Βελτίωση της παραγωγής εχινακοσίδης και ακτεοσίδης με πρόκληση δύο σταδίων σε καλλιέργεια εναιωρήματος κυττάρων Cistanche Deserticola

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Wen-Hao Chen et al

Αφηρημένη

Σε κατάλληλες συγκεντρώσεις, οι πολυαμίνες προάγουν την ανάπτυξη του τύλου καιεχινακοσίδηπεριεχόμενο τουCistanche deserticolaενώ το Ag plus αύξησε την περιεκτικότητα σεεχινακοσίδηκαιακτεοσίδη. Σε μια περίοδο καλλιέργειας 20-ημέρας, όταν η πουτρεσκίνη (25 lM) και το Ag plus (10 lM) προστέθηκαν την 8η και την ημέρα 16, αντίστοιχα, ηεχινακοσίδηπαραγωγή (1,7 gl–1) καιακτεοσίδηη παραγωγή (0.4 gl–1) έφτασε στο μέγιστο, το οποίο ήταν 1.4-πλάσιο και 1.5-πλάσιο από αυτές τις μονής επεξεργασίας πουτρεσκίνης, 1.6-πλάσιο και 1.4-πλάσιο αυτών σε μονή θεραπεία Ag plus, αντίστοιχα. Η εξωγενής πουτρεσκίνη ενίσχυσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την αντιοξειδωτική ενζυμική ενεργότητα, έτσι αύξησε σημαντικά την τελική βιομάζα. Ag plus προσθήκη αύξησε σημαντικά την περιεκτικότητα σε H2O2 και τη δραστηριότητα της φαινυλαλανινοαμμωνίας-λυάσης, γεγονός που οδήγησε σε υψηλότερηεχινακοσίδηκαιακτεοσίδηπεριεχόμενα.

Λέξεις-κλειδιάΑκτεοσίδη,Cistanche deserticola, Εχινακοσίδη, Elicitor, Αναστολή καλλιέργεια

Συντομογραφίες

APOX Ασκορβική υπεροξειδάση

CAT Catalase

H2O2 Υπεροξείδιο του υδρογόνου

PAL αμμωνία-λυάση φαινυλαλανίνης

PeGs Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες

ROS αντιδραστικά είδη οξυγόνου

SOD Υπεροξειδική δισμουτάση

Cistanche deserticola

Κάντε κλικ στα προϊόντα Cistanche UK και Cistanche εκχύλισμα

Εισαγωγή

Cistanche deserticolaΤο YC Ma χρησιμοποιείται ευρέως στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PeGs) είναι κύρια βιοενεργά συστατικά αυτού του φυτού. Μεταξύ των PeG,εχινακοσίδηκαιακτεοσίδηείναι τα κύρια συστατικά για τη βελτίωση της σεξουαλικής ισχύος, τη ρύθμιση της λειτουργίας του ανοσοποιητικού, τον καθαρισμό των ελεύθερων ριζών και τις αντιγηραντικές ιδιότητες (Song et al. 2003). Λόγω της υπερεκμετάλλευσης, της δύσκολης καλλιέργειας και του υποβαθμισμένου περιβάλλοντος, άγριο Cistanche deserticolaτα φυτά βρίσκονται στο χείλος της εξαφάνισης. Η καλλιέργεια φυτικών κυττάρων μπορεί να είναι μια ελκυστική εναλλακτική λύση για τη λήψη αυτών των βιοδραστικών συστατικών. Τα κύρια προβλήματα που αντιμετωπίζει η καλλιέργεια in vitro τουCistanche deserticolaείναι χαμηλή βιομάζα και χαμηλή περιεκτικότητα σε PeG. Πολλοί διεγέρτες αναφέρθηκε ότι διεγείρουν την PeGsynthesis (Cheng et al. 2005, 2006; Lu and Mei 2003; Ouyang et al. 2003a; Xu et al. 2005), αλλά δυστυχώς, οι περισσότεροι διεγέρτες μείωσαν την κυτταρική βιομάζα.

Τα τελευταία χρόνια, ο συνδυασμός διαφορετικών διεγερτών διερευνάται στην καλλιέργεια εναιωρήματος φυτικών κυττάρων. Λόγω των διαφορετικών δράσεων των διαφορετικών διεγερτών, ο συνδυασμός διαφορετικών διεγερτών μπορεί να επιτύχει ένα συνεργικό αποτέλεσμα. Οι διεγέρτες μπορούν να σφαιροποιηθούν ταυτόχρονα, για παράδειγμα, στην καλλιέργεια εναιωρήματος του Taxus spp. (Yuan et al. 2002) και ginseng (Bae et al. 2006). Από την άλλη πλευρά, η προσθήκη διαφορετικών διεγερτών στο στάδιο της ανάπτυξης βιομάζας και στο στάδιο παραγωγής δευτερογενούς μεταβολίτη αντίστοιχα έδωσε τη μέγιστη παραγωγή βιομάζας και ταξόλης στην καλλιέργεια εναιωρήματος του Taxus baccata ( Khosroushahiet al. 2006). Ωστόσο, λίγες αναφορές είναι διαθέσιμες σχετικά με τη χρήση των συνδυαστικών διεγερτών στην κυτταρική καλλιέργεια Cistanche deserticola.

