Η ολοκληρωμένη ανάλυση Omics αποκαλύπτει μονοπάτια που σχετίζονται με μικροαγγειακή φλεγμονή σε βιοψίες αλλομοσχευμάτων νεφρού

edmund.chen@wecistanche.com

Στη μεταμόσχευση στερεών οργάνων, τα microRNA (miRNAs) έχουν αναδειχθεί ως βασικοί παράγοντες στη ρύθμιση της λειτουργίας των αλλομοσχευτικών κυττάρων ως απόκριση σε τραυματισμό. Για να αποκτήσουμε μια εικόνα του ρόλου των miRNAs στην απόρριψη που προκαλείται από αντισώματα, ένας φαινότυπος απόρριψης που ορίζεται ιστολογικά από μικροαγγειακή φλεγμονή,νεφρό Οι βιοψίες αλλομοσχευμάτων υποβλήθηκαν σε προφίλ miRNA αλλά και σε αγγελιοφόρο RNA (mRNA). Χρησιμοποιώντας μια μοναδική διαδικασία επιλογής πολλαπλών βημάτων που είναι ειδική για τη μελέτη BIOMARGIN (κοόρτη ανακάλυψης, N=86; κοόρτη επιλογής, N=99, κοόρτη επικύρωσης, N=298), έξι διαφορετικά εκφρασμένα miRNA ταυτοποιήθηκαν με συνέπεια: miR-139-5p (κάτω) και miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (πάνω). Το επίπεδο έκφρασής τους συσχετίστηκε σταδιακά με την ένταση της μικροαγγειακής φλεγμονής. Η κυτταρική ειδικότητα των γονιδίων-στόχων miRNAs διερευνήθηκε ενσωματώνοντας τους in vivo mRNA στόχους τους με αλληλουχία μονοκυτταρικού RNA από μια ανεξάρτητη κοόρτη βιοψίας αλλομοσχεύματος. Η έκφραση miR{11}}p που προέρχεται από το ενδοθήλιο συσχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση γονιδίων που σχετίζεται με το MHC. Αντίθετα, η υπερέκφραση του miR{14}}p που προέρχεται από το επιθήλιο συσχετίστηκε ισχυρά με την υποβαθμισμένη ομοιόσταση των νεφρικών ηλεκτρολυτών και τις κατασταλμένες οδούς που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό. Στα ανοσοκύτταρα, το miR-150-5p ρύθμισε την ενεργοποίηση του NF-kB στα Τ λεμφοκύτταρα ενώ το miR-155-5p ρύθμισε το μάτισμα του mRNA σε κύτταρα που παρουσίαζαν αντιγόνο. Συνολικά, τα ενσωματωμένα ωμικά μάς επέτρεψαν να ξεδιαλύνουμε νέα μονοπάτια που εμπλέκονται στη μικροαγγειακή φλεγμονή και προτείνουμε ότι οι τροποποιήσεις του μεταβολισμού στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα συμβαίνουν ως συνέπεια της απόρριψης που προκαλείται από αντισώματα, πέρα ​​από το κοντινό ενδοθηλιακό διαμέρισμα.

Λέξεις-κλειδιά:μεταμόσχευση νεφρού, microRNA, multi-omics, μικροαγγειακή φλεγμονή, απόρριψη που προκαλείται από αντισώματα

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

ΕΙΣΑΓΩΓΗΣεμεταμόσχευση νεφρού(KT), η αλλοάνοση βλάβη συνήθως χωρίζεται σε δύο τύπους απόρριψης αλλομοσχεύματος σύμφωνα με τη χωρική κατανομή της ανοσοδιήθησης και πληροφορίες σχετικά με την παρουσία ή την απουσία αντισωμάτων αντι-HLA ειδικών για τον δότη. Η διάγνωση βασίζεται στη βιοψία αλλομοσχεύματος με τη διαβάθμιση των ιστολογικών βλαβών σύμφωνα με την ταξινόμηση Banff International Consensus(1). Η σωληναρίτιδα (τραύμα "t") και η διάμεση φλεγμονή (πληγή "Ι") είναι χαρακτηριστικά ιστολογικά χαρακτηριστικά της απόρριψης με τη μεσολάβηση Τ-λεμφοκυττάρων (TCMR) και σχετίζονται με την άμεση κυτταροτοξικότητα στο διάμεσο σωληναριακό διαμέρισμα. Η απόρριψη με τη μεσολάβηση αντισωμάτων (ABMR) σχετίζεται συχνότερα με κυκλοφορούντα αντισώματα anti-HLA με φλεγμονή που στοχεύει το μικροαγγειακό διαμέρισμα. Οι ενεργές ιστολογικές βλάβες ABMR περιλαμβάνουν την παρουσία μονοπύρηνων κυττάρων στα σπειραματικά τριχοειδή αγγεία ("g" αλλοίωση) και στα περισωληνοειδή τριχοειδή ("ptc" αλλοίωση), που αναφέρονται συνδυαστικά ως "μικροαγγειακή φλεγμονή" (MVI). Σε χρόνια ενεργό ABMR, χρόνιος τραυματισμός ιστού, όπως σπειραματοπάθεια από μεταμόσχευση ή αρτηριακή ίνωση του εσωτερικού χιτώνα, προστίθεται σε αυτές τις οξείες βλάβες(1). Χρησιμοποιώντας τους τρέχοντες ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες που στοχεύουν στα Τ' κύτταρα, η TCMR θεωρείται ότι έχει περιορισμένη προγνωστική επίδραση, ενώ η ABMR είναι μια κύρια αιτία αποτυχίας του μοσχεύματος, η οποία σχετίζεται με την έλλειψη αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων (2).

Προκειμένου να βρεθούν καλύτερες θεραπείες για το MVI και το ABMR, απαιτείται καλύτερη γνώση των βιολογικών μηχανισμών που βρίσκονται πίσω από αυτές τις διαδικασίες τραυματισμού. Οι τεχνολογίες omics υψηλής απόδοσης φαίνεται να είναι κατάλληλες για το σκοπό αυτό, καθώς επιτρέπουν τον ακριβή και ταυτόχρονο έλεγχο χιλιάδων γονιδίων, πρωτεϊνών και μεταβολιτών(3). Ολόκληρη-μεταγραφική ανάκριση τουνεφρόΟι βιοψίες αλλομοσχεύματος έχουν δείξει βαθιές αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου mRNA στα τραυματισμένα μόνιμα κύτταρα ή σε διεισδυτικούς κυτταρικούς πληθυσμούς κατά τη διάρκεια του ABMR(4). Εν τω μεταξύ, τα microRNA (miRNAs) έχουν αναδειχθεί ως βασικοί παίκτες στον κυτταρικό μεταβολισμό, ρυθμίζοντας το αγγελιαφόρο RNA (mRNA) σε μεταμεταγραφικό επίπεδο. Στην πραγματικότητα, τα miRNA έφεραν επανάσταση στην κατανόησή μας για τη βελτίωση των φυσιολογικών διεργασιών του σώματος που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη(5). Δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι η απορρυθμισμένη έκφραση miRNA έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη πολλών παθολογιών, συμπεριλαμβανομένωννεφρική νόσο(6). Καθώς τα προφίλ έκφρασης miRNA διαφέρουν μεταξύ ασθενών και υγιών καταστάσεων, πολλές μελέτες έχουν αναλύσει τα miRNA είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με άλλους πιο παραδοσιακούς δείκτες, όχι μόνο για τη διάγνωση της νόσου και την πρόγνωση της εξέλιξης της νόσου αλλά και για το σχεδιασμό πιθανών θεραπευτικών εφαρμογών (7).

