Πώς το Apelin-13 ανακουφίζει αποτελεσματικά τη διαβητική νεφροπάθεια;

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Το Apelin-13 ανακουφίζει τη διαβητική νεφροπάθεια ενισχύοντας την παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου και καταστέλλοντας την ίνωση του νεφρικού ιστού

ZHUO GAO, XIN ZHONG, YING-XIA TAN & DONG LIU

Αφηρημένη

Ο διαβήτης είναι μια σοβαρή μεταβολική ασθένεια και η νεφρική βλάβη που προκαλείται από τον διαβήτη επηρεάζει επίσης σοβαρά την επιβίωση των ασθενών. Η απελίνη είναι ένα μόριο που παίζει καθοριστικό ρόλο στον μεταβολισμό των λιπιδίων και πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότιapelin-13, ένας υποτύπος της απελίνης, παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα. Ωστόσο, ο ρόλος τουapelin-13σεδιαβητική νεφροπάθειαπαραμένει ασαφές. Στην παρούσα μελέτη, ένα μοντέλο αρουραίου τουδιαβητικόςνεφροπάθειακατασκευάστηκε με την ένεση στρεπτοζοκίνης (STZ). Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, έγινε ένεση σε αυτούς τους αρουραίουςapelin-13. Τα επίπεδα γλυκόζης αίματος, πρωτεΐνης ούρων και ινσουλίνης προσδιορίζονταν εβδομαδιαία. Στη συνέχεια, η έκφραση της πρωτεΐνης που σχετίζεται με τον υποδοχέα τύπου 1 της περιοχής αγγειοτενσίνης (APJ), της συνθάσης του ενδοθηλιακού μονοξειδίου του αζώτου (eNOS), της Ε-καντερίνης και της ακτίνης α-λείου μυός (a-SMA) στους ιστούς των νεφρών προσδιορίστηκε με western blotting. Στη συνέχεια, τα ενδοθηλιακά κύτταρα των σπειραματικών αγγείων καλλιεργήθηκαν με μέσο υψηλής γλυκόζης. Αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή μεapelin-13για 24 ώρες. Τέλος, η κυτταρική βιωσιμότητα αυτών των κυττάρων και η έκφραση των APJ, eNOS.E-καντερίνης και -SMA σε αυτά τα κύτταρα προσδιορίστηκαν με στύπωμα western. Ως αποτέλεσμα, η θεραπεία τουapelin-13προκάλεσε χαμηλότερα επίπεδα γλυκόζης αίματος και πρωτεΐνης ούρων. Επιπλέον, η εφαρμογή τουapelin-13προώθησε την παραγωγή ινσουλίνης και μείωσε την αντίσταση στην ινσουλίνη. Θεραπεία μεapelin-13προώθησε την έκφραση του APJ, του eNOS και της Ε-καντερίνης ενώ κατέστειλε την έκφραση του -SMA στους ιστούς των νεφρών των αρουραίων και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των σπειραματικών αγγείων. Επιπλέον, η εφαρμογή τουapelin-13προώθησε επίσης τη βιωσιμότητα των κυττάρων αυτών των κυττάρων. Συμπερασματικά,apelin-13ανακουφισμένοςδιαβητικόςνεφροπάθειαμε την προώθηση της παραγωγής μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) και την ανακούφιση της ίνωσης των ιστών των νεφρών.

Εισαγωγή

Ο διαβήτης είναι μια μεταβολική νόσος και η διαταραχή του μεταβολισμού της γλυκόζης είναι η κύρια κλινική εκδήλωση(1). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι, λόγω της δημοτικότητας των δίαιτων με υψηλή περιεκτικότητα σε ζάχαρη και λιπαρά και του καθιστικού τρόπου ζωής των ατόμων, η συχνότητα του διαβήτη αναμένεται να συνεχίσει να αυξάνεται τα επόμενα χρόνια (2.,3). Η εμφάνιση διαβήτη συχνά συνοδεύεται από βλάβη σε πολλά όργανα και οι ασθενείς με μακροχρόνιο διαβήτη συχνά διαγιγνώσκονται με σοβαρή νεφρική ανεπάρκεια (4,5). Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι το 30 τοις εκατό των ασθενών με διαβήτη τύπου 1 και το 25 τοις εκατό των ασθενών με διαβήτη τύπου 2 ανέπτυξανδιαβητικόςνεφροπάθεια(6). Επιπλέον, η εμφάνιση και ανάπτυξη τουδιαβητικόςνεφροπάθειαοδήγησε σε αύξηση της θνησιμότητας των ασθενών με διαβήτη.Διαβητικόςνεφροπάθεια-η επαγόμενη νεφρική βλάβη των ποδοκυττάρων και των τριχοειδών είναι ο κύριος παράγοντας που επηρεάζει την επιβίωση των ασθενών(7). Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη μιας θεραπείας γιαδιαβητικόςνεφροπάθειαείναι ζωτικής σημασίας για τη βελτίωση του ποσοστού επιβίωσης των ασθενών με διαβήτη.

