In Screen Synergistic Drug Combinations From Herb Medicines: A Case Using Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Μονάδα Νευροπροστασίας

Η νευροπροστασία είναι οι μηχανισμοί και οι στρατηγικές που χρησιμοποιούνται για την προστασία από νευρωνική βλάβη ή εκφυλισμό στο ΚΝΣ μετά από οξείες διαταραχές (π.χ. εγκεφαλικό ή τραυματισμό/τραύμα του νευρικού συστήματος) ή ως αποτέλεσμα χρόνιων νευροεκφυλιστικών νόσων (π.χ. Πάρκινσον, Αλτσχάιμερ, Σκλήρυνση κατά Πλάκας). Ο στόχος της νευροπροστασίας είναι να περιοριστεί η νευρωνική δυσλειτουργία/θάνατος μετά από τραυματισμό του ΚΝΣ και να προσπαθήσει να διατηρήσει την υψηλότερη

πιθανή ακεραιότητα των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων στον εγκέφαλο με αποτέλεσμα μια αδιατάρακτη νευρική λειτουργία. Όπως φαίνεται από το Σχ. 4, ορισμένοι στόχοι στο μονοπάτι της Σεροτονεργικής σύναψης εμπλέκονται στη λειτουργία της νευροπροστασίας. Για παράδειγμα, η παραγωγή προσταγλανδινών μέσω των PTGS1 και PTGS2 (επίσης γνωστών ως COX-1 και COX-2) είναι ένας ουσιαστικός μεσολαβητής για την πρόκληση αντιφλεγμονωδών και νέων μηχανισμών υπέρ της επίλυσης56. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η γονιδιακή έκφραση του ADCY5, ενός ενζύμου που καταλύει τη δημιουργία του cAMP57, μειώνεται από τη μεθυλίωση του προαγωγέα σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC που προκαλούνται από COX{10}}58. Με βάση την παραπάνω ανάλυση, υποθέτουμε ότι η συσσώρευση COX-2 μπορεί να επηρεάσει την έκκριση της sAPP, τη διάσπαση της ΑΡΡ που διασπάται από τη -σεκρετάση που ρυθμίζεται από το cAMP και ασκεί περαιτέρω το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα59,60. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η νευροπροστασία παίζει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία της νευροφλεγμονής.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Πειραματική Επικύρωση

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μικρογλοίας BV2 που αντιμετωπίζονται από τις ενώσεις

Τα κύτταρα μικρογλοίας BV2 (8×104 κύτταρα/ml) τροφοδοτούνται με συγκεντρώσεις 37,5 έως 300 μΜ ανά χιλιοστόλιτρο μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό από τις τέσσερις ενώσεις για 24 ώρες. Θεωρούμε τη βιωσιμότητα των κυττάρων της ομάδας ελέγχου που καλλιεργήθηκε απουσία ορού με λιγότερο από 0,1% DMSO ως 100% (Εικ. 5(a–d)). Δεν παρατηρείται σημαντική κυτταρική κυτταροτοξικότητα στις συνταγογραφούμενες δόσεις των ομάδων.

Επικύρωση της συνέργειας των φαρμάκων και της πιθανής αντιφλεγμονώδους επίδρασης in vitro

Για περαιτέρω αξιολόγηση των ληφθέντων αποτελεσμάτων στο πυρίτιο, τέσσερις ενώσεις που καλύπτουν τρία συνεργιστικά ζεύγη, συγκεκριμένα ισοακτεοσίδη, 2'-ακετυλακτεοσίδη, εχινακοσίδη και βερμπασκοσίδη, επιλέγονται για να εξεταστούν τα συνεργιστικά τους αποτελέσματα φαρμάκου και η πιθανή αντιφλεγμονώδης δράση τους χρησιμοποιώντας κύτταρα BV2 που έχουν υποστεί επεξεργασία με LPS. Συγκεκριμένα, διεξάγουμε ανάλυση western blot για έκφραση πρωτεΐνης iNOS και COX-2 για να επιβεβαιώσουμε τη συνέργεια και τα αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα των προβλεπόμενων συνδυασμών φαρμάκων.

