5Δ2CARD με επισήμανση FLAG σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα HEK293T που εξέφραζαν επίσης V5-ISG15, HA-Ube1L και FLAG-UbcH8, που αξιολογήθηκαν από FLAG PD και IB με αντι-V5 στις 40 ώρες μετά τη διαμόλυνση. γ, Ενδογενής MDA5 ISGylation σε κύτταρα ISG15 KO HeLa που ανασυστάθηκαν σταθερά με φορέα, WT ISG15 ή ISG15-ΑΑ και συνεπιμολύνθηκαν με HA–Ube1L και FLAG–UbcH8 μετά από θεραπεία με IFN (1,000 U ml−1 ) για 24 ώρες, που προσδιορίζεται με IP με anti-MDA5 και IB με anti-ISG15. δ, ISGylation των GST–MDA5–2CARD WT και Lys23Arg/ Lys43Arg σε κύτταρα HEK293T που συνεπιμολύνθηκαν με V5–ISG15, HA–Ube1L και FLAG–UbcH8 για 24 ώρες, που προσδιορίστηκε από GST PD και IB με anti-VV5. ε, ISGylation των FLAG–MDA5 WT και Lys23Arg/Lys43Arg σε κύτταρα HEK293T που συνεπιμολύνθηκαν με V5–ISG15, HA–Ube1L και FLAG–UbcH8, που προσδιορίστηκε από FLAG PD και IB με αντι-V5. f, δραστηριότητα αναφοράς IFN-λουσιφεράσης σε κύτταρα HEK293T που επιμολύνθηκαν για 40 ώρες με φορέα, FLAG-MDA5 WT ή μεταλλάγματα. Οι τιμές της λουσιφεράσης παρουσιάζονται ως διπλή επαγωγή σε σχέση με τις τιμές για τα επιμολυσμένα με φορέα κύτταρα, ρυθμισμένες στο 1. Τα WCL ανιχνεύθηκαν με ΙΒ με αντι-FLAG και αντι-ακτίνη. g, ανάλυση RT-qPCR του mRNA IFNB1 και CCL5 σε κύτταρα HEK293T που επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με φορέα είτε με αυξανόμενες ποσότητες FLAG-MDA5 WT ή Lys23Arg/Lys43Arg. h, φωσφορυλίωση STAT1 και αφθονία πρωτεϊνών ISG (IFIT1 και -2) στα WCL κυττάρων HEK293T που επιμολύνθηκαν παροδικά με φορέα ή FLAG–MDA5 WT ή Lys23Arg/Lys43Arg, που προσδιορίστηκε με IB. I, ανάλυση RT–qPCR των υποδεικνυόμενων αντιιικών γονιδίων σε MDA5 KO SVGA που ανασυστάθηκαν παροδικά είτε με κενό φορέα είτε με MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg ή Ser88Glu με επισήμανση FLAG. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα (μέσος όρος ± sd των n= 3 βιολογικών αντιγράφων σε f, g και i). *Π< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Εικ. 3|Το CARD ISGylation προωθεί το σχηματισμό συγκροτημάτων MDA5 υψηλότερης τάξης. α, β, κλασμάτωση κυτοσόλιο-μιτοχονδρίων των WCL από NHLF που επιμολύνθηκαν για 30 ώρες με μη στοχευόμενο siRNA ελέγχου (si. C) ή ISG15-ειδικό siRNA (si.ISG15) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ψευδή επεξεργασία ή επιμολύνθηκε με EMCV RNA (0.4 μg ml−1 ) (a) ή RABVLe (1 pmol ml−1 ) (b) για 16 ώρες. Το IB πραγματοποιήθηκε με αντι-ΜϋΑ5 (α), αντι-RIG-I (b), αντι-ISG15 και αντι-ακτίνη (α και β). -Η τουμπουλίνη και το MAVS χρησίμευσαν ως δείκτες καθαρότητας για το κυτοσολικό και το μιτοχονδριακό κλάσμα, αντίστοιχα (α και β). γ, Ενδογενής ολιγομερισμός MDA5 σε WT και Isg15−/− MEF που επιμολύνθηκαν με EMCV RNA (0,5 μg ml−1) για 16 ώρες και αξιολογήθηκαν με SDD–AGE και IB με αντι-MDA5. Τα WCL αναλύθηκαν περαιτέρω με SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με IB με αντι-MDA5 και αντι-ακτίνη. δ, Ολιγομερισμός της FLAG–MDA5–2CARD σε κύτταρα HEK293T που επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNA, είτε με ή χωρίς HA–Ube1L και FLAG–UbcH8 για 48 ώρες, προσδιοριζόμενο από NativePAGE και IB με anti-FLAG. Τα WCL αναλύθηκαν περαιτέρω με SDS-PAGE και διερευνήθηκαν με IB με anti-FLAG, anti-HA, anti-ISG15 και αντι-ακτίνη. ε, Ολιγομερισμός των FLAG–MDA5 WT και Lys23Arg/Lys43Arg σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα MDA5 KO HEK293, που αξιολογήθηκε με SDD–AGE και IB με anti-FLAG. Τα WCL αναλύθηκαν περαιτέρω με SDS-PAGE και IB με anti-FLAG και αντι-ακτίνη. στ, Ολιγομερισμός MDA5 WT με επισήμανση FLAG και μεταλλαγμένων σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα MDA5 KO HEK293, που αξιολογήθηκαν από NativePAGE και IB με αντι-MDA5. Τα WCL αναλύθηκαν περαιτέρω με SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με IB με αντι-MDA5 και αντι-ακτίνη. g, δραστηριότητα αναφοράς IFN-λουσιφεράσης σε κύτταρα MDA5 KO HEK293 που επιμολύνθηκαν για 24 ώρες είτε με κενό φορέα είτε με MDA5 WT επισημασμένο με FLAG ή μεταλλάκτες. Η δραστικότητα της λουσιφεράσης παρουσιάζεται ως διπλή επαγωγή σε σχέση με τις τιμές για κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα, που ορίζονται σε 1. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα (μέση τιμή ± sd των n= 3 βιολογικών αντιγράφων σε g). ***Π< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Η εξαρτώμενη από ISGylation σηματοδότηση MDA5 περιορίζει την αναπαραγωγή του ιού.