Η απελίνη βρίσκεται στη χρωμοσωμική περιοχή Xq25-26.1 και κωδικοποιείται από το γονίδιο APLN (8) και είναι ο ενδογενής συνδετήρας της πρωτεΐνης που σχετίζεται με τον υποδοχέα της περιοχής αγγειοτενσίνης τύπου 1 του υποδοχέα G (APJ), η οποία είναι συνήθως εκκρίνεται και παράγεται από λευκό λιπώδη ιστό (9). Το Apelin και ο υποδοχέας του APJ εκφράζονται ευρέως σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών κυττάρων της παρεγκεφαλίδας, της καρδιάς και των αιμοφόρων αγγείων, ειδικά στο καρδιαγγειακό σύστημα(10). Η απελίνη αναγνωρίστηκε ως αδιποκίνη που σχετίζεται με το μεταβολισμό των λιπιδίων σε μια πρόσφατη μελέτη(11). Ωστόσο, μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η απελίνη παίζει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της ενεργειακής ομοιόστασης του σώματος, του μεταβολισμού της γλυκόζης και του νερού καθώς και σε άλλες βιολογικές λειτουργίες(12). Η έκφραση της απελίνης έχει αποκαλυφθεί στο παρελθόν ότι βελτιώνει την αντίσταση στην ινσουλίνη, την αθηροσκλήρωση και την επαγόμενη από τον διαβήτη αγγειακή βλάβη (13). Ωστόσο, μια διαφορετική μελέτη αποκάλυψε ότι η έκφραση της απελίνης προκάλεσε την εμφάνιση και την ανάπτυξη διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας(14). Επομένως, ο ρόλος της απελίνης στην εμφάνιση και ανάπτυξη επιπλοκών που σχετίζονται με τον διαβήτη παραμένει ασαφής.

Επιπλέον, η απελίνη υπάρχει ως διαφορετικοί υποτύποι (απελίν-36, απελίνη-17 καιapelin-13)στο σώμα μέσω της διάτμησης του ενδοπλασματικού δικτύου. Αποκαλύφθηκε ότι όσο μικρότερη είναι η πεπτιδική αλυσίδα της απελίνης, τόσο ισχυρότερη είναι η βιολογική της δραστηριότητα(15). Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η απελίνη βελτίωσε την ευαισθησία στην ινσουλίνη και προκάλεσε χαμηλότερα επίπεδα σακχάρου στο αίμα μειώνοντας τη χρόνια φλεγμονή σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2, ενισχύοντας έτσι τον μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπιδίων (16). Ωστόσο, η επίδραση της απελίνης στηνδιαβητικόςνεφροπάθειαείναι επί του παρόντος αμφιλεγόμενη. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι τα επίπεδα της απελίνης/APJ στον ορό ασθενών μεδιαβητικόςνεφροπάθειαείναι ανυψωμένα, προάγοντας την εμφάνιση και την ανάπτυξη τωνδιαβητικόςνεφροπάθεια(17). Από την άλλη, μια διαφορετική μελέτη το αποκάλυψεapelin-13θα μπορούσε να αναστείλει τις μορφολογικές αλλαγές των νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων στο περιβάλλον υψηλής γλυκόζης, αναστέλλοντας έτσι την εμφάνιση και την ανάπτυξη της διαδικασίας επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) στα σπειραματικά κύτταρα και τελικά καθυστερώντας την εμφάνισηδιαβητικόςνεφροπάθεια(18). Επομένως, η επίδραση της απελίνης στις νεφρικές επιπλοκές που προκαλούνται από διαβήτη παραμένει ασαφής.

Στην παρούσα μελέτη, ο ρόλος τωνapelin-13στη διαδικασία τουδιαβητικόςνεφροπάθειαδιερευνήθηκε περαιτέρω με την κατασκευή ενός μοντέλου αρουραίου τουδιαβητικόςνεφροπάθεια.

Cistancheσωληνοειδήςπρολαμβάνεινεφρόνόσος, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Υλικά και μέθοδοι

