Γιατί το Herba Cistanches μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του συνδρόμου νεφρικής ανεπάρκειας;

Το μεταβολικό προφίλ αποκαλύπτει θεραπευτικά αποτελέσματα του Herba Cistanches σε ένα ζωικό μοντέλο «συνδρόμου νεφρικής ανεπάρκειας» που προκαλείται από υδροκορτιζόνη

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Γιουνπίνγκ Τσιού, Μιντζούν Τσεν, Μινγκμίνγκ Σου, Γκουοξιάνγκ Σιε, Σιν Λι, Μινγκμέι Ζου, Αϊχουά Ζάο, Τζιαν Τζιάνγκ &Γουέι Τζια

Αφηρημένος

Φόντο

Χέρμπα Σιστάντσες(Roucongrong) είναι αποτελεσματική στη θεραπεία του Shenxu Zheng ('σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας'). Ωστόσο, οι μηχανισμοί και οι συστηματικές μεταβολικές αποκρίσεις στη φυτική παρέμβαση είναι ασαφείς.

Μεθόδους

Χρησιμοποιώντας μεταβολικό προφίλ με βάση το GC-MS, διερευνήσαμε τις μεταβολικές αποκρίσεις σεΧέρμπα Σιστάντσεςπαρέμβαση σε μοντέλο αρουραίων της προκαλούμενης από υδροκορτιζόνη »σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας'.

Αποτελέσματα

Τα μεταβολικά προφίλ των αρουραίων μετά από ένεση υδροκορτιζόνης αποκλίνουν από τη μεταβολική κατάσταση πριν από τη δόση σε διαφορετικά χρονικά σημεία, που κυμαίνονται από την ημέρα 1 έως την ημέρα 10, ενώ τα μεταβολικά προφίλ των αρουραίων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία τόσο με υδροκορτιζόνη όσο και με εκχύλισμα νερούΧέρμπα Σιστάντσεςεπέστρεψε στην κατάσταση προ-δόσης την ημέρα 10.

Συμπέρασμα

Η παρέμβαση τουΧέρμπα Σιστάντσεςπροκάλεσε συστηματική ανάκαμψη από τη μεταβολική διαταραχή που προκαλείται από υδροκορτιζόνη σε αρουραίους. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει επίσης ότι το μεταβολικό προφίλ είναι χρήσιμο στη μελέτη θεραπευτικών μηχανισμών φυτικών φαρμάκων.

Φόντο

Μέσω της διαμόρφωσης των βιοχημικών αντιδράσεων, των μηχανισμών ελέγχου και των ενζυμικών δραστηριοτήτων, πολλά φάρμακα ή χημικές ουσίες προκαλούν διακυμάνσεις των μεταβολιτών που υπάρχουν σε μεμονωμένα κύτταρα, ιστούς ή σωματικά υγρά [1]. Μεταβολικό προφίλ, δηλαδή ανίχνευση μεταβολιτών χαμηλού μοριακού βάρους (MW< 1000="" da)="" by="" means="" of="" an="" advanced="" analytical="" instrument="" coupled="" with="" multivariate="" statistics,="" can="" show="" systemic="" responses="" of="" living="" systems="" to="" xenobiotics.="" it="" is="" also="" technically="" feasible="" to="" catalog="" all="" the="" multifactorial="" heritable="" and="" environmentally="" influenced="" metabolic="" profiles="" of="" an="" organism,="" including="" the="" physiopathological="" consequences="" of="" toxin="" and/or="" disease-induced="" disturbances="" or="" disequilibria="" in="" the="" metabolic="" regulatory="" network="" on="" a="" systemic="" level.="" to="" date,="" metabolic="" profiling="" has="" been="" established="" in="" screening,="" diagnosis,="" the="" prognosis="" of="" diseases="" [2–4],="" and="" safety="" evaluation="" of="" certain="" drugs="" and="" chemicals="">

Ο πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (NMR) [12] και η φασματομετρία μάζας (MS) [13], που εφαρμόζονται μόνα τους ή σε συνδυασμό, έχουν χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία προφίλ και τον χαρακτηρισμό των μεταβολικών συνεπειών των τοξινών ή/και των διαταραχών που προκαλούνται από ασθένειες. Το NMR, το οποίο δεν απαιτεί κουραστική προεπεξεργασία δείγματος, είναι μια γρήγορη και απλή μέθοδος για τη λήψη εγγενών πληροφοριών από σύνθετα και άθικτα βιολογικά δείγματα. Από την άλλη, η ευρεία εφαρμογή της συλλαβισμένης ΣΚΠ στο μεταβολικό προφίλ οφείλεται στην υψηλή ευαισθησία και διαθεσιμότητά της [14, 15]. Συγκεκριμένα, το μεταβολικό προφίλ με βάση το GC-MS έχει χρησιμοποιηθεί για την ανακάλυψη μηχανισμών φαρμάκων και ζιζανιοκτόνων in vivo, βιοδεικτών ασθενειών [16] και επιδράσεων της αλλοιωμένης γονιδιακής έκφρασης στο μεταβολισμό και στην παρακολούθηση της απόδοσης των οργανισμών σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές [17–20].