EhcinacosideσεCistanche deserticola

Προηγούμενες αναφορές γιαCistanche deserticolaεπικεντρώθηκε στην αύξηση της περιεκτικότητας σε PeG, αλλά οι διεγέρτες όπως οι πολυαμίνες για την προώθηση της βιομάζας αγνοήθηκαν εν μέρει. Οι πολυαμίνες μπορεί να προάγουν τη βιομάζα του τύλου ενισχύοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ανακουφίζοντας τη γήρανση των κυττάρων (Bais and Ravishankar 2002). Αναφέρθηκε πρόσφατα ότι οι πολυαμίνες συμμετείχαν στην αλληλεπίδραση με το αιθυλένιο και την ανοχή στο αβιοτικό στρες, ενώ το αιθυλένιο και τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) από αβιοτικό στρες είχαν ως αποτέλεσμα τη γήρανση και τον θάνατο των κυττάρων (Cona et al. 2006). Από την άλλη πλευρά, το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από διεγέρτες είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ROS, συμπεριλαμβανομένου του υπεροξειδίου του υδρογόνου (H2O2) και του ανιόντος υπεροξειδίου (O2–), τα οποία αναφέρθηκαν ότι μεσολαβούν με προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και δευτερογενή σύνθεση μεταβολιτών ως μόρια σήματος (Yuan et al. 2001 Xu andDong 2005). Για παράδειγμα, το H2O2 προκάλεσε τη γονιδιακή έκφραση της λυάσης αμμωνίας φαινυλαλανίνης (EC 4.3.1.5), βασικού ενζύμου για αμυντική απόκριση και δευτερογενή μεταβολισμό (Desikan et al. 1998), η οποία ρύθμισε την παραγωγή PeG σε κυτταρική καλλιέργειαCistanche deserticola(Cheng et al. 2005; Ouyanget al. 2003a). Εν όψει του οξειδωτικού στρες, ορισμένα μεταλλικά ιόντα, όπως Ni2 plus, Co2 plus, Ag plus, προώθησαν τη δευτερογενή σύνθεση μεταβολιτών αποτελεσματικά σε πολλά φυτά (Zhao et al. 2005). Ίσως μπορεί να ενισχύσουν τη δραστηριότητα PAL και την παραγωγή PeG. Σε αυτή τη μελέτη, πολυαμίνες και ιόντα μετάλλων, καθώς και ο συνδυασμός αυτών των διεγερτών, εφαρμόστηκαν για την ενίσχυση της ανάπτυξης του τύλου,εχινακοσίδη, καιακτεοσίδηπεριεχόμενο του Cistanche deserticola. Επιπλέον, διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ των διεγέρτων και της περιεκτικότητας σε H2O2, καθώς και οι επιδράσεις τους στις δραστηριότητες του PAL και των αντιοξειδωτικών ενζύμων.

Υλικά και μέθοδοι

Φυτικά υλικά

Cistanche deserticolaκυτταρικές σειρές προκλήθηκαν από το στέλεχος. Μετά την αποστείρωση, το στέλεχος κόπηκε σε κομμάτια περίπου 1 cm3 και καλλιεργήθηκε σε μέσο Β5 (Gamborg et al. 1968) που περιείχε 5 lM ναφθαλινοξικό οξύ (NAA), 9 lM 6-βενζυλ αδενίνη (6-BA), 4 lM 2,4-διχλωροφαινοξυοξικό οξύ (2,4-}) και 30 g σακχαρόζης l–1. Μετά από 30 ημέρες, ο ανοιχτοκίτρινος κάλος αφαιρέθηκε και υποκαλλιεργήθηκε σε μέσο Β5 με 5 lMNAA, 9 lM 6-BA και 1 lM 2,4-D, και η καλλιέργεια κυτταρικού εναιωρήματος καθιερώθηκε σύμφωνα με τις μεθόδους των Ouyang et al. (2003β).

Καλλιέργεια κάλου

Περίπου 1,5 g φρέσκου τύλου (0,125 g DW) από καλλιέργεια εναιώρησης 20-ημέραςCistanche deserticolaεμβολιάστηκε σε φιάλη Erlenmeyer 250-ml που περιείχε 50 ml μέσου Β5. Το μέσο B5 συμπληρώθηκε με 5 lM NAA, 9 lM 6-BA, 1 lM 2,4-D και 30 g σακχαρόζης l-1 σε pH 5,6 πριν από την αποστείρωση σε αυτόκλειστο. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τρεις επαναλήψεις στους 25 βαθμούς στο σκοτάδι σε περιστροφικό αναδευτήρα (110 στροφές min–1) για 20 ημέρες.