Δοκιμασίες σε ζώα. Συνολικά 30 αρσενικοί αρουραίοι Sprague Dawley (ηλικίας 6-8εβδομάδων;200-230g) ελήφθησαν από το Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.Ltd. και στεγάζεται σε ένα δωμάτιο ελεγχόμενης θερμοκρασίας (25 βαθμοί ) και συγκεκριμένο παθογόνο δωμάτιο με σταθερή υγρασία (40-50 τοις εκατό ) σε 12-h κύκλο φωτός/σκότους και λαμβάνει τροφή και νερό κατά βούληση για 1 εβδομάδα . Αυτοί οι αρουραίοι στη συνέχεια χωρίστηκαν εξίσου σε έξι ομάδες (Control, Model, Ap-E40, Ap-E400, Ap-L40 και Ap-L400). Οι αρουραίοι στην ομάδα ελέγχου δεν έλαβαν καμία θεραπεία. Οι αρουραίοι των άλλων ομάδων τράφηκαν με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε ζάχαρη και λιπαρά (Thermo Fisher Scientific, Inc.) και έλαβαν ενδοφλέβια ένεση στρεπτοζοκίνης (STZ, 40 mg/kg, αρ. προϊόντος S0130, Merck KGaA) κάθε εβδομάδα. Μετά από 3 εβδομάδες, οι αρουραίοι Ap-E40 και Ap-E400 υποβλήθηκαν σε θεραπεία μεapelin-13(40 και 400 pmol/kg, αντίστοιχα, προϊόν αρ. Α6469, Merck KGaA). Συνολικά 6 εβδομάδες μετά την ένεση STZ, οι αρουραίοι των ομάδων Ap-L40 και Ap-L400 υποβλήθηκαν σε θεραπεία μεapelin-13(40 και 400 pmol/kg, αντίστοιχα). Μετά από οκτώ ενέσεις STZ, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία με πεντοβαρβιτάλη νατρίου (160 mg/kg, ip). Μετά την ευθανασία, συλλέχθηκαν ο ορός και τα όργανα. Το βάρος των αρουραίων ανιχνεύτηκε με χρήση ηλεκτρονικών ζυγαριών κάθε εβδομάδα, από 1 εβδομάδα πριν από την ένεση STZ και μέχρι την ευθανασία. Τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα ανιχνεύονταν κάθε εβδομάδα χρησιμοποιώντας μετρητή γλυκόζης αίματος (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Τα επίπεδα πρωτεΐνης στα ούρα ανιχνεύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας BCA (αρ. κατ. P0012S; Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας Beyotime) κάθε εβδομάδα. Η ινσουλίνη ορού νηστείας ανιχνεύτηκε επίσης κάθε εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα κιτ του εμπορίου (αρ. κατ.RAB0904; Merck KGaA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο δείκτης αντίστασης στην ινσουλίνη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: (Επίπεδα ινσουλίνης στο αίμα x επίπεδα γλυκόζης αίματος)/22,5. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων 8η έκδοση(19) και εγκρίθηκαν (αρ. έγκρισης2020-79-PJO1) από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Ιατρικού Κέντρου της Πολεμικής Αεροπορίας (Πεκίνο, Κίνα) .

Ανίχνευση αζώτου ουρίας αίματος (BUN) και κρεατινίνης ορού (Ser). Τα επίπεδα BUN (αρ. κατ. ml076479) και Scr (αρ. κατ. ml059158) στο αίμα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd.) μετά από 3 και 8 εβδομάδες ένεσης STZ, αντίστοιχα . Όλα τα στάδια αυτής της δοκιμασίας πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανίχνευση μονοξειδίου του αζώτου (NO), αγγειοτενσίνης II (Ang Il) και ενδοθηλίνης-1(ET-1). Τα επίπεδα NO, Ang II και ET-1 στον ορό και στους νεφριδικούς ιστούς ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ NO (αρ. κατ. S0021; Beyotime Institute of Biotechnology), κιτ Ang II (αρ. προϊόντος RAB0010, Merck KGaA ), και κιτ ET-1 (αρ. κατ. E-EL-R1458c; Elabscience Biotechnology, Inc.). Όλα τα βήματα των αναλύσεων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H&E). Μετά την ευθανασία, οι ιστοί των νεφρών συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με προψυγμένο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS). Ο νεφρός στη συνέχεια διαχωρίστηκε και σταθεροποιήθηκε με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ενσωματωμένοι σε παραφίνη ιστοί νεφρού κόπηκαν σε τμήματα 5-um. Στη συνέχεια, αυτά τα τμήματα αφυδατώθηκαν σε διάλυμα αιθανόλης 70 και 90 τοις εκατό για 10 λεπτά το καθένα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε χρώση H&E σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά για την ανίχνευση παθολογικών αλλαγών. Όλα τα στάδια αυτής της δοκιμασίας πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του κιτ χρώσης Η&Ε (αρ. κατ. C0105S; Beyotime Institute of Biotechnology).

Ανοσοϊστοχημεία. Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας την τυπική μέθοδο υπεροξειδάσης/DAB και αντιχρώση αιματοξυλίνης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αφού μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA; Beyotime Institute of Biotechnology) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, οι τομές επωάστηκαν με πρωτεύον αντίσωμα anti-APJ (κατ. αρ. ΡΑ5-114830· Thermo Fisher Scientific, Inc. . κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς .Μετά από πλύση PBS, οι τομές επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού (κωδικός προϊόντος ab6721;1:1,000; Abcam) στους 4C για 50 λεπτά, ακολουθούμενο από το Πλύσιμο PBS Στη συνέχεια, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάλυμα DAB και αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Τελικά, οι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός (Olympus Corporation).

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία. Μια ανθρώπινη νεφρική σπειραματική μικροαγγειακή ενδοθηλιακή κυτταρική σειρά (hRGEC) ελήφθη από το BioVector NTCC, Inc. και καλλιεργήθηκε σε μέσο RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific, Inc., συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) σε υγροποιημένο αέρα στους 37 βαθμούς C με 5 τοις εκατό CO. Αυτά τα κύτταρα χωρίστηκαν σε ομάδες ελέγχου, μοντέλου, Ap-L(Apelin-low) και Ap-H(Apelin-high). Model, Ap-L και Ap-H Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI{12}} υψηλής γλυκόζης (25 mmol/l: Cytiva) και τα κύτταρα της ομάδας ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 με κανονική περιεκτικότητα σε γλυκόζη (5,5 mmol/l). Τα κύτταρα της ομάδας Ap-L υποβλήθηκαν σε αγωγή με χαμηλά επίπεδαapelin-13(0.1 μmol/) και τα κύτταρα Ap-Hgroup αντιμετωπίστηκαν με υψηλά επίπεδαapelin-13(1 μmol/).

