Μέρος 1 Η χρόνια νεφρική νόσος και η γήρανση μειώνουν διαφορικά το υλικό των οστών και τη μικροαρχιτεκτονική σε ποντίκια C57Bl/6

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Η χρόνια νεφρική νόσος και η γήρανση μειώνουν διαφορικά το υλικό και τη μικροαρχιτεκτονική των οστών σε ποντίκια C57Bl/6

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Bateman4 , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1 Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Boulder, CO

2 Τμήμα Ορθοπαιδικής Χειρουργικής, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Σαν Φρανσίσκο, Καλιφόρνια

3 Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών, University of Utah, Salt Lake City, UT

4 Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina, Chapel Hill, NC

5 Department of Biomedical Engineering, The College of New Jersey, Ewing, NJ

6Advanced Light Source, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA

7 Department of Materials Science & Engineering, Cornell University, Ithaca, NY

8 