Χέρμπα Σιστάντσες(Roucongrong), ένα κοινό κινεζικό τονωτικό βότανο που αναπτύσσεται στην έρημο, παρουσιάζει σημαντικές δραστηριότητες για τη βελτίωση της μνήμης [21] και/ή της σεξουαλικής ισχύος [22], την απομάκρυνση των ελεύθερων ριζών, την αντιγήρανση [23-26] και τη νευροπροστασία [27, 28]. Για αιώνες,Χέρμπα Σιστάντσεςέχει χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά στη θεραπεία του Shenxu Zheng ('σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας') [29]. ΠρόσφαταΧέρμπα Σιστάντσεςαποδείχθηκε ότι είχε βελτιωμένες νεφρικές διαταραχές που προκαλούνται από υδροκορτιζόνη [30]· Ωστόσο, οι μεταβολικές συνέπειές της δεν είναι σαφείς. Η προηγούμενη μελέτη μας [31] διαπίστωσε ότι τα μεταβολικά προφίλ των αρουραίων που εκτίθενται σε υδροκορτιζόνη σε υψηλή δοσολογία (δηλαδή ένα ζωικό μοντέλο για το «σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας«) [32], έδειξε ένα μοναδικό βιοχημικό πρότυπο ενδογενών μεταβολιτών στα ούρα. Αυτά τα αποτελέσματα μας ενέπνευσαν να μελετήσουμε τους μηχανισμούς των συνεπών βιοχημικών αλλαγών μετά την τροποποίηση της υδροκορτιζόνης, χρησιμοποιώντας μεταβολικό προφίλ με βάση το GC-MS για να διερευνήσουμε εάν το Herba Cistanches θα μπορούσε να αντιστρέψει ή να εξουδετερώσει τις παρεκκλίνουσες μεταβολικές επιδράσεις της υδροκορτιζόνης.

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

Μεθόδους

Υλικά και όργανα

Χέρμπα Σιστάντσεςαγοράστηκε από την Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co Ltd (Κίνα) και αναγνωρίστηκε ως Cistanche deserticola Y C Ma από τον Δρ Mengyue Wang (Εργαστήριο Φαρμακογνωστικής, Φαρμακευτική Σχολή, Πανεπιστήμιο Shanghai Jiao Tong) σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο [33]. Το ενέσιμο διάλυμα υδροκορτιζόνης (0,5%) αγοράστηκε από την Shanghai Xinyi Pharmaceutical Co (Κίνα). Τα αντιδραστήρια απονεωτικοποίησης ήταν το Ν-μεθυλο-Ν-τριμεθυλοσιλυλοτρι φθοροακακεταμίδιο (MSTFA) (Sigma-Aldrich Inc, ΗΠΑ) και το Τριμεθυλοδοσιλάνιο (TMSI) (Sigma-Aldrich Inc, ΗΠΑ) αναμεμειγμένο σε αναλογία 1000:1. Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα ήταν αναλυτικής καθαρότητας. Το εξαιρετικά καθαρό νερό παρασκευάστηκε με σύστημα καθαρισμού Millipore (18,2 MΩ, ΗΠΑ). Οι μεταβολικοί κλωβοί αγοράστηκαν από την Suzhou Fengshi Εργαστηριακό Πείραμα Ζώων Co Ltd (Κίνα).

Προετοιμασία του εκχυλίσματος Herba Cistanches

Πεντακόσια γραμμάρια χονδροειδώς κονιορτοποιημένου φυτικού υλικού ήταν παλινδρομημένο με 2 λίτρα εξαιρετικά καθαρού νερού για 2 ώρες. Μετά τη διήθηση, το εκχύλισμα εξατμίστηκε περίπου στο ένα δέκατο του αρχικού όγκου σε περιστροφικό εξατμιστήρα Buchi και αραιώθηκε στα 250 mL σε ογκομετρική φιάλη με εξαιρετικά καθαρό νερό. Η τελική συγκέντρωση αργούΧέρμπα Σιστάντσεςτο εκχύλισμα ήταν 2 g/mL.

Δοσολογία και δειγματοληψία

Ο χειρισμός όλων των ζώων σε αυτή τη μελέτη ήταν σύμφωνος με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές και πραγματοποιήθηκε στο Κέντρο Πειραματόζωων, Πανεπιστήμιο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής της Σαγκάης, Σαγκάη, Κίνα. Συνολικά 19 αρσενικοί αρουραίοι Wistar ηλικίας εννέα εβδομάδων αγοράστηκαν από την Shanghai Laboratory Animal Co Ltd (Κίνα). Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε σύστημα φραγμού με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία (20-22 °C) και υγρασία (60 ± 10%), και σε κύκλο 12 ωρών με τα φώτα αναμμένα στις 8:00 π.μ. Στους αρουραίους δόθηκε ad libitum τροφή και νερό. Μετά από εγκλιματισμό δύο εβδομάδων, τα ζώα μεταφέρθηκαν σε μεμονωμένους μεταβολικούς κλωβούς και χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες: (1) ομάδα θεραπείας (n = 7) στην οποία εγχύθηκε υδροκορτιζόνη (5%) i.p. σε 1,5 mg/100 g σωματικού βάρους ακολουθούμενη από από του στόματος χορήγησηΧέρμπα Σιστάντσεςεκχύλισμα για 10 ημέρες. (2) ομάδα μοντέλων (n = 7) στην οποία εγχύθηκε υδροκορτιζόνη (5%) i.p. σε 1,5 mg/100 g άπαξ ημερησίως επί 10 ημέρες· και (3) ομάδα ελέγχου (n = 5) στην οποία ο φορέας εγχύθηκε i.p. σε περίπου 0,6 ml για 10 ημέρες [31].Χέρμπα Σιστάντσεςχορηγήθηκε στην ομάδα θεραπείας σε δόση 20 g/kg σύμφωνα με τη σύσταση των Shen κ.ά. [30]. Είκοσι τετράωρα δείγματα ούρων συλλέχθηκαν σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα: προ-δόση (-24 – 0 ώρες), ημέρα 1 (0 – 24 ώρες), ημέρα 3, ημέρα 7 και ημέρα 10. Όλα τα δείγματα ούρων φυγοκεντρήθηκαν (6383 × g, LG 16-W, Beijing Jingli Centrifuge Co Ltd, Κίνα) για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα αιωρούμενα συντρίμμια και αποθηκεύτηκαν αμέσως στους -80 °C για επακόλουθη ανάλυση GC-MS.