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε εάν απαιτείται ISGylation του MDA5 για την ικανότητά του να περιορίζει την αναπαραγωγή του ιού. Το FLAG–MDA5 WT, αλλά όχι το Lys23Arg/Lys43Arg, ανέστειλε δυναμικά (κατά ~2log) την αντιγραφή EMCV (Εικ. 4a). Ομοίως, κύτταρα MDA5 KO HEK293 που ανασυστάθηκαν με WT MDA5, αλλά όχι κύτταρα συμπληρωμένα με το μετάλλαγμα Lys23Arg/ Lys43Arg, περιόρισαν αποτελεσματικά την αντιγραφή DENV (Εικ. 4β). Ανασυστάσαμε επίσης τα SVGA αστροκυττάρων MDA5 KO, έναν φυσιολογικά σχετικό τύπο κυττάρου για μόλυνση ZIKV, είτε με φορέα είτε με MDA5 WT ή Lys23Arg/Lys43Arg και, στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την αντιγραφή του ZIKV σε χρονικό διάστημα 40- ωρών. Ο αναδιπλασιασμός του ZIKV μειώθηκε κατά ~100-πλάσια σε κύτταρα που ανασυστάθηκαν με WT MDA5 σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν φορέα. Αντίθετα, κύτταρα συμπληρωμένα με MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg δεν περιόρισαν το ZIKV, παρόμοια με κύτταρα που εκφράζουν MDA5 Ser88Glu (Εικ. 4c). Το WT MDA5, αλλά όχι το Lys23Arg/Lys43Arg, περιόρισε επίσης την αναπαραγωγή του SCoV2, αν και σε μικρότερο βαθμό από αυτόν που παρατηρήθηκε για τους άλλους ιούς που δοκιμάστηκαν (Εικ. 4δ).

Εικ. 4|Απαιτείται ISGylation για περιορισμό του ιού από το MDA5. Τίτλοι EMCV στο υπερκείμενο των κυττάρων HEK293T που επιμολύνθηκαν για 40 ώρες είτε με φορέα είτε με FLAG–MDA5 WT ή Lys23Arg/Lys43Arg και στη συνέχεια μολύνθηκαν με EMCV (MOI=0.001) για 24 h, προσδιορίστηκε με ανάλυση TCID50. β, Ποσοστό μολυσμένων με DENV κυττάρων MDA5 KO HEK293 που επιμολύνθηκαν για 24 ώρες είτε με φορέα είτε με FLAG–MDA5 WT ή Lys23Arg/Lys43Arg και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ψευδή αγωγή ή μολύνθηκαν με DENV (MOI=5) για 48 ώρες , αξιολογήθηκε από FACS χρησιμοποιώντας αντιφλαβοϊό Ε (4G2). SSC, πλαϊνή διασπορά. γ, τίτλοι ZIKV στο υπερκείμενο των MDA5 KO SVGA που επιμολύνθηκαν για 30 ώρες με φορέα ή επισημασμένο με FLAG MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg ή Ser88Glu και στη συνέχεια μολύνθηκαν με ZIKV (MOI=0.1) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους , προσδιορίστηκε με ανάλυση πλάκας. pfu, μονάδες σχηματισμού πλάκας. hpi, ώρες μετά τη μόλυνση. d, τίτλοι SCoV2 στο υπερκείμενο των κυττάρων HEK293T-hACE2 που επιμολύνθηκαν για 24 ώρες είτε με κενό φορέα είτε με FLAG–MDA5 WT ή Lys23Arg/Lys43Arg και στη συνέχεια μολύνθηκαν με SCoV2 (MOI=0.5) για 24 h, που προσδιορίζεται με ανάλυση πλάκας. ε, Σχηματική της πειραματικής προσέγγισης για την «αποσύνδεση» του ρόλου του ISG15 στο MDA5-διαμεσολάβησε την επαγωγή IFN από τον ρόλο του στην απόσβεση της σηματοδότησης IFNAR. Sup., υπερκείμενο. f, κύτταρα «δότη» NHLF επιμολύνθηκαν για 40 ώρες με τα υποδεικνυόμενα siRNAs και στη συνέχεια μολύνθηκαν με mutEMCV (MOI=0.1) για 16 ώρες. Τα υπερκείμενα των κυττάρων απενεργοποιήθηκαν με υπεριώδη ακτινοβολία και μεταφέρθηκαν σε κύτταρα «δέκτη» Vero. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μολύνθηκαν με ZIKV (MOI=0.002–2) για 72 ώρες και τα θετικά σε ZIKV κύτταρα προσδιορίστηκαν με ανοσοχρώση με αντιφλαβοϊό Ε (4G2) και υπόστρωμα υπεροξειδάσης TrueBlue. g, κύτταρα «δότη» RIG-I KO HEK293 επιμολύνθηκαν με si. C ή si.ISG15 μαζί με φορέα ή FLAG–MDA5 WT ή Lys23Arg/Lys43Arg, για 24 ώρες, ακολουθούμενη από μόλυνση από EMCV (MOI {= 0.001) για 16 ώρες. Τα υπερκείμενα κύτταρα απενεργοποιημένα με υπεριώδη ακτινοβολία μεταφέρθηκαν σε κύτταρα «λήπτες» Vero για 24 ώρες, ακολουθούμενη από μόλυνση με EMCV (MOI=0.001–0,1) για 40 ώρες. Οι επαγόμενες από το EMCV κυτταροπαθητικά αποτελέσματα εμφανίστηκαν με χρώση Coomassie Blue. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα (μέσος όρος ± sd των n= 3 βιολογικών αντιγράφων σε a–d). *Π< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Στη συνέχεια προσδιορίσαμε την επίδραση της σίγησης ISG15 στην ικανότητα του MDA5 να αναστέλλει την αναπαραγωγή του ιού. Αν και το MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg απέτυχε να καταστείλει την αναπαραγωγή EMCV ανεξάρτητα από τη σίγαση ISG15, το WT MDA5 περιόρισε αποτελεσματικά την αντιγραφή EMCV στο si. C-μορφομετατραπέντα κύτταρα και, απροσδόκητα, επίσης σε ISG15-εξαντλημένα κύτταρα (Extended Data Σχήμα 5a). Σε μια εξερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού αυτών των απροσδόκητων αποτελεσμάτων, βρήκαμε ότι τα μολυσμένα με EMCV κύτταρα που εξέφραζαν WT MDA5 είχαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ISG όταν το ISG15 αποσιωπήθηκε σε σύγκριση με μολυσμένα κύτταρα που διαμολύνθηκαν με WT MDA5 και si. C (Εκτεταμένα δεδομένα Σχ. 5β). Ομοίως, αυξημένη έκφραση μεταγραφής ISG και πρωτεΐνης παρατηρήθηκε σε κύτταρα με ανεπάρκεια ISG{15} που επιμολύνθηκαν με RNA EMCV ή μολύνθηκαν με mutEMCV, παρά την κατάργηση της επαγωγής IFN (Εκτεταμένα δεδομένα Σχήμα 5γ,δ). Αντίθετα, το knockdown MDA5 ακύρωσε την έκφραση τόσο της πρωτεΐνης IFN- όσο και της ISG, όπως αναμενόταν (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 5δ). Παρατηρήσαμε ότι η αφθονία πρωτεΐνης του USP18, ενός ενζύμου αποβουκιτινοποίησης που ρυθμίζει αρνητικά τη σηματοδότηση IFNAR31, μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα με εξάντληση ISG15- μετά από μόλυνση από EMCV σε σύγκριση με μολυσμένα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με si. C ή MDA5-συγκεκριμένο siRNA (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 5β,δ), το οποίο είναι σύμφωνο με τον αναφερόμενο ρόλο του ISG15 στην πρόληψη της υποβάθμισης του USP1832. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι σε πειραματικές ρυθμίσεις στόχευσης γονιδίου ISG15- (δηλαδή, σίγηση ή ΚΟ) η αντιική επίδραση του MDA5 ISGylation καλύπτεται από ανώμαλη ρύθμιση ISG λόγω της κατάλυσης της ανασταλτικής επίδρασης του ISG15 στη σηματοδότηση IFNAR.