ActedosieσεCistanche deserticola

Θεραπείες διεγέρτων

Σε ένα μόνο πείραμα πρόκλησης, αποστειρωμένα με φίλτρο διαλύματα πουτρεσκίνης (Put), σπερμίνης (Spm), σπερμιδίνης (Spd), νιτρικού αργύρου και χλωριούχου κοβαλτίου προστέθηκαν στο μέσο σε σχεδιασμένες συγκεντρώσεις για να διερευνηθούν οι επιπτώσεις τους στην ανάπτυξη του κάλλου και στην περιεκτικότητα σε PeG. Με τον βέλτιστο τύπο διεγέρτη και τη συγκέντρωση, διερευνήθηκε η επίδραση του χρόνου σίτισης. Στη συνέχεια, με βάση τη βέλτιστη συγκέντρωση και τον χρόνο τροφοδοσίας, ο συνδυασμός διαφορετικών διεγερτών σχεδιάστηκε για να ενισχύσει την παραγωγή PeG σε ένα πείραμα πρόκλησης δύο σταδίων. Η καλλιέργεια τύλου χωρίς διεγέρτες ενεργεί ως έλεγχος. Για τη διερεύνηση του μηχανισμού δράσης των διεγερτών, ο κάλος αφαιρέθηκε σε ένα σχεδιασμένο χρόνο μετά την προσθήκη του προκλητή για περαιτέρω ανάλυση στο πείραμα πρόκλησης δύο σταδίων.

Βιοχημικές αναλύσεις

Σε ένα σχεδιασμένο χρόνο μετά την προσθήκη του διεγέρτη, τα κύτταρα διηθήθηκαν και πλύθηκαν απαλά με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια προσδιορίστηκε η κυτταρική βιωσιμότητα με χρώση χλωριούχου 2,3,5-τριφαινυλτετραζολίου σύμφωνα με τη μέθοδο του Verleysenet αϊ. (2004), Ο δείκτης βιωσιμότητας ορίζεται ως η απορρόφηση που μετράται ανά γραμμάριο φρέσκου ιστού. Η περιεκτικότητα σε H2O2 φρέσκων κυττάρων προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Velikova et al. (2000). Ο προσδιορισμός της δραστικότητας της αμμωνίας-λυάσης της φαινυλαλανίνης (PAL) (EC 4.3.1.5) βασίστηκε στη μέθοδο των Koukol και Conn (1961). Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση και τον προσδιορισμό υπεροξειδάσης υπεροξειδάσης (SOD) (EC1.15.1.1), καταλάσης (CAT) (EC 1.11.1.6), εκχύλισης ασκορβικής υπεροξειδάσης (APOX) και προσδιορισμού ήταν οι ίδιες με εκείνες των Jebara et al. (2005).

Μέτρηση βιομάζας, εχινακοσίδης και ακτεοσίδης

Για τον προσδιορισμό του ξηρού βάρους (DW), ο κάλλος διηθήθηκε και πλύθηκε με απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια λυοφιλοποιήθηκε σε σταθερό βάρος για να καταγραφεί το ξηρό βάρος.

Ξηρά κύτταρα (20 mg) εκχυλίστηκαν με 10 ml 50 τοις εκατό (v/v) μεθανόλης σε θερμοκρασία δωματίου σε υπερήχους (40 kHz, 160 W) για 15 λεπτά. Μετά από διήθηση μέσω φίλτρου 0,22 lm, δείγματα 20 λίτρων εγχύθηκαν σε σύστημα HPLC (Waters 2695) εξοπλισμένο με στήλη C18 (Diamonsil, 250 mm · 4,6 mm, μέγεθος σωματιδίων 5 μm). Η κινητή φάση αποτελούνταν από μεθανόλη και 0,05 τοις εκατό διάλυμα οξικού οξέος-νερού (ο/ο) σε αναλογία 35:65 (ν/ν). Ο ρυθμός ροής ήταν 1,0 ml min^–1, η θερμοκρασία της στήλης ήταν 30 βαθμοί και το μήκος κύματος ανίχνευσης UV (Waters 2996) ήταν 334 nm.

Οι καμπύλες βαθμονόμησης τουεχινακοσίδηκαιακτεοσίδηείχαν καλή γραμμικότητα στο εύρος των {{0}}.2–6,4 lg(r=0.9997) και 0.16–4,6 lg (r {{1{{ 24}}}},9995), αντίστοιχα. Οι μέσες ανακτήσεις της εχινακοσίδης και της ακτεοσίδης(n=5) ήταν 98,7 τοις εκατό (RSD=1,5 τοις εκατό ) και 98,2 τοις εκατό (RSD=1 ,28 τοις εκατό ), αντίστοιχα. Τα πειράματα ακρίβειας και ακρίβειας έδειξαν καλά αποτελέσματα, η σχετική τυπική απόκλιση ήταν μικρότερη από 2 τοις εκατό. Τα όρια ποσοτικοποίησης ήταν 0,04 και 0,06 lg για την εχινακοσίδη και την ακτεοσίδη, αντίστοιχα. Τα πρότυπα εχινακοσίδης και ακτεοσίδης αγοράστηκαν από το NICPBP (Εθνικό Ινστιτούτο για τον Έλεγχο Φαρμακευτικών και Βιολογικών Προϊόντων, Πεκίνο, Κίνα). Παραγωγή εχινακοσίδης/ακτεοσίδης=Περιεκτικότητα εχινακοσίδης/ακτεοσίδης (mg g–1 DW) x Βιομάζα (g DW l^–1).

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα πειράματα και οι προσδιορισμοί επαναλήφθηκαν τρεις φορές και όλες οι τιμές ήταν οι μέσοι όροι των τριπλών ± SE. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε ανάλυση διακύμανσης (one-way ANOVA, δοκιμή Tukey) για την ανίχνευση σημαντικών διαφορών με PROC ANOVA της έκδοσης SAS 6.12.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις των πολυαμινών στην ανάπτυξη του τύλου,εχινακοσίδη, καιακτεοσίδηπεριεχόμενο.