Στο πλαίσιο της μεταμόσχευσης στερεών οργάνων, τα miRNAs μπορεί να εμπλέκονται στην απόρριψη μέσω του ρόλου τους στη ρύθμιση της λειτουργίας των ανοσοκυττάρων και στην απόκριση των κυττάρων που κατοικούν στο αλλομόσχευμα σε τραυματισμό (6,8). Αρκετές μελέτες έχουν διερευνήσει τα miRNA αλλομοσχευμάτων ως βιοδείκτες και/ή τελεστές στις ρυθμίσεις του TCMR (8,9), αλλά καμία δεν έχει επικεντρωθεί μέχρι στιγμής στο MVI και το ABMR. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύαμε να ενσωματώσουμε διαφορετικά επίπεδα ωμικής απόνεφρόβιοψίες αλλομοσχευμάτων, για να αποκτήσουν μια εικόνα του ρόλου των miRNA σε αυτόν τον επιβλαβή φαινότυπο απόρριψης.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχεδιασμός ΜελέτηςΑυτή η μελέτη αποτελεί μέρος των BIOMarkers που χρηματοδοτούνται από το FP7-ΝεφρώνΠρόγραμμα έρευνας για τραυματισμούς μοσχεύματος (BIOMARGIN, https://cordis.europa. eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, αριθμός NCT02832661), υπό την ηγεσία μιας ευρωπαϊκής ερευνητικής κοινοπραξίας σε αναζήτηση βιοδεικτών αλλομοσχευμάτων ανοσοποιητικών αλλοιώσεων σεμεταμόσχευση νεφρούλήπτες, με διαγνωστική ή/και προγνωστική αξία. Το BIOMARGIN είναι μια πολυκεντρική, προοπτική, πολυφασική μελέτη, που πραγματοποιείται στα τέσσεραμεταμόσχευση νεφρούκέντρα στην Ευρώπη (Νοσοκομείο Necker, Παρίσι, Γαλλία, Πανεπιστημιακά Νοσοκομεία, Λουβέν, Βέλγιο, Ιατρική Σχολή Ανόβερου, Αννόβερο, Γερμανία και Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Λιμόζ, Γαλλία). Τα δείγματα συλλέχθηκαν προοπτικά τη στιγμή της διαλογής και των ενδεικτικών βιοψιών μεταξύ Απριλίου 2013 και Ιουνίου 2015 (Εικόνα IA). Όλες οι μεταμοσχεύσεις πραγματοποιήθηκαν με αρνητικές διασταυρώσεις κυτταροτοξικότητας που εξαρτώνται από το συμπλήρωμα. Σε αυτά τα τέσσερα κλινικά κέντρα, πραγματοποιήθηκαν βιοψίες πρωτοκόλλου στους 3,12 και μερικές φορές στους 24 μήνες μετά τη μεταμόσχευση, σύμφωνα με την πρακτική του τοπικού κέντρου, επιπλέον των βιοψιών ένδειξης. Το συμβούλιο θεσμικής αναθεώρησης σε κάθε τοποθεσία ενέκρινε τη μελέτη και όλοι οι ασθενείς παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση.

Κοόρτες ΜελέτηςΗ μελέτη χωρίστηκε σε τρεις φάσεις (Εικόνα 1Α). Στην πρώτη φάση ανακάλυψης περιπτώσεων ελέγχου, χρησιμοποιήθηκαν N=88 δείγματα βιοψίας για ανάλυση έκφρασης σφαιρικού miRNA (N=754 miRNAs, εξαιρουμένων των πιθανών κανονικοποιητικών miRNAs) . Επιλέξαμε δείγματα με βάση τη διαθεσιμότητα και τα ιστολογικά κριτήρια (εξαιρουμένων των περιπτώσεων με διάγνωση σπειραματονεφρίτιδας ή νεφροπάθειας σχετιζόμενης με τον ιό πολυομαίου και περιπτώσεων με ασαφή διάγνωση). Με βάση τις τοπικές αναγνώσεις βιοψίας, έγινε μια πρώτη επιλογή, η οποία βελτιώθηκε περαιτέρω μέσω κεντρικής ανάγνωσης από μια ομάδα παθολόγων, ανεξάρτητων από το αρχικό κέντρο. Η στατιστική ανάλυση (βλ. επιλογή miRNA) χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή της εκτεταμένης λίστας των miRNAs, που εκφράζονται πιο διαφορετικά μεταξύ των ιστολογικών φαινοτύπων, που στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκαν στη 2η φάση.

Ένας παρόμοιος σχεδιασμός μελέτης περίπτωσης-μάρτυρα χρησιμοποιήθηκε για τη δεύτερη φάση (επιλογής), όπου πραγματοποιήθηκε ανάλυση έκφρασης στοχευμένου miRNA (N=143) σε δείγματα βιοψίας N=99. Ο ίδιος στατιστικός αγωγός εφαρμόστηκε για την επιλογή μιας ακόμη πιο περιορισμένης λίστας miRNA, που θα ποσοτικοποιηθεί στη συνέχεια στην 3η φάση. Τέλος, στην τρίτη κοόρτη (επικύρωση), όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν προοπτικά και διαδοχικά σύμφωνα με το πρωτόκολλο BIOMARGIN μεταξύ 24 Ιουνίου 2014 και 2 Ιουλίου 2015 και με επαρκήνεφρόΗ ποιότητα της βιοψίας αλλομοσχεύματος, αξιολογήθηκαν για τα 38 miRNA που επιλέχθηκαν ως αποτέλεσμα της δεύτερης φάσης επιλογής. Σε αυτήν την κοόρτη ρύθμισης της πραγματικής ζωής, δεν έγινε επιλογή με βάση την ιστολογία, τα δημογραφικά στοιχεία, τον χρόνο ή οποιονδήποτε άλλο παράγοντα εκτός από τη διαθεσιμότητα του δείγματος και τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου (καταλληλότητα βιοψίας και απόδοση RNA).

Επιλογή miRNAΈνας ισχυρός στατιστικός αγωγός αναπτύχθηκε ειδικά για τη μελέτη BIOMARGIN στο R(R Core Team(10), έκδοση 1.0.44), ως επέκταση του πακέτου βιοσημάτων R (1l). Εν συντομία, στη φάση της ανακάλυψης, πραγματοποιήσαμε μια στρατηγική επιλογής χαρακτηριστικών που περιλαμβάνει προσεγγίσεις μονομεταβλητών και πολυμεταβλητών. Για μονομεταβλητή επιλογή, χρησιμοποιήσαμε ένα μη παραμετρικό τεστ (δοκιμή Wilcoxon-Mann-Whitney) και ένα παραμετρικό τεστ (Student's t-test) και μια κοόρτη Discovery (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Οι βαθμολογίες πρόβλεψης κάθε μεταγραφής miRNA σε κάθε πολυπαραγοντικό μοντέλο ενσωματώθηκαν για να δώσουν μια "πολυμεταβλητή βαθμολογία". Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα αυτών των μονομεταβλητών και πολυμεταβλητών αναλύσεων, μπορέσαμε να ταξινομήσουμε και να επιλέξουμε ένα υποσύνολο υποψηφίων miRNA που θα είναι μέρος της εκτεταμένης λίστας που θα ποσοτικοποιηθεί κατά την επόμενη φάση.Για αυτήν την μεταθωριακή ανάλυση που επικεντρώνεται στα μονοπάτια VMI, η διάμεση κανονικοποιημένη έκφραση κάθε miRNA συγκρίθηκε μεταξύ των περιπτώσεων και των μαρτύρων χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Wilcoxon και στις τρεις κοόρτες. Ελέγξαμε για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini & Hochberg False Discovery Rate (FDR).

