Ιριδοειδείς και άκυκλοι μονοτερπενικοί γλυκοσίδες, κανκανοσίδες L, M, N, O, και P από το Cistanche Tubulosa

Cistanche tubulosa(SΚΡΕΝΚ) R. WΔΙΚΑΙΩΜΑ(Orobanchaceae) είναι ένα πολυετές παρασιτικό φυτό που αναπτύσσεται στις ρίζες τουΣαλβαδόραήΚαλοτρόπηςείδη, που διανέμονται στη Βόρεια Αφρική, την Αραβία και τις ασιατικές χώρες.1) Οι βλαστοί αυτού του φυτού (Kanka-nikujuyou στα Ιαπωνικά) έχουν παραδοσιακά χρησιμοποιηθεί για τοθεραπεία της ανικανότητας, της στειρότητας, της οσφυϊκής μοίρας και της αδυναμίας του σώματοςκαθώς και παράγοντας προώθησης της κυκλοφορίας του αίματος.1,2) Κατά τη διάρκεια των μελετών μας σε βιοενεργά συστατικά από στελέχη τουC. tubulosa, 3-6) αναφέραμε προηγουμένως είκοσι τέσσερις φαινυλαιθανοειδείς αμινογλυκοσίδες συμπεριλαμβανομένων των κανκανοσιδών Η1, H2, I, J1, J2, K1, και Κ2και δύο ακυλιωμένα ολιγοσάκχαρα από φρέσκους μίσχουςC. tubulosa. 5,6) Επιπλέον, κύριοςφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, εχινακοσίδη, ακτεοσίδη και ισοακτεοσίδη, βρέθηκε ότι αναστέλλουν την αύξηση των επιπέδων της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST) και της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (άλας) ορού στο τραυματισμένο ήπαρ των ποντικών που προκαλείται απόD-γαλακτοζαμίνη (D-GalN)/ λιποπολυσακχαρίτης σε δόσεις 25-100 mg/kgper os(p.o.). Οι δομικές απαιτήσεις των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών για την ηπατοπροστατευτική δράση διευκρινίστηκαν επίσης.5) Σε αυτή τη συνεχιζόμενη μελέτη για τα συστατικά στους φρέσκους μίσχους τουC. tubulosa, απομονώσαμε περαιτέρω έντεκα ιριδοειδή γλυκοσίδες συμπεριλαμβανομένων των κανκανοσίδων L (1), M (2), και Ν (3), επτά άκυκλοι μονοτερπενικοί γλυκοσίδες συμπεριλαμβανομένων των κανκανοσίδων Ο (4) και π (5), τρία φαινυλοπροπανοειδή και τέσσερις λιγνάνες. Αυτή η εργασία ασχολείται με την απομόνωση και την αποσαφήνιση της δομής πέντε νέων ενώσεων (1-5).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΑΝΑΚΟΥΦΙΣΗ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Νωποί μίσχοι C. tubulosa (καλλιεργημένοι στο Urumqi, επαρχία Xinjiang, Κίνα) εκχυλίστηκαν με μεθανόλη υπό αναρροή για να δώσουν ένα μεθανολικό εκχύλισμα (8,36% από τους φρέσκους μίσχους). Από το μεθανολικό εκχύλισμα, κλάσματα εκλουσμένα με H2O- και MeOH (5,63% και 2,73%, αντίστοιχα) ελήφθησαν με χρωματογραφία στήλης Diaion HP-20 (H2O→MeOH) όπως περιγράφηκε προηγουμένως.5) Το κλάσμα που εκλούστηκε με MeOH ήταν υποβλήθηκε σε χρωματογραφίες στήλης SiO2 και ODS και τελικά HPLC για να δώσει κανκανοσίδες L (1, 0.0026%), M (2, 0.{{27} }}001%), N (3, 0.00{{60}}7%), O (4, 0.0{{90}}2{{1{{05}}%) και P (5, 0 .0002%), 6-deoxycatalpol3,7) (6, {0.197%), bartsioside3,7) (7, { (147}}). 10, 0,0056%), 8- επιλογανικό οξύ3,8) (11, 0,0023%), 8-επιδεοξυλογανικό οξύ3,7) (12, 0,0004%), γενιποσιδικό οξύ3,7) (13, 0,0040% ), κανκανοσίδη Ε3) (14, 0,0026%), (2Ε,6Ζ)-8-bD-γλυκοπυρανοσυλοξυ-2,6-διμεθυλ-2,6-οκταδιενοϊκό οξύ3 ,9) (15, 31,0 mg, 0,0014%), (2Ε,6Ε)-3,7-διμεθυλ-8-υδροξυοκταδιεν{{98}υλ-ObD-γλυκοπυρανοσίδη10) (16, 0,0082%), 8-υδροξυγερανιόλη 8-Ο-bD-γλυκοπυρανοσίδη11) (17, 0,0044%), βετουλαλβουζίδη Α12) (18, 0,0004%), κωνοφόρα 13) (19, 0,0,0002%) 20, 0,0015%), σιναπική αλδεΰδη 4-ObD-γλυκοπυρανοσίδη14) (21, 0,0001%), ()-πινορεσινόλη ObD-γλυκοπυρανοσίδη 4,8,15) (22, 0,0010%), ευκομμίνη Α1, (2030,6) %), ισοευκομμίνη Α17) (24, 0,0010%), και ()-συριγγαρεσινόλη ObD-γλυκοπυρανοσίδη 4,8,18) (25, 0,0044%).