Εικ. 5|Το SCoV2 PLpro δεσμεύεται και απο-ISGylates MDA5–2CARD. Αναπαράσταση κορδέλας της κρυσταλλικής δομής του συμπλέγματος SCoV2 PLpro: ISG15 (Protein Data Bank, accession no. 6YVA). Υποδεικνύονται τα βασικά υπολείμματα που μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση της θέσης 1 (Asn156 και Arg166/Glu167) ή στην αλληλεπίδραση της θέσης 2 (Phe69) στο PLpro, καθώς και στην καταλυτικά ενεργή θέση του (Cys111). β, ISGylation του GST-MDA5-2CARD σε κύτταρα HEK293T που συν-επιμολύνθηκαν για 20 ώρες με φορέα ή V{20}}επισημασμένο SCoV2 PLpro WT ή μεταλλάγματα, μαζί με FLAG–ISG15, HA–Ube1L και FLAG–UbcH8, προσδιορίζεται από GST PD και IB με anti-FLAG και anti-GST. Τα WCL ανιχνεύθηκαν με IB με αντι-V5, αντι-ΗΑ, αντι-FLAG και αντι-ακτίνη. γ, Σύνδεση MDA5 ή RIG-I με επισήμανση HA σε V5-σημασμένο SCoV2– PLpro ή MeV-V με επισήμανση FLAG (θετικός έλεγχος) σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα HEK293T, που προσδιορίστηκε από HA PD και IB με αντι-V5 ή anti-FLAG, και anti-HA. Τα WCL ανιχνεύθηκαν από IB με anti-V5 και anti-FLAG. δ, Ολιγομερισμός της FLAG–MDA5–2CARD σε κύτταρα HEK293T που συνεπιμολύνθηκαν με φορέα ή με V5-επισήμανση SCoV2 PLpro WT ή Cys111Ala για 24 ώρες, που αξιολογήθηκε από NativePAGE και IB με anti-FLAG. Τα WCL αναλύθηκαν περαιτέρω με SDS-PAGE και διερευνήθηκαν με IB με anti-FLAG, anti-V5 και anti-actin. ε, ISGylation του GST–MDA5–2CARD σε κύτταρα HEK293T που εξέφραζαν επίσης FLAG–ISG15, HA–Ube1L και FLAG–UbcH8, και συνεπιμολύνθηκαν για 40 ώρες με φορέα ή την υποδεικνυόμενη επισήμανση V{5- κορωνοϊού PLpro πρωτεϊνών, που προσδιορίζονται από GST PD και IB με anti-FLAG, anti-V5 και anti-GST. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία προστασίας από ιούς που αποσυνδέει πειραματικά τη σηματοδότηση MDA5 σε κύτταρα μολυσμένα από ιό από τη σηματοδότηση IFNAR κατάντη στα ίδια κύτταρα (Εικ. 4e). Υπερκείμενα από κύτταρα «δότη» μολυσμένα με mutEMCV που ήταν είτε si. Οι διαμολύνσεις C ή χωρίς ISG15 ή MDA5, απενεργοποιήθηκαν με υπεριώδη ακτινοβολία (UV) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μη μολυσμένα κύτταρα «λήπτες». Τα κύτταρα λήπτες «πριμοδοτημένα» στη συνέχεια μολύνθηκαν με ZIKV για την άμεση παρακολούθηση της αντιϊκής επίδρασης της παραγωγής IFN με τη μεσολάβηση MDA5- από κύτταρα δότες. Ενώ τα υπερκείμενα από si. Τα επιμολυσμένα με C κύτταρα «δότες» ανέστειλαν δυναμικά την αντιγραφή του ZIKV και τα υπερκείμενα από τα κύτταρα εξουδετέρωσης ISG15 ή MDA5 περιόρισαν ελάχιστα τη μόλυνση ZIKV (Εικ. 4στ). Παρομοίως, τα υπερκείμενα καλλιέργειας από κύτταρα δότη μολυσμένα με EMCV επιμολύνθηκαν με WT MDA5 μαζί με si. Το C οδήγησε σε μεγαλύτερη προστασία των κυττάρων-δεκτών από την ιική πρόκληση από ότι από κύτταρα που εκφράζουν WT MDA5 και έχουν εξαντληθεί από ISG15 (Εικ. 4g). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η ISGylation είναι σημαντική για τον περιορισμό με τη μεσολάβηση MDA5- μιας σειράς ιών RNA.

