Προσδιορισμός γονιδίων ρολογιού που σχετίζονται με την υπέρταση στα νεφρά από αυθόρμητα υπερτασικούς αρουραίους

edmund.chen@wecistanche.com

ΙΣΤΟΡΙΚΟΥπάρχει μια ημερήσια διακύμανση στη διακύμανση της αρτηριακής πίεσης της υπέρτασης και η ανωμαλία της διακύμανσης της αρτηριακής πίεσης θεωρείται ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για βλάβη οργάνων, συμπεριλαμβανομένων των καρδιαγγειακών επιπλοκών. Στην τρέχουσα μελέτη, προσπαθήσαμε να εντοπίσουμε μόρια υπεύθυνα για τον σχηματισμό του κιρκάδιου ρυθμού της αρτηριακής πίεσης υπό τον έλεγχο τουνεφρόβιολογικό ρολόι στην υπέρταση.

ΜΕΘΟΔΟΙ  Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μικροσυστοιχίας DNA σενεφράαπό 5-αυθόρμητα υπερτασικούς αρουραίους (SHRs)/Izm, επιρρεπείς σε εγκεφαλικό επεισόδιο SHR αρουραίους (SHRSP)/Izm και Wistar Kyoto (WKY)/Izm. Για την ανίχνευση της παραλλαγής, τα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού (TCMK-1) διεγέρθηκαν με δεξαμεθαζόνη. Πραγματοποιήσαμε ανοσοχρώση και ανάλυση western blot στονεφρώνμυελός τουνεφρόαπό 5-αρουραίους WKY και SHR ηλικίας εβδομάδων.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΕξάγαμε 1.032 γονίδια με το E-box, μια ακολουθία δέσμευσης για το BMAL1 και το CLOCK χρησιμοποιώντας μια ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων. Σε μια ανάλυση μικροσυστοιχίας, εντοπίσαμε 12 γονίδια αυξημένα 2-πλάσιο στονεφράτων SHRs και SHRSP σε σύγκριση με τους αρουραίους WKY. Σε μια ανάλυση περιοδικής παλινδρόμησης, η αμιδοτρανσφεράση του πυροφωσφορικού φωσφοριβοσυλίου (Ppat) και η εύθραυστη Χ νοητική υστέρηση, το αυτοσωμικό ομόλογο 1 (Fxr1) έδειξε κιρκάδιο ρυθμό. Η ανοσοκυτταροχημεία αποκάλυψε θετικότητα PPAT στους πυρήνες και το κυτταρόπλασμα στα σωληνάρια και FXR1-θετικότητα στο κυτταρόπλασμα του TCMK-1. Σε αρουραίους και SHR ηλικίας 5-εβδομάδων WKYνεφρά, το PPAT εντοπίστηκε στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα των εγγύς και περιφερικών σωληναρίων και το FXR1 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των εγγύς και άπω σωληναρίων.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑΤα PPAT και FXR1 είναι βασικά μόρια στον έλεγχο του κιρκάδιου ρυθμού της αρτηριακής πίεσης από τονεφρόστην υπέρταση.

Λέξεις-κλειδιά:πίεση αίματος;; υπέρταση; νεφρό; νεφροσωληνίσκος; αυθόρμητα υπερτασικός αρουραίος

Διάφορα βιολογικά φαινόμενα, συμπεριλαμβανομένου του κύκλου ύπνου, του καρδιακού ρυθμού και της αρτηριακής πίεσης, έχουν κιρκάδιο ρυθμό. Για τον κιρκάδιο ρυθμό ανακαλύφθηκε η παρουσία βιολογικού ρολογιού, στη συνέχεια διαπιστώθηκε ότι ο κιρκάδιος ρυθμός υπάρχει σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς από τα αρχαιοβακτήρια μέχρι τους ανθρώπους. 1

Ο υπερχιασματικός πυρήνας (SCN), που θεωρείται ότι λειτουργεί ως κεντρικό ρολόι, είναι ένα κέντρο που ασκεί αυτόνομη ταλάντωση κιρκάδιου ρυθμού. Επιπλέον, τα εσωτερικά ρολόγια που υπάρχουν στα περιφερειακά όργανα ελέγχονται από κεντρικά ρολόγια και σηματοδοτούν τον κατάλληλο ρυθμό για κάθε όργανο. 2 Το κεντρικό ρολόι ελέγχει τα περιφερειακά ρολόγια μέσω νευρικών και χυμικών παραγόντων. Το SCN αποτελείται από μεγάλο αριθμό νευρώνων που ταλαντώνονται αυτόνομα, όταν αυτά τα κύτταρα απομονώθηκαν και διασκορπίστηκαν σε αρουραίους και ποντίκια, εμφάνισαν κιρκάδιους ρυθμούς με μικρές διαφορές στη συχνότητα πυροδότησης και την έκφραση γονιδίων. Έτσι, οι μεμονωμένοι νευρώνες στο SCN είναι κύτταρα ρολογιού με τους δικούς τους κιρκαδικούς ταλαντωτές. 3