Όπως φαίνεται στην Εικ. 5(e–g), αναφέρονται τα επίπεδα των πρωτεϊνών iNOS και COX-2 στο πλαίσιο των κυτταρικών γραμμών BV2 που δοκιμάστηκαν. Παρατηρούμε ότι είτε στη θεραπεία με ισοακτεοσίδη είτε με 2'-ακετυλακτεοσίδη, οι εκφράσεις πρωτεΐνης του iNOS και του COX-2 στα κύτταρα BV2 μειώθηκαν σημαντικά σε διαφορετικά επίπεδα δόσης. Ωστόσο, η θεραπεία με το συνδυασμό ισοακτεοσίδης και 2'-ακετυλακτεοσίδης προκαλεί σημαντική αύξηση στους φλεγμονώδεις παράγοντες iNOS και COX-2 (Εικ. 5(ε)). Το Σχήμα 5(στ) δείχνει ότιθεραπεία με εχινακοσίδη ή βερμπασκοσίδη, ως μεμονωμένος παράγοντας, προκαλεί μείωση της έκφρασης iNOS και COX-2. Επιπλέον, όπως αναμενόταν, η θεραπεία με εχινακοσίδη σε συνδυασμό με βερμπασκοσίδη σε συγκέντρωση 150 μM είχε ως αποτέλεσμα μια πιο έντονη μείωση της

επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (iNOS και COX-2), υποδεικνύοντας τις συνεργικές αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις αυτού του συνδυασμού φαρμάκων. Ομοίως, όπως υποδεικνύεται στο Σχ. 5(g), ο συνδυασμός εχινακοσίδης και 2'-ακετυλολακτεοσίδης δείχνει σημαντική συνεργιστική επίδραση στην αναστολή της COX-2 σε συγκέντρωση 75 μΜ ή 300 μΜ. Ωστόσο, για το iNOS, στη δόση των 300 μΜ, ο συνδυασμός αντιπροσωπεύει αξιοσημείωτη καταστολή της πρωτεΐνης. Αντίθετα, διαπιστώνουμε ότι δεν υπάρχουν εμφανείς ανασταλτικές επιδράσεις τόσο στο iNOS όσο και στο COX-2 σχετικά με τον συνδυασμό ισοακτεοσίδης και 2'-ακετυλακτεοσίδης ή εχινακοσίδης και βερμπασκοσίδης σε συγκέντρωση 75μM (Συμπληρωματικό Σχήμα 2), εκτός από τη θεραπεία με άλλα ζεύγη δείχνει πολύ πιο αδύναμο αποτέλεσμα σε σύγκριση με τους μεμονωμένους παράγοντες στη δόση των 150 ή 300 μΜ που φαίνεται στο Σχ. 5 (π.χ.).

Συνοψίζοντας, η in vitro μελέτη παρέχει πρόσθετες πληροφορίες για τον έλεγχο συνδυασμών φαρμάκων με δυνητικά αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα και καταδεικνύει την αξιοπιστία της στρατηγικής in silico screen.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΝΕΥΡΟΦΛΕΓΜΟΝΩΝ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Συζήτηση

Η νευροφλεγμονή εμπλέκεται στην πλειονότητα των νευρολογικών, ψυχιατρικών και νευροαναπτυξιακών ασθενειών και αυτό δεν είναι μόνο συνέπεια, αλλά θα μπορούσε να είναι έναυσμα της παθολογίας. Ωστόσο, οι τρέχουσες θεραπείες για τη νευροφλεγμονώδη είναι ως επί το πλείστον μονοθεραπείες, περιορισμένες από γνωστές παρενέργειες, όπως γνωρίζουμε, οι αναστολείς COX-2 μπορεί να οδηγήσουν σε καρδιαγγειακά ελαττώματα ως απόκριση σε μακροχρόνια θεραπεία και η στοχευμένη στο TNF θεραπεία θα μπορούσε να προκαλέσει μόλυνση μέσω ανοσοκαταστολή. Οι συνδυαστικές θεραπευτικές προσεγγίσεις μπορεί να είναι επιβεβλημένες για τη βελτίωση της θεραπείας πολύπλοκων ασθενειών με τα ακόλουθα πλεονεκτήματα: την αντισταθμισμένη ευρωστία του δικτύου και την αντιστάθμιση παράκαμψης, την αυξημένη κλινική αποτελεσματικότητα διατηρώντας την ελάχιστη ανθρώπινη τοξικότητα και τη μειωμένη δόση κάθε ένωσης63. Ωστόσο, η διερεύνηση των συνεργιστικών συνδυασμών φαρμάκων μεταξύ των ενώσεων που προέρχονται από φυτικά φάρμακα με βάση τη φαρμακολογία του συστήματος περιορίζεται από τον πιθανό κύριο λόγο για μεγάλες ποσότητες ενώσεων.