Ο Πίνακας 1 δείχνει τις επιδράσεις των πολυαμινών στην ανάπτυξη κάλων,εχινακοσίδη, καιακτεοσίδηπεριεχόμενο τουCistanche deserticola. Το Put και το Spm προώθησαν την ανάπτυξη τύλου σημαντικά σε κατάλληλη συγκέντρωση. Περίπου 25 lM Put ήταν πιο αποτελεσματική και η βιομάζα (11,2 g DW l–1) ήταν 1.3-πλάσιος από τον έλεγχο. Ταυτόχρονα ενισχυμένες πολυαμίνεςεχινακοσίδηπεριεχόμενο σημαντικά. Όταν προστέθηκαν 25 lM Put,εχινακοσίδηΗ περιεκτικότητα αυξήθηκε κατά 46 τοις εκατό σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ δεν βρέθηκε σημαντική αύξηση της περιεκτικότητας σε ακτεοσίδη.

Επιδράσεις του Ag plus και του Co2 plus στην ανάπτυξη τύλου, την περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη

Οι επιδράσεις των μεταλλικών ιόντων στην ανάπτυξη του τύλου,εχινακοσίδη, καιακτεοσίδηΗ περιεκτικότητα απεικονίζεται στον Πίνακα 2. Τα περιεχόμενα εχινακοσίδης και ακτεοσίδης προήχθησαν σε μεγάλο βαθμό από το Ag plus ενώ η ανάπτυξη του τύλου αναστέλλεται ελαφρώς. Όταν προστέθηκαν 10 lM Ag plus,εχινακοσίδηπεριεχόμενο καιακτεοσίδητο περιεχόμενο αυξήθηκε κατά 73 τοις εκατό και 62 τοις εκατό, αντίστοιχα σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ταυτόχρονα δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη βιομάζα μεταξύ της επεξεργασίας Ag plus και του ελέγχου. Το Co2 plus δεν έδειξε θετικά αποτελέσματα στην ανάπτυξη του τύλου και στο περιεχόμενο PeG.

Επιδράσεις του χρόνου σίτισης στην ανάπτυξη του τύλου, στην περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη

Το Put (25 lM) και το Ag plus (10 lM) επιλέχθηκαν για περαιτέρω πειράματα. Οι επιπτώσεις του χρόνου σίτισης στην ανάπτυξη κάλων,εχινακοσίδη, καιακτεοσίδηΤο περιεχόμενο φαίνεται στον Πίνακα 3. Όταν προστέθηκε Put (25 lM) την ημέρα 8, ελήφθη η μέγιστη βιομάζα (11,8 g DW l–1). Στο μεταξύ, τοεχινακοσίδητο περιεχόμενο αυξήθηκε στα 107,2 mg g–1 DW ενώακτεοσίδητο περιεχόμενο ήταν σχεδόν ίδιο με αυτό του ελέγχου.

Ag plus προσθήκη σε παλαιότερο χρόνο οδήγησε σε λιγότερη βιομάζα. Προσθέτοντας Ag plus (10 lM) την ημέρα 16 και τα δύοεχινακοσίδηπεριεκτικότητα (127,9 mg g–1 DW) καιακτεοσίδηΤο περιεχόμενο (34,2 mg g–1 DW) έφτασε στο μέγιστο, το οποίο ήταν 2,{4}}πλάσιο και 1,4-πλάσιο από εκείνα του μάρτυρα, αντίστοιχα.

Οι συνδυαστικές επιδράσεις του Put και του Ag plus στην ανάπτυξη τύλου, εχινακοσίδης και ακτεοσίδης

Όπως φαίνεται στα αποτελέσματα των μεμονωμένων διεγερτών, η προσθήκη προσθήκης στο πρώιμο στάδιο ενίσχυσε τη βιομάζα και η προσθήκη Ag plus στην περιεκτικότητα προαγωγής εχινακοσίδης και ακτεοσίδης στο τελευταίο στάδιο χωρίς να μειώσει σημαντικά τη βιομάζα. Έτσι σχεδιάστηκε ένα πρωτόκολλο πρόκλησης δύο σταδίων. Put (25 lM) και Ag plus (10 lM) προστέθηκαν στα αντίστοιχα βέλτιστα στάδια τους.

Το σχήμα 1 δείχνει τα αποτελέσματα του συνδυασμού της προσθήκης Putand Ag plus στην ανάπτυξη του τύλου,εχινακοσίδη, καιακτεοσίδηπαραγωγής σε αντίθεση με τον έλεγχο. Όταν προστέθηκε Put (25 lM) την ημέρα 8 και Ag plus (10 lM) την ημέρα 16, η βέλτιστη βιομάζα (11,4 g DW l–1), η περιεκτικότητα σε εχινοσίδη (152,4 mg g–1 DW) και η περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη (36,1 mg g–1 DW) επιτεύχθηκαν την ημέρα 20 (Εικ. 1). οεχινακοσίδηπαραγωγή (1,7 gl–1) καιακτεοσίδηη παραγωγή (0,4 gl–1) ανήλθε στο 3.3-πλάσιο και 2.1-πλάσιο από εκείνα στον έλεγχο, αντίστοιχα, τα οποία ήταν υψηλότερα από εκείνα της απλής πρόκλησης (Πίνακας 3) . Σε σύγκριση με τη θεραπεία με έναν διεγέρτη, τοεχινακοσίδηκαιακτεοσίδηΗ παραγωγή με συνδυασμό των διεγερτών ήταν 1.4-πλάσιο και 1.5-πλάσιο αυτών στη θεραπεία μεμονωμένης τοποθέτησης, 1.6-πλάσιο και 1.4-πλάσιο αυτών σε μία μόνο θεραπεία Ag plus. , αντίστοιχα. Η παρατεταμένη καλλιέργεια μείωσε τη βιομάζα, την παραγωγή εχινακοσίδης και την παραγωγή ακτεοσιδών (Εικ. 1)