Πρόσφατα, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τον ρυθμό των βιολογικών ρολογιών έχουν αποσαφηνιστεί. Το βιολογικό ρολόι αποτελείται από έναν κύριο βρόχο στον οποίο ο εγκέφαλος και ο μυς που μοιάζουν με 1 (BMAL1), οι κιρκαδικοί κύκλοι κινητικής εξόδου kaput (CLOCK), Περίοδος (PER) και Κρυπτόχρωμα (CRY) λειτουργούν ως πρωτεΐνες πυρήνα. Το CLOCK και το BMAL1 σχηματίζουν ένα διμερές για να λειτουργήσει ως παράγοντας μεταγραφής και να δεσμευτεί σε μια αλληλουχία E-box (CACGTG). 4 Τα γονίδια-στόχοι περιλαμβάνουν άλλα γονίδια ρολογιού, όπως το Per και το Cry. Οι δημιουργούμενες πρωτεΐνες PER και CRY μετατοπίζονται στον πυρήνα και καταστέλλουν τα γονίδια BMAL1 και CLOCK. Στη συνέχεια, το PER και το CRY επιλύονται με την πάροδο του χρόνου μέσω πολυβάθμιας φωσφορυλίωσης από κινάση καζεΐνης (CKIε), συνθάση γλυκογόνου (GSK-3) και ενεργοποιημένη με AMP πρωτεϊνική κινάση (AMPK). Έτσι, η καταστολή των BMAL1 και CLOCK ακυρώνεται από το PER και το CRY και η προώθηση της έκφρασης γονιδίου από το CLOCK και το BMAL1 ξεκινά ξανά και το ρολόι πηγαίνει γύρω. Εκτός από αυτόν τον κύριο βρόχο, υπάρχει επίσης ένας υποβρόχος που περιλαμβάνει υποοικογένεια πυρηνικού υποδοχέα 1, ομάδα D 1 (NR1D1), ορφανό υποδοχέα που σχετίζεται με τον υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος (ROR), D-θέση πρωτεΐνης σύνδεσης προαγωγέα λευκωματίνης (DBP) και Ε4 πρωτεΐνη 4 που δεσμεύει τον υποκινητή (E4BP4). Το NR1D1 συνδέεται με την ακολουθία RRE (AGGTCA) και καταστέλλει τον κύριο βρόχο μέσω αρνητικής ανάδρασης, ενώ το DBP ​​προωθεί τον κύριο βρόχο μέσω θετικής ανάδρασης δεσμεύοντας στην ακολουθία D-box (TTATGTAA). 5 Αναφέρεται επίσης ότι οι πρωτεΐνες που χτυπούν τον κιρκάδιο ρυθμό υπό τον έλεγχο του βιολογικού ρολογιού φτάνουν περίπου το 15 τοις εκατό σε κάθε ιστό. 6 Το βιολογικό ρολόι εμπλέκεται στο σχηματισμό κιρκάδιων ρυθμών διαφόρων φυσιολογικών φαινομένων.

Είναι γνωστό ότι υπάρχει μια ημερήσια διακύμανση στη διακύμανση της αρτηριακής πίεσης της υπέρτασης και η ανωμαλία της διακύμανσης της αρτηριακής πίεσης θεωρείται ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για βλάβη οργάνων συμπεριλαμβανομένων των καρδιαγγειακών επιπλοκών. 7 Ο διαταραγμένος κιρκάδιος ρυθμός της αρτηριακής πίεσης προκαλεί βλάβες στα όργανα. Υπάρχουν πολλές αναφορές για τη σχέση μεταξύ της αρτηριακής πίεσης και των βιολογικών ρολογιών, όπως το Per, το Cry, το Bmal1 και το Clock. Μειωμένη αρτηριακή πίεση, απώλεια ημερήσιας διακύμανσης της αρτηριακής πίεσης και τραυματισμός αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων έχουν αναφερθεί σε ποντικούς νοκ-άουτ Bmal1. 8 Τα ποντίκια Clock knockout έχουν αναφέρει ότι παρουσιάζουν αυξημένη απέκκριση νατρίου στα ούρα, μειωμένη αρτηριακή πίεση και ακόμη και μειωμένο καρδιακό ρυθμό και μειωμένο κιρκάδιο πλάτος καρδιακού ρυθμού. 9 Dashti et al. ανέφερε ότι τα γονίδια του ρολογιού επάγουν ένα μεγάλο ποσοστό φαινοτυπικής διακύμανσης στη συστολική αρτηριακή πίεση. 10