Στην εργασία, λαμβάνουμε πρώτα 63 πιθανές βιοδραστικές ενώσεις από τοβότανο Cistanche tubulosa, πληρώντας τα κριτήρια (DL μεγαλύτερο από ή ίσο με 0.18) για περαιτέρω ανάλυση με τη βοήθεια της πρόβλεψης που είναι απαραίτητη για τον έλεγχο πιο υποσχόμενων μορίων με επιθυμητές ιδιότητες. Μετά την χαρτογράφηση των 133 στόχων των 63 πιθανών βιοδραστικών ενώσεων στη βάση δεδομένων, λαμβάνουμε 43 στόχους που σχετίζονται με τη νευροφλεγμονή και, στη συνέχεια, η ανάλυση ομαδοποίησης GOBP των προβλεπόμενων στόχων μπορεί πιθανώς να συμβάλει στη θεραπεία της νευροφλεγμονής. Το αναλυτικό αποτέλεσμα του δικτύου CT εμφάνισε μέσο βαθμό ανά ένωση 11.209 και 7.651 ανά στόχο, αντίστοιχα, και 38 από αυτούς προσάρμοσαν περισσότερους από 7 στόχους (μεγαλύτερους από τον μέσο βαθμό). Για παράδειγμα, η εχινακοσίδη (mol41) που προβλέπεται με 7 στόχους, η βερμπασκοσίδη (mol33), με 9 στόχους ή η επιτραπέζια πλευρά Β (mol57), με 8 στόχους θα μπορούσαν να παίξουν βασικούς ρόλους στη νευροπροστασία σύμφωνα με την αυξανόμενη βιβλιογραφία.

Επιτυγχάνουμε άμεσους θεραπευτικούς στόχους όπως APP, MAPT (επίσης γνωστό ως Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 και HTR2A (επίσης γνωστό ως 5-HT2A), GRIN2B (υπομονάδα τύπου NMDA τύπου γλουταμινικού ιοντοτροπικού υποδοχέα 2B) και GRIA1 (υπομονάδα 1 τύπου ιονοτροπικού υποδοχέα γλουταμινικού υποδοχέα AMPA) ή κατάντη δυνητικούς στόχους όπως PTGS274 ή NOS275 που σχετίζονται με νευροφλεγμονή ή διάφορες ασθένειες του νευρικού συστήματος.

Η ανάλυση του δικτύου Compound-Target-Pathway εμφανίζει 12 ενώσεις από τα κορυφαία 10 ζεύγη φαρμάκων μέσω του αλγόριθμου PEA, που συνδέονται με τους 43 πιθανούς στόχους και τις οδούς που συνδέονται με τη νευροφλεγμονή, για παράδειγμα, μονοπάτι σηματοδότησης ασβεστίου, αλληλεπίδραση νευροενεργού συνδέτη-υποδοχέα ή Μονοπάτι σηματοδότησης TNF και ούτω καθεξής. Στο σύστημα, αυτές οι προβλεπόμενες ενώσεις θα μπορούσαν να δράσουν όχι μόνο στις πρωτεΐνες των ανοδικών αλλά και κατάντη οδών που σχετίζονται με νευροφλεγμονή και φλεγμονώδεις βιοδείκτες, ειδικότερα. Επιπλέον, παρέχονται πρόσθετες πληροφορίες για τον έλεγχο συνδυασμών φαρμάκων με δυνητικά αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα και η αξιοπιστία της στρατηγικής διαλογής in silico επαληθεύεται με πειραματική επικύρωση. Η οδός νευροφλεγμονής αποτελείται από το μονοπάτι της νόσου του Alzheimer, το μονοπάτι σηματοδότησης ασβεστίου, το μονοπάτι σηματοδότησης GnRH, το μονοπάτι σηματοδότησης VEGF και τη σεροτονινεργική σύναψη. Τα αναλυτικά αποτελέσματα μας εξήγησαν σαφώς ότι οι μονάδες κυτταρικού θανάτου, φλεγμονής και νευροπροστασίας αποτελούν παραδείγματα για την αποκρυπτογράφηση του μηχανισμούCistanche tubulosa για τη θεραπεία της νευροφλεγμονής.