Προετοιμασία δείγματος και GC-MS

Το GC-MS πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη μας με μικρές τροποποιήσεις [31]. Εν συντομία, κάθε κλάσμα 0,5 μL τριμεθυλοσιλλυλο (TMS) παραγωγοποιημένης αναλυτέας ουσίας εγχέεται σε τριχοειδή στήλη από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου (17 m × εσωτερική διάμετρο 220 μm, πάχος φιλμ 0,11 μm. HP Ultra-1, Agilent J&W Επιστημονική, ΗΠΑ). Το GC-MS διεξήχθη σε μια χρωματογραφία αερίου PerkinElmer με παύλα και σε ένα φασματόμετρο μάζας XL συστήματος TurboMass-Auto (PerkinElmer Inc, ΗΠΑ).

Επεξεργασία δεδομένων και πολυμεταβλητή ανάλυση

Τα δεδομένα GC-MS μετατράπηκαν σε μορφή NetCDF μέσω της DataBridge (PerkinElmer Inc, ΗΠΑ). Προσαρμοσμένες δέσμες ενεργειών εκτελέστηκαν στο MATLAB 7.0 (The MathWorks Inc, USA) για να εκτελεστεί διόρθωση γραμμής βάσης, αποσυμπίεση και στοίχιση κορυφών, αποκλεισμός εσωτερικού προτύπου και κανονικοποίηση στο συνολικό άθροισμα του χρωματογραφήματος. Ο προκύπτων 3-διάστατος πίνακας που περιλαμβάνει αυθαίρετο δείκτη κορυφής (ζευγαρωμένος χρόνος κατακράτησης-m/z), δείγματα (παρατηρήσεις) και κανονικοποιημένες περιοχές κορυφής (μεταβλητές) εισήχθη στο πακέτο λογισμικού SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Σουηδία) για πολυμεταβλητή ανάλυση.

Η μέση κεντράρισμα πραγματοποιήθηκε κατά στήλη για την αφαίρεση των μετατοπίσεων. Όλοι οι μετρούμενοι μεταβολίτες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε ίσο επίπεδο με αυτόματη κλιμάκωση (κλιμακούμενη σε μοναδιαία διακύμανση) πριν από την πολυμεταβλητή ανάλυση. Η ανάλυση των κύριων συνιστωσών (PCA) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό SIMCA-P 11.0 για να αποκαλύψει τη γενική ομαδοποίηση, την ομαδοποίηση και τις τάσεις μεταξύ των υποκειμένων χωρίς προηγούμενη γνώση. Το πρώτο κύριο στοιχείο (PC1) αντιπροσωπεύει τη μεγαλύτερη διακύμανση στα δεδομένα. Το δεύτερο κύριο συστατικό (PC2) είναι ορθογώνιο σε PC1 και αντιπροσωπεύει τη μέγιστη ποσότητα διακύμανσης που δεν εξηγείται από το PC1. Τα υπόλοιπα κύρια εξαρτήματα κατασκευάστηκαν με τον ίδιο τρόπο. Εν τω μεταξύ, οι μέσες τροχιές των βαθμολογιών PCA χρησιμοποιήθηκαν για να παρέχουν μια δυναμική ένδειξη για την εμφάνιση, την εξέλιξη ή / και την ανάκτηση του συνδρόμου με την πάροδο του χρόνου. Οι συντελεστές συσχέτισης από τη μερική ανάλυση ελαχίστων τετραγώνων – διάκρισης (PLS-DA) χρησιμοποιήθηκαν για την κατάταξη της σημασίας κάθε μεταβλητής για την περαιτέρω αποτύπωση των μεταβολιτών που εκφράζονται διαφορικά και είναι υπεύθυνοι για τον διαχωρισμό μεταξύ των ομάδων. Το PLS-DA προέρχεται από τη μέθοδο των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS), η οποία είναι μια γενικευμένη μέθοδος πολλαπλής παλινδρόμησης που ασχολείται με πολλαπλούς προγνωστικούς παράγοντες και μεταβλητές απόκρισης [34]. Το PLS-DA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό SIMCA-P 11.0 [35]. Πραγματοποιήθηκε μια τυπική διασταυρούμενη επικύρωση 7 γύρων. Το ένα έβδομο των δειγμάτων εξαιρέθηκε από το μοντέλο σε κάθε γύρο, ώστε να επικυρωθεί το μοντέλο. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε με επαναληπτικό τρόπο για διασταυρούμενη επικύρωση έως ότου κάθε δείγμα είχε αποκλειστεί μία φορά.