Πείραμα σχηματισμού σωλήνων. Ο σχηματισμός σωλήνων σε κύτταρα hRGEC προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (προϊόν αρ. Κ905-50· AmyJet Scientific, Inc). Όλες οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός (μεγέθυνση, x4, Olympus Corporation). Όλα τα στάδια αυτής της δοκιμασίας πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Προσδιορισμός κιτ μέτρησης κυττάρων-8(CCK-8). Μετά από 24,48 και 72 ώρες επώασης στους 37 βαθμούς 0,10 ul CCK-8 το αντιδραστήριο (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) αραιώθηκε με το μέσο καλλιέργειας και προστέθηκε στις πλάκες 96-πηγαδιού. Στη συνέχεια, αυτά τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε επωαστήρα για 1 ώρα. Τελικά. Η απορρόφηση αυτών των κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Inc.) σε μήκος κύματος 450 nm.

Western blotting. Οι συνολικές πρωτεΐνες συλλέχθηκαν από νεφριδιακό ιστό και κύτταρα hRGEC χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας BCA. Στη συνέχεια, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (40 ugs) διαχωρίστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης 10 τοις εκατό δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) (Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας Beyotime) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (EMD). Millipore). το οποίο αποκλείστηκε με 5 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) (Beyotime Institute of Biotechnology) στους 37 βαθμούς για 1,5 ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα: υποδοχέας Ang II τύπου 1 (AT1R:1:1,000· κωδικός προϊόντος ab124734· Abcam), ενδοθηλιακή ΝΟ συνθάση (eNOS;1:1, 000; κωδικός προϊόντος ab5589;Abcam), APJ(1:1,000;κατ.αρ.PA5-114830; Thermo Fisher Scientific, Inc),υποδοχέας αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού (TGBR: 1:1.000;κωδικός προϊόντος ab97459; Abcam), E-cadherin (1:1,000:κωδικός προϊόντος ab212059; Abcam), -ακτίνη λείων μυών( -SMA;1:1. 000: αριθμός προϊόντος 19245; Cell Signaling Technology, Inc.) και GAPDH(1:2,500; κωδικός προϊόντος ab9485; Abcam). Μετά την αρχική επώαση αντισώματος, οι μεμβράνες πλύθηκαν με PBS-Tween-20(0,1 τοις εκατό) και επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP αντίσωμα (1:2,000· κωδικός προϊόντος ab6721· Abcam) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου(7) Τέλος, τα ανοσοαντιδραστικά σήματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι σχετικές εντάσεις των ανοσοκηλίδων μετρήθηκαν με συσκευή απεικόνισης μοριακής απεικόνισης Versa Doc MP 5000 και λογισμικό Quantity One (έκδοση 4.6) (και τα δύο από την Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Στατιστική ανάλυση. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 7.0(GraphPad Software, Inc.). Τα unpaired Student's t-test χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση δύο ομάδων. Οι συγκρίσεις μεταξύ διαφορετικών ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από το posthoc τεστ Tukey. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) και όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Π<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Αποτελέσματα

Απελίν-13μειώνει το βάρος και τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα και αυξάνει τα επίπεδα ινσουλίνης τουδιαβητικόςνεφροπάθειααρουραίους στις 8 εβδομάδων. Το βάρος και τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα των αρουραίων ανιχνεύονταν εβδομαδιαία κατά τη διαδικασία εκτροφής τους. Τα αποτελέσματα (Εικ. 1Α και Β) αποκάλυψαν ότι το βάρος και τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα των αρουραίων στις ομάδες Ap-E40 και Ap-E400 δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά την ένεσηapelin-13στις 3 εβδομάδες. Οι ίδιες παράμετροι στους αρουραίους των ομάδων Ap-L40 και Ap-L400 μειώθηκαν μετά τηνapelin-13ένεση στις 8 εβδομάδες σε σύγκριση με εκείνη στις 3 εβδομάδες. Τα επίπεδα ινσουλίνης στο αίμα μειώθηκαν επίσης μετά τηνapelin-13ένεση στις 8 εβδομάδες σε σύγκριση με εκείνη στις 3 εβδομάδες (Εικ. 1C).

Απελίν-13Η θεραπεία βελτιώνει τη νεφρική λειτουργία τουδιαβητικόςνεφροπάθειααρουραίους. Τα αυξημένα επίπεδα BUN και Scr έδειξαν την εμφάνιση και την ανάπτυξη νεφρικής βλάβης (20). Τα επίπεδα BUN και Scr αποκαλύφθηκαν υψηλότερα μετά τηνapelin-13ένεση στις 8 εβδομάδες σε σύγκριση με εκείνη στις 3 εβδομάδες (Εικ. 2Α). Ομοίως, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες ούρων και η έκταση της παθολογικής βλάβης των νεφρικών ιστών αποκάλυψαν επίσης τις ίδιες τάσεις (Εικ. 2Β και Γ).