Δομές Kankanosides L (1), M (2) και N (3)

Η κανκανοσίδη L (1) ελήφθη ως λευκή σκόνη με αρνητική οπτική περιστροφή ([a]D 26 - 45.7 σε MeOH). Το φάσμα υπερύθρων του έδειξε ισχυρή ζώνη απορρόφησης στα 3433 και 1{{2{0}}80 cm- 1 υποδηλώνοντας ένα τμήμα γλυκοσιδίου. Ο γρήγορος βομβαρδισμός ατόμων (FAB)-MS 1 εκτέλεσης στους τρόπους θετικού και αρνητικού ιόντος έδειξε κορυφές οιονεί μοριακών ιόντων σε m/z 371 [Μ Na] και 347 [Μ-Η]-, αντίστοιχα, και ο μοριακός τύπος ήταν προσδιορίζεται ως C15H24O9 με μέτρηση FABMS υψηλής ανάλυσης. Η όξινη υδρόλυση του 1 με 1,0 Μ υδροχλωρικό οξύ (HCl) απελευθέρωσε D-γλυκόζη, η οποία αναγνωρίστηκε με ανάλυση HPLC χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή οπτικής περιστροφής.3-6) Τα φάσματα 1 H- και 13C-NMR του 1 (CD3OD, Πίνακες 1, 2), τα οποία εκχωρήθηκαν από διάφορα πειράματα NMR,19) έδειξαν σήματα που μπορούν να αποδοθούν σε τέσσερα μεθυλένια [d 1,43 (1H, br dd, J= περίπου 5, 13 Hz, 4a-H), 1,73 ( 1H, br dd, J= περίπου 12, 14 Hz, 6a-H), 1,85 (1H, m, 4b-H), 1,93 (1H, br dd, J= περίπου 8. , 14 Hz, 6b-H), 3.50 (1H, ddd, J= 2.4, 12.5, 13.0 Hz, 3a-H), 3.83 (1H, br dd, J=