Εικ. 1 Τα προφίλ βιομάζας (Α),εχινακοσίδη, καιακτεοσίδηπαραγωγή (Β) με/χωρίς συνδυασμούς διεγερτών σε καλλιέργεια εναιωρήματοςCistanche deserticola. Οι κάθετες ράβδοι αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα τριών επαναλήψεων. Κάλος, 0.125 g DW, εμβολιάστηκε σε φιάλες Erlenmeyer 250-ml που περιείχαν 50 ml μέσου Β5. Put (25 lM) και Ag plus (10 lM) προστέθηκαν την ημέρα 8 και την ημέρα 16, αντίστοιχα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στους 25 βαθμούς στο σκοτάδι σε περιστροφικό αναδευτήρα (110 στροφές λεπτό-1) για 20 ημέρες

Επίδραση του Put και του Ag plus στη βιωσιμότητα των κυττάρων, την περιεκτικότητα σε H2O2 και τις δραστηριότητες του PAL και των αντιοξειδωτικών ενζύμων

Να κατανοήσουν τον μηχανισμό δράσης των διεγερτών στην κυτταρική ανάπτυξη και τον δευτερογενή μεταβολισμό τουCistanche deserticola, οι αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων, η περιεκτικότητα σε H2O2 και οι δραστηριότητες του PAL και των αντιοξειδωτικών ενζύμων μετά την προσθήκη Put και Ag plus εξετάστηκαν στην καλλιέργεια διέγερσης δύο σταδίων. Όταν τοPut προστέθηκε την ημέρα 8 (0 h στο Σχ. 2), η περιεκτικότητα σε H2O2 μειώθηκε γρήγορα, που ήταν μόνο 48,9 τοις εκατό του μάρτυρα την 6η ώρα, αντίστοιχα, και επανήλθε στο επίπεδο του ελέγχου σταδιακά μετά από 24 ώρες (Εικ. 2Α). Η βιωσιμότητα των κυττάρων αυξήθηκε μέχρι τις 12 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκε σταθερά, που ήταν 26,9 τοις εκατό και 16,7 τοις εκατό υψηλότερη από τον έλεγχο στις 24 και 48 ώρες αντίστοιχα (Εικ. 2Β). Οι δραστηριότητες των SOD και APOX αυξήθηκαν σημαντικά μετά από 6 ώρες και η δραστηριότητα SOD μειώθηκε σε παρόμοιο επίπεδο του ελέγχου μετά από 24 ώρες, ενώ η δραστηριότητα APOX ήταν ακόμη 1.{24}}πλάσιος του ελέγχου (Εικ. 2C, D). Η προσθήκη δεν έδειξε σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα CAT (Εικ. 2Ε). Η μείωση της περιεκτικότητας σε H2O2 και η αύξηση της δραστηριότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων σήμαινε λιγότερη οξειδωτική βλάβη και κράτησε περισσότερα κύτταρα βιώσιμα από τον έλεγχο.

Εικ. 2 Οι αλλαγές της περιεκτικότητας σε H2O2, της κυτταρικής βιωσιμότητας, της δραστηριότητας APOX, SOD, CAT και PAL μετά την προσθήκη την 8η ημέρα καλλιέργειας εναιωρήματοςCistanche deserticola. Οι κάθετες ράβδοι αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα τριών επαναλήψεων

Ταυτόχρονα, η δραστηριότητα PAL έφτασε στο μέγιστο τη 12η ώρα και στη συνέχεια μειώθηκε σταδιακά στο επίπεδο παρόμοιο με τον έλεγχο μετά από 48 ώρες (Εικ. 2F).

Τα κύτταρα καλλιεργούνταν συνεχώς μετά την προσθήκη Put, και προστέθηκε Ag plus στο μέσο την ημέρα 16 (0 h στο Σχήμα 3). Η περιεκτικότητα σε H2O2 αυξήθηκε γρήγορα και διατηρήθηκε σε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο από τον έλεγχο μέχρι τις 48 ώρες (Εικ. 3Α). Ωστόσο, η βιωσιμότητα των κυττάρων αναστέλλεται σημαντικά και έγινε μικρότερη (Εικ. 3Β). Η δραστηριότητα APOX διατήρησε σταθερό επίπεδο και μειώθηκε μετά από 24 ώρες (Εικ. 3C). Οι δραστηριότητες SOD και CAT αυξήθηκαν απότομα μετά από 3 ώρες και έφτασαν τα μέγιστα στις 12 ώρες και 6 ώρες, αντίστοιχα, που ήταν 1.{14}}πλάση 1.{16}}πλάση υψηλότερη από τα στοιχεία ελέγχου και μετά έπεσαν αργά (Εικ. 3D , Ε). Η δραστηριότητα PAL αυξήθηκε στο 2.{19}}πλάσιο του ελέγχου μετά από 24 ώρες, το οποίο ήταν ακόμα 22,5 τοις εκατό υψηλότερο από τον έλεγχο μετά από 48 ώρες (Εικ. 3ΣΤ).