Η νευροφλεγμονή συνοδεύει διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες που θα μπορούσαν να είναι όχι μόνο συνέπεια, αλλά και έναυσμα παθολογίας, επομένως, οι αντιφλεγμονώδεις θεραπείες προτείνονται ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση. Προς απογοήτευσή μας, αν και έχουμε συνειδητοποιήσει τους περιορισμούς των μονοθεραπειών, η αξιολόγηση και οι υποκείμενοι μηχανισμοί των συνδυαστικών θεραπειών εξακολουθούν να είναι οι κύριες προκλήσεις στην ανάπτυξη της νέας εναλλακτικής στρατηγικής. Επομένως, αυτή η εργασία θα μπορούσε να προσφέρει νέες θεραπευτικές ευκαιρίες για τη νευροφλεγμονή και μπορεί να ανοίξει μια νέα οδό για την ανακάλυψη συνδυασμών φαρμάκων από φυσικά προϊόντα.

Υλικά και μέθοδοι

Συλλογή Compounds

Συνολικά 66 χημικά συστατικά του Cistanche tubulosa συλλέγονται χειροκίνητα από το TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, συμπεριλαμβανομένων 26 φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων, 22 ιριδοειδή, 4 λιγνάνες, 7 μονοτερπενικές γλυκοσίδες, 2 αζωτούχες ουσίες σάκχαρα βενζολίου ακρυλοϋλίου, 1 στερόλη, 1 κετόλη. Δεδομένου ότιγλυκοσίδες σε σωληνίσκο Cistancheσυνήθως υδρολύονται για να απελευθερώσουν αγλυκόνη η οποία στη συνέχεια απορροφάται στον εντερικό βλεννογόνο, επομένως, λαμβάνουμε υπόψη τα μόρια χωρίς γλυκόλη, τα οποία επισημαίνονται ως _qt. Αυτό οδήγησε στη δημιουργία των 103 ενώσεων. Αυτά τα μόρια παρέχονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

Αξιολόγηση ομοιότητας με φάρμακα

Για να λάβουμε τις πιθανές βιοδραστικές ενώσεις από το Cistanche tubulosa, αξιολογούμε την ομοιότητα με το φάρμακο αυτών των συστατικών υπολογίζοντας την ομοιότητα Tanimoto μεταξύ φυτικών ενώσεων και τις μέσες μοριακές ιδιότητες όλων των χημικών ουσιών στη βάση δεδομένων Drugbank. Και, το μοντέλο πρόβλεψης DL έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε πολλές μελέτες, για την επιλογή βιοδραστικών ενώσεων. Στην εργασία, ο δείκτης DL Μεγαλύτερο ή ίσο με 0.18 των υποψηφίων ορίζεται ως η τιμή κατωφλίου που ταιριάζει καλύτερα σε επακόλουθη ανάλυση.

Πρόβλεψη στόχου φαρμάκων

Ο προσδιορισμός των στόχων αποτελεσματικότητας για τις κύριες ενώσεις παραμένει ένα βασικό βήμα για την πρόοδο των ενώσεων στην ανάπτυξη φαρμάκων. Εδώ, δύο εσωτερικά εργαλεία: το SysDT και το WES εκτελούνται για την εξαγωγή των πληροφοριών μοριακών στόχων για την απόρριψη φαρμάκων. Το SysDT είναι ένα in-solo μοντέλο που εκτελείται με συνδυασμό χημικών, γονιδιωματικών και φαρμακολογικών πληροφοριών που βασίζεται σε δύο ισχυρά μαθηματικά εργαλεία: Random Forest (RF) και Support Vector Machine (SVM) για την αποτελεσματική αντιμετώπιση του ζητήματος της αναγνώρισης στόχου. Το ληφθέν μοντέλο χρησίμευσε ως πολύτιμη πλατφόρμα για την πρόβλεψη αλληλεπιδράσεων φαρμάκου-στόχου με συνολική ακρίβεια 97,3%, ακρίβεια ενεργοποιημένης πρόβλεψης 87,7% και ακρίβεια αναστολής πρόβλεψης 99,8%. Για να καταγράψετε περισσότερα υποσχόμενα στοιχεία, τα κριτήρια φιλτραρίσματος ορίζονται ως τιμή RF μεγαλύτερη ή ίση με 0.7 ή SVM Μεγαλύτερη ή ίση με 0.8 σε αυτήν τη μελέτη.