Το Herba Cistanches μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του συνδρόμου νεφρικής ανεπάρκειας

Μονομεταβλητή ανάλυση

Οι διαφορικά εκφρασμένοι μεταβολίτες που εντοπίστηκαν από την πολυμεταβλητή ανάλυση επαληθεύτηκαν επίσης στο λογισμικό MATLAB 7.0 (The MathWorks Inc, USA) με μη παραμετρική δοκιμή Kruskal-Wallis με επίπεδο σημαντικότητας στο P<>

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ερμηνεία των φασμάτων GC-MS

Τυπικά χρωματογραφήματα συνολικού ρεύματος ιόντων GC-MS (TIC) ούρων αρουραίων την ημέρα 10 από την ομάδα θεραπείας, την ομάδα μοντέλου και την ομάδα ελέγχου παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Χρησιμοποιώντας το βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο ανάλυσης GC-MS σε συνδυασμό με μια διαδικασία αποσυμπίεσης αιχμής που βασίζεται σε λογισμικό, ανιχνεύθηκαν με συνέπεια 117 μεμονωμένοι μεταβολίτες σε τουλάχιστον 90% των δειγμάτων ούρων. Ο σύνθετος προσδιορισμός των κορυφών ενδιαφέροντος πραγματοποιήθηκε συγκρίνοντας το φασματικό θραύσμα μάζας με τις βιβλιοθήκες αναφοράς NIST (Εθνικό Ινστιτούτο Προτύπων και Τεχνολογίας), τις βιβλιοθήκες Wiley και τα πρότυπα αναφοράς. Ήμασταν σε θέση να επαληθεύσουμε 23 από τους 117 μεταβολίτες (20%), η πλειοψηφία των οποίων ήταν αμινοξέα, πολυαμίνες, λιπαρά οξέα, πουρίνες και ορμόνες των επινεφριδίων που εμπλέκονται κυρίως στον ενεργειακό μεταβολισμό, το μεταβολισμό των λιπιδίων και το μεταβολισμό των αμινοξέων.

Σχήμα 1 Τυπικά χρωματογραφήματα συνολικού ρεύματος ιόντων GC-MS (TIC) ούρων την ημέρα 10 από την ομάδα θεραπείας (Α), την ομάδα μοντέλου (Β) και την ομάδα ελέγχου (C).

Χρονικά εξαρτώμενες αλλαγές στα δείγματα ούρων

Οι μέσες τροχιές των βαθμολογιών PCA που προέκυψαν από την ομάδα μοντέλου και την ομάδα θεραπείας απεικονίστηκαν στο Σχήμα 2. Η παροδική μετατόπιση στο διάγραμμα τροχιάς αποκάλυψε τη δυναμική πρόοδο του 'σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας» που προκαλείται από υδροκορτιζόνη μόνη της ή σε συνδυασμό μεΧέρμπα Σιστάντσεςθεραπεία. Στην ομάδα μοντέλων, τα μεταβολικά μοτίβα την ημέρα 1 και την ημέρα 3 ήταν διαφορετικά από εκείνα της 7ης και της 10ης ημέρας, υποδηλώνοντας ότι το μεταβολικό ρυθμιστικό δίκτυο την ημέρα 1 και την ημέρα 3 μπορεί να είχε υποστεί μια παροδική περίοδο με υψηλές διακυμάνσεις και ότι το διαταραγμένο δίκτυο μπορεί να είχε αποκατασταθεί την ημέρα 7 και την ημέρα 10, γεγονός που τελικά οδήγησε σε ένα σταθερό μοτίβο κοντά στην κατάσταση προ-δόσης. Κατ' αναλογία, το γεγονός ότι το μεταβολικό πρότυπο της ημέρας 1 και της 3ης ημέρας προφανώς παρέκκλινε από εκείνο της προ-δόσης στην ομάδα θεραπείας έδειξε το κυρίαρχο «σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας' κατάσταση. Σε αυτή την περίοδο, οι επιδράσεις της υδροκορτιζόνης ήταν πιθανώς κυρίαρχες σε σχέση με εκείνες τηςΧέρμπα Σιστάντσεςαπόσπασμα. Αυτά τα ευρήματα ήταν σύμφωνα με τη γενική παρατήρηση ότι οι αρουραίοι και από τις δύο ομάδες έδειξαν λιγότερη δραστηριότητα την ημέρα 1 και την ημέρα 3. Είναι ενδιαφέρον ότι τα μεταβολικά μοτίβα την ημέρα 7 και την ημέρα 10 πλησίασαν σταδιακά και σημαντικά την κατάσταση προ-δόσης, υποδηλώνοντας ότιΧέρμπα Σιστάντσεςείχαν κάποια αντισταθμιστικά ή θεραπευτικά αποτελέσματα στους αρουραίους που εκτέθηκαν στην υδροκορτιζόνη. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τα κλινικά ευρήματα πουΧέρμπα Σιστάντσεςείναι αποτελεσματική στη θεραπεία του 'σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας'. Γενικά, και οι δύο τροχιές παρέχουν μια οπτική, συνολική και δυναμική εικόνα της έναρξης, της εξέλιξης και της ανάκτησης του 'σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας'.