Εικ. 6|Το SCoV2 PLpro αναστέλλει την προκαλούμενη από ISG15-σηματοδότηση MDA5 μέσω της δραστηριότητάς του de-ISGylase. α, ανάλυση RT–qPCR των μεταγραφών IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5 και RIG-I σε NHLF που επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNA για 40 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με ψευδές RNA ή RNA SCoV2 (0,4 μg ml −1) για 24 ώρες. β, Σύνδεση του SCoV2 Nsp3 σε ενδογενή MDA5 σε κύτταρα A549–hACE2 που είχαν μολυνθεί με SCoV2 (MOI=0}.5) για 24 ώρες, προσδιορίστηκε με IP με anti-MDA5 (ή μάρτυρα ισοτύπου IgG) ακολουθούμενη από IB με anti-Nsp3 και anti-MDA5. Τα WCL ανιχνεύθηκαν με IB με αντι-Nsp3 και αντι-ακτίνη. γ, Ενδογενής MDA5 ISGylation σε κύτταρα A549–hACE2 που ήταν ψευδεπίγραφα μολυσμένα ή μολυσμένα με SCoV2 (MOI=0.5) για 40 ώρες παρουσία αναστολέα PLpro (GRL-0617· 50 μM) ή φορέα έλεγχος (διμεθυλοσουλφοξείδιο), που προσδιορίζεται με IP με αντι-MDA5 (ή μάρτυρα ισοτύπου IgG), ακολουθούμενο από ΙΒ με αντι-ISG15 και αντι-MDA5. Η αφθονία πρωτεϊνών των IFIT1, RSAD2, ISG15 και ακτίνης στα WCL διερευνήθηκε από το IB. Η αποτελεσματική αντιγραφή του ιού επαληθεύτηκε από το IB με anti-Nsp3 και anti-Spike (S). d, ανάλυση RT–qPCR των μεταγραφών IFNB1, CCL5 και IFIT1, και γονιδιωματικού RNA (gRNA) EMCV σε κύτταρα HeLa που επιμολύνθηκαν παροδικά για 24 ώρες με φορέα ή V5-SCoV2 PLpro WT ή μεταλλάγματα και στη συνέχεια μολύνθηκαν με mutEMCV (MOI=0.5) για 12 ώρες. ε, τίτλοι EMCV στο υπερκείμενο των κυττάρων RIG-I KO HEK293 που επιμολύνθηκαν παροδικά για 24 ώρες με φορέα ή FLAG–MDA5, μαζί με V5-με επισήμανση SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala ή Arg166Ser/Glu167Arg και στη συνέχεια μολύνθηκαν, με EMCV (MOI=0.001) για 16 ώρες, που προσδιορίζεται με ανάλυση πλάκας. στ, Πρωτεϊνική αφθονία των υποδεικνυόμενων ISG στα WCL από το πείραμα στο e, που προσδιορίστηκε από το ΙΒ με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα (μέσος όρος ± sd n= 3 βιολογικών αντιγράφων στα a, d και e). *Π< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Το SCoV2 PLpro στοχεύει το MDA5 για απο-ISGylation.