Κλινικοπαθολογική ΕκτίμησηΟι επιμέρους βαθμολογίες ιστολογικών αλλοιώσεων αξιολογήθηκαν ημιποσοτικά σύμφωνα με τα κριτήρια Banff 2019(16). Ο όρος "μικροαγγειακή φλεγμονή" (MVI) χρησιμοποιήθηκε για να αναφέρεται σε οποιονδήποτε βαθμό συνδυασμού σπειραματοειδίτιδας (g) και/ή περισωληνιακής τριχοθυλακίτιδας (ptc). Όλες οι περιπτώσεις ABMR πληρούσαν τα πρώτα 2 κριτήρια της ταξινόμησης Banf 2015 ή Banff 2017 (ιστολογική ενδείξεις οξείας ιστικής βλάβης και ενδείξεις τρέχουσας/πρόσφατης αλληλεπίδρασης αντισωμάτων με το αγγειακό ενδοθήλιο), αλλά δεν πληρούσαν όλες το τρίτο κριτήριο [ορολογικές ενδείξεις ειδικών αντισωμάτων δότη (DSA) και/ή χρώση CAd]. Τα DSA μετά τη μεταμόσχευση προσδιορίστηκαν ανά πρακτική του τοπικού κέντρου, με τη θετικότητα του DSA να ορίζεται ως ανιχνεύσιμα αντισώματα ορού αντι-HLA ειδικά για τον δότη με μέση τιμή έντασης φθορισμού (MFI) 500 τη στιγμή της βιοψίας ή οποιαδήποτε στιγμή πριν.

Εξαγωγή RNA από δείγματα βιοψίας για προφίλ mRNA και miRNAΠυρήνες δύο βελόνων λήφθηκαν σε καθένανεφρόβιοψία αλλομοσχεύματος. Το ένα χρησιμοποιήθηκε για συμβατική ιστολογική ταξινόμηση και τουλάχιστον το μισό από το άλλο αποθηκεύτηκε αμέσως σε Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Ολλανδία). , και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε σε{3}} βαθμό έως την εξαγωγή RNA. Ολικό RNA απομονώθηκε από τονεφρόΔείγματα βιοψίας αλλομοσχεύματος χρησιμοποιώντας το Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen Benelux BV) σε ένα όργανο QIAcube (Qiagen Benelux BV). Η ποσότητα (απορρόφηση στα 26{{2{0}} nm) και η καθαρότητα (αναλογία απορρόφησης στα 230.260 και 280 nm) του απομονωμένου RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Γάνδη, Βέλγιο). Ο αριθμός ακεραιότητας RNA (RIN) αξιολογήθηκε με το κιτ RNA Eukaryote nano/pico (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgium) στο όργανο Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Οι δείκτες ποιοτικού ελέγχου δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ του VMI και του No Ομάδες MVI [RIN(mean±SD):5,6±1,96vs5,4±1,97,P{14}}.66;260/280 ratio (mean±SD):1,87±0,06 vs 1,87±0,1l,P{26 }}.40]. Για δείγματα RNA με χαμηλό RIN (<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΡΥΣΗ

Προφίλ miRNASpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 θεωρήθηκαν ότι δεν εκφράζονται. Τα RNU44 και RNU48 έδειξαν συνεπή έκφραση σε όλα τα δείγματα, ο μέσος συντελεστής διακύμανσης (RNU44 συν RNU48) ήταν 3,73 τοις εκατό στην κάρτα Array A και 3,79 τοις εκατό στην κάρτα Array B] και χρησιμοποιήθηκαν ως γονίδια για την κανονικοποίηση δεδομένων σε όλες τις υπομελέτες.

mRNA Μεταγραφική ΑνάλυσηΗ μεταγραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με μικροσυστοιχία όπως έχει ήδη περιγραφεί(17). Εν συντομία, το συνολικό RNA που εξήχθη από τα δείγματα βιοψίας ενισχύθηκε αρχικά και βιοτινυλιώθηκε σε συμπληρωματικό RNA(cRNA) χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίων GeneChip 39 IVT PLUS (Affymetrix) και υβριδοποιήθηκε με τις ακτίνες Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.{. Affymetrix), το οποίο περιελάμβανε 54.675 σετ ανιχνευτών που κάλυπταν ολόκληρο το γονιδίωμα. Χρησιμοποιήσαμε μια ισχυρή κανονικοποίηση του μέσου όρου πολλαπλών κυκλωμάτων (RMA). Η διάμεση κανονικοποιημένη έκφραση κάθε mRNA συγκρίθηκε μεταξύ των περιπτώσεων και των μαρτύρων χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Wilcoxon. Ελέγξαμε τον πληθωρισμό του κινδύνου άλφα λόγω πολλαπλών δοκιμών εφαρμόζοντας τη μέθοδο Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR). Ο χειρισμός των δεδομένων μικροσυστοιχίας έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες για τις ελάχιστες πληροφορίες σχετικά με το πείραμα μικροσυστοιχιών.

Στο Silico AnalyzesΤο λογισμικό Biological Interpretation Of Multiomics Experiments (BIOMEX) χρησιμοποιήθηκε για διαφορική ανάλυση μεταγραφικών δεδομένων, χρησιμοποιώντας τον σχολιασμό Ensembl ID(18). Το Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Έκδοση: 478438M Έκδοση περιεχομένου:44691306, Qiagen) και το OMICSnet(19) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συνόλων γονιδίων που ρυθμίζονται από τα επιλεγμένα miRNA. Το OMICSnet χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση ανάλυσης οντολογίας γονιδίων με τη βάση δεδομένων μονοπατιού Reactome, χρησιμοποιώντας την πλήρη διαδρομή (20). Η δημιουργία γονιδιακών δικτύων ήταν εντελώς χωρίς επίβλεψη και βασιζόταν στον αριθμό των αναφερόμενων μοριακών αλληλεπιδράσεων κάθε μεμονωμένου γονιδίου με όλα τα άλλα γονίδια στο δίκτυο. Τα γονίδια που παρουσιάζουν τον υψηλότερο αριθμό αλληλεπιδράσεων τοποθετήθηκαν αυτόματα στο κέντρο του δικτύου, ενώ τα γονίδια με μικρότερο αριθμό αλληλεπιδράσεων εξαπλώθηκαν στην περιφέρεια. Η κυτταρική προέλευση επιλεγμένων miRNAs διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας το έργο Fantom5(21), το οποίο παρέχει μια ανάλυση κεφαλαίων της γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινα κύτταρα και ιστούς. Για ανάλυση έκφρασης miRNA, εξετάσαμε όλανεφρό-σχετικά δομικά κύτταρα και όλα τα κυκλοφορούντα αιμοποιητικά κύτταρα, χωρίς περαιτέρω επιλογή.

Ανάλυση Δεδομένων Αλληλουχίας Μονοκυτταρικού RNAΧρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα αλληλουχίας ανθρώπινου μονοκύτταρου RNA (siRNA-seq) από δύο βιοψίες ABMR και τέσσερις υγιείς αναφορές που αντιστοιχούν σε βιοψίες επιτήρησης μοσχεύματος. Οι σχετικές ακατέργαστες μετρήσεις ή πίνακες λήφθηκαν αντίστοιχα από το GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22)καιΝεφρόPrecision Medicine Project (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Οι ακατέργαστες μήτρες έκφρασης γονιδίου που δημιουργήθηκαν ανά δείγμα συγχωνεύτηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη συσκευασία Seurat V4 (23). Οι παράμετροι που εφαρμόστηκαν για τη δημιουργία και το φιλτράρισμα αντικειμένων Seurat ήταν οι εξής: συμπερίληψη κυττάρων που εκφράζουν από 500 έως 10000 ανιχνευμένα γονίδια και λιγότερο από 25 τοις εκατό μιτοχονδριακά μεταγραφήματα. Μετά το φιλτράρισμα, όλα τα αντικείμενα ενσωματώθηκαν χρησιμοποιώντας τη ροή εργασίας ενοποίησης SCTransform στο Seurat (24). Εν συντομία, χρησιμοποιήθηκαν 3000 δυνατότητες για ενσωμάτωση χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση PrepSCTIntegration και η συνάρτηση FindIntegrationAnchors χρησιμοποιήθηκε για τον περιορισμό του εφέ παρτίδας. Ένα πλήρες σύνολο δεδομένων προσέγγισης και προβολής ομοιόμορφης πολλαπλής (UMAP) δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση DimPlot και τα κορυφαία 16 κύρια στοιχεία. Τα συμπλέγματα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τις συναρτήσεις FindNeighbors και FindClusters με ανάλυση 0,6. Η αναγνώριση συστάδων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση FeaturePlot αξιολογώντας την έκφραση συγκεκριμένων δεικτών σε κάθε σύμπλεγμα. Τα διαγράμματα κουκκίδων δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τις συναρτήσεις σχεδίασης DotPlot και FeaturePlot, με κανονικοποιημένες μετρήσεις στον προσδιορισμό RNA ως δεδομένα εισόδου.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ

Στατιστική ανάλυσηΤα χαρακτηριστικά του ασθενούς και του δότη περιγράφηκαν με αριθμούς, ποσοστά και συχνότητες για κατηγορικές μεταβλητές. Αναφέραμε συνεχείς μεταβλητές χρησιμοποιώντας μέσους όρους και τυπικές αποκλίσεις (SD) εάν κατανέμονται κανονικά, διάμεσους και διατεταρτημοριακά εύρη (IQR) για μεταβλητές με λοξή κατανομή. Συγκρίναμε τα χαρακτηριστικά τους χρησιμοποιώντας το τεστ Fisher ή το τεστ Wilcoxon όταν ήταν απαραίτητο. Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμή Kruskal-Wallis για να συγκρίνουμε τη διάμεση έκφραση miRNA σύμφωνα με την ένταση MVI και τη δοκιμή Spearman για ανάλυση συσχέτισης. Θεωρήσαμε τη στατιστική σημασία για τις τιμές P μικρότερη από 0.05. Χρησιμοποιήσαμε το GraphPad Prism (έκδοση 8; GraphPad Software, San Diego, CA) και το RStudio (έκδοση 4.0.3) για στατιστική ανάλυση και παρουσίαση δεδομένων. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πακέτα R: heatmap3 (heatmap3_1.1.9)για αναλύσεις θερμικών χαρτών, fmsb(fmsb_0.7.0)και κλίμακες (κλίμακες_1.1.1)πακέτα για οικόπεδα ραντάρ, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) για γραφήματα ράβδων και complot(corrplot_0.90) για ανάλυση πίνακα συσχέτισης.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Αναγνώριση πολλαπλών βημάτων των miRNA που σχετίζονται με το MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Οι άλλοι 59 ασθενείς (MVI-) παρουσίασαν διάφορες διαγνώσεις που περιελάμβαναν απόρριψη με τη μεσολάβηση Τ-κυττάρων (TCMR, N=8), διάμεση ίνωση και σωληναριακή ατροφία (IFIA, N=20), και φυσιολογικές βιοψίες (N{{6 }}), αλλά όχι MVI. Από τα 754 υποψήφια miRNA, 18 miRNA εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ των ομάδων MVI plus και MVI- (Εικόνα 1Β). Στην κοόρτη επιλογής, ένας περιορισμένος κατάλογος 143 miRNAs ποσοτικοποιήθηκε σε 99 δείγματα. Σε αυτήν την κοόρτη επιλογής, 14 miRNA εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ των περιπτώσεων με (N=28) και χωρίς (N=71)ABMR (Εικόνα 1C). Τέλος, στη μεγαλύτερη διατομική κοόρτη, 38 miRNAs ποσοτικοποιήθηκαν σε 298 δείγματα, εκ των οποίων τα 12 miRNA εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ βιοψιών ABMR(N{{{=29) έναντι no ABMR (N=269) (Εικόνα 1D ).

Συνεπής αναγνώριση 6 σχετιζόμενων με MVI MiRNAs και συσχέτιση με την ιστολογίαΣτη συνέχεια, διασταυρώσαμε τις 3 λίστες των διαφορικά εκφραζόμενων miRNAs και εντοπίσαμε 6 miRNA που συσχετίστηκαν σταθερά με το MVI ή το ABMR στις 3 ανεξάρτητες κοόρτες (Εικόνα 2Α).miR-142-3p,miR-150-5p,miR Οι -155-5p, miR-222-3p και miR-223-3p υπερεκφράστηκαν σε MVI/ABMR, ενώ η έκφραση miR-139-5p μειώθηκε. Τα διαγράμματα ραντάρ (Εικόνα 2Β) εμφανίζουν για κάθε βήμα τη διαφορική έκφραση μεταξύ περίπτωσης και ελέγχου των 6 miRNAs και υποστηρίζουν την ευρωστία των προφίλ miRNA στις τρεις ανεξάρτητες κοόρτες. Στη συνέχεια, μελετήσαμε πώς η έκφραση των 6 miRNAs σχετίζεται με μεμονωμένες ιστολογικές βλάβες και στις 483 βιοψίες αλλομοσχευμάτων που λαμβάνονται μαζί. Η έκφραση των 5 ρυθμιζόμενων miRNA σταδιακά αυξήθηκε με την ένταση των βλαβών MVI, ενώ η έκφραση του miR-139-5p συσχετίστηκε αρνητικά (Εικόνα 2Γ).MiR-139-5p/142-3p/ Το 150-5p/155-5p/223-3p όχι μόνο συσχετίστηκε σε μεγάλο βαθμό με χαρακτηριστικά που σχετίζονται με το ABMR (g, ptc, C4d εναπόθεση), αλλά και με βλάβες που σχετίζονται με TCMR (i, t ) και βλάβες IFTA (ct, ci), υποδηλώνοντας τη συμμετοχή τους σε κοινές, μη ειδικές για το ABMR, φλεγμονώδεις και ουλώδεις διεργασίες. Εναλλακτικά, κάποια εγγενής συγγραμμικότητα μπορεί εκ φύσεως να υπάρχει μεταξύ των βλαβών, με αποτέλεσμα την αδυναμία μας να αναγνωρίσουμε την πραγματική εξειδίκευση για μία βλάβη. Το MiR-222-3p δεν συσχετίστηκε με ιστολογικές βλάβες TCMR ή IFTA (Εικόνα 2D).

Multi-Omics Integration: Αλληλεπίδραση mRNA-miRNA στο MVΣτη συνέχεια, αξιολογήσαμε τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια μεταξύ των περιπτώσεων MVI plus και MVI-, στο προηγουμένως δημοσιευμένο σύνολο ανακάλυψης (25). Από τους 54.675 ανιχνευτές, συνολικά 2755 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) ταυτοποιήθηκαν μεταξύ των MVI plus και MVI-

ομάδες, που περιλαμβάνουν 1085 ρυθμισμένα προς τα κάτω και 1670 προς τα πάνω ρυθμισμένα γονίδια (Εικόνα 3Α). Τα πιο διαφορικά εκφρασμένα mRNA σε δείγματα MVI plus ήταν τα CXCL9 και CXCL10, σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές(17,26) ότι αυτά τα γονίδια είναι τα πιο υπερεκφρασμένα στο ABMR. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε το IPA και το OMICSnet για να αναγνωρίσουμε σε silico τα υποτιθέμενα γονίδια-στόχους για κάθε miRNA. Συνολικά 4504 mRNA προβλέφθηκε ότι θα στοχεύονταν από τουλάχιστον ένα από τα 6 miRNA. Στη συνέχεια, ενσωματώσαμε αυτούς τους 4504 προβλεπόμενους στόχους με τα DEG σε βιοψίες αλλομοσχευμάτων. Η ολοκληρωμένη ανάλυση miRNA/mRNA εντόπισε 61 DEG που στοχεύονταν από το miR-139-5p που αυξήθηκαν σημαντικά στις βιοψίες MVI συν. Προσδιόρισε επίσης 28, 58,52,43 και 27 DEGs σημαντικά μειωμένες σε βιοψίες MVI συν που στοχεύονταν αντίστοιχα από miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p,and miR-223-3p (Εικόνα 3Β).