Εικ. 3 Οι αλλαγές της περιεκτικότητας σε H2O2, της κυτταρικής βιωσιμότητας, της δραστηριότητας APOX, SOD, CAT και PAL μετά την προσθήκη Ag συν προσθήκη καλλιέργειας εναιωρήματος την ημέρα 16Cistanche deserticolaμε προσθήκη προσθήκης την ημέρα 8. Οι κάθετες ράβδοι αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα τριών επαναλήψεων.

Συζήτηση

Οι πολυαμίνες και τα μεταλλικά ιόντα έδειξαν διαφορετικές επιρροές στην ανάπτυξη του τύλου και στην παραγωγή PeGCistanche deserticola. Σε κατάλληλες συγκεντρώσεις, οι πολυαμίνες ενίσχυσαν κυρίως την ανάπτυξη του κάλου, ενώ το Ag plus προώθησε την παραγωγή τουεχινακοσίδηκαιακτεοσίδησημαντικά. Όταν και το Putand Ag plus στη βέλτιστη συγκέντρωση προστέθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους, εμφανίστηκαν κάποια συνεργικά αποτελέσματα.

Για την ανάπτυξη του τύλου, το αποτέλεσμα προώθησης βασίστηκε στον τύπο των πολυαμινών, τη συγκέντρωση και τον χρόνο σίτισης. Το 25 lMPut ήταν πιο αποτελεσματικό για την ανάπτυξη του τύλου όταν προστέθηκε την ημέρα 8. Ο διεγέρτης έδειξε τη βέλτιστη επίδραση προαγωγής στο πρώιμο στάδιο ανάπτυξης. Αν και βρέθηκε ότι το Ag plus και το Co2 plus ενισχύουν τους δευτερογενείς μεταβολίτες σε διαφορετικά φυτά (Zhaoet al. 2005), μόνο το Ag plus έδειξε θετική επίδραση στα περιεχόμενα τουεχινακοσίδηκαιακτεοσίδη. Επειδή το Ag plus μπορούσε να αναστείλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, η προσθήκη Ag plus την ημέρα 16 ενίσχυσε την παραγωγήεχινακοσίδηκαιακτεοσίδηχωρίς να μειώνεται σημαντικά η βιομάζα.

Όταν τα φυτικά κύτταρα εκτίθενται σε επεξεργασία με διεγέρτη, ο διεγέρτης εκκινεί τη μεταγωγή σήματος από την επιφάνεια της πλασματικής μεμβράνης και την παραγωγή ROS, προκαλεί απόκριση άμυνας των φυτών και ενισχύει τον δευτερογενή μεταβολισμό των φυτών ρυθμίζοντας βασικά ένζυμα που καταλύουν τη βιοσύνθεση των δευτερογενών μεταβολιτών-στόχων (Zhao et al. 2005). Το οξειδωτικό στρες λόγω της θεραπείας διεγέρτη έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ROS και μπορεί να ανακουφιστεί από τα αντιοξειδωτικά, συμπεριλαμβανομένων των SOD, APX, CAT και POD. Όταν η οξειδωτική βλάβη είναι πέρα ​​από τις λειτουργίες των αντιοξειδωτικών ενζύμων, τα φυτικά κύτταρα μπορεί να πεθάνουν καθώς μειώνεται η βιωσιμότητα των κυττάρων.

Το H2O2, ένας τύπος ROS, πιστεύεται ότι μεσολαβεί στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και ρυθμίζει τη δευτερογενή σύνθεση μεταβολιτών προκαλώντας την έκφραση πολλών αμυντικών γονιδίων και γονιδίων βιοσυνθετικών δευτερογενών μεταβολιτών, όπως το PAL. Το H2O2, ένας τύπος ROS, πιστεύεται ότι μεσολαβεί στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και ρυθμίζει τη δευτερογενή σύνθεση μεταβολιτών προκαλώντας την έκφραση πολλών αμυντικών γονιδίων και γονιδίων βιοσυνθετικών δευτερογενών μεταβολιτών, όπως το PAL.