Σχετικά με τη συμβολή τωννεφράστους κιρκάδιους ρυθμούς, φυσιολογικόςνεφράέχουν μεγαλύτερη απέκκριση ηλεκτρολυτών και παραγωγή ούρων κατά τη διάρκεια της ημέρας από ό,τι τη νύχτα, και υπάρχει κιρκάδιος ρυθμός στην απέκκριση νατρίου, καλίου και χλωρίου. 11 Στην υπέρταση, η αποτυχία του κιρκάδιου ρυθμού αυτών των λειτουργιών αναφέρεται ότι σχετίζεται με καρδιαγγειακές επιπλοκές. 12 ποντίκια με νοκ-άουτ Per1 παρουσιάζουν αυξημένη απέκκριση νατρίου και μειωμένη αρτηριακή πίεση σε σχέση με την υπομονάδα τουνεφρώνεπιθηλιακό κανάλι νατρίου (ENaC) στον αγωγό συλλογής τουνεφρό, υποδηλώνοντας την παρουσία βιολογικού ρολογιού στονεφρό.13 Επιπλέον, παρατηρείται ημερήσια διακύμανση της αρτηριακής πίεσης (κατάσταση nondipper) σε ασθενείς με χρόνιαΝεφρική Νόσος. 14 Έτσι, το κεντρικό ρολόι που βρίσκεται στο SCN ρυθμίζει τονεφρώνπεριφερειακό ρολόι, σημειώνοντας τον βέλτιστο χρονισμό για τονεφρό.

Ο αυθόρμητα υπερτασικός αρουραίος (SHR), ένα γενετικό μοντέλο ιδιοπαθούς υπέρτασης, έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζει απόκλιση στον καρδιακό ρυθμό και ημερήσια διακύμανση της αρτηριακής πίεσης, τα οποία ενισχύονται με τη γήρανση. 15 Προηγουμένως, ερευνήσαμε το κιρκάδιο ρολόι των επινεφριδίων σε αρουραίους SHR και Wistar Kyoto (WKY) που διατηρούνταν σε κύκλο φωτός-σκότους 12-ώρας και βρήκαμε ότι το SHR έχει μη φυσιολογικό επινεφριδιακό κιρκάδιο ρολόι

και δείχνουν τον αλλοιωμένο κιρκάδιο ρυθμό του ενζύμου περιορισμού του ρυθμού κωδικοποίησης γονιδίου ελεγχόμενου από το ρολόι στη γένεση στεροειδών καθώς και του αλλοιωμένου επιπέδου γλυκοκορτικοειδών ορού. 16 Εκτός από το σήμα από το κεντρικό ρολόι SCN, το γλυκοκορτικοειδές που απελευθερώνεται από τα επινεφρίδια είναι γνωστό ότι συγχρονίζει το περιφερικό κιρκάδιο ρολόι σε άλλο όργανο. 17 Η διέγερση με δεξαμεθαζόνη μπορεί να αναπαράγει την κιρκάδια διακύμανση του γονιδίου του ρολογιού και να είναι εφαρμόσιμη για in vitro μελέτη. 18 Σε αυτή την περίπτωση, είναι πιθανό το SHR να έχει επίσης μη φυσιολογικά περιφερειακά κιρκαδικά ρολόγια σε διάφορα όργανα, συμπεριλαμβανομένωννεφρόπου παίζει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Ωστόσο, κιρκάδιο ρολόι μέσανεφρόαπό το SHR δεν έχει γίνει πλήρως κατανοητό.

Στην τρέχουσα μελέτη, προσπαθήσαμε να αναγνωρίσουμε τα υπεύθυνα γονίδια ρολογιού τουνεφρόστην υπέρταση χρησιμοποιώντας αρουραίους SHR και επιρρεπείς σε εγκεφαλικά επεισόδια SHR (SHRSP), και αξιολόγησε τους ρόλους των γονιδίων του ρολογιού που εμπλέκονται στη ρύθμιση του μη φυσιολογικού κιρκάδιου ρυθμού της αρτηριακής πίεσης.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Ηθική και ζώαΗ έρευνά μας συμμορφώθηκε με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων που δημοσιεύτηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ (NiH Publication No. 85-23, 1996). Τα ερευνητικά πρωτόκολλα που περιλαμβάνουν τη χρήση ζώντων ζώων αξιολογήθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Nihon (Αρ. 11–034). Οι αρουραίοι WKY/Izm και το SHR/Izm που διατηρούνται στο Disease Model Cooperative Research Association αγοράστηκαν από την Japan SLC (Hamamatsu, Shizuoka, Ιαπωνία). Η συστολική αρτηριακή πίεση μετρήθηκε με τη μέθοδο tail-cuff. Σε αυτήν τη μελέτη, προκειμένου να αποφευχθούν δευτερογενείς αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση με την αύξηση της αρτηριακής πίεσης και να εντοπιστούν υπεύθυνα γονίδια που επηρεάζουν τους κιρκάδιους ρυθμούς και τελικά συσχετίζουν την υπέρταση, επιλέξαμε προυπερτασικούς αρουραίους 5-εβδομάδων.