Κυτταρική προέλευση των miRNAs που σχετίζονται με το MVΗ κυτταρική προέλευση των έξι miRNAs χαρακτηρίστηκε σε διάφορανεφρώνυπότυποι κυττάρων και αιμοποιητικών κυττάρων χρησιμοποιώντας άτλαντα miRNA που είναι διαθέσιμος στο διαδίκτυο [βάση δεδομένων Fantom (27)]. Η ομαδοποίηση χωρίς επίβλεψη έγινε διάκρισηνεφρώνmiRNA που προέρχονται από κύτταρα από miRNA που προέρχονται από κύτταρα του ανοσοποιητικού (Εικόνα 4Α). Αποκάλυψε επίσης έναν ή δύο κυρίαρχους τύπους κυττάρων για κάθε miRNA. Το MiR-139-5p φάνηκε να εκφράζεται κυρίως από σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα (EC). Το MiR-222-3p, αν και η έκφρασή του δεν συσχετίστηκε με σωληναριακή φλεγμονή (βλάβες Banff"t", Εικόνα 2D), σχετιζόταν κυρίως μενεφρώνεπιθηλιακά κύτταρα. Τα τέσσερα εναπομείναντα miRNAs εκφράστηκαν κυρίως σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) ή κοκκιοκύτταρα, με miR-142-3p εμπλουτισμένο σε κύτταρα ΝΚ και μονοκύτταρα, miR-150-5p σε CD4 plus και CD8 συν Τ κύτταρα, miR -155-5p σε CD19 συν Β κύτταρα και μακροφάγα, και miR-223-3p στα ουδετερόφιλα.

Η αλληλουχία μονοκυτταρικού RNA ταυτοποίησε όλα τα νεφρικά κύτταρα και τα διεισδυτικά ανοσοκύτταρα Για να χαρακτηρίσουμε τον πιθανό ρόλο κάθε miRNA που σχετίζεται με MVI, αναλύσαμε δημόσια διαθέσιμα δεδομένα sc-RNAseq από δύονεφρώνβιοψίες αλλομοσχευμάτων με ABMR και υψηλές βαθμολογίες MVI (g2, ptc3)(22). Αυτά τα σύνολα δεδομένων ενσωματώθηκαν με 4 υγιείς βιοψίες αναφοράς χωρίς MVI. Μετά τον ποιοτικό έλεγχο και το φιλτράρισμα, ανιχνεύθηκαν 31545 κύτταρα και η ομαδοποίηση χωρίς επίβλεψη αποκάλυψε 12 συστάδες (Εικόνα 4Β). Χρησιμοποιήσαμε καθιερωμένους δείκτες(28) για να αναγνωρίσουμε όλους τους κύριους υποτύπους κυττάρων που βρίσκονται και διεισδύουν και να τους επισημάνουμε (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Στη συνέχεια, εστιάσαμε στους κυτταρικούς πληθυσμούς από τους οποίους πιστεύεται ότι προέρχονται τα έξι miRNA μας. Σε αυτόν τον στόχο, διαστρωματώσαμε τα κύτταρα σε 4 κύριες ομάδες που αντιστοιχούν στο ενδοθήλιο, το επιθήλιο, τα λεμφοκύτταρα και τα APCs (Εικόνα 4C). Σύμφωνα με την προηγούμενη ανάλυση αυτών των δεδομένων (22), ούτε ουδετερόφιλοι ούτε πληθυσμοί ΝΚ κυττάρων εντοπίστηκαν στα σύνολα δεδομένων sc-RNASeg.

Το miR-139-5p Ελέγχει την ενεργοποίηση EC και την πορεία παρουσίασης αντιγόνου κατά τη διάρκεια του MVIΤο MiR-139-5p ήταν το μόνο μειωμένο miRNA στη μελέτη μας σε περιπτώσεις με MVI/ABMR (Εικόνα 2Α) και βρέθηκε ότι προέρχεται κυρίως από σπειραματικό EC (Εικόνα 4Α). Εξήντα ένα από τα γονίδια-στόχοι του επιβεβαιώθηκε ότι ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε μαζική μικροσυστοιχία από περιπτώσεις MVI plus (Εικόνα 3Β) και η έκφρασή τους διερευνήθηκε περαιτέρω σε ανάλυση ενός κυττάρου στις 3 προηγουμένως αναγνωρισμένες υποσυστάδες EC (Εικόνες 4Β, Γ). Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5Α, το ενεργοποιημένο ECcluster ήταν ανιχνεύσιμο μόνο σε δείγματα MVI plus. Επιπλέον, τα μισά από τα 61 γονίδια (N=30) αυξήθηκαν σταθερά στις βιοψίες sc-RNAseq MVI συν, ανεξάρτητα από τις τρεις υποομάδες EC. Μεταξύ αυτών, το GBP5 ήταν το πιο αυξημένο γονίδιο. Στη συνέχεια, η ανάλυση γονιδιακής οντολογίας χρησιμοποιώντας αυτές τις 30 μεταγραφές που προέρχονται από το ενδοθήλιο αναγνώρισε τους UBE2D1 και YWHAG ως κεντρικούς παίκτες στο γονιδιακό δίκτυο (Εικόνα 5Β). Πιο συγκεκριμένα, εμπλουτίστηκαν τα μονοπάτια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό και τα μονοπάτια επεξεργασίας και παρουσίασης αντιγόνων με τη μεσολάβηση του κύριου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC) (Εικόνα 5Γ). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ψευδοχρόνου για να χαρακτηριστούν καλύτερα οι αλλαγές γονιδιακής έκφρασης στην πορεία της ενεργοποίησης EC, η τροχιά κατάστασης μεταξύ των κυττάρων (Εικόνες 5D, E), το UBE2D1, το YWHAG και το GBP5 αυξανόταν συνεχώς κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης του ενδοθηλίου που σχετίζεται με το MVI. Πολύ παρόμοιες τροχιές βρέθηκαν για τα γονίδια που σχετίζονται με το MHC HLA-A,-B και -DRA αλλά και για δείκτες ενεργοποίησης του ενδοθηλίου και φλεγμονής όπως VCAM1, CXCL9 και CXCL10, υποδηλώνοντας ότι όλα αυτά τα γονίδια εκφράζονται ταυτόχρονα κατά την ενδοθηλιακή ενεργοποίηση. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το miR-139-5p μειώνεται κατά τη διάρκεια των βλαβών MV και δεν καταστέλλει πλέον την οδό παρουσίασης του αντιγόνου MHC στην ενεργοποιημένη EC.

Το miR-222-3p Βλάπτει και τα δύοΝεφρώνΦυσιολογικές και σχετιζόμενες με το ανοσοποιητικό μονοπάτια σε επιθηλιακά κύτταρα κατά τη διάρκεια του MVI Στη συνέχεια, εστιάσαμε στο miR-222-3p, ένα ρυθμισμένο προς τα πάνω miRNA σε δείγματα MVI μενεφρώνπροέλευση επιθηλιακών κυττάρων και μια πιο αποκλειστική συσχέτιση με ιστολογικές βλάβες που σχετίζονται με ABMR (Εικόνες 2A, D, 4A). Στον ιστό αλλομοσχεύματος όγκου, η έκφραση 43 από τα γονίδια-στόχους του μειώθηκε (Εικόνα 3Β) και αξιολογήθηκε περαιτέρω σε ένα ανάλυση κελιών στο διαφορετικόνεφρώνεπιθηλιακούς πληθυσμούς που προσδιορίσαμε προηγουμένως (Εικόνες 4Β, Γ). Μια μαζική μείωση 41 από αυτά τα 43 (95 τοις εκατό) γονίδια σε όλα τα αναγνωρισμένανεφρώνσυστάδες επιθηλιακών κυττάρων υποδηλώνουν γονιδιακή σίγαση

προφίλ στο VMI (Εικόνα 6Α). Είναι ενδιαφέρον ότι 4 γονίδια εμπλέκονται σενεφρώνφυσιολογικά μονοπάτια (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 και KIF3B), αλλά και γονίδια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό (TRAPI και PEBPI) ταυτοποιήθηκαν ως κεντρικά γονίδια στο δίκτυο (Εικόνα 6Β). Η γονιδιακή οντολογία των γονιδίων the43 αποκάλυψε εμπλουτισμό στα μονοπάτια σηματοδότησης ErbB αλλά και σε μονοπάτια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό και η απόκριση κυτοκίνης (Εικόνα 6C) και η έκφραση ERBB4 επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω σε όλα τανεφρώνκύτταρα (Εικόνα 6D). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι κατά τη διάρκεια του VMI, ένα υψηλό επίπεδο -222-3p inνεφρώντα επιθηλιακά κύτταρα συνδέονται με ισχυρή καταστολή των γονιδίων που εμπλέκονται και στα δύονεφρώνμονοπάτια ομοιόστασης ηλεκτρολυτών και μονοπάτια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό στο επιθήλιο.