περ. 5, 13 Hz, 3b-H), 3,78, 4,12 (1H το καθένα, και τα δύο d, J= 13.1 Hz, 10-H2)], δύο μεθίνες [d 2,15 (1H, dd, J=7.2, 8.9 Hz, 9-H) και 2.23 (1H, m, 5-H)], και μια ομάδα ακετάλης [d 4.81 (1H, d, J{{28 }}.9 Hz, 1-Η)] μαζί με ένα τμήμα β-γλυκοπυρανοσυλίου [d 4.70 (d, J= 7.9 Hz, 1 -H)]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, το πείραμα φασματοσκοπίας συσχέτισης 1 H-1 H (1 H-1 H COSY) στο 1 έδειξε την παρουσία μερικών δομών γραμμένων με έντονες γραμμές. Στο πείραμα συσχέτισης ετεροπυρηνικών πολλαπλών δεσμών (HMBC) στο 1, παρατηρήθηκαν συσχετίσεις μεγάλης εμβέλειας μεταξύ των ακόλουθων πρωτονίων και ανθράκων (1-H και 3-C, 8-C; {{ 49}}Η και 7-C, 10-Η και 8- }}Η2 και 7-C, 8-C; Πείραμα φασματοσκοπίας ενίσχυσης πυρηνικής Overhauser (φασματοευαίσθητο NOESY), το οποίο έδειξε συσχετίσεις NOE μεταξύ των ακόλουθων ζευγών πρωτονίων (1-H και 3aH; 3a-H και 4a-H; 3b-H και 4b-H; 4b-H και 5-Η, 5- Η και 6β-Η, 7-Η; και 10-H2), όπως φαίνεται στο Σχ. 1. Τα φάσματα 1 H- και 13C-NMR του 1 ήταν υπερτιθέμενα σε αυτά του κύριου ιριδοειδή συστατικού 6-deoxycatalpol (6), εκτός από τα οφειλόμενα σήματα στο κορεσμένο τμήμα d-λακτόλης. Τελικά, η υδρογόνωση του 6 έδωσε 1, έτσι η στερεοδομή της κανκανοσίδης L αποσαφηνίστηκε ότι είναι 3,4- διυδρο-6-δεοξυκαταλπόλη (1).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΑΝΑΚΟΥΦΙΣΗ ΔΙΑΤΑΡΑΧΗΣ ΔΙΕΡΓΗΣΗΣ ΤΑΧΥΔΡΟΜΕΙΟΥ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Η κανκανοσίδη Μ (2) ελήφθη ως λευκή σκόνη με αρνητική οπτική περιστροφή ([a]D 26 - 18.7 σε MeOH). Το φάσμα IR του 2 έδειξε ζώνες απορρόφησης στα 3433, 1736, 1655 και 1076 cm- 1 που αποδίδονται σε υδροξύλιο, d-λακτόνη, ολεφίνη και αιθερικά τμήματα. Το φάσμα θετικών ιόντων FAB-MS 2 έδειξε μια κορυφή οιονεί μοριακού ιόντος σε m/z 353 [Μ Na] και ο μοριακός τύπος προσδιορίστηκε ως C15H22O8 με μέτρηση FAB-MS θετικών ιόντων υψηλής ανάλυσης. Οξύ υδρόλυση του 2 με 1,0 Μ HCl απελευθερωμένη D-γλυκόζη. Τα φάσματα 1H- και 13CNMR του 2 (CD3OD, Πίνακες 1, 2) έδειξαν σήματα που μπορούν να αποδοθούν σε τέσσερα μεθυλένια [d 1.66, 2.11 (1Η το καθένα, και τα δύο m, 4-H2), 2.15, 2.75 (1Η το καθένα, και τα δύο m, 6-H2), 4.29 (1H, ddd, J= 2.8, 8.4, 14.3 Hz, 3b-H), 4.32, 4.51 (1H το καθένα, και τα δύο d, J{{{61 }}.1 Hz, 10-H2), 4.35 (1H, ddd, J{= 3.1, 6.7, 14.3 Hz, 3a-H)], δύο μεθίνες [d 2.97 (1H, m, 5-Η), 3,82 (1Η, br s, 9-Η)], μια ολεφίνη [d 5,94 (1Η, m, 7-Η)] και μια κορεσμένη ομάδα λακτόνης (d C 174.9) μαζί με ένα τμήμα bD-γλυκοπυρανοσυλίου [d 4.32 (1Η, d, J= 7.9 Hz, 1 -Η)]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, το πείραμα 1 H–1 H COZY στο 2 έδειξε την παρουσία μερικών δομών γραμμένων με έντονες γραμμές και, στο πείραμα HMBC, παρατηρήθηκαν συσχετίσεις μεγάλης εμβέλειας μεταξύ των ακόλουθων ζευγών πρωτονίων και άνθρακα ({{ 103}}H και 7-H και 9-H και 8-C; }}H2 και 7-C, 8-C, 9-}H και 10-C. Η σχετική στερεοδομή του 2 χαρακτηρίστηκε από ένα ευαίσθητο στη φάση πείραμα NOESY, το οποίο έδειξε συσχετίσεις NOE μεταξύ των ακόλουθων ζευγών πρωτονίων (3a-H και 4a-H; 3b-H και 4b-H; 4b-H και 5- H; 5-H and 6b-H, 9-H) όπως φαίνεται στο Σχ. 1. Έτσι, η στερεοδομή του 2 διευκρινίστηκε όπως φαίνεται.