Η σταθμισμένη ομοιότητα συνόλου (WES) είναι ένα νέο ισχυρό υπολογιστικό μοντέλο για τον εντοπισμό των άμεσων στόχων του φαρμάκου για τα πραγματικά βιοενεργά συστατικά. Ως νέο εργαλείο, το ληφθέν μοντέλο έχει καλή απόδοση στην πρόβλεψη της σύνδεσης με μέση ευαισθησία 85% (SEN) και των μη δεσμευτικών μοτίβων με 71% (SPE) με τις μέσες περιοχές κάτω από τις καμπύλες λειτουργίας του δέκτη (ROC, AUC) 85,2% και μέση συμφωνία 77,5%. Οι ληφθέντες στόχοι χαρτογραφούνται περαιτέρω στο Uniprot για να ομαλοποιηθούν τα ονόματα και οι οργανισμοί τους στη συνέχεια. Εδώ, επιλέγουμε μόνο τους στόχους του Homo sapiens για περαιτέρω ανάλυση. Οι υποψήφιοι στόχοι των επιλεγμένων ενώσεων χαρτογραφούνται στη βάση δεδομένων CTD για να λάβουμε τις σχετικές ασθένειές τους και τελικά εξετάζουμε πιθανούς στόχους που σχετίζονται με τη νευροφλεγμονή.

GO Εμπλουτισμός και ανάλυση για στόχους

Για να διερευνήσουμε τις εμπλεκόμενες βιολογικές διεργασίες των ληφθέντων στόχων, αντιστοιχίζουμε τους στόχους στο DAVID και οι όροι με τιμή P μικρότερη από 0.05 επιλέγονται σε αυτήν την ενότητα.

Ανάλυση συνδυασμού φαρμάκων

Στην προηγούμενη εργασία μας, χρησιμοποιήθηκε ένα πλαίσιο φαρμακολογίας συστήματος για την πρόβλεψη συνδυασμών φαρμάκων σε ένα πρόσφατα σχεδιασμένο μοντέλο, που ονομάζεται Probability Ensemble Approach (PEA) για την ανάλυση της κλινικής αποτελεσματικότητας και των δυσμενών επιδράσεων των συνδυασμών φαρμάκων. Αναπτύχθηκε αναλυτικά ένα δίκτυο Bayesian που ενσωματώνεται με έναν αλγόριθμο ομοιότητας για να μοντελοποιήσει τους συνδυασμούς από μοριακές και φαρμακολογικές επιδράσεις των ενώσεων. Στη συνέχεια παρουσιάστηκε η συνδυασμένη αξιολόγηση που κάλυψε την κλινική αποτελεσματικότητα και τις ανεπιθύμητες ενέργειες για τα προβλεπόμενα ζεύγη. Εν συντομία, δείχνει ότι το PEA θα μπορούσε να προβλέψει την αποτελεσματικότητα των ζευγών με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία (AUC=0.90) στην εργασία μας. Σε αυτή την εργασία, επιλέγουμε τους δέκα κορυφαίους συνδυασμούς φαρμάκων με βάση τις πιθανότητες συνέργειας τους, οι οποίες αντιπροσωπεύουν τη δυνατότητα πρόκλησης συνέργειας μεταξύ δύο ενώσεων.

Δόμηση και ανάλυση δικτύου/διαδρομών

Για τη διερεύνηση των σχέσεων μεταξύ των δραστικών συστατικών και των φλεγμονωδών ασθενειών, το δίκτυο σύνθετου στόχου (CT) και το δίκτυο μεθόδου σύνθετου στόχου (CTP) δημιουργούνται από το Cytoscape 2.8.1, ένα δημοφιλές πακέτο βιοπληροφορικής για οπτικοποίηση βιολογικού δικτύου και ενοποίηση δεδομένων. Οι ποσοτικές ιδιότητες του δικτύου αναλύονται από τα δύο παρακάτω πρόσθετα Network Analyzer και CentiScaPe 1.2. Στο δίκτυο γραφικών, οι κόμβοι υποδεικνύουν είτε ενώσεις, στόχους ή μονοπάτια, ενώ οι ακμές κωδικοποιούν την αλληλεπίδραση φαρμάκου-στόχου. Για περαιτέρω διερεύνηση των βιολογικών επιπτώσεων του τρόπου με τον οποίο λειτουργούν οι κυτταρικοί στόχοι μέσω της διαμόρφωσης πολλαπλών οδών μεταβολισμού, συναρμολογείται μια ενσωματωμένη «οδός» από τις ενημερωμένες πληροφορίες για την παθολογία της νευροφλεγμονής. Πρώτον, χρησιμοποιώντας την αντιστοίχιση τους στη βάση δεδομένων KEGG, τα επιτευχθέντα προφίλ στόχων συγκεντρώνονται σε διάφορα μονοπάτια. Μετά την εγκατάλειψη των έμμεσων τμημάτων, τότε, μια σχετικά συνθετική οδός ενσωματώνεται χειροκίνητα λόγω των παθολογικών και κλινικών δεδομένων.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Πειραματική Επικύρωση