Σχήμα 2 Μέση τροχιά των βαθμολογιών PC1 έναντι PC2 για δείγματα ούρων από την ομάδα μοντέλων (-●-) και την ομάδα θεραπείας (--●--). Κάθε κουκκίδα δηλώνει μια μέση βαθμολογία σε διαφορετικά χρονικά σημεία, δηλαδή προ-δόση, ημέρες 1, 3, 7 και 10. Η γραμμή σφάλματος αντιπροσωπεύει την τυπική απόκλιση για κάθε χρονικό σημείο που λαμβάνεται από το πρώτο κύριο στοιχείο.

Συγκριτική μεταβολική ανάλυση δειγμάτων ούρων

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις μεταβολικές επιδράσεις της υδροκορτιζόνης, συγκρίναμε τα μεταβολικά προφίλ που λαμβάνονται από τις ομάδες ελέγχου, μοντέλου και θεραπείας. Η γενική ομαδοποίηση των τριών ομάδων μπορεί εύκολα να παρατηρηθεί σε διάφορα χρονικά σημεία, δηλαδή προ-δόση, ημέρα 3 και ημέρα 10 (Εικόνα 3). Ενώ δεν υπάρχει τάση διαχωρισμού στα προφίλ ούρων πριν από τη δόση, τα μεταβολικά προφίλ αποκλίνουν από εκείνα της ομάδας ελέγχου την ημέρα 3 μετά την έκθεση σε υδροκορτιζόνη. Η μεταβολική διαταραχή από την υδροκορτιζόνη εμφανίστηκε τόσο στην ομάδα μοντέλου όσο και στην ομάδα θεραπείας. Ωστόσο, μετά από μια διαδοχική θεραπεία 7 ημερών μεΧέρμπα Σιστάντσες, τα μεταβολικά προφίλ της ομάδας αγωγής έγιναν και πάλι συγκρίσιμα με εκείνα της ομάδας μάρτυρα, υποδεικνύοντας ότιΧέρμπα Σιστάντσεςαποκατέστησε αποτελεσματικά τον διαταραγμένο μεταβολισμό.

Σχήμα 3 Σύγκριση μεταβολικών προφίλ από την ομάδα ελέγχου (μαύρο διαμάντι), την ομάδα μοντέλου (κόκκινο διαμάντι) και την ομάδα θεραπείας (μπλε διαμάντι) σε διαφορετικά χρονικά σημεία: προ-δόση (Α), ημέρα 3 (Β) και ημέρα 10 (Γ). Κάθε κουκκίδα στο διάγραμμα βαθμολογιών PCA αντιπροσωπεύει τα δεδομένα που λαμβάνονται από έναν αρουραίο.

Διαφορική ταυτοποίηση των μεταβολικών προφίλ

Ένα διασταυρούμενο επικυρωμένο μοντέλο PLS-DA χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των βασικών μεταβολιτών σε διαφορετικά μεταβολικά προφίλ για ευκολότερη διαφοροποίηση μεταξύ των αρουραίων της ομάδας ελέγχου και των αρουραίων της ομάδας μοντέλου (δηλαδή της επαγόμενης από υδροκορτιζόνη) αρουραίων με ή χωρίςΧέρμπα Σιστάντσεςθεραπεία την ημέρα 3 (Πίνακας 1). Προσδιορίστηκαν οι αλλαγές στη σχετική συγκέντρωση κάθε βασικού μεταβολίτη μεταξύ των ομάδων και προέκυψε η αντίστοιχη απεικόνιση των μεταβολών μεταξύ των ομάδων κατά την προ-δόση, ημέρα 3 και ημέρα 10 (Σχήμα 4). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 και στον Πίνακα 1, ενώ οι περισσότεροι από τους ενδογενείς μεταβολίτες αυξήθηκαν ή μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα μοντέλου, εκείνοι στην ομάδα θεραπείας υποβλήθηκαν σε παροδική περίοδο όπως παρατηρήθηκε την ημέρα 1 και την ημέρα 3 και σταδιακά πλησίασαν το (φυσιολογικό) επίπεδο ελέγχου. Για παράδειγμα, σε σύγκριση με την ελαφρά διακύμανση (1,1–1,5 φορές) των μεταβολιτών στην ομάδα θεραπείας την ημέρα 10, τα πολύ αυξημένα επίπεδα (1,7-3,0 φορές) τυροσίνης, τυραμίνης, ντοπαμίνης και νοραδρεναλίνης στα ούρα παρατηρήθηκαν στην ομάδα μοντέλου καθ 'όλη τη διάρκεια του πειράματος. Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι ο ενισχυμένος μεταβολισμός της κατεχολαμινών που προκλήθηκε από τα γλυκοκορτικοειδή είχε ως αποτέλεσμα την υπερκατανάλωση των ανοσολογικών λειτουργιών, οδηγώντας έτσι στο «σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας' [31].Χέρμπα Σιστάντσες, ένα τονωτικό βότανο που βελτιώνει το ανοσοποιητικό σύστημα [36], μπορεί να εξουδετερώσει ορισμένες επιδράσεις της υδροκορτιζόνης.Χέρμπα Σιστάντσεςμπορεί επίσης να είναι σε θέση να αποκαταστήσει ένα φυσιολογικό μεταβολικό ρυθμιστικό δίκτυο. Απαιτούνται περαιτέρω πειράματα με διαφορετικές προσεγγίσεις όπως η μοριακή βιολογία, η κυτταρική βιολογία και η χημεία των φυτών για την οριοθέτηση των δράσεων τηςΧέρμπα Σιστάντσες(και τα συστατικά του) στο 'σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας'.