Το miR-150-5p Ρυθμίζει την ενεργοποίηση NF-kB στα Τ λεμφοκύτταρα κατά τη διάρκεια του MVI Ομοίως, ερευνήσαμε τον ρυθμιστικό ρόλο του (αυξημένου) miR-150-5p κατά τη διάρκεια του MVI στο σύμπλεγμα των Τ-κυττάρων, όπου εκφραζόταν περισσότερο (Εικόνα 4Α). Σχεδιάσαμε γραφικά τα 58 μειωμένα DEG που σχετίζονται με το MVI που ταυτοποιήθηκαν σε δείγματα βιοψίας αλλομοσχεύματος χύδην (Εικόνα 3Β) και τα αντιμετωπίσαμε με έκφραση γονιδίου στο σύμπλεγμα Τ-κυττάρων sc-RNAseq (Εικόνα 7Α). Η αναλογία των γονιδίων που στοχεύονταν τόσο από το miR150-5p όσο και συγκεκριμένα υποεκφράζονται στα Τ-κύτταρα κατά τη διάρκεια του MVI ήταν εκπληκτικά χαμηλή (15/58,25,9 τοις εκατό) υποδηλώνοντας ότι η συνολική μείωση αυτών των γονιδίων in vivo δεν οφειλόταν αποκλειστικά στην Διαμέρισμα Τ λεμφοκυττάρων. Ωστόσο, από αυτήν την εξαιρετικά επιλεγμένη λίστα 15 γονιδίων και χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα OMICSnet, κατασκευάσαμε ένα δίκτυο γονιδίων (Εικόνα 7Β) και πραγματοποιήσαμε ανάλυση γονιδιακής οντολογίας (Εικόνα 7Γ). Παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση miR-150-5p συσχετίστηκε με το NF -Ρύθμιση KB στα Τ λεμφοκύτταρα κατά την MVI.

Το miR-155-5p Ρυθμίζει το μάτισμα του mRNA στα APC κατά τη διάρκεια του MV Τέλος, η ίδια ακριβώς στρατηγική εφαρμόστηκε για τα γονίδια-στόχους 52miR-155-5, που υποεκφράζονται κατά τη διάρκεια του MVI (Εικόνα 3Β). Σε αντίθεση με το miR-150-5p στα Τ λεμφοκύτταρα, παρατηρήσαμε ότι σχεδόν τα δύο τρίτα των στοχευόμενων γονιδίων miR-155-5p μειώθηκαν σταθερά στο σύμπλεγμα APC sc-RNAseq (31/52,59,6 τοις εκατό, Εικόνα 8Α). Η ανάλυση του δικτύου γονιδίων αποκάλυψε ότι το AIFMI και το CIAO1 ήταν κεντρικά γονίδια (Εικόνα 8Β). Επιπλέον, η γονιδιακή οντολογία αποκάλυψε ισχυρό εμπλουτισμό σε μονοπάτια που σχετίζονται με το μάτισμα του mRNA (Εικόνα 8C).

ΣΥΖΗΤΗΣΗΧάρη στον μοναδικό σχεδιασμό της, η μελέτη BIOMARGIN είναι το τυπικό πλαίσιο για την ολοκλήρωση πολυ-ομικών δεδομένων. Πράγματι, πολύ στιβαροί αγωγοί χρησιμοποιήθηκαν και στις κοόρτες ανακάλυψης, επιλογής και επικύρωσης που περιλάμβαναν μεγάλο αριθμό ασθενών από διαφορετικά κέντρα μεταμόσχευσης. Στις τρεις ανεξάρτητες κοόρτες, ταυτόχρονα παρατηρήσαμε και επιβεβαιώσαμε το περίεργο προφίλ έκφρασης 6 miRNA κατά τη διάρκεια του MVI: το miR-139-5p μειώθηκε ενώ το miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p και miR-223-3p αυξήθηκαν. Είναι σημαντικό ότι το επίπεδο καθενός από αυτά τα 6 miRNA συσχετίστηκε με τη σοβαρότητα του MVI, υποδηλώνοντας έναν δοσοεξαρτώμενο μηχανισμό ρύθμισης. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε σε πλατφόρμες πυριτίου για να διερευνήσουμε κάθε κυτταρική προέλευση miRNA. Εντυπωσιακά, δύο διακριτές ομάδες miRNAs παρατηρήθηκαν: μια πρώτη προέρχεται από διεισδυτικά ανοσοκύτταρα και μια δεύτερη πιο εξειδικευμένη σε μόνιμουςνεφρώνκύτταρα. Στη συνέχεια, τόσο τα miRNAs όσο και τα mRNA μετρήθηκαν στο ίδιο σύνολο δειγμάτων βιοψίας, επιτρέποντας μια ολοκληρωμένη ανάλυση in vivo επικυρωμένων διαφορικά εκφρασμένων mRNA/miRNA που σχετίζονται με το MVI. Τέλος, αφού περιγράψαμε τη συσχέτιση mRNAs/miRNA στην ανάλυση όγκου ιστού, επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση mRNAs/miRNA στην ανάλυση ενός κυττάρου για τέσσερα από τα 6 αναγνωρισμένα miRNA.

Είναι ενδιαφέρον ότι το miR-139-5p ήταν το μόνο miRNA που συσχετίστηκε αρνητικά με βλάβες MVI. Προέρχεται κυρίως από την EC και έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζει γονίδια που σχετίζονται με το MHC. Μεταξύ των γονιδίων-στόχων του, το UBE2D1 ρυθμίστηκε σε μεγάλο βαθμό κατά τη διάρκεια της ενδοθηλιακής ενεργοποίησης που σχετίζεται με το MVI. Η οικογένεια UBE2D είναι μια οικογένεια ενζύμων σύζευξης ουβικιτίνης Ε2 στο σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (29, 30) και το UBeD1 αποδείχθηκε ότι ενισχύει την ουβικιτίνη Μαρτίου-1, οδηγώντας στην προς τα πάνω ρύθμιση των πρωτεϊνών MHC τάξης II (31). Επιπλέον, η GBP5 ήταν η πιο αντιπροσωπευόμενη γονιδιακή αδρανοποιημένη EC κατά τη διάρκεια του MVI, κάτι που είναι σύμφωνο με τις πρόσφατες αναφορές μας που δείχνουν ότι η GBP5 ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό σε βιοψίες ABMR(17) αλλά και σε δείγματα αίματος(32). Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση GBP5 αποδείχθηκε ότι είναι επαγώγιμη από την ιντερφερόνη τύπου II σε ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα της μήτρας, μαζί με τα CXCL9 και CXCL10(33). Ο πρώιμος ρόλος αυτών των δύο προφλεγμονωδών χημειοκινών στις διεργασίες οξείας απόρριψης είναι καλά τεκμηριωμένος και το επίπεδό τους στα ούρα προτείνεται για την παρακολούθηση του κινδύνου οξείας απόρριψης στη συνήθη παρακολούθηση των ληπτών μοσχευμάτων νεφρού (34). Ένας άλλος στόχος miR-139-5p είναι το YWHAG.YWHAG που κωδικοποιεί την οικογένεια πρωτεϊνών του HLA-F και έχει περιγραφεί ως διαφορικά εκφραζόμενη κατά τη διάρκεια της ενεργού προϊβρωτικής διαδικασίας στη διαβητική νεφροπάθεια (35). Ο πιθανός ρόλος του miR-139-5p στην ίνωση, μια τελική κοινή οδό μετά τη φλεγμονή, είναι ακόμη πιο σχετικός που το IFTA συμπεριλήφθηκε πρόσφατα σε μια σύνθετη βαθμολογία για την πρόβλεψη της επιβίωσης του αλλομοσχεύματος νεφρού μετά το ABMR(36). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το miR-139-5p δεν καταστέλλει πλέον την έκφραση του αντιγόνου MCH στην επιφάνεια του Anethum κατά τη διάρκεια του MVI και θα συμμετείχε στη διαδικασία χημειοέλξης και ίνωσης, αλλά αυτοί οι μηχανισμοί παραμένουν πειραματικά επιβεβαιωμένη έκφραση στην επιφάνεια του ενδοθηλίου κατά τη διάρκεια του MVI και θα μπορούσε να συμμετάσχει σε διεργασίες χημειοέλξης και ίνωσης, αλλά αυτοί οι μηχανισμοί παραμένουν να επιβεβαιωθούν πειραματικά.