Η κανκανοσίδη Ν (3) απομονώθηκε ως λευκή σκόνη με αρνητική οπτική περιστροφή ([a]D 25 - 24.6 σε MeOH). Στο FAB-MS θετικού ιόντος του 3, παρατηρήθηκε κορυφή οιονεί μοριακού ιόντος σε m/z 371 [Μ Na]. Ο μοριακός τύπος C16H28O8 προσδιορίστηκε με μέτρηση FAB-MS υψηλής ανάλυσης. Οξύ υδρόλυση του 3 με 1.0 Μ HCl απελευθερωμένη D-γλυκόζη. Τα δεδομένα 1H- και 13C-NMR (CD3OD, Πίνακες 1, 2) έδειξαν σήματα που μπορούν να αποδοθούν σε ένα μεθύλιο [d 1.07 (3H, d, J= 7.2 Hz, {{{{ 28}}Η3)], τέσσερα μεθυλένια {d 1,37, 1,87 (1Η το καθένα, και τα δύο m, 7-H2), 1,65, 1,81 (1Η το καθένα, και τα δύο m, 6-Η2), [3,65 ( 1H, dd, J= 9.1, 9.8 Hz), 3.90 (1H, dd, J= 5.9, 9.8 Hz), 11-H2], και [3.70 (1H, dd, J{= 3.3, 12.0 Hz), 3.88 (1H, m), 3-H2]}, τέσσερις μεθίνες [d 1.69 (1H, m, 4-H), 1.75 (1Η, m, 9-Η), 2.06 (1Η, m, 8-Η), 2.16 (1Η, m, 5-Η)], και μια ημιακετάλη ομάδα [d 4.67 ( 1H, d, J{= 7.4 Hz, 1-H)] μαζί με ένα τμήμα bD-γλυκοπυρανοσυλίου [d 4.26 (1H, d, J= 7.9 Hz, {{101 }}Η)]. Η ιριδοειδής δομή του 3 διευκρινίστηκε με πειράματα 1 H–1 H COZY και HMBC και η σχετική στερεοδομή χαρακτηρίστηκε από ένα ευαίσθητο στη φάση πείραμα NOESY όπως φαίνεται στο Σχ. 1. Συνεπώς, η στερεοδομή του 3 διευκρινίστηκε όπως φαίνεται.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΕΠΙΛΥΣΗ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΟΥ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΟΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Δομές Κανκανοσίδων Ο (4) και Ρ (5)

Οι κανκανοσίδες Ο (4) και Ρ (5), C16H26O8, ελήφθησαν επίσης ως λευκές σκόνες με αρνητικές οπτικές περιστροφές (4: [a]D 23 - 26.1· 5: [a]D 21 - 32. 7 και τα δύο σε MeOH). Τα φάσματα υπερύθρων των 4 και 5 έδειξαν ζώνες απορρόφησης στα 3433, 1696, 1647 και 1076 cm- 1 για 4 και 3434, 1701, 1647 και 1{ {95}}76 cm- 1 για 5, που αποδίδονται σε γλυκοσιδικές, καρβοξυλικές και ολεφινικές λειτουργίες. Τα φάσματα υπεριώδους ακτινοβολίας τους έδειξαν κοινό μέγιστο απορρόφησης στα 217 nm, υποδεικνύοντας την παρουσία ενός τμήματος α, β-ακόρεστου καρβοξυλικού οξέος και στα δύο. Η όξινη υδρόλυση των 4 και 5 απελευθέρωσε D-γλυκόζη, ενώ με την ενζυματική υδρόλυση με γλυκοσιδάση, 4 και 5 έδωσαν (2E,6E)-8-υδροξυ-2,6-διμεθυλ{{37} },6-οκταδιενοϊκό οξύ2{0) (4a) και (2E,6E)-8-υδροξυ-3,7- διμεθυλ-2,{{ 47}}οκταδιενοϊκό οξύ21) (5α), αντίστοιχα. Τα δεδομένα 1H- και 13C-NMR του 4 (CD3OD, Πίνακες 2, 3) έδειξαν σήματα που μπορούν να αποδοθούν σε δύο μεθύλια [d 1,71 (3H, br s, 10-H3), 1,81 (3H, d, J{{ 66}}.0 Hz, 9-H3)], τρία μεθυλένια {d 2.19 (2H, br t, J= περίπου 7 Hz, 5-H2), 2.36 (2H, m, 4-H2), [4.24 (1H, dd, J= 7.6, 12.0 Hz), 4.33 (1H, dd, J= 6.2, 12.0 Hz), { {96}}Η2]}, και δύο τρι-υποκατεστημένες ολεφίνες [d 5.41 (1H, ddd, J= 1.2, 6.2, 7.6 Hz, 7- Η), 6.75 (1H, tq, J{ {111}}.2, 1.0 Hz, 3-Η)] μαζί με ένα τμήμα b-Dglucopyranosyl [d 4.34 (d, J= 7.8 Hz, 1 -H)]. Με τη σύγκριση των σημάτων άνθρακα στο φάσμα 13C-NMR του 4