Πίνακας 1 Κατάλογος των μεταβολιτών που περιλαμβάνονται στο μεταβολικό προφίλ της παρούσας μελέτης

Από: Μεταβολικό προφίλ αποκαλύπτει θεραπευτικά αποτελέσματα τηςΧέρμπα Σιστάντσεςσε ένα ζωικό μοντέλο που προκαλείται από υδροκορτιζόνη »σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας'

Σημείωση: Οι συντελεστές συσχέτισης (corr coeffs) όλων των ενώσεων υπολογίστηκαν από ένα διασταυρούμενο επικυρωμένο μοντέλο PLS-DA (Q2Ycum = 0,899, ένα ικανοποιητικό μοντέλο που χρησιμοποιεί δύο συνιστώσες) την ημέρα 3 μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας μοντέλου με ή χωρίςΧέρμπα Σιστάντσεςθεραπεία. Επιπλέον, οι αλλαγές αναδίπλωσης δοκιμάστηκαν από τη μη παραμετρική δοκιμή Kruskal-Wallis. Kw (P) δηλώνει τις τιμές P της δοκιμής. H = ομάδα ελέγχου, M = ομάδα μοντέλου, D = ομάδα αγωγής. Για παράδειγμα, το H/M/0 αντιπροσωπεύει τις σχετικές αλλαγές αναδίπλωσης (μοντέλο για έλεγχο) στην κατάσταση προ-δόσης.

Εικόνα 4 Επανάληψη των μεταβολών των βασικών μεταβολιτών. Το κόκκινο χρώμα υποδηλώνει σχετικές αυξημένες συγκεντρώσεις (οι αλλαγές της πτυχής > 1,5), ενώ το πράσινο χρώμα υποδηλώνει σχετικές μειωμένες συγκεντρώσεις (οι αλλαγές της αναδίπλωσης< -1.5).="" fold="" changes="" ranging="" from="" -1.5="" to="" 1.5="" are="" considered="" to="" be="" physiological="" variations.="" a="" fold="" change="" (m/h,="" d/h)="" is="" the="" concentration="" ratio="" of="" the="" model="" group="" or="" treatment="" group="" to="" the="" control="">

Συμπέρασμα

Η παρούσα μελέτη μεταβολικού προφίλ με τη χρήση GC-MS έδειξε ότιΧέρμπα Σιστάντσεςπροκάλεσε συστηματική ανάρρωση από τη μεταβολική διαταραχή που προκαλείται από υδροκορτιζόνη σε αρουραίους, ένα ζωικό μοντέλο για το «σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας'. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει επίσης ότι το μεταβολικό προφίλ είναι μια χρήσιμη μέθοδος για τη μελέτη των θεραπευτικών επιδράσεων των φυτικών φαρμάκων.

Συντομογραφίες

MS: φασματομετρία μάζας

GC-MS: αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας

NMR: πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός

PCA: ανάλυση κύριων συνιστωσών

PLS-DA: μερικά ελάχιστα τετράγωνα – διακριτική ανάλυση

Αναφορές

1. Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E: «Μεταβονωμική»: Κατανόηση των μεταβολικών αποκρίσεων των ζωντανών συστημάτων σε παθοφυσιολογικά ερεθίσματα μέσω πολυμεταβλητής στατιστικής ανάλυσης βιολογικών φασματοσκοπικών δεδομένων NMR. Ξενοβιοτικά. 1999, 29 (11): 1181-1189. 10.1080/004982599238047.

2. Brindle JT, Antti H, Holmes E, Tranter G, Nicholson JK, Bethell HWL, Clarke S, Schofield PM, McKilligin E, Mosedale DE, Grainger DJ: Ταχεία και μη επεμβατική διάγνωση της παρουσίας και της σοβαρότητας της στεφανιαίας νόσου χρησιμοποιώντας μεταβονομική με βάση το 1H-NMR. Nat Med. 2002, 8 (12): 1439-1444. 10.1038/nm802.

3. Κωνσταντίνου ΜΑ, Παπακωνσταντίνου Ε, Μπενάκη Δ, Spraul M, Shulpis K, Κούπαρης ΜΑ, Μικρός Ε: Εφαρμογή φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού σε συνδυασμό με ανάλυση κύριων συστατικών στην ανίχνευση εγγενών σφαλμάτων μεταβολισμού με τη χρήση κηλίδων αίματος: Μια μεταβονομική προσέγγιση. Πρωκτικό Chim Acta. 2004, 511 (2): 303-312. 10.1016/j.aca.2004.02.012.

4. Beckonert O, Monnerjahn J, Bonk U, Leibfritz D: Οπτικοποίηση μεταβολικών αλλαγών στον ιστό του καρκίνου του μαστού χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία 1H-NMR και αυτοοργανωτικούς χάρτες. NMR Βιοϊατρική. 2003, 16 (1): 1-11. 10.1002/νβμ.797.

5. Mortishire-Smith RJ, Skiles GL, Lawrence JW, Spence S, Nicholls AW, Johnson BA, Nicholson JK: Χρήση της μεταβονομικής για τον εντοπισμό του εξασθενημένου μεταβολισμού των λιπαρών οξέων ως μηχανισμού τοξικότητας που προκαλείται από φάρμακα. Chem Res Τοξικόλη. 2004, 17 (2): 165-173. 10.1021/tx034123ι.