Οι κοροναϊοί όπως ο SARS-CoV (SCoV), ο MERS-CoV και ο πρόσφατα εμφανιζόμενος SCoV2 κωδικοποιούν ένα PLpro που μεσολαβεί στη διάσπαση της ιικής πολυπρωτεΐνης33. Επιπλέον, η PLpro έχει δραστηριότητες αποουβικιτίνης και απο-ISGylating. Το SCoV2 PLpro αποδείχθηκε πρόσφατα ότι ρυθμίζει τις αντιικές αποκρίσεις κυρίως μέσω της δραστηριότητάς του στην απο-ISGylase15. Δεδομένου ότι το MDA5 είναι γνωστό ότι είναι ένας σημαντικός αισθητήρας για την ανίχνευση κοροναϊών34,35 και επειδή τα δεδομένα μας έδειξαν ότι απαιτείται ISGylation για περιορισμό του ιού με τη μεσολάβηση MDA, εξετάσαμε εάν το SCoV2 PLpro αφαιρεί ενζυματικά το MDA5 ISGylation για να ανταγωνιστεί την έμφυτη ανοσία. Το SCoV2 PLpro WT, αλλά όχι το καταλυτικά ανενεργό μετάλλαγμα του (PLpro Cys111Ala)15, κατάργησε την ISGylation των GST–MDA5–2CARD και FLAG–MDA5 (Εικ. 5a,b και Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 6a). Τα μεταλλαγμένα PLpro Asn156Glu και Arg166Ser/Glu167Arg, τα οποία είναι οριακά και σοβαρά μειωμένα στη σύνδεση ISG15 στη διεπαφή «θέση 1», αντίστοιχα14,36, επηρέασαν ελαφρά ή όχι την ISGylation. Αντίθετα, το PLpro Phe69Ala, στο οποίο η διεπαφή «θέσης 2» που καθορίζει κατά προτίμηση τη σύνδεση με την ουβικιτίνη, αλλά όχι το ISG15, διαταράσσεται14,36, μείωσε την ISGylation MDA5 τόσο ισχυρά όσο το WT PLpro (Εικ. 5a,b και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ. 6α ). Ωστόσο, το SCoV2 PLpro δεν κατέστειλε την ubiquitination RIG-I-2CARD (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 6β). Βρήκαμε ότι το PLpro αλληλεπιδρούσε ειδικά με το MDA5, αλλά όχι το RIG-I, όπως το MeV-V που δεσμεύει το MDA5 και χρησίμευε ως έλεγχος37 (Εικ. 5γ). Χαμηλές ποσότητες PLpro ανέστειλαν τη σηματοδότηση από το MDA5, αλλά όχι το RIG-I, ενώ υψηλότερες ποσότητες PLpro κατέστειλαν τη σηματοδότηση κατά των ιών και από τους δύο RLR (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 6γ). Αυτό ενισχύει το MDA5 που είναι άμεσος στόχος του PLpro. Η απο-ISGylation του IRF3 πιθανώς ευθύνεται για την ανασταλτική επίδραση που έχουν υψηλότερες δόσεις PLpro στη σηματοδότηση RLR15,38. Κατά την εξέταση της επίδρασης του PLpro στον ολιγομερισμό MDA5-2CARD, το PLpro WT αλλά όχι το Cys111Ala μπλόκαρε αποτελεσματικά τον ολιγομερισμό MDA5-2CARD (Εικ. 5δ), υποδεικνύοντας ότι το SCoV2 PLpro αναστέλλει τον εξαρτώμενο από την ISGylation σχηματισμό ολιγομερούς MDA5 μέσω της ενζυμικής του δραστηριότητας. Τα ένζυμα PLpro των σχετικών κορονοϊών, SCoV, MERS–CoV και ιού ηπατίτιδας ποντικού (MHV), καθώς και του κοροναϊού HCoV-NL63 (NL63) επίσης δεσμεύτηκαν και μείωσαν αποτελεσματικά την ISGylation MDA5–2CARD (Εικ. 5ε) , υποδηλώνοντας ότι ο ανταγωνισμός του MDA5 από το PLpro μπορεί να διατηρηθεί ευρέως μεταξύ των κοροναϊών.

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

Το SCoV2 PLpro ανταγωνίζεται την εξαρτώμενη από το ISG15-σήμα MDA5.

Στη συνέχεια προσδιορίσαμε τη συνάφεια της ISG15-εξαρτώμενης σηματοδότησης MDA5 για την επαγωγή κυτοκίνης κατά των ιών που προκαλείται από το SCoV2. Καθώς η μόλυνση SCoV2 είναι γνωστό ότι προκαλεί ελάχιστα IFN τύπου Ι λόγω αποτελεσματικών ιικών ανταγωνισμών39, απομονώσαμε το συνολικό RNA από μολυσμένα κύτταρα με SCoV2-και στη συνέχεια το επαναδιαμολύναμε σε κύτταρα για να διεγείρουμε την έμφυτη ανοσολογική σηματοδότηση. Το RNA SCoV2, αλλά όχι το RNA από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε ψευδή αγωγή, επήγαγαν δυναμικά μεταγραφές IFN. Ωστόσο, αυτή η επαγωγή μειώθηκε σημαντικά όταν το ISG15 ή το MDA5 σίγησε (Εικ. 6α). Το knockdown RIG-I δεν επηρέασε δυσμενώς την αντιϊκή γονιδιακή έκφραση που προκαλείται από το SCoV2 RNA, υποδεικνύοντας ότι τα SCoV2 RNA-PAMPs ανιχνεύονται κυρίως από τον άξονα ISG15-MDA5 (Εικ. 6a).

Βρήκαμε ότι η μη δομική πρωτεΐνη 3 SCoV2 (Nsp3), μέσα στην οποία βρίσκεται το PLpro, αλληλεπιδρά εύκολα με το ενδογενές MDA5 κατά τη διάρκεια της αυθεντικής μόλυνσης από SCoV2 (Εικ. 6β). Η ενδογενής ISGylation MDA5 ήταν μη ανιχνεύσιμη σε κύτταρα μολυσμένα με SCoV2-, αν και ο ιός πυροδότησε την έκφραση ISG15. Ωστόσο, σε μολυσμένα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ειδικό αναστολέα PLpro15, η ISGylation MDA5 και η επαγωγή ISG κατάντη ενισχύθηκαν σημαντικά (Εικ. 6γ), υποστηρίζοντας την πρόταση ότι το PLpro καταστέλλει αποτελεσματικά την ISGylation MDA5 και τη σηματοδότηση κατά τη διάρκεια ζωντανής μόλυνσης από SCoV2. Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση του WT και του μεταλλαγμένου PLpro στην ενεργοποίηση του ενδογενούς MDA5 κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από mutEMCV. Σύμφωνα με την επίδρασή τους στην MDA5 ISGylation (Εικ. 5β και Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 6α), το SCoV2 PLpro WT και το Phe69Ala απέτρεψαν την επαγωγή μεταγραφής κατά του ιού, ενώ το MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, παρόμοιο με το γονίδιο Cys111Ala δεν επηρέασε το αντιικό γονίδιο (Fig. 6δ). Σε συμφωνία με αυτό, η αντιγραφή του mutEMCV ενισχύθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν PLpro WT ή Phe69Ala, αλλά όχι σε κύτταρα που εκφράζουν PLpro Cys111Ala ή Arg166Ser/Glu167Arg (Εικ. 6d). Ομοίως, το WT PLpro, αλλά όχι το μετάλλαγμα Arg166Ser/Glu167Arg ή Cys111Ala, απέκλεισε τον περιορισμό EMCV από το FLAG–MDA5 (Εικ. 6e). η επίδραση στην αντιγραφή του ιού συσχετίστηκε με τις επαγόμενες πρωτεΐνες ISG (Εικ. 6στ). Συλλογικά, αυτό καθιερώνει το SCoV2 PLpro ως ανταγωνιστή IFN που απο-ISGylates ενεργά MDA5.