Απελίν-13ανακουφίζειδιαβητικόςνεφροπάθειαδιαμορφώνοντας την παραγωγή NO, Angel και ET-1. Η έκφραση της APJ ανιχνεύθηκε και τα αποτελέσματα (Εικ. 3Α) αποκάλυψαν ότι η έκφραση της APJ στους νεφρικούς ιστούς των αρουραίων μειώθηκε μετά τηνapelin-13ένεση στις 8 εβδομάδες σε σύγκριση με εκείνη στις 3 εβδομάδες. ΚΑΜΙΑ παραγωγή δεν θα μπορούσε να ανακουφίσει τοδιαβητικόςνεφροπάθεια-προκαλούμενη αγγειακή βλάβη στον νεφρικό ιστό (21). Επομένως, η παραγωγή ΝΟ, Ang II και ET-1 ανιχνεύθηκε στους νεφρικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι τα επίπεδα του ΝΟ μειώθηκαν μετά την ένεση τουapelin-13στις 8 εβδομάδες σε σύγκριση με αυτό στις 3 εβδομάδες. Ωστόσο, τα επίπεδα Ang II και ET-1 έχουν αυξηθεί μετά την ένεση τουapelin-13στις 8 εβδομάδες σε σύγκριση με εκείνη στις 3 εβδομάδες (Εικ. 3Β και Γ). Στη συνέχεια, η έκφραση των eNOS και AT1R ανιχνεύθηκε με στύπωμα western. Όπως αποκαλύπτεται στο Σχήμα 4Α, η έκφραση του AT1R κατεστάλη μετά την ένεσηapelin-13στις 3 και 8 εβδομάδες σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων, αντίστοιχα. Τα επίπεδα του eNOS αυξήθηκαν μετά την ένεση τουapelin-13στις 3 και 8 εβδομάδες σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων.

Απελίν-13ανακουφίζειδιαβητικόςνεφροπάθειαρυθμίζοντας την έκφραση του ATIR, του ενδοθηλιακού νιτρικού eNOS και των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη νεφρική ίνωση στην οδό APJ. Η έκφραση του APJ αυξήθηκε και εκείνη του TGBR μειώθηκε μετά την ένεση τουapelin-13στις 3 και 8 εβδομάδες σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων. Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ίνωση, E-cadherin και -SMA, ανιχνεύθηκαν και τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η έκφραση της E-cadherin ενισχύθηκε και τα επίπεδα της a-SMA μειώθηκαν μετά την ένεσηapelin-13στις 3 και 8 εβδομάδες σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων (Εικ. 4Β).

Απελίν-13προάγει τον πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό σωλήνων και ρυθμίζει την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη νεφρική ίνωση στην οδό APJ σε βραχυπρόθεσμα νεφρικά αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που προκαλούνται από υψηλή γλυκόζη. Τα κύτταρα hRGEC καλλιεργήθηκαν στο μέσο υψηλής γλυκόζης για 24, 48 και 72 ώρες. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάλυση CCK-8για την ανίχνευση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Τα αποτελέσματα (Εικ.5Α) αποκάλυψαν ότι η θεραπεία μεapelin-13προάγει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η εφαρμογή τουapelin-13προώθησε επίσης το σχηματισμό αυλού (Εικ.5Β). Στις 24 ώρες τουapelin-13θεραπείας, αποκαλύφθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης των APJ, eNOS και Ε-καντερίνης ήταν αυξημένα και τα επίπεδα TGBR, ATIR και -SMA μειώθηκαν σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου (Εικ. 5C).

Απελίν-13καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό σωλήνων και ρυθμίζει την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη νεφρική ίνωση στην οδό APJ σε μακροχρόνια νεφρικά αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που προκαλούνται από υψηλή γλυκόζη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μέσο υψηλής γλυκόζης για 72 και 96 ώρες και παρέμβαση μεapelin-13ξεκίνησε από τις 72 h. Μετά από 24 ώρες, τα αποτελέσματα της ανάλυσης CCK-8 αποκάλυψαν ότι η εφαρμογή τουapelin-13κατέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου (Εικ. 6Α). Ο σχηματισμός αυλού ανεστάλη μετά από θεραπεία μεapelin-13(Εικ.6Β).Επιπλέον. θεραπεία μεapelin-13προώθησε επίσης την έκφραση των APJ, eNOS και E-cadherin σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων. Η εφαρμογή τουapelin-13κατέστειλε επίσης την έκφραση των TGBR, AT1R και a-SMA (Εικ. 6C) σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Εικόνα 1. Το Apelin-13 ανακουφίζει από την αντίσταση στην ινσουλίνη των αρουραίων.(Α) Το βάρος των ποντικών ανιχνεύτηκε εβδομαδιαία. (Β) Τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα ανιχνεύονταν εβδομαδιαία. "Π-<0.001 vs.the="" control="" group.=""><><0.01 and=""><0.001 vs.the="" model="" group.(c)levels="" of="" insulin="" were=""><0.05,"p-0.01><0.001 vs.the="" after="" intervention="" 3w="">