Προετοιμασία δειγμάτων

Εχινακοσίδη, βερμπασκοσίδη, ισοακτεοσίδη και 2'-ακετυλακτεοσίδηαγοράζονται από την Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Κίνα). Τα δείγματα δοκιμής διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma, ΗΠΑ) για να λάβουν 100 mM, ως μητρικό διάλυμα, και στη συνέχεια αποθηκεύονται στους 4 βαθμούς. Οι τελικές αραιώσεις του DMSO που προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας δεν ξεπέρασαν ποτέ το 0,1% που εξασφάλιζε ότι δεν υπήρχε επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα κύτταρα μικρογλοίας ποντικού BV2 αναπτύχθηκαν αρχικά από την τράπεζα κυττάρων της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών της Σαγκάης και καλλιεργήθηκαν σε εργασίες 25 ή 75 cm2 με τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Gibco BRL, ΗΠΑ), πενικιλίνη G (100 μονάδες/mL) και στρεπτομυκίνη (100 mg/mL) σε υγροποιημένο επωαστήρα με 5% CO2/95% O2 στους 37 βαθμούς.

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Τα κύτταρα μικρογλοίας BV2 σπέρνονται σε 96-πλάκα πηγαδιού σε πυκνότητα 1×105 κύτταρα/ml, μετά από επώαση για 18 ώρες, τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 100 ul φρέσκου μέσου με ή χωρίς διάφορες ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις δειγμάτων δοκιμής για επιπλέον 24 ώρες. Η ανάλυση CCK-8 (BestBio, Σαγκάη, Κίνα) είναι μια βολική, αξιόπιστη μέθοδος για τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων. Για να εξαλειφθεί το υπόβαθρο των δειγμάτων δοκιμής, απορρίπτουμε ολόκληρο το μέσο καλλιέργειας και στη συνέχεια προστίθενται 100 ul/φρεάτιο φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 10% CCK{10}} διάλυμα. Οι τιμές OD στα 450 nm διαβάζονται σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Molecular Devices, Καλιφόρνια, ΗΠΑ) μετά από επώαση 3 ωρών στους 37 βαθμούς και 5% CO2.

Ανάλυση Western Blot

Η κυτταρική πρωτεΐνη εξάγεται από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας κιτ προετοιμασίας πρωτεϊνών θηλαστικών Qproteome™ (Qiagen, Γερμανία) μετά από τις υποδεικνυόμενες διαδικασίες από το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, ΗΠΑ) εφαρμόζεται στον ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεΐνης. Ισοδύναμες ποσότητες πρωτεΐνης (50 ug) μετουσιώνονται με βρασμό στους 100 βαθμούς για 10 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης δείγματος 2*laemmli (Bio-Rad, ΗΠΑ) συν 5% -μερκαπτοαιθανόλη σε αναλογία 1:1 και φορτώνεται ανά λωρίδα σε 12% SDS-PAGE (μινιτζέλες πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλοθειικού νατρίου), ηλεκτρομεταφέρεται σε μεμβράνες φουοριδίου πολυβινυλιδενίου 0,45 μm (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, ΗΠΑ) για 150 λεπτά στα 200 mA. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες αποκλείονται σε 3% αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) σε θερμοκρασία δωματίου και επωάζονται με τα πρωτεύοντα αντισώματα iNOS και COX-2 (Abcam) στους 4 βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας. Μετά από τρεις διεξοδικές πλύσεις σε Tris-ρυθμισμένο Saline-Tween (TBST) για 5 λεπτά, οι μεμβράνες ανιχνεύονται με συζευγμένα με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (HRP) δευτερογενή αντισώματα (1:10000 αραιώσεις· Abcam) για 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες στη συνέχεια οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Καλιφόρνια, ΗΠΑ) μετά από δύο φορές πλύση σε TBST και μία φορά σε TBS, κάθε φορά για 5 λεπτά. Οι πυκνομετρικές τιμές κανονικοποιούνται χρησιμοποιώντας -ακτίνη ως εσωτερικό μάρτυρα φόρτωσης.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος±τυπικό σφάλμα και η ανάλυση Western blot επαναλαμβάνεται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα με το ίδιο αποτέλεσμα. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιείται για τη σύγκριση των διαφορών των μέσων για τρεις ή περισσότερες ομάδες, η στατιστική σημασία αναλύεται με το Student's t-test μεταξύ δύο ομάδων.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%