Αναζήτηση γονιδίων με E-box σε ολόκληρο το γονιδίωμα

Χρησιμοποιήσαμε τη βάση δεδομένων Molecular Signatures στην ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA; Broad Institute, Boston, MA) για να αναζητήσουμε στο σύμπλεγμα γονιδίων για στόχους ανθρώπινου παράγοντα μεταγραφής και χρησιμοποιήσαμε τη βάση δεδομένων με τον υψηλότερο αριθμό γονιδίων ανάντη από το γονίδιο σημείου έναρξης μεταγραφής Α. στο οποίο το E-box (CACGTG) ήταν παρόν σε 2,000 bp ανάντη.

Ανάλυση μικροσυστοιχίας DNA

Νεφράαφαιρέθηκαν από 5-αρουραίους SHR/Izm, SHRSP/Izm και WKY/Izm εβδομάδων σε 12:00. Η εκτομήνεφρόομογενοποιήθηκε με ένα TaKaRa BioMasher Standard (Takara, Otsu, Shiga, Ιαπωνία) και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε. Μετά τον υβριδισμό και τη σάρωση, πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση με Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies). Η έκφραση του γονιδίου συγκρίθηκε και εξετάστηκε. Τα γονίδια των οποίων η έκφραση κυμαίνεται μεταξύ των στελεχών εξήχθησαν με ουδό μεγαλύτερο από 2-πλάσιο ή μικρότερο από 0.5-πλάσιο.

Ανίχνευση παραλλαγής υποψήφιων γονιδίων σε κύτταρα TCMK-1

Σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού (TCMK{{0}}) από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) διεγέρθηκαν με 0,5 μmol/l δεξαμεθαζόνης όπως περιγράφεται

προηγουμένως. 18 Το μέσο άλλαξε σε Dulbecco's Modified Eagle Medium χωρίς ορό. Ολικό RNA εκχυλιζόταν κάθε 4 ώρες μετά τη διέγερση με δεξαμεθαζόνη και η αφθονία των mRNA Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat και Tef ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο. Στο ίδιο βήμα, πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο σε RNA γλυκεραλδεΰδης {{14}φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) και χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Οι χρησιμοποιούμενοι εκκινητές παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1 online. Η περιοδικότητα της διακύμανσης του mRNA μετά από διέγερση με δεξαμεθαζόνη των κυττάρων TCMK{17}} αναλύθηκε με ανάλυση παλινδρόμησης πολλαπλών μεταβλητών που προσδιόρισε την καμπύλη πλέγματος (MESS), το πλάτος (AMP), τη φάση (TZ1) βελτιστοποιώντας την καμπύλη συνημιτόνου χρησιμοποιώντας την Μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων Εκτιμήσεις MESS, AMP και TZ1. Τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95 τοις εκατό υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της απλής σύμπτωσης.

Ανοσοφθορίζουσα χρώση κυττάρων TCMK-1Τα κύτταρα TCMK-1 σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη. Μετά από πλύση με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά, τα κύτταρα επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ΡΡΑΤ κουνελιού

(Sigma-Aldrich) αραιώθηκε 250 φορές και το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-FXR1 κουνελιού (Abcam, Cambridge, UK) αραιώθηκε 300 φορές σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μια αραίωση 1,000-του Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG (Invitrogen), ως δευτερεύοντος αντισώματος, έγινε για να αντιδράσει στο σκοτάδι για 1 ώρα.

Ανοσοχρώση στα νεφρά από αρουραίους WKY και SHRονεφρώνμυελός τουνεφρόαπό 5-αρουραίους WKY/ Izm εβδομάδων και SHR/Izm απομονώθηκε και ενσωματώθηκε σε παραφίνη και επωάστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-PPAT κουνελιού αραιωμένο 250 φορές και μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-FXR1 κουνελιού αραιωμένο 200 φορές. Το Histofine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI) (Nichirei Biosciences, Τόκιο, Ιαπωνία) εφαρμόστηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. Οι φέτες αφυδατώθηκαν, καθαρίστηκαν, σφραγίστηκαν με μαρινόλη και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο.

Western blotting για πρωτεΐνες FXR1 και PPAT στους νεφρούς από αρουραίους WKY και SHRονεφρώνο μυελός υποβλήθηκε σε εκχύλιση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό προσδιορισμού ραδιο-ανοσοκαθίζησης (Nacalai Tesque, Kyoto, Ιαπωνία). Οι φέτες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου με iblot (Invitrogen) και μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό διάλυμα αποβουτυρωμένου γάλακτος για 1 ώρα. Εφαρμόστηκαν τα πρωτεύοντα αντισώματα, τα οποία ήταν το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-FXR1 και το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά του PPAT. Ως δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε συζευγμένη με υπεροξειδάση χρένος IgG κατσίκας αντικουνελιού (Jackson ImmuneReseach, West Grove, ΡΑ). Το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικά πρότυπα.