Το δεύτερονεφρώνΤο προερχόμενο miRNA που εντοπίσαμε είναι το miR-222- 3p, του οποίου η έκφραση βρέθηκε ότι είναι πιο συγκεκριμένη για τις βλάβες MVI: σχετίζεται με τις βαθμολογίες g και PTC καθώς και με την εναπόθεση C4d, αλλά όχι με βλάβες i ή t. Ωστόσο, προήλθε κυρίως από επιθηλιακά κύτταρα. Μετά από πολυ-ομική ολοκλήρωση σε ανάλυση κυττάρου, προσδιορίσαμε ότι το miR-222-3p καταστέλλει κυρίως τη σηματοδότηση ErbB που είναι ζωτικής σημασίας για θεμελιώδεις κυτταρικές λειτουργίες, όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, η ανάπτυξη και η διαφοροποίηση (37). Στην ανθρώπινη βιολογία, απαιτείται φυσιολογική σηματοδότηση ErbB γιανεφρώνομοιόσταση ηλεκτρολυτών και διατήρηση της ακεραιότητας των νεφρών (38). Τα αποτελέσματά μας αναγνώρισαν επίσης τα ADAM22, NRG1, ZNF91 ως γονίδια που σχετίζονται με τη σηματοδότηση ErbB που καταστέλλονται κυρίως στο επιθήλιο κατά τη διάρκεια του MVI. Άλλα γονίδια απαραίτητα για τη φυσιολογία των νεφρών, όπως το ATP1B1 και το KIF3B, καταστέλλονταν επίσης στο νεφρικό επιθήλιο από miR-222-3p κατά τη διάρκεια του MVI. Προηγουμένως, οι Baker et al. έδειξε ότι το ATP1B1 (b1 υπομονάδα Na plus /K συν -ATPase) οδηγείνεφρώνσωληναριακή επαναρρόφηση νατρίου (39). Επιπλέον, οι Aguado-Fraile et al. έχουν ταυτοποιήσει το μέλος της οικογένειας Kinesin 3B (KIF3B) ως εμπλεκόμενο στη διακίνηση κυττάρων σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου αρουραίου. Το KIF3B εμφανίζεται ως βασικός μεσολαβητής της απόκρισης των εγγύς επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων στην ισχαιμία/επαναιμάτωση με πιθανή εφαρμογή σενεφρώνδιαχείριση ισχαιμικής βλάβης (40). Μπορούμε επομένως να υποθέσουμε ότι το miR-222-3p καταστέλλει βασικές φυσιολογικές οδούς κατά τη διάρκεια του MVI στο επιθήλιο. Επιπλέον, τα μονοπάτια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό ρυθμίζονται επίσης από υπερέκφραση miR-222-3p: σημαντικά γονίδια όπως το TRAP1 και το PEBP1 αναστέλλονται πλήρως σε δείγματα με ισχυρό MVI. Είναι ενδιαφέρον ότι το TRAP1 αποδείχθηκε ότι βελτιώνεταινεφρώνσωληναρισιακή διάμεση ίνωση σε ποντίκια με μονόπλευρη απόφραξη του ουρητήρα με προστασίανεφρώνμιτοχόνδρια σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων (41). Επιπλέον, το PEBP1 παρέχει αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα μέσω της αναστολής των οδών MAPK και NF-kB υπό ομοιοστατικές/βασικές συνθήκες (42). Σενεφρώνεπιθήλιο, μια μελέτη των Marko et al. έδειξε κομψά ότι η μετα-ισχαιμική ενεργοποίηση του NF-kB επιδεινώνει τη σωληναριακή βλάβη και επιδεινώνει τη φλεγμονή (43). Στα χέρια μας, το PEBP1 καταπιέστηκε πλήρως από το miR-222-3p, υποδηλώνοντας ότι η οδός NF kB απελευθερώνεται κατά τη διάρκεια του MVI. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επιθηλιακή βιολογία διαταράσσεται κατά τη διάρκεια του MVI καινεφρώντα επιθηλιακά κύτταρα ανταποκρίνονται ενεργά στους τραυματισμούς του MVI ενώ η συμμετοχή αυτού του ιστού στο MVI σπάνια αντιμετωπίζεται. Αυτά τα μοριακά ευρήματα θα μπορούσαν να ρίξουν νέο φως στις βλάβες οξείας σωληναριακής βλάβης, ένα καλά καθιερωμένο, αλλά για καιρό παραμελημένο κριτήριο ABMR. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι τα επιθηλιακά κύτταρα μπορούν να εκκρίνουν εξωσωματικό miR-222-3p και να επάγουν φαινότυπο Μ2 σε μακροφάγα (44). Στο μεταξύ, οι Li et al. πολύ πρόσφατα ανέφεραν ότι τα μακροφάγα Μ2 υπερεκφράζουν το miR-155 και παρέχουν αυτό το miRNA στο μικροπεριβάλλον, επίσης μέσω της έκκρισης εξωσωμάτων. Στη μεταμόσχευση νεφρού, το miR-155 αυξήθηκε σε διάφορες καταστάσεις (IFTA, οξεία απόρριψη και TCMR) και σε σωματικά υγρά ή ιστούς (45). Είναι ενδιαφέρον ότι το miR- 155 μπορεί να προάγει την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση μέσω της στόχευσης του RASSF4 στα επιθηλιακά κύτταρα (46). Αυτή η αλληλεπίδραση που βασίζεται σε miRNA μεταξύ μακροφάγων καινεφρώναπομένει να αξιολογηθούν τα επιθηλιακά κύτταραμεταμόσχευση νεφρούκαι ειδικότερα στο πλαίσιο του MVI. Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, παρατηρήσαμε ότι το miR-155-5p εκφράστηκε κυρίως από APC που περιλάμβαναν μονοκύτταρα και μακροφάγα. Σε αυτό το συγκεκριμένο υποσύνολο, η οντολογία των γονιδίων-στόχων miR- 155-5p αποκάλυψε εμπλουτισμό σε μονοπάτια ματίσματος premRNA. Είναι ενδιαφέρον ότι οι Janssen et al. ανέφεραν ότι η φλεγμονή των πνευμόνων προκάλεσε οδούς ματίσματος προ-mRNA σε κυψελιδικά μακροφάγα. Επιπλέον, η ενεργοποίηση πριν από το μάτισμα του mRNA διέφερε στα μακροφάγα που κατοικούν στον ιστό σε σύγκριση με τα μακροφάγα που προέρχονται από μονοκύτταρα (που συλλέγονται από αίμα). Αναφέρθηκαν αλλαγές στον μεταβολισμό του πυρήνα σε στρατολογημένα μακροφάγα, με αυξημένη εκροή μέσω της γλυκόλυσης και μειωμένη εκροή μέσω του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος (κύκλος TCA, δηλαδή κύκλος Krebs) (47). Όσον αφορά το miR-150-5p, βρήκαμε ότι η υπερέκφρασή του κατά τη διάρκεια του MVI συσχετίστηκε με την οδό NF-kB στο σύμπλεγμα λεμφοκυττάρων που περιλαμβάνει τόσο τα έμφυτα κύτταρα ΝΚΤ όσο και τα προσαρμοστικά Τ κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι το miR-150-5p είναι ζωτικής σημασίας για τη δημιουργία ώριμων και λειτουργικών κυττάρων ΝΚ (48) και τα κύτταρα CD8 συν Τ με έλλειψη miR{13}}p αναφέρθηκαν ότι είναι λιγότερο κυτταροτοξικά (49). Επιπλέον, τα CD8 Τ κύτταρα μπορούν επίσης να εκκρίνουν miR-150-5p σε εξωσώματα (50) που θα μπορούσαν με τη σειρά τους να προάγουν την ενεργοποίηση ινοβλαστών στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα και τα επακόλουθανεφρώνίνωση όπως προτείνεται από πρόσφατες αναφορές (51, 52).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ

Η μελέτη μας έχει κάποιους περιορισμούς. Εστιάσαμε την έρευνά μας σε 6 miRNAs, τα οποία προσδιορίζονται με συνέπεια σε όλο τον σχεδιασμό πολλαπλών βημάτων. Ωστόσο, προχωρήσαμε σε μια επιλογή miRNA βήμα προς βήμα, με μόνο ένα κλάσμα όλων των γνωστών miRNAs να ποσοτικοποιούνται στην κοόρτη επικύρωσης. Η στατιστική οδός για την επιλογή miRNA βασίστηκε στον αρχικό σχεδιασμό του BIOMARGIN, κατάλληλος για την αναγνώριση διαγνωστικών βιοδεικτών για πολλαπλά τελικά σημεία (ABMR, αλλά και TCMR και IFTA). Ως εκ τούτου, αν και αυξήθηκε σημαντικά στις κοόρτες ανακάλυψης και επιλογής (Εικόνα 2Α), το miR-146a δεν ποσοτικοποιήθηκε στην κοόρτη επικύρωσης. Ως εκ τούτου, το miR-146a αποκλείστηκε εκ των πραγμάτων από τη διαδικασία επιλογής μας, αν και η βιβλιογραφία υποδηλώνει έναν ρόλο στην ισχαιμία/επαναιμάτωση στη μεταμόσχευση νεφρού (53) και στον έλεγχο των αλλοάνοσων αποκρίσεων με τη μεσολάβηση Treg (54). Επιπλέον, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι ένα πιο ισχυρό μέγεθος δείγματος θα είχε δώσει περισσότερα miRNA, όπως miR-138 (κάτω) και miR-511 (πάνω) που εκφράστηκαν διαφορικά στις περιπτώσεις ABMR της κοόρτης επιλογής και έδειξε μια τάση προς την ίδια κατεύθυνση στη κοόρτη ανακάλυψης. Επιπλέον, δεν πραγματοποιήσαμε ανάλυση sc-RNAseq στα δικά μας δείγματα βιοψίας, αλλά χρησιμοποιήσαμε ένα διαθέσιμο διαδικτυακό σύνολο δεδομένων sc-RNAseq. Κατά τη στιγμή του σχεδιασμού της μελέτης και της συλλογής δειγμάτων βιοψίας, η τεχνολογία scRNAseq δεν ήταν πράγματι ακόμη διαθέσιμη και η ανάγκη για πρόσφατα συλλεγμένα δείγματα δεν επέτρεπε την αναδρομική χρήση κατεψυγμένων ή ενσωματωμένων σε παραφίνη δειγμάτων. Ομοίως, το προφίλ mRNA έγινε χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες, την τεχνολογία αναφοράς εκείνη την εποχή, η οποία τώρα έχει ξεπεράσει τις επιδόσεις της επόμενης γενιάς RNA-seq. Η χρήση ενός διαδικτυακού διαθέσιμου συνόλου δεδομένων sc-RNAseq περιορίζει την ικανότητά μας να αναφέρουμε τα βασικά δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Αυτές οι πληροφορίες που λείπουν θα μπορούσε να εγείρει ανησυχία σχετικά με την αντιπροσωπευτικότητα των πληθυσμιακών ομάδων. Επιπλέον, δεν ελέγξαμε καμία τεχνική πτυχή της αλληλουχίας. Ως εκ τούτου, στην επιλεγμένη ανάλυση, η ανάλυσή μας sc-RNAseq δεν ανίχνευσε κανένα σύμπλεγμα ουδετερόφιλων ή ΝΚ κυττάρων σε αυτά τα δείγματα. Ως εκ τούτου, οι μεταγενέστερες αναλύσεις μας για τα miR-142-3p και miR-223-3p περιορίστηκαν στη δημιουργία του αντίστοιχου γονιδιακού δικτύου στόχων και οντολογίας (Συμπληρωματικό Σχήμα S2) και δεν επέτρεψαν καμία εξερεύνηση ανάλυσης ενός κυττάρου. Ωστόσο, το γονιδιακό δίκτυο και η οντολογία των 27 γονιδίων-στόχων του miR-223-3p αποκάλυψαν τον εμπλουτισμό του κύκλου TCA (Συμπληρωματικό Σχήμα S2) μαζί με τη σηματοδότηση ERBB. Μπορούμε λοιπόν να υποθέσουμε ότι τόσο το miR-155-5p στα μονοκύτταρα και το miR-223-3p στα ουδετερόφιλα παίζουν ρόλο στο μεταβολισμό και τη φλεγμονώδη απόκριση που εμπλέκονται από αυτά τα κύτταρα κατά τη διάρκεια του MVI. Επιπλέον, το miR-142-3p έχει ήδη αποδειχθεί ότι είναι αυξημένο στην απόρριψη αλλομοσχεύματος νεφρού (9, 55, 56), αλλά μέχρι στιγμής δεν είχε συσχετιστεί ειδικά με το ABMR. Ένας άλλος περιορισμός της μελέτης μας είναι ότι συγκεκριμένες αλλαγές γονιδιακής έκφρασης στα σπάνια διεισδυτικά κύτταρα μπορεί να καλυφθούν σε ανάλυση μαζικής γονιδιακής έκφρασης. Απαιτούνται επομένως περαιτέρω μελέτες που περιλαμβάνουν περισσότερα δείγματα για να επιτραπεί η σωστή διερεύνηση όλων, ακόμη και των σπάνιων υποτύπων κυττάρων, αλλά επί του παρόντος περιορίζονται από το σχετικά υψηλό κόστος της τεχνικής.

Συμπερασματικά, ερευνήσαμε εδώ τις μοριακές οδούς που σχετίζονται με το MVI, τον κύριο ιστολογικό τραυματισμό που σχετίζεται με την ABMR. Η ολοκληρωμένη προσέγγιση ωμικής που χρησιμοποιήθηκε μας επέτρεψε να ξεδιαλύνουμε νέα μονοπάτια που εμπλέκονται στο MVI και υποδηλώνει ότι οι τροποποιήσεις του σωληναριακού επιθηλιακού μεταβολισμού συμβαίνουν ως συνέπεια της ABMR, πέρα ​​από το κοντινό ενδοθηλιακό διαμέρισμα. Η μελέτη μας απεικονίζει τις μεγάλες δυνατότητες των multi-omics να ξεδιαλύνουν μηχανισμούς ασθενειών και ανοίγει το δρόμο για νέες έρευνες για να διευκρινιστεί περαιτέρω η διασταυρούμενη συζήτηση μεταξύνεφρώνυποσύνολα κυττάρων μόνιμης και διείσδυσης αλλομοσχεύματος.