με εκείνα του 4a, παρατηρήθηκε μετατόπιση γλυκοζυλίωσης στη θέση 8- (d C 4: 65,5; 4a: 59,4). Η θέση του δεσμού γλυκοζίτη επιβεβαιώθηκε επίσης από πειράματα HMBC όπως φαίνεται στο Σχ. 2. Συνεπώς, η στερεοδομή του 4 διευκρινίστηκε ότι είναι (2E,6E)-8-bD-γλυκοπυρανοσυλοξυ-2,{{{ 16}}διμεθυλ-2,6-οκταδιενοϊκό οξύ. Από την άλλη πλευρά, τα δεδομένα 1 H- και 13C-NMR του 5 (CD3OD, Πίνακες 2, 3) έδειξαν την παρουσία ενός (2E,6E)-8-υδροξυ{{3{0}} ,7-διμεθυλ-2,6-ομάδα οκταδιενοϊκού οξέος [d 1,70 (3H, br s, 10-H3), 2,14 (3H, br s, 9- Η3), 2,24 (2Η, m, 4-Η2), 2,27 (2Η, m, 5-Η2), 4,05, 4,20 (1Η έκαστο, αμφότερα br d, J= περίπου. 12 Hz, 8-H2), 5.47 (1H, tq, J{= 7.1, 0.9 Hz, 6-H), 5.67 (1H, br s, 1-H )] μαζί με ένα τμήμα bD-γλυκοπυρανοσυλίου [d 4,23 (d, J{= 7.7 Hz, 1 -H)]. Η συνδεσιμότητα του τμήματος bD-γλυκοπυρανοσυλίου στο 5 διευκρινίστηκε με βάση πειράματα HMBC όπως φαίνεται στο Σχ. 2. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια τυπική μετατόπιση γλυκοζυλίωσης για τα σήματα στη θέση 8- (d C 5: 75.6; 5a: 68,8). με βάση τα προαναφερθέντα στοιχεία, η στερεοδομή του 5 προσδιορίστηκε ότι είναι (2E,6E)-8-bD-γλυκοπυρανοσυλοξυ-3,7-διμεθυλ-2,{{103 }}οκταδιενοϊκό οξύ.

Επιδράσεις των συστατικών στην κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από τον παράγοντα νέκρωσης όγκου-α (TNF-a) σε κύτταρα L929

Ο TNF-a είναι γνωστό ότι προκαλεί μια ποικιλία τραυματισμών οργάνων μέσω της πρόκλησης κυτταρικής απόπτωσης. Στην περίπτωση του ήπατος, οι βιολογικές επιδράσεις του TNF-a έχουν εμπλακεί σε ηπατική βλάβη που προκαλείται από ηπατικές τοξίνες, ισχαιμία/επαναιμάτωση, ιογενή ηπατίτιδα και αλκοόλ.22-24) Επομένως, ο TNF-a θεωρείται ότι είναι σημαντικός στόχος για την ανακάλυψη αντιφλεγμονωδών και ηπατοπροστατευτικών παραγόντων. Με βάση την προαναφερθείσα ιδέα, διερευνήσαμε προστατευτικά συστατικά από προϊόντα που απαντώνται στη φύση στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από TNF-a σε κύτταρα L929, μια ευαίσθητη κυτταρική σειρά TNF-a.25) Στο παρελθόν, έχουμε αναφέρει

ότι αρκετά συστατικά από Piper chaba, 26-29) Boesenbergia rotunda, 30,31) Punica granatum, 32) Helichrysum arenarium, 33-35) και Sapindus rarak, 36-38) βρέθηκαν να παρουσιάζουν ανασταλτικές επιδράσεις της επαγόμενης από TNF-a κυτταροτοξικότητας σε κύτταρα L929. Δεδομένου ότι τα φαινυλαιθανοειδή συστατικά του C. tubulosa (π.χεχινακοσίδη, ακτεοσίδη και ισοακτεοσίδη, κ.λπ.) 5) ανέστειλε επίσης αυτή την κυτταροτοξικότητα, εξετάσαμε περαιτέρω τα συστατικά ιριδοειδούς, φαινυλοπροπανοειδούς και λιγνάνης όπως φαίνεται στον Πίνακα 4. Ως αποτέλεσμα, η κανκανοσίδη Α (9, αναστολή: 16,3± 2.0% στο 1). 00 mM), μουσαινοσιδικό οξύ (10, 44,7± 8,7%), 8-επιγαμικό οξύ (11, 10,7± 0,4%), 8-υδροξυ γερανιόλη 8-ObD- Η γλυκοπυρανοσίδη (17, 21,3± 2,4%) και η ()-πινορεσινόλη ObD-γλυκοπυρανοσίδη (22, 22,3± 1,6%), βρέθηκαν να παρουσιάζουν σημαντική δραστικότητα. Αν και οι δραστηριότητές τους ήταν πιο αδύναμες από εκείνες του εχινακοσίδη (IC50= 31.1 mM), του ακτεοσιδίου (17,8 mM) και του ισοακετοζίτη (22,7 mM), των βασικών φαινυλαιθανοειδών συστατικών.5)

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%