Συζήτηση

Η σύζευξη ISG15 είναι γνωστό ότι προσδίδει αντιική δράση σε ένα πλήθος ιών. Ωστόσο, έχουν εντοπιστεί μόνο μερικά γνήσια υποστρώματα12. Από την άλλη πλευρά, το ISG15 στη μη συζευγμένη του μορφή δρα προσωρινά ενισχύοντας την αναστολή σήματος IFNAR με τη μεσολάβηση USP18-31,32,40. Η παρούσα μελέτη προσδιορίζει έναν βασικό ρόλο για την ISGylation στην επαγωγή IFN με τη μεσολάβηση MDA5-. Η εργασία μας τονίζει επίσης τη σημασία του πειραματικού σχεδιασμού στον οποίο η αποσύνδεση του ρόλου του ISG15 στην ενεργοποίηση του MDA5 από αυτόν στην απόσβεση της σηματοδότησης IFNAR είναι απαραίτητη για την αποκάλυψη της ισχυρής αντιϊκής δράσης του ISG15. Σε έναν μολυσμένο οργανισμό, είναι πιθανώς το άθροισμα πολλαπλών γεγονότων ISGylation (που επηρεάζουν τόσο τις πρωτεΐνες του ξενιστή όσο και τις ιικές πρωτεΐνες) που καθορίζει την έκβαση της μόλυνσης και την παθογένεση, η οποία μπορεί να εξαρτάται από το πλαίσιο12.

Οφέλη από το σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η ISGylation του MDA5 δρα αναλόγως με τη Lys63-συνδεδεμένη ουμπικιτινίωση του RIG-I5: και τα δύο PTM (1) ρυθμίζονται από την επαγόμενη από PP1-αποφωσφορυλίωση και (2) προάγουν τον ολιγομερισμό CARD και το RLR υψηλότερο -παραγγελία συγκροτημάτων. Ωστόσο, ενώ η ουβικιτίνη είναι άφθονη τόσο σε μη μολυσμένα όσο και σε μολυσμένα κύτταρα, η έκφραση ISG15 αυξάνεται έντονα από τη διέγερση με IFN. Ωστόσο, ακόμη και σε βασικά επίπεδα, το ISG15 είναι συζευγμένο με πολλές πρωτεΐνες ξενιστές20, συμπεριλαμβανομένου του MDA5 όπως έδειξε η εργασία μας, το οποίο μπορεί να είναι αρκετό για την αρχική ενεργοποίηση του MDA5. Κατά τη διάρκεια ιογενών λοιμώξεων που ανιχνεύονται από πολλαπλά PRR, η MDA5 ISGylation μπορεί να είναι ένας μηχανισμός «εκκίνησης» με τον οποίο η ανοδική ρύθμιση του ISG15 από έναν άμεσο εγγενή αισθητήρα (για παράδειγμα, RIG-I)41 εκκινεί το MDA5 για να εισέλθει σε λειτουργία «εκκίνησης». Καθώς το ISG15 ρυθμίζει αρνητικά το RIG-I16,17, το ISGylation μπορεί να προκαλέσει «εναλλαγή αισθητήρα» όπου η ενεργοποίηση MDA5 προωθείται όταν αυξάνονται τα επίπεδα ISG15, ενώ η δραστηριότητα RIG-I μειώνεται. Προσδιορίσαμε ότι το SCoV2 PLpro ανταγωνίζεται την MDA5 ISGylation μέσω της ενζυματικής του δράσης μετά τη δέσμευση στον αισθητήρα. αυτή η στρατηγική πιθανότατα διατηρείται μεταξύ των κοροναϊών, κάτι που απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Οι αναλύσεις με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψαν ότι το κορονοϊό Nsp3 είναι μέρος ενός συμπλέγματος πόρων που εκτείνεται σε κυστίδια διπλής μεμβράνης που προέρχονται από το ενδοπλασματικό δίκτυο και εξάγει νεοσυντιθέμενο ιικό RNA42. Έτσι, το MDA5 μπορεί να τοποθετηθεί σε άμεση γειτνίαση με τη θέση εξαγωγής ιικού RNA για να διευκολύνει την ανίχνευση PAMP. Ωστόσο, η περιοχή PLpro του Nsp3 (η οποία βρίσκεται στην κυτταροπλασματική πλευρά) εμποδίζει τη σηματοδότηση MDA5 μέσω άμεσης απο-ISGylation. Ορισμένοι ιοί μπορεί επίσης να αναστέλλουν την ISGylation MDA5 μέσω απορρύθμισης της φωσφορυλίωσης MDA5, όπως φαίνεται για το MeV-V. Συνοπτικά, η μελέτη μας αποκαλύπτει έναν εξέχοντα ρόλο για την ISGylation στην ενεργοποίηση της ανοσίας που διαμεσολαβείται από το MDA, καθώς και στην αναστολή της από το SCoV2, αποκαλύπτοντας έναν πιθανό μοριακό στόχο για το σχεδιασμό θεραπευτικών μέσων κατά του COVID-19.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Liu, G. & Gack, MU Διακεκριμένες και ενορχηστρωμένες λειτουργίες αισθητήρων RNA στην έμφυτη. Immunity 53, 26–42 (2020).

2. Wu, J. & Chen, ZJ Έμφυτη ανοσολογική αίσθηση και σηματοδότηση κυτοσολικών νουκλεϊκών οξέων. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).

3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I και άλλοι αισθητήρες RNA στην αντιική ανοσία. Annu. Rev. Immunol. 36, 667–694 (2018).

4. Schlee, M. Κύριοι αισθητήρες παθογόνων υποδοχέων τύπου RNA—RIG-I. Immunobiology 218, 1322-1335 (2013).

5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-like receptors: η ρύθμιση και οι ρόλοι τους στην ανίχνευση RNA. Nat. Rev. Immunol. 20, 537–551 (2020).

6. Wies, Ε. et αϊ. Η αποφωσφορυλίωση των αισθητήρων RNA RIG-I και MDA5 από τη φωσφατάση PP1 είναι απαραίτητη για την έμφυτη ανοσολογική σηματοδότηση. Immunity 38, 437–449 (2013).