6. Waters NJ, Holmes E, Williams A, Waterfield CJ, Duncan Farrant R, Nicholson JK: Μελέτες NMR και αναγνώρισης προτύπων σχετικά με τις μεταβολικές επιδράσεις του α-ναφθυλισοθειοκυανικού α στο ήπαρ, τα ούρα και το πλάσμα στον αρουραίο: Μια ολοκληρωμένη μεταβονομική προσέγγιση. Chem Res Τοξικόλη. 2001, 14 (10): 1401-1412. 10.1021/tx010067στ.

7. Coen M, Lenz EM, Nicholson JK, Wilson ID, Pognan F, Lindon JC: Μια ολοκληρωμένη μεταβονομική διερεύνηση της τοξικότητας ακεταμινοφαίνης στον ποντικό χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία NMR. Chem Res Τοξικόλη. 2003, 16 (3): 295-303. 10.1021/tx0256127.

8. Small-Howard A, Turner H: Η έκθεση σε υλικά που προέρχονται από καπνό προκαλεί υπερπαραγωγή εκκρινόμενων πρωτεϊνασών στα μαστοκύτταρα. Τοξικόλη Appl Φαρμακολ. 2005, 204 (2): 152-163. 10.1016/j.taap.2004.09.003.

9. Waters NJ, Waterfield CJ, Farrant RD, Holmes E, Nicholson JK: Μεταβονωμική αποσυμπίεση της ενσωματωμένης τοξικότητας: Εφαρμογή στη θειοακακεταμίδη ηπατο- και νεφροτοξικότητα. Chem Res Τοξικόλη. 2005, 18 (4): 639-654. 10.1021/tx049869b.

10. Robertson DG: Μεταβονομική στην τοξικολογία: Μια ανασκόπηση. Toxicol Sci. 2005, 85 (2): 809-822. 10.1093/τοξικό/kfi102.

11. Robertson DG, Bulera SJ: Τοξικολογία υψηλής απόδοσης: Πρακτικά ζητήματα. Curr Opin Ανακάλυψη φαρμάκων Dev. 2000, 3 (1): 42-47.

12. Nicholson JK, Connelly J, Lindon JC, Holmes E: Metabonomics: Μια πλατφόρμα για τη μελέτη της τοξικότητας των φαρμάκων και της γονιδιακής λειτουργίας. Νατ Αναβ Ντίσκοφ ναρκωτικών. 2002, 1 (2): 153-161. 10.1038/νρντ728.

13. Taylor J, King RD, Altmann T, Fiehn O: Εφαρμογή της μεταβολομικής στη διάκριση του γονότυπου των φυτών με τη χρήση στατιστικών και μηχανικής μάθησης. Βιοπληροφορική. 2002, 18 (SUPPL 2): S241-S248.

14. Wilson ID, Nicholson JK, Castro-Perez J, Granger JH, Johnson KA, Smith BW, Plumb RS: Υγρή χρωματογραφία υψηλής ανάλυσης "υπερ-απόδοσης" σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας oa-TOF ως εργαλείο για τη δημιουργία προφίλ διαφορικής μεταβολικής οδού σε λειτουργικές γονιδιωματικές μελέτες. J Proteome Res. 2005, 4 (2): 591-598. 10.1021/pr049769r.

15. Jonsson P, Gullberg J, Nordstrom A, Kusano M, Kowalczyk M, Sjostrom M, Moritz T: Μια στρατηγική για τον εντοπισμό διαφορών σε μεγάλες σειρές μεταβολομικών δειγμάτων που αναλύθηκαν από τον GC/MS. Πρωκτικό Chem. 2004, 76 (6): 1738-1745. 10.1021/ac0352427.

16. Ohdoi C, Nyhan WL, Kuhara T: Χημική διάγνωση του συνδρόμου Lesch-Nyhan με χρήση αέριας χρωματογραφίας-ανίχνευση φασματομετρίας μάζας. J Chromatogr, B: Πρωκτική Technol Biomed Ζωή Sci. 2003, 792 (1): 123-130. 10.1016/S1570-0232(03)00277-0.

17. Fiehn O, Kopka J, Dormann P, Altmann T, Trethewey RN, Willmitzer L: Προφίλ μεταβολίτη για τη λειτουργική γονιδιωματική των φυτών. Νατ Βιοτεχνόλη. 2000, 18 (11): 1157-1161. 10.1038/81137.

18. Lafaye A, Junot C, Pereira Y, Daniel G, Tabet JC, Ezan E, Labarre J: Συνδυασμένες αναλύσεις πρωτεώματος και προφίλ μεταβολιτών αποκαλύπτουν εκπληκτικές γνώσεις σχετικά με το μεταβολισμό του θείου ζύμης. J Biol Chem. 2005, 280 (26): 24723-24730. 10.1074/jbc. Μ502285200.

19. Schauer N, Steinhauser D, Strelkov S, Schomburg D, Allison G, Moritz T, Lundgren K, Roessner-Tunali U, Forbes MG, Willmitzer L, Fernie AR, Kopka J: βιβλιοθήκες GC-MS για την ταχεία ταυτοποίηση μεταβολιτών σε σύνθετα βιολογικά δείγματα. ΦΕΒΡΕΣ Λετ. 2005, 579 (6): 1332-1337. 10.1016/j.febslet.2005.01.029.