Οι πολυαμίνες βελτίωσαν την ανοχή στο αβιοτικό στρες με την αποτελεσματική απομάκρυνση των ROS, την προστασία του νουκλεϊκού οξέος και της μεμβράνης (Alca'zar et al. 2006) και ενισχύοντας τη δράση των αντιοξειδωτικών ενζύμων (Tang and Newton 2005). Σύμφωνα με την αναφορά των Παπαδάκη και Ρουμπελάκη-Αγγελάκη (2005), Έδειξε καλύτερη επίδραση αποκλεισμού στη συσσώρευση ROS από το Spd και το Spm. Όπως φαίνεται στα αποτελέσματά μας, η τελική επεξεργασία βιομάζας inPut ήταν μεγαλύτερη από αυτή των θεραπειών Spd και Spm. Το Exogenous Put μειώνει την περιεκτικότητα σε H2O2, αυξάνει τις αντιοξειδωτικές ενζυμικές δραστηριότητες και τη βιωσιμότητα των κυττάρων αποτελεσματικά. Πιθανώς η υψηλότερη βιωσιμότητα των κυττάρων συνέβαλε σε περισσότερο πολλαπλασιασμό και υψηλότερη βιομάζα. Στη συνέχεια, θα μπορούσε να εξηγηθεί γιατί η προσθήκη Ag συν σε παλαιότερο χρόνο οδήγησε σε λιγότερη βιομάζα για το Ag συν ενισχυμένη συσσώρευση H2O2 και μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Οι δραστηριότητες των αντιοξειδωτικών ενζύμων ενισχύθηκαν για να ανακουφίσουν το οξειδωτικό στρες χωρίς να επηρεάσουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η προσθήκη Ag plus προώθησε επίσης την PALactivity καθώς και την παραγωγήεχινακοσίδηκαιακτεοσίδηπολύ. Ο μηχανισμός μπορεί να είναι συνεπής με τα αποτελέσματα των Desiken et al. (1998) και Yuan et al. (2001). Το H2O2 μπορεί να διαδραματίσει βασικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την παραγωγή PeG. Βάλτε αυξημένη δραστηριότητα PAL καιεχινακοσίδηπεριεχόμενο σε έναν βαθμό, πιθανώς με διαφορετικό τρόπο για Βάλτε μειωμένη περιεκτικότητα σε H2O2.

Τα τελευταία χρόνια, οι περισσότερες αναφορές έχουν επικεντρωθεί στην επίδραση ενός μόνο διεγέρτη στην ανάπτυξη του τύλου και στην περιεκτικότητα σε PeGsCistanche deserticola. Ωστόσο, πολλοί διεγέρτες δεν ενίσχυσαν την ανάπτυξη του τύλου στη βέλτιστη συγκέντρωση, όπως η ασκιτοζάνη, ο διεγέρτης μυκήτων (Fusarium solani), ο ιασμονικός μεθυλεστέρας και το σαλικυλικό οξύ (Cheng et al. 2006; Lu and Mei2003; Xu et al. 2005). Ένα μείγμα στοιχείων σπάνιων γαιών βελτίωσε την κυτταρική ανάπτυξη και την παραγωγή PeG, 26 τοις εκατό και 167 τοις εκατό υψηλότερα από εκείνα του μάρτυρα, αντίστοιχα (Ouyanget al. 2003b). Η επαναλαμβανόμενη πρόκληση με έναν μόνο διεγέρτη ενίσχυσε επίσης σημαντικά την παραγωγή PeG (Cheng et al.2005, 2006). Είναι μια καλή εναλλακτική λύση για να αποκτήσετε τη βέλτιστη παραγωγή βιομάζας και PeG προσθέτοντας διαφορετικούς διεγέρτες σε διαφορετικά στάδια. Όταν προστέθηκαν 25 lM Put και 10 lM Ag plus την ημέρα 8 και την ημέρα 16, αντίστοιχα, ηεχινακοσίδηη παραγωγή (1,7 gl–1) και η παραγωγή ακτεοσίδης (0,4 gl–1) έφθασαν στο μέγιστο, τα οποία ήταν υψηλότερα από εκείνα από την απλή λήψη Put ή Ag plus καθώς και από τις προηγούμενες αναφορές.

Από: «Βελτίωση τουεχινακοσίδηκαιακτεοσίδηπαραγωγή με πρόκληση δύο σταδίων σε καλλιέργεια κυτταρικού εναιωρήματοςCistanche deserticola' μεWen-Hao Chen et al

---World J Microbiol Biotechnol (2007) 23:1451–1458 / Springer Science plus Business Media BV 2007