Εικόνα 2. Η θεραπεία με απελίνη-13 ανακουφίζει τη νεφρική βλάβη των αρουραίων που προκαλείται από τον διαβήτη.(Α) Ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα αζώτου ουρίας αίματος και κρεατινίνης ορού. (Β) Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των ούρων ανιχνεύτηκε εβδομαδιαία. (Γ) Ο τραυματισμός των ιστών των νεφρών ανιχνεύθηκε με τη χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (μεγέθυνση.x200), P<0.01, and="" p-0.001="" ys.the="" after="" intervention="" 3w="" group.bun.blood="" urea="" nitrogen:="" scr,="" serum="">

Εικόνα 3. Το Apelin-13 ενεργοποιεί την έκφραση του APJ.(Α) Η έκφραση της APJ στους ιστούς των νεφρών ανιχνεύθηκε με τις ανοσοϊστοχημικές δοκιμασίες (μεγέθυνση, x200). (Β) Η παραγωγή ΝΟ ανιχνεύθηκε με τα εμπορικά κιτ. (Γ) Τα επίπεδα των Ang Il και ET-I προσδιορίστηκαν με εμπορικά κιτ."<0.01><0.001 vs.="" the="" after="" intervention="" 3w="" group.apj,="" angiotensin="" domain="" type="" 1="" receptor-associated="" proteins;="" no,="" nitric="" oxide;="" ang="" i,="" angiotensin="" ii;="">

Εικόνα 4. Η εφαρμογή του apelin-13 προάγει την έκφραση του eNOS.(Α) Η έκφραση του ATIR andeNOS ανιχνεύθηκε με το western blotting. (Β) Τα επίπεδα APJ, TGBR, E-cadherin και a-SMA σε ιστούς νεφρών αρουραίων ανιχνεύθηκαν με western blotting.'P.<><0.01><0.001.enos, endothelial="" nitric="" oxide="" synthase;="" at1r,="" ang="" ii="" type="" i="" receptor;="" apj,="" angiotensin="" domain="" type="" 1="" receptor-associated="" proteins;="" tgbr,="" transforming="" growth="" factorβreceptor;="" α-sma,="" α-smooth="" muscle="">

Εικόνα 5. Η απελίνη-13 ανακουφίζει τον τραυματισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων των σπειραματικών αγγείων που προκαλείται από υψηλότερη γλυκόζη.(Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με την ανάλυση Cell Counting Kit-8. (Β) Τα hRGECs ανιχνεύθηκαν με τα πειράματα σχηματισμού αυλού (μεγέθυνση, x4). (Γ) Η έκφραση των AT1R.eNOS, APJ, TGBR, E-cadherin και a-SMA σε αυτά τα κύτταρα προσδιορίστηκε με το western blotting, 'P-0.05."P<0.01><0.001. atir.="" ang,="" i="" type="" 1="" receptor:="" enos,="" endothelial="" nitric="" oxide="" synthase;="" apj,="" angiotensin="" domain="" type="" i="" receptor-associated="" proteins;="" tgbr,="" transforming="" growth="" factor="" βreceptor;a-sma,α-smooth="" muscle="">

Εικόνα 6. Η απελίνη-13 ανακουφίζει από τον τραυματισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων των σπειραματικών αγγείων καταστέλλοντας την ίνωση.(Α) Η κυτταρική βιωσιμότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων των σπειραματικών αγγείων προσδιορίστηκε με δοκιμασία CellCounting Kit-8. (Β) hRGECs ανιχνεύθηκαν με τα πειράματα σχηματισμού αυλού (μεγέθυνση, x4). (Γ) Τα επίπεδα των AT1R, eNOS, APJ, TGBR.E.-καντερίνης και a-SMA σε αυτά τα κύτταρα προσδιορίστηκαν με western blotting."<><0.01><0.001.stir. ang="" iitype="" 1receptor;enos,="" endothelial="" nitric="" oxide="" synthase;="" apjangiotensin="" domain="" type="" 1="" receptor-associated="" proteins;="" tgbr,="" transforming="" growth="" factorβreceptor;α-sma,a-smooth="" muscle="">

Συζήτηση

Ο διαβήτης είναι ένα μεταβολικό νόσημα και η διαταραχή του μεταβολισμού της γλυκόζης είναι η κύρια κλινική του εκδήλωση. Τα τελευταία χρόνια, η επίπτωση αυτής της νόσου αυξάνεται σταθερά(22). Ο διαβήτης οδηγεί σε βλάβη και δυσλειτουργία πολλών οργάνων. Η νεφρική βλάβη που προκαλείται από τον διαβήτη είναι μια από τις πιο σημαντικές αιτίες θνησιμότητας σε ασθενείς με διαβήτη(23). Οι κύριες κλινικές εκδηλώσεις τουδιαβητικόςνεφροπάθειαέχουν αποκαλυφθεί ότι είναι πρωτεϊνουρία και επίμονη έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας (24). Επιπλέον, η εμφάνιση και ανάπτυξη τουδιαβητικόςνεφροπάθειαέχουν αποκαλυφθεί ότι προάγουν την ανάπτυξη καρδιαγγειακών παθήσεων (25). Ως εκ τούτου, η ανάγκη ανάπτυξης μιας νέας θεραπείας για την καταστολή της βλάβης που προκαλείται απόδιαβητικόςνεφροπάθειασε ασθενείς είναι επείγον.