20. Willse A, Belcher AM, Preti G, Wahl JH, Thresher M, Yang P, Yamazaki K, Beauchamp GK: Προσδιορισμός των κύριων οσμών σώματος που ρυθμίζονται από το σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας με στατιστική ανάλυση ενός συγκριτικού πειράματος αέριας χρωματογραφίας/φασματομετρίας μάζας. Πρωκτικό Chem. 2005, 77 (8): 2348-2361. 10.1021/ac048711t.

21. Wang XW, Wang XF, Wu LY: Βελτίωση της μνήμης ποντικών φαινυλαιθανοειδών γλυκοσίδων του Cistanche deserticola. Rep Chin Pharm. 2002, 19: 41-42.

22. Xie JH, Wu CF: Επίδραση του αιθανολικού εκχυλίσματος του Cistanche deserticola στο περιεχόμενο των νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης στον εγκέφαλο των αρουραίων. Ζονγκκαογιάο. 1993, 24: 417-419.

23. Li LL, Wang XW, Wang XF: Αντιλιπιδική υπεροξείδωση και αντιακτινωτική δράση των γλυκοσίδων σεχέρμπα Σιστάντσες.Chin J Chin Mater Med. 1997, 22 (6): 364-367.

24. Shahat AA, Nazif NM, Abousetta LM, Ibrahim NA, Cos P, Van Miert S, Pieters L, Vlietinck AJ: Φυτοχημική έρευνα και αντιοξειδωτική δράση των πόρων Duranta. Phytother Res. 2005, 19 (12): 1071-1073. 10.1002/ptr.1766.

25. Gao J, Igarashi K, Nukina M: Τρεις νέες φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες από την Caryopteris incana και η αντιοξειδωτική τους δράση. Χεμ Φαρμ Μπουλ. 2000, 48 (7): 1075-1078.

26. Κυριακοπούλου Ι, Μαγιάτης Π, Σκαλτσούνης ΑΛ, Αλιγιάννης Ν, Harvala C: Samioside, ένας νέος φαινυλαιθανοειδής γλυκοσίδης με σαρωτική και αντιμικροβιακή δράση από τη Phlomis samia. J Nat Prod. 2001, 64 (8): 1095-1097. 10.1021/np010128+.

27. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB: Προστατευτική επίδραση της σωληνοσίδης Β στην απόπτωση που προκαλείται από άλφα του TNF στα νευρωνικά κύτταρα. Acta Φαρμακολική Αμαρτία. 2004, 25: 1276-1284.

28. Geng XC, Song LW, Pu XP, Tu PF: Νευροπροστατευτικές επιδράσεις των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών από τη σάλσα Cistanches έναντι της 1-μεθυλο-4-φαινυλο-1, 2, 3, 6-τετραϋδροπυριδίνης (MPTP) που προκαλείται από ντοπαμινεργική τοξικότητα σε ποντίκια C57. Βιολ Φαρμ Ταύρος. 2004, 27: 797-801. 10.1248/bpb.27.797.

29. He W, Shu X, Zong G, Shi M, Xiong Y, Chen M: Ενίσχυση των νεφρών και yang που υποστηρίζει τη δράση του cistanche deserticola Y. C. Ma πριν και μετά την προετοιμασία. Ζονγκούο Ζονγκ Γιάο Ζάζι. 1996, 21 (9): 534-537. 575

30. Shen LZ, Zhong XY, Wang SX: Επίδραση του Cistanche deserticola σε φυσιολογικούς και ανεπαρκείς αρουραίους Shen-yang. Ζονγκγιάο Γιαόλι Γιου Λιντσουάνγκ. 2001, 17 (1): 17-18.

31. Chen M, Zhao L, Jia W: Μεταβονομική μελέτη σχετικά με τα βιοχημικά προφίλ ενός ζωικού μοντέλου που προκαλείται από υδροκορτιζόνη. J Proteome Res. 2005, 4 (6): 2391-2396. 10.1021/pr050158o.

32. Chen Q, Yi NY: Τα ζωικά μοντέλα και τα φάρμακα για την ανεπάρκεια Yin και την ανεπάρκεια Yang. Πειραματική μεθοδολογία φαρμακολογικής έρευνας στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Επιμέλεια: Chen Q. 1993, Πεκίνο: Εκδοτικός Οίκος Για την Υγεία των Ανθρώπων, 982-984.

33. Εθνική Επιτροπή Φαρμακοποιίας: Φαρμακοποιία της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας. 2005, Πεκίνο: Τύπος χημικής βιομηχανίας, 1: 90-

34. Πολυμεταβλητή και Μεγαμεταβλητή Ανάλυση Δεδομένων Μέρος Ι: Βασικές Αρχές και Εφαρμογές, Δεύτερη αναθεωρημένη και διευρυμένη έκδοση. [http://www.umetrics.com/default.asp/pagename/training_literature/c/5]

35. Οδηγός χρήσης SIMCA-P και SIMCA-P+ 11. [http://www.umetrics.com/default.asp/pagename/downloads_userguide/c/3]

36. Chin HL, Su YC: Μελέτη σχετικά με τις φαρμακολογικές επιδράσεις του Cistanche deserticola Ma. Ζονγκούο Ζονγκ Γιάο Ζάζι. 1993, 19: 143-146.

Από: Κινέζικη Ιατρική τόμος 3, Αριθμός άρθρου: 3 (2008)