βιβλιογραφικές αναφορές

Alca'zar R, Marco F, Cuevas JC, Patron M, Ferrando A, Carrasco P, Tiburcio AF, Altabella T (2006) Συμμετοχή πολυαμινών στην απόκριση των φυτών στο αβιοτικό στρες. Biotechnol Lett 28:1867–1876
Bae KH, Choi YE, Shin CG, Kim YY, Kim YS (2006) Ενισχυμένη παραγωγικότητα ginsenoside με συνδυασμό αιθεφόνης και ιασμονικού μεθυλεστέρα σε τυχαίες ριζικές καλλιέργειες ginseng (Panax ginseng CA Meyer). Biotechnol Lett 28:1163–1166
Bais HP, Ravishankar GA (2002) Ο ρόλος των πολυαμινών στην οντογένεση των φυτών και οι βιοτεχνολογικές τους εφαρμογές. Καλλιέργεια οργάνων ιστών φυτικών κυττάρων 69:1–34
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005) Η επαναλαμβανόμενη πρόκληση ενισχύει τη συσσώρευση γλυκοζιτών φαινυλαιθανοειδών σε καλλιέργειες κυτταρικού εναιωρήματοςCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Βελτίωση της βιοσύνθεσης φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών σεCistanche deserticolaκαλλιέργειες κυτταρικού εναιωρήματος με διεγέρτη χιτοζάνης. J Biotechnol 121:253-260
Cona A, Rea G, Angelini R, Federico R, Tavladoraki P (2006) Functions of amine oxidases in plant development and Defense. Trends Plant Sci 11:80–88
Desikan R, Reynolds Α, Hancock JT, Neill SJ (1998) Η Harpin και το υπεροξείδιο του υδρογόνου ξεκινούν και τα δύο προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο αλλά έχουν διαφορικές επιδράσεις στην έκφραση του αμυντικού γονιδίου σε καλλιέργειες εναιωρήματος Arabidopsis. Biochem J 330:115-120
Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Απαιτήσεις θρεπτικών στοιχείων αιωρηματικών καλλιεργειών κυττάρων ρίζας σόγιας. Exp Cell Res 50:151–158Jebara S, Jebara M, Limam F, Aouani ME (2005) Changes in
Δραστηριότητες ασκορβικής υπεροξειδάσης, καταλάσης, υπεροξειδάσης γουαϊακόλης και υπεροξειδικής δισμουτάσης σε οζίδια κοινών φασολιών (Phaseolus vulgaris) υπό στρες αλατιού. J Plant Physiol 162:929–936
Khosroushahi AY, Valizadeh M, Ghasempour A, Khosrowshahli M, Naghdibadi H, Dadpour MR, Omid Y (2006) Βελτιωμένη παραγωγή ταξόλης με συνδυασμό παραγόντων επαγωγής στην κυτταρική καλλιέργεια εναιωρήματος Taxus baccata. Cell Biol Int 30:262-269
Koukol J, Conn EE (1961) The metabolism of aromatic and properties of the phenylalanine deaminase of Hordeum vulgare. J Biol Chem 236:2692-2698
Lu CT, Mei XG (2003) Βελτίωση της παραγωγής φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών από έναν διεγέρτη μυκήτων σε καλλιέργεια κυτταρικού εναιωρήματοςCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437–1439
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003a) Σχηματισμός φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων απόCistanche deserticolaκάλος που αναπτύσσεται σε στερεά μέσα. Biotechnol Lett 25:223-225
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003b) Επιδράσεις των στοιχείων σπάνιων γαιών στην ανάπτυξηCistanche deserticolaκύτταρα και την παραγωγή φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών. J Biotechnol 102:129-134
Papadakis AK, Roubelakis-Angelakis KA (2005) Οι πολυαμίνες αναστέλλουν τη δημιουργία υπεροξειδίου που προκαλείται από την οξειδάση NADPH και η πουτρεσκίνη αποτρέπει τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου που δημιουργείται από την οξειδάση της πολυαμίνης. Planta 220:826–837
Song ZH, Lei L, Tu PF (2003) Πρόοδοι στην έρευνα της φαρμακολογικής δραστηριότητας σε φυτάCistancheHoffing et Link. Chin Tradit Herbal Drugs 34:16–18
Tang W, Newton RJ (2005) Οι πολυαμίνες μειώνουν την οξειδωτική βλάβη που προκαλείται από το αλάτι αυξάνοντας τις δραστηριότητες των αντιοξειδωτικών ενζύμων και μειώνοντας την υπεροξείδωση των λιπιδίων στο πεύκο της Βιρτζίνια. Plant Growth Regul 46:31–43
Velikova V, Yordanov I, Edreva A (2000) Το οξειδωτικό στρες και ορισμένα αντιοξειδωτικά συστήματα σε επεξεργασία με όξινη βροχή είναι φυτοπροστατευτικός ρόλος εξωγενών πολυαμινών. Plant Sci 151:59–66
Verleysen H, Samyn G, Van Bockstaele E, Debergh P (2004) Αξιολόγηση αναλυτικών τεχνικών για την πρόβλεψη της βιωσιμότητας μετά την κρυοσυντήρηση. Λατρεία οργάνων ιστών φυτικών κυττάρων 77:11–21
Xu MJ, Dong JF (2005) Το O2– από την οξειδωτική έκρηξη που προκαλείται από τον διεγέρτη είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση της ενεργοποίησης της αμμωνίας-λυάσης της φαινυλαλανίνης και της σύνθεσης καθαρανθίνης σε κυτταρικές καλλιέργειες Catharanthus roseus. Enzyme Microb Technol 36:280-284
Xu LS, Xue XF, Fu CX, Jin ZP, Chen YQ, Zhao DX (2005).Cistanche deserticola. Chin J Biotechnol 21:402–406
Yuan YJ, Li C, Hu ZD, Wu JC (2001) Μονοπάτι μεταγωγής σήματος για οξειδωτική έκρηξη και παραγωγή ταξόλης σε καλλιέργειες εναιωρήματος Taxus Chinensis var. mairei που επάγεται από ολιγοσακχαρίτη από Fusarium oxysprum. Enzyme Microb Technol 29:372-379
Yuan YJ, Wei ZJ, Miao ZQ, Wu JC (2002) Δράση μονοπατιών των διεγερτών στο μονοπάτι βιοσύνθεσης Taxol και το συνεργιστικό τους αποτέλεσμα. Biochem Eng J 10:77–83
Zhao J, Davis LC, Verpoorte R (2005) Μεταβίβαση σήματος διεγέρτη που οδηγεί στην παραγωγή φυτικών δευτερογενών μεταβολιτών. Biotechnol Adv 23:283–333