7. Gack, MU et al. Η λιγάση της ουβικιτίνης TRIM25 RING-Finger E3 είναι απαραίτητη για την αντιική δράση που προκαλείται από το RIG-I. Nature 446, 916–920 (2007).

8. Chiang, C. & Gack, MU Μετα-μεταφραστικός έλεγχος των ενδοκυτταρικών παθογόνων οδών αίσθησης. Trends Immunol. 38, 39–52 (2017).

9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Κοινές και διακριτές λειτουργίες ιντερφερονών τύπου Ι και τύπου ΙΙΙ. Immunity 50, 907–923 (2019).

10. Schoggins, JW γονίδια που διεγείρονται από την ιντερφερόνη: τι κάνουν όλα; Annu. Rev. Virol. 6, 567–584 (2019).

11. Zhang, D. & Zhang, DE Ιντερφερόνη-διεγερμένο γονίδιο 15 και το σύστημα ISGylation πρωτεΐνης. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).

12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 στην αντιική ανοσία και όχι μόνο. Nat. Rev. Microbiol. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. et al. Μειωμένη δραστηριότητα ιντερφερόνης τύπου Ι και φλεγμονώδεις αποκρίσεις σε ασθενείς με σοβαρή COVID-19. Science 369, 718–724 (2020).

14. Klemm, Τ. et al. Μηχανισμός και αναστολή της παπαΐνης πρωτεάσης, PLpro, του SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).

15. Shin, D. et αϊ. Η πρωτεάση που μοιάζει με παπαΐνη ρυθμίζει την εξάπλωση του ιού του SARS-CoV-2 και την έμφυτη ανοσία. Nature 587, 657–662 (2020).

16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Ρύθμιση αρνητικής ανάδρασης της προκαλούμενης από RIG-I αντιϊκής σηματοδότησης με σύζευξη ISG15 που προκαλείται από ιντερφερόνη. J. Virol. 82, 1474–1483 (2008).

17. Du, Υ. et αϊ. Το LRRC25 αναστέλλει τη σηματοδότηση IFN τύπου Ι στοχεύοντας το RIG-I που σχετίζεται με το ISG15- για αυτοφαγική αποικοδόμηση. EMBO J. 37, 351–366 (2018).

18. Hato, SV et αϊ. Η πρωτείνη οδηγός μηνγοϊού μπλοκάρει τη μεταγραφή του γονιδίου ιντερφερόνης-άλφα/βήτα και αναστέλλει την ενεργοποίηση του ρυθμιστικού παράγοντα 3 της ιντερφερόνης. Κυτταρική μικροβιόλη. 9, 2921–2930 (2007).

19. Deddouche, S. et al. Προσδιορισμός ενός σχετιζόμενου με LGP2-αγωνιστή MDA5 σε κύτταρα μολυσμένα με ιό πικορνα. eLife 3, e01535 (2014).

20. Το σύστημα σύζευξης Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te ISG15 στοχεύει ευρέως σε νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες: επιπτώσεις για την αντιική λειτουργία του ISG15. ΜοΙ. Cell 38, 722-732 (2010).

21. Lenschow, DJ et al. Αναγνώριση του διεγερμένου από ιντερφερόνη γονιδίου 15 ως αντιιικού μορίου κατά τη διάρκεια μόλυνσης από τον ιό Sindbis in vivo. J. Virol. 79, 13974–13983 (2005).

22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Μεσολαβούμενη από φωσφορυλίωση αρνητική ρύθμιση της αντιϊκής δραστηριότητας RIG-I. J. Virol. 84, 3220–3229 (2010).

23. Nistal-Villan, Ε. et al. Αρνητικός ρόλος της φωσφορυλίωσης της σερίνης 8 RIG-I στη ρύθμιση της παραγωγής ιντερφερόνης-βήτα. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).

24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Η συμβατική πρωτεϊνική κινάση C-άλφα (PKC-άλφα) και η PKC-βήτα ρυθμίζουν αρνητικά τη μεταγωγή σήματος αντιικού RIG-I. J. Virol. 86, 1358–1371 (2012).

25. Davis, ΜΕ et al. Ο ανταγωνισμός της φωσφατάσης PP1 από την πρωτεΐνη V του ιού της ιλαράς απαιτείται για την έμφυτη ανοσολογική διαφυγή του MDA5. Cell Host Microbe 16, 19–30 (2014).

26. Η πρωτεΐνη Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperone προάγει την αντιϊκή έμφυτη ανοσία μέσω της διευκόλυνσης του ολιγομερισμού του MDA5 και της ενδοκυτταρικής ανακατανομής. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).

27. Wu, Β. et αϊ. Δομική βάση για αναγνώριση dsRNA, σχηματισμό νήματος και ενεργοποίηση αντιιικού σήματος από το MDA5. Cell 152, 276-289 (2013).

28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM δομές νηματίων MDA5-dsRNA σε διαφορετικά στάδια υδρόλυσης ΑΤΡ. ΜοΙ. Cell 72, 999–1012 (2018).

29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Ο έμφυτος ανοσολογικός αισθητήρας LGP2 ενεργοποιεί την αντιική σηματοδότηση ρυθμίζοντας την αλληλεπίδραση MDA5-RNA και τη συναρμολόγηση νήματος. ΜοΙ. Cell 55, 771-781 (2014).

30. Uchikawa, Ε. et αϊ. Δομική ανάλυση της δέσμευσης dsRNA στους υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων κατά των ιών LGP2 και MDA5. ΜοΙ. Cell 62, 586–602 (2016).

31. Malakhova, OA et al. Το UBP43 είναι ένας νέος ρυθμιστής της σηματοδότησης της ιντερφερόνης ανεξάρτητα από τη δραστικότητα της ισοπεπτιδάσης ISG15. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).