Στατιστικές αναλύσειςΟι τιμές αναφέρθηκαν ως η μέση τιμή ± SE. Το Student's t-test χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση μη ζευγαρωμένων δεδομένων. Χρησιμοποιήθηκε επίσης μια ανάλυση διακύμανσης 2-τρόπου με τη διαδικασία Bonferroni/Dunn ως μετα-τεστ. τιμές P του<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistical="">

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Πίεση αίματοςΗ συστολική αρτηριακή πίεση {{0}}αρουραίων WKY/Izm εβδομάδων, αρουραίων SHR/Izm και SHRSP/Izm αρουραίων ήταν 116 ± 3,0 (n=6), 121 ± 3,3 (n=6), και 125 ± 3,4 (n=5) mm Hg, αντίστοιχα. Η συστολική αρτηριακή πίεση δεν διέφερε μεταξύ των 3 στελεχών σε στατιστικά σημαντικό βαθμό.

Αναζήτηση γονιδίων με E-box στον προαγωγέα με ανάλυση GSEAΑναζητήσαμε γονίδια που φέρουν την αλληλουχία δέσμευσης E-box (CACGTG) του CLOCK και του ετεροδιμερούς BMAL1 σε ολόκληρο το γονιδίωμα. Ως αποτέλεσμα, εντοπίστηκαν 1.032 γονίδια που φέρουν ένα E-box μεταξύ 2,000 bp ανάντη ή κατάντη από το σημείο έναρξης της μεταγραφής (Συμπληρωματικός Πίνακας S2 online).

Σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης στο νεφρό από αρουραίους WKY, SHR και SHRSP με ανάλυση μικροσυστοιχίας DNAΣυγκρίναμε τη γονιδιακή έκφραση σενεφράαπό 5-αρουραίους WKY/Izm εβδομάδων και αρουραίους SHR/Izm που χρησιμοποιούν μικροσυστοιχίες DNA. Τριακόσια εξήντα τρία γονίδια εκφράστηκαν σε μεγάλο βαθμό (περισσότερο από 2-φορές) στονεφρώνφλοιός αρουραίων SHR/Izm σε σύγκριση με αρουραίους WKY/Izm. Τα επίπεδα έκφρασης 281 γονιδίων στονεφρόήταν περισσότερα από 0.5-πλάσια σε σύγκριση με τους αρουραίους WKY/Izm. Στονεφρώνμυελός αρουραίων SHR/Izm, 284 γονίδια έδειξαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης και 203 γονίδια

παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με τους αρουραίους WKY/Izm. Στονεφρώνστον φλοιό των αρουραίων SHRSP/Izm, τα επίπεδα έκφρασης 267 γονιδίων ήταν πάνω από 2-πλάσια σε σύγκριση με εκείνα σε αρουραίους WKY/Izm. Τα επίπεδα έκφρασης 580 γονιδίων ήταν μικρότερα από 0,5-πλάσια σε σύγκριση με αρουραίους WKY/Izm. Στονεφρώνμυελός του SHRSP/Izm, 639 γονίδια έδειξαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης και 251 γονίδια έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με αρουραίους WKY/Izm. Μεταξύ 1.032 γονιδίων με E-box, το επίπεδο έκφρασης των mRNA 17 γονιδίων ήταν πάνω από 2-πλάσιο στονεφρώνφλοιός αρουραίων SHR/Izm σε σύγκριση με

Εικόνα 2. Η παραλλαγή έκφρασης των υποψηφίων γονιδίων mRNAs σε κύτταρα TCMK-1 μετά από διέγερση με δεξαμεθαζόνη. Τα κύτταρα TCMK-1 διεγέρθηκαν με 0,5 μmol/l δεξαμεθαζόνης για 2 ώρες. Το συνολικό RNA εκχυλιζόταν κάθε 4 ώρες μετά τη διέγερση με δεξαμεθαζόνη και η αφθονία των mRNA Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat και Tef αξιολογήθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο. Η σχετική γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε με σύγκριση με το GAPDH mRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM (n=6).

Αρουραίοι WKY/Izm. Μεταξύ αυτών των 17 γονιδίων, η έκφραση 4 γονιδίων (Bcl6, Nr1d1, Ppat και Tef) αυξήθηκε περισσότερο από 2- φορές στονεφρώνφλοιός αρουραίων SHRSP/Izm σε σύγκριση με αρουραίους WKY/Izm (Πίνακας 1). Στονεφρώνφλοιός αρουραίων SHR/Izm, ανιχνεύθηκε έκφραση mRNA 10 γονιδίων, τα οποία μειώθηκαν λιγότερο από 0.5- φορές σε σύγκριση με αρουραίους WKY/Izm. 8 από αυτά τα γονίδια (Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1,

Τα Plbd1, Tbl1x και Trim46) μειώθηκαν επίσης ως λιγότερο από 0.5-πλάσιο στονεφρώνφλοιός αρουραίων SHRSP/Izm (Πίνακας 1). Η έκφραση mRNA 10 γονιδίων στονεφρώνο μυελός από αρουραίους SHR/Izm αυξήθηκε περισσότερο από 2-πλάσιος σε σύγκριση με τους αρουραίους WKY/Izm. Μεταξύ αυτών των 10 γονιδίων, η έκφραση mRNA Nr1d1 και Tef στονεφρώνο μυελός από αρουραίους SHRSP/Izm αυξήθηκε περισσότερο από 2- φορές σε σύγκριση με αρουραίους WKY/Izm (Πίνακας 1). Η έκφραση του mRNA του υποδοχέα τρανσφερρίνης (Tfrc) στονεφρώνο μυελός των αρουραίων SHR/Izm εμφανίστηκε λιγότερο από 0.5-πλάσιος σε σύγκριση με τους αρουραίους WKY/Izm. Ωστόσο, η έκφραση Tfrc mRNA αυξήθηκε στονεφρώνμυελός αρουραίων SHRSP/Izm (Πίνακας 1).

Επαγωγή mRNA γονιδίων ρολογιού σε νεφροσωληναριακά κύτταραΤο σχήμα 1 δείχνει τη διακύμανση στην έκφραση των Per1, Bmal1, Nr1d1 και Cry1 mRNAs μετά την προσθήκη δεξαμεθαζόνης σε κύτταρα TCMK-1. Τα πλάτη της έκφρασης mRNA Per1, Bmal1 και Nr1d1 έδειξαν κορυφές στις 28 και 44 ώρες μετά από 4 ώρες διέγερσης με δεξαμεθαζόνη. Το πλάτος της έκφρασης του Cry1 mRNA έδειξε κορυφές στις 4, 28 και 44 ώρες μετά από 4 ώρες διέγερσης με δεξαμεθαζόνη. Έτσι, η διέγερση με δεξαμεθαζόνη προκάλεσε τη διακύμανση της έκφρασης mRNA του γονιδίου ρολογιού στο TCMK-1 (Εικόνες 1 και 2).

διέγερση με δεξαμεθαζόνη. Η έκφραση mRNA του Ppat κορυφώθηκε στις 28 ώρες μετά τη διέγερση με δεξαμεθαζόνη και στη συνέχεια αυξήθηκε ξανά στις 44 ώρες. Το Hnrnpa3 έδειξε κορυφές στις 16, 28 και 44 ώρες και έδειξε πλάτη σχετικά παρόμοια με το Per1. Το Npm1 έδειξε μια κορυφή στις 28 ώρες, παρόμοια με το Per1. Το Fxr1 έδειξε μια κορυφή στις 24 και 44 ώρες (Εικόνα 2). Πραγματοποιήσαμε μια περιοδική ανάλυση παλινδρόμησης για να αξιολογήσουμε τη στατιστική σημασία αυτών των διακυμάνσεων. Η ανάλυση έδειξε ότι η διακύμανση της έκφρασης mRNA Cry1 και Bmal1 έδειξε σημαντική (P < 0.05)="" περιοδικότητα="" μετά="" τη="" φόρτωση="" δεξαμεθαζόνης="" σε="" κύτταρα="" tcmk-1="" (συμπληρωματικό="" σχήμα="" s1="" και="" πίνακας="" s3).="" σε="" σύνδεση).="" τα="" αποτελέσματα="" της="" περιοδικής="" ανάλυσης="" παλινδρόμησης="" 7="" γονιδίων="" φαίνονται="" στο="" συμπληρωματικό="" σχήμα="" s2="" και="" στον="" πίνακα="" s3="" online.="" η="" ανάλυση="" έδειξε="" ότι="" τα="" fxr1="" και="" ppat="" έδειξαν="" σημαντική="" (p=""><0,05) παλινδρόμηση.="" στην="" παλινδρόμηση="" του="" fxr1,="" τόσο="" η="" περίοδος="" όσο="" και="" το="" πλάτος="" έδειξαν="" μεγάλα="" κύματα,="" ενώ="" στο="" ppat,="" τόσο="" η="" περίοδος="" όσο="" και="" το="" πλάτος="" ήταν="" μικρά="" και="" έδειχναν="" υπερδιαφανή="">

Ανοσοχρώση PPAT και FXR1 σε νεφροσωληνοειδή κύτταρα και σε νεφρούς από αρουραίους WKY και SHRΤο PPAT εντοπίστηκε τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα. Το FXR1 εντοπίστηκε μόνο στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων TCMK-1 (Εικόνα 3). Το PPAT χρωματίστηκε τόσο στους πυρήνες όσο και στο κυτταρόπλασμα στα εγγύς και άπω σωληνάρια (Εικόνα 4). Το FXR1 χρωματίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα των εγγύς και περιφερικών σωληναρίων (Εικόνα 4). Δεν υπήρχαν εμφανείς διαφορές στη χρώση ή τον εντοπισμό στους νεφρούς των αρουραίων WKY και SHR.

Η έκφραση πρωτεΐνης FXR1 και PPAT σε νεφρούς από αρουραίους WKY και SHRΤο Σχήμα 5 δείχνει την western blotting των πρωτεϊνών FXR1 και PPAT στονεφρώνμυελός από 5-αρουραίους WKY και SHR εβδομάδων. Η αφθονία της πρωτεΐνης FXR1 ήταν στονεφρώνο μυελός των αρουραίων SHR ήταν σημαντικά χαμηλότερος σε σύγκριση με τους αρουραίους WKY (P < 0.05).="" η="" έκφραση="" της="" πρωτεΐνης="" ppat="">νεφρώνο μυελός των αρουραίων WKY και SHR δεν διέφερε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό.

ΣΥΖΗΤΗΣΗΗ υπέρταση προκαλεί καρδιαγγειακά καινεφρώνεπιπλοκές, όπως χρόνιεςΝεφρική Νόσος(ΧΝΝ). Οι ασθενείς με ΧΝΝ είναι γνωστό ότι αναπτύσσουν ανωμαλίες διακύμανσης της αρτηριακής πίεσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι ηνεφρόμπορεί να εμπλέκεται στους μη φυσιολογικούς κιρκάδιους ρυθμούς της αρτηριακής πίεσης στην υπέρταση. 19 Στην παρούσα μελέτη, λοιπόν, στοχεύσαμε να εντοπίσουμε μόρια υπεύθυνα για τον σχηματισμό του κιρκάδιου ρυθμού της αρτηριακής πίεσης υπό τον έλεγχο του βιολογικού ρολογιού τουνεφρόστην υπέρταση. Λάβαμε 1,032 υποψήφια γονίδια που φέρουν την αλληλουχία E-box από τη βάση δεδομένων GSEA. Επειδή το ετεροδιμερές BMAL1/CLOCK δεσμεύει το E-box για να ρυθμίσει τη μεταγραφή γονιδίων προς τα κάτω, αυτά τα γονίδια θεωρούνται ότι ελέγχονται από ένα βιολογικό κιρκάδιο ρολόι. Προκειμένου να ταυτοποιηθούν τα μόρια που εμπλέκονται στον κιρκάδιο ρυθμό της αρτηριακής πίεσης στο νεφρό, διερευνήσαμε διεξοδικά τη γονιδιακή έκφραση σε νεφρούς από αρουραίους SHR, SHRSP και WKY χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία DNA. Μεταξύ των 1.032 γονιδίων, επιλέξαμε μεταγραφές που αυξήθηκαν περισσότερο από 2- φορές ή μειώθηκαν λιγότερο από 0.5-φορές.

στο SHRνεφρόσε σχέση με εκείνα των αρουραίων WKY. Στη συνέχεια επικεντρωθήκαμε στα γονίδια που έδειξαν παρόμοιες τάσεις στονεφράτου SHRSP, συγκεκριμένα, Bcl6, Nr1d1, Ppat, Tef, Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1, Plbd1, Tbl1x και Trim46. Αυτά τα 12 γονίδια που φέρουν την αλληλουχία E-box, τα οποία έδειξαν υψηλότερα ή χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης και στους δύο υπερτασικούς αρουραίους μοντέλου (SHR και SHRSP) σε σύγκριση με τους αρουραίους WKY με φυσιολογική πίεση, συνδέονται πιθανώς με τον κιρκάδιο ρυθμό της αρτηριακής πίεσης. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, το Nr1d1 που ονομάζεται επίσης ιός της αντίστροφης ερυθροβλάστωσης (Rev-erb), έχει αναφερθεί ότι σχηματίζει έναν υποβρόχο του βιολογικού ρολογιού. 20

Έχει επιβεβαιωθεί ότι η υποβολή καλλιεργημένων κυττάρων σε φόρτιση δεξαμεθαζόνης ή σοκ ορού αλόγου υψηλής συγκέντρωσης αναπαρήγαγε το εύρος της έκφρασης του γονιδίου ρολογιού in vitro. 21,22 Η προσθήκη ορού υψηλής συγκέντρωσης και γλυκοκορτικοειδούς θεωρείται χρήσιμη για την αναπαραγωγή του κιρκάδιου ρυθμού της έκφρασης του γονιδίου ρολογιού στους περιφερικούς ιστούς. 18,23 Σε αυτή τη μελέτη, καταφέραμε να επάγουμε το πλάτος των γονιδίων ρολογιού mRNA Per1, Cry1 και Nr1d1 in vivo με φόρτωση δεξαμεθαζόνης σε σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού. Με τη φόρτωση δεξαμεθαζόνης, το Per1 αυξήθηκε στις 4, 20–24 και 44 ώρες μετά τη διέγερση, το Cry1 αυξήθηκε στις 0–8 και 24–32 ώρες και το Nr1 d1 αυξήθηκε σε 0– 4, 16–24 και 40–44 ώρες. Αυτές οι αλλαγές είναι παρόμοιες με αυτές που περιγράφονται σε προηγούμενες αναφορές. 21 Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα δεξαμεθαζόνης, εντοπίσαμε την επαγωγή πλάτους 2 γονιδίων: Fxr1 και Ppat. Επιπλέον, η ανοσοχρώση έδειξε ότι το PPAT εκφράστηκε στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα των σωληναρίων και το FXR1 εκφράστηκε στο κυτταρόπλασμα των σωληναρίων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αυτά τα 2 μόρια ελέγχονται από τονεφρώνπεριφερικό ρολόι και είναι πιθανοί υποψήφιοι για σχηματισμό κιρκάδιου ρυθμού της αρτηριακής πίεσης.

Το Western blotting αποκάλυψε ότι η έκφραση πρωτεΐνης του FXR1 ήταν χαμηλότερη στονεφρώνμυελό των αρουραίων SHR σε σχέση με εκείνο των αρουραίων WKY. Η έκφραση του PPAT στον νεφρικό μυελό των αρουραίων WKY και του SHR δεν διέφερε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Το Fxr1 ανήκει στην ίδια οικογένεια γονιδίων με το εύθραυστο X νοητική υστέρηση γονίδιο 1 (Fmr1), το οποίο θεωρείται το αιτιολογικό γονίδιο του συνδρόμου εύθραυστου Χ. Η FXR1 είναι μια πρωτεΐνη δέσμευσης RNA που αλληλεπιδρά με τα FMR1 και FXR2. Υποτίθεται ότι το κυτταρόπλασμα και ο πυρήνας μπορούν να αλληλοεπιδρούν επειδή έχουν σήματα πυρηνικού εντοπισμού και σήματα πυρηνικής εξαγωγής. 24 Στους ανθρώπους, η ανώμαλη έκφραση του Fxr1 στους σκελετικούς μύες έχει αποδειχτεί ότι προκαλεί μυϊκή δυστροφία της πρόσοψης και του βραχιονίου. 25 Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση Fxr1 μειώθηκε στονεφράτων αρουραίων SHR και SHRSP και εκφράστηκε σε σωληναριακό κυτταρόπλασμα μεσοδερμικής προέλευσης, το οποίο είναι ίδιο με αυτό των σκελετικών μυών και μπορεί να εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των σωληναριακών κυττάρων. Το PPAT σχηματίζει ένα ομοτετραμερές σε σχήμα ντόνατς και γίνεται αδρανοποιημένο ομοτετραμερές δεσμεύοντας νουκλεοτίδια πουρίνης για να επηρεάσει το μεταβολισμό του ουρικού οξέος. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση του PPAT αυξήθηκε στονεφράτων αρουραίων SHR και SHRSP και το PPAT εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των σωληναριακών κυττάρων. Επειδή το ουρικό οξύ έχει ισχυρή αγγειακή τοξικότητα και αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για αρτηριοσκλήρωση. Έτσι, η ανώμαλη λειτουργία PPAT μπορεί να σχετίζεται με τα παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά του SHR.

Αυτή η μελέτη εφάρμοσε αναλύσεις αλληλουχίας και έκφρασης και πειράματα καλλιεργημένων κυττάρων σε μια νέα προσπάθεια να περιορίσει τα μόρια που σχετίζονται με τη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης και τα οποία ελέγχονται από το βιολογικό ρολόι. Επιπλέον, τα Fxr1 και Ppat ελέγχονται από το βιολογικό ρολόι και σχετίζονται με τη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τη μέτρηση και την επιβεβαίωση της χρονικής διακύμανσης της έκφρασης των γονιδίων Fxr1 και Ppat στον αρουραίονεφρό.Αναμένεται ότι θα διευκρινιστούν οι μηχανισμοί δράσης αυτών των μορίων. Ο έλεγχος αυτών των μορίων θεωρείται στόχος για τη βιολογική αντιμετώπιση των ανωμαλιών της διακύμανσης της αρτηριακής πίεσης.

Με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, ένας πιθανός κιρκαδικός βρόχος ανάδρασης στονεφρόαπό το SHR φαίνεται στο Σχήμα 6. Τα PPAT και FXR1 έχουν ένα EBOX στο οποίο το BMAL1 και το CLOCK συνδέονται με τον προαγωγέα, υποδηλώνοντας ότι εμπλέκονται στο σχηματισμό του κιρκάδιου ρυθμού σε σωληνάρια υπό τον έλεγχο γονιδίων ρολογιού. Θεωρείται ότι εμπλέκονται στην επαναρρόφηση και απέκκριση νερού και ηλεκτρολυτών στα σωληνάρια και ότι μπορεί να επηρεάσουν την υπέρταση και τον κιρκάδιο ρυθμό της αρτηριακής πίεσης.

Έτσι, τα PPAT και FXR1 θεωρήθηκαν μόρια που εμπλέκονται στο σχηματισμό του κιρκάδιου ρυθμού της αρτηριακής πίεσης στονεφρό. Όσον αφορά τους μηχανισμούς ρύθμισης της αρτηριακής πίεσης, αυτά τα μόρια είναι κορυφαίοι υποψήφιοι για μελέτες που επιδιώκουν να αποσαφηνίσουν τους μηχανισμούς που διέπουν το σχηματισμό του κιρκάδιου ρυθμού της αρτηριακής πίεσης.