Η απελίνη είναι ένας παράγοντας λίπους στους λιπώδεις ιστούς. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η απελίνη θα μπορούσε να ανακουφίσει τις κλινικές εκδηλώσεις ασθενών με διαβήτη ρυθμίζοντας τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα (26). Μια άλλη πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η απελίνη-36 θα μπορούσε να αναστείλει την έκκριση ινσουλίνης που προκαλείται από γλυκόζη υψηλής συγκέντρωσης (16,7 mmol/), αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην έκκριση ινσουλίνης που προκαλείται από γλυκόζη χαμηλής συγκέντρωσης (2,8 mmol/)(27). Στα σώματα παχύσαρκων και ανθεκτικών στην ινσουλίνη ποντικών, η απελίνη θα μπορούσε να ανακουφίσει την αντίσταση στην ινσουλίνη και να αποκαταστήσει τη χρήση της γλυκόζης στον οργανισμό (28). Ωστόσο, στον τομέα τωνδιαβητικόςνεφροπάθεια, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι τα επίπεδα της απελίνης και του υποδοχέα της APJ στον ορό ασθενών μεδιαβητικόςνεφροπάθειααυξήθηκαν και τα υψηλότερα επίπεδα απελίνης και APJ προώθησαν τον σχηματισμό αιμοφόρων αγγείων και προκάλεσαν τον πολλαπλασιασμό των σπειραματικών τριχοειδών αγγείων, προάγοντας έτσι την εμφάνιση και την ανάπτυξηδιαβητικόςνεφροπάθεια(29). Ωστόσο, μια διαφορετική μελέτη έδειξε επίσης ότιapelin-13θα μπορούσε να αναστείλει τον μετασχηματισμό των νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων σε περιβάλλον υψηλής γλυκόζης, αναστέλλοντας έτσι την εμφάνιση και την ανάπτυξη της διαδικασίας EMT στα σπειραματικά κύτταρα, καθυστερώντας τελικά την εμφάνισηδιαβητικόςνεφροπάθεια(30).Στην παρούσα μελέτη, αποδείχθηκε ότι η χρήση τουapelin-13μείωσε τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα και ανακούφισε την αντίσταση στην ινσουλίνη σε αυτούς τους αρουραίους. καθώς και μείωση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες στα ούρα.Απελίν-13Η θεραπεία ανακούφισε επίσης τη σημαντική βλάβη που προκαλείται από τη γλυκόζη στα ενδοθηλιακά κύτταρα των σπειραματικών αγγείων. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χρήση τουapelin-13ανακούφισε τις εκδηλώσεις τουδιαβητικόςνεφροπάθεια.

Μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε ότι η απελίνη θα μπορούσε να μειώσει την περιεκτικότητα σε γλυκόζη στο αίμα ρυθμίζοντας την έκφραση του eNOS και ενεργοποιώντας την οδό Akt (31). Η έκφραση της απελίνης θα μπορούσε επίσης να παράγει ΝΟ ενεργοποιώντας την APJ, ανακουφίζοντας επομένως τις κλινικές εκδηλώσειςδιαβητικόςνεφροπάθεια(32).Το APJ είναι ο υποδοχέας τουapelin-13, καιapelin-13θα μπορούσε να ασκήσει τις βιολογικές του επιδράσεις δεσμεύοντας στο APJ (33). Στην παρούσα μελέτη, ανιχνεύθηκε επίσης η παραγωγή ΝΟ και η έκφραση των eNOS και APJ. Αποκαλύφθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του eNOS και του APJ αυξήθηκαν στους νεφρικούς ιστούς και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των σπειραματικών αγγείων μετά από θεραπεία μεapelin-13. Η παραγωγή ΝΟ ενισχύθηκε επίσης στους νεφρικούς ιστούς των αρουραίων μετά από θεραπεία μεapelin-13. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότιapelin-13προώθησε την έκφραση του eNOS ενεργοποιώντας το APJ. Ως εκ τούτου, υψηλότερα επίπεδα eNOS αύξησαν την παραγωγή ΝΟ, προάγοντας τελικά την αγγειακή διαπερατότητα και τη νεφρική διήθηση.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η νεφρική ίνωση είναι χαρακτηριστικό τηςδιαβητικόςνεφροπάθεια(34,35). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποκάλυψαν ότι η έκφραση της Ε-καντερίνης ενισχύθηκε σε κύτταρα και νεφρικούς ιστούς μετά από θεραπεία μεapelin-13, ενώ αυτή του a-SMA μειώθηκε.Απελίν-13θεραπεία αποκαλύφθηκε επίσης ότι ανακουφίζειδιαβητικόςνεφροπάθειαμε την καταστολή της ίνωσης των νεφρικών ιστών και των ενδοθηλιακών κυττάρων των σπειραματικών αγγείων.

Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη ανέφερε τις επιπτώσεις τουapelin-13για την ανάπτυξη τουδιαβητικόςνεφροπάθεια. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποκάλυψαν ότιapelin-13ανακουφίστηκεδιαβητικόςνεφροπάθειαμε την προώθηση της παραγωγής ΝΟ και την ανακούφιση από την ίνωση στους νεφρικούς ιστούς. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη έχει και έναν περιορισμό. Το οξειδωτικό στρες και η φλεγμονή παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη τουδιαβητικόςνεφροπάθεια(36-40). Ανapelin-13βελτιωμένηδιαβητική νεφροπάθειαμε τη μείωση της φλεγμονής και του οξειδωτικού στρες δικαιολογεί διερεύνηση στη μελλοντική μας μελέτη.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Yu SY, Dong B, Fang ZF, Hu XQ, Tang L και Zhou SH: Η κατάρρευση του lncRNA AK139328 ανακουφίζει τον τραυματισμό της ισχαιμίας του μυοκαρδίου/επαναιμάτωσης σε διαβητικούς ποντικούς μέσω της ρύθμισης του miR-204-3p και της αναστολής της αυτοφαγίας. J Cell Mol Med 22:4886-4898."2018.

2. Rowley WR και Bezold C: Creating public awareness: State forecasts 2025 diabetes.Popul Health Manag 15: 194-200.2012,

3. Rowley WR. Bezold C.Arikan Y, Byrne E and Krohe S: Diabetes 2030: Insights from χθες, σήμερα και μελλοντικές τάσεις. Popul Health Manag 20; 6-12.2017.

4. Αμερικανική Ένωση Διαβήτη: Πρότυπα ιατρικής φροντίδας στον διαβήτη-2014.Diabetes Care 37(Suppl 1): S5-S13.2014.

5. Ahlqvist E, van Zuydam NR, Groop LC και McCarthy MI: Η γενετική των διαβητικών επιπλοκών. Nat Rev Nephrol 11:277-287. 2015.

6. Navarro-Gonzalez JF, Jarque A, Muros M, Mora C και Garcia J: Ο παράγοντας νέκρωσης όγκου-άλφα ως θεραπευτικός στόχος γιαδιαβητικόςνεφροπάθεια.Cytokine Growth Factor Rev 20; 165-173.2009.

7. Alvarez ML και Distefano JK: Ο ρόλος των μη κωδικοποιητικών RNAs στοδιαβητικόςνεφροπάθεια: Πιθανές εφαρμογές ως βιοδείκτες για την ανάπτυξη και την εξέλιξη της νόσου. Diabetes Res Clin Pract 99:1-11,2013.

8.Del Ry S,Cabiati M, Raucci S, Simioniuc A, Caselli C, Prescimone T και Giannessi D: Αλληλουχία και καρδιακή έκφραση του Apelin σε Sus Scrofa. Pharmacol Res 60: 314-319,2009.

9, Fasshauer M and Bluher M: Adipokines in health and disease. Trends Pharmacol Sci 36: 461-470.2015.

10. Lv D, LiH και Chen L: Apelin και APJ, ένας κρίσιμος παράγοντας και θεραπευτικός στόχος για την αθηροσκλήρωση. Acta Biochim Biophys Sin(Σαγκάη) 45 527-533.2013.

11. Wysocka MB. Pietraszek-Gremplewicz K and Nowak D: Ο ρόλος της απελίνης στις καρδιαγγειακές παθήσεις, την παχυσαρκία και τον καρκίνο. Front Physiol 9: 557.2018.

12.Sentinelli F, Capoccia D., Bertoccini L,Barchetta I,Incani M, Coccia F, Manconi E,Lenzi A,Cossu E.Leonetti F, et al:Αναζήτηση γενετικής παραλλαγής στο γονίδιο apelin με επαναπροσδιορισμό και συσχέτιση μελέτη σε ευρωπαϊκά θέματα, Genet Test Mol Biomarkers 20;98 102,2016.

13. Onalan E, Yakar B, Barim AO και Gursu MF: Επίπεδα απελίνης και ρεζιστίνης ορού σε ασθενείς με μειωμένη γλυκόζη νηστείας, μειωμένη ανοχή στη γλυκόζη, διαβήτη τύπου 2 και μεταβολικό σύνδρομο. Endokrynol Pol 71:319-324,2020.

14. Adki KM and Kulkarni YA: Πιθανοί βιοδείκτες στη διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια. Curr Diabetes Rev 16: 971-983.2020.

15. Wu R, Zhu Zand Zhou D: VEGF, apelin και HO-1 σε διαβητικούς ασθενείς με αμφιβληστροειδοπάθεια: Μια ανάλυση συσχέτισης. BMC Ophthalmol 20: 326.2020.

Σημείωση:τα παραπάνω δεν είναι πλήρης λίστα αναφοράς