32. Zhang, Χ. et αϊ. Το ανθρώπινο ενδοκυτταρικό ISG15 αποτρέπει την υπερενίσχυση ιντερφερόνης-άλφα/βήτα και την αυτο-φλεγμονή. Nature 517, 89–93 (2015).

33. Harcourt, BH et al. Προσδιορισμός προϊόντων ρεπλικάσης κορονοϊού σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου και χαρακτηρισμός δραστικότητας πρωτεάσης τύπου παπαΐνης. J. Virol. 78, 13600–13612 (2004).

34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Ο ιός της ηπατίτιδας από κορωνοϊό ποντικού ποντικού αναγνωρίζεται από το MDA5 και προκαλεί ιντερφερόνη τύπου Ι σε μακροφάγα/μικρογλοία του εγκεφάλου. J. Virol. 82, 9829–9838 (2008).

35. Menachery, VD et al. Εξασθένηση και αποκατάσταση σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου μετάλλαξης κορωνοϊού που στερείται δραστηριότητας 2'-Ο-μεθυλοτρανσφεράσης. J. Virol. 88, 4251–4264 (2014).

36. Bekes, Μ. et al. Αναγνώριση της Lys48-συνδεδεμένης δι-ουβικιτίνης και των δραστηριοτήτων αποουβικιτίνης της πρωτεάσης παπαΐνης του κορωνοϊού SARS. ΜοΙ. Cell 62, 572-585 (2016).

37. Childs, Κ. et al. Το mda-5, αλλά όχι το RIG-I, είναι ένας κοινός στόχος για τις πρωτεΐνες V παραμυξοϊού. Virology 359, 190–200 (2007).

38. Shi, ΗΧ et αϊ. Θετική ρύθμιση της ενεργοποίησης του ρυθμιστικού παράγοντα 3 της ιντερφερόνης από το Herc5 μέσω τροποποίησης ISG15. ΜοΙ. Cell Biol. 30, 2424–2436 (2010).

39. Blanco-Melo, D. et al. Η μη ισορροπημένη απόκριση του κεντρικού υπολογιστή στον SARS-CoV-2 οδηγεί στην ανάπτυξη του COVID-19. Cell 181, 1036–1045 (2020).

40. Speer, SD et al. Ανεπάρκεια ISG15 και αυξημένη ιική αντίσταση σε ανθρώπους αλλά όχι σε ποντίκια. Nat. Commun. 7, 11496 (2016).

41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Οι ουσιαστικοί, μη περιττοί ρόλοι των RIG-I και MDA5 στην ανίχνευση και τον έλεγχο της μόλυνσης από τον ιό του Δυτικού Νείλου. J. Virol. 87, 11416–11425 (2013).

42. Wolf, G. et al. Ένας μοριακός πόρος εκτείνεται στη διπλή μεμβράνη του οργανιδίου αντιγραφής του κοροναϊού. Science 369, 1395–1398 (2020).

43. Ταγματάρχης, EO et al. Δημιουργία μιας σειράς ανθρώπινων εμβρυϊκών νευρογλοιακών κυττάρων που υποστηρίζει τον πολλαπλασιασμό του ιού JC. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82, 1257–1261 (1985).

44. Hertzog, J. et al. Η μόλυνση με ένα βραζιλιάνικο προϊόν απομόνωσης του ιού Ζίκα δημιουργεί διεγερτικό RNA RIG-I και η ιική πρωτεΐνη NS5 εμποδίζει την επαγωγή και τη σηματοδότηση IFN τύπου Ι. Ευρώ. J. Immunol. 48, 1120–1136 (2018).

45. Cerikan, Β. et αϊ. Εγγενής προσαρμογή των κυττάρων που προκύπτει από χρόνια κατάλυση ενός βασικού ρυθμιστή rho GTPase. Dev. Cell 39, 28–43 (2016).

46. ​​Chan, YK & Gack, MU Ένας μηχανισμός του ιού του δάγκειου πυρετού που βασίζεται σε φωσφομιμητικά για να ανταγωνίζεται την έμφυτη ανοσία. Nat. Immunol. 17, 523–530 (2016).

47. Riedl, W. et αϊ. Ο ιός Zika NS3 μιμείται ένα κυτταρικό 14-3-3-μοτίβο δέσμευσης για να ανταγωνίζεται την έμφυτη ανοσία που προκαλείται από RIG-I- και MDA5-. Cell Host Microbe 26, 493–503 (2019).

48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 ουβικουτυλίωση και αποικοδόμηση από τον ιό της παρωτίτιδας καταστέλλουν τη σηματοδότηση κυτοκίνης και ογκογονιδίου. J. Virol. 77, 6385–6393 (2003).

49. Oudshoorn, D. et al. Η HERC6 είναι η κύρια λιγάση Ε3 για σφαιρική σύζευξη ISG15 σε κύτταρα ποντικού. PLoS ONE 7, e29870 (2012).

50. Kim, DK et al. Μια ολοκληρωμένη, ευέλικτη συλλογή περιοχών κωδικοποίησης SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).

51. Chiang, C. et αϊ. Η ογκοπρωτεΐνη Ε6 του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων στοχεύει τις USP15 και TRIM25 για να καταστείλει την έμφυτη ανοσολογική σηματοδότηση που προκαλείται από το RIG-I. J. Virol. 92, e01737-17 (2018).

52. Gack, MU et al. Οι ρόλοι της RIG-I N-τερματικής διαδοχικής κάρτας και παραλλαγής ματίσματος στη μεταγωγή σήματος κατά του ιού με τη μεσολάβηση TRIM25-. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 16743–16748 (2008).

53. Chiang, JJ et al. Η ιική αποκάλυψη των κυτταρικών μεταγραφών ψευδογονιδίου 5S rRNA επάγει ανοσία που προκαλείται από RIG-I. Nat. Immunol. 19, 53–62 (2018).

54. Sparrer, KMJ et al. Το TRIM23 μεσολαβεί στην επαγόμενη από τον ιό αυτοφαγία μέσω ενεργοποίησης του TBK1. Nat. Microbiol. 2, 1543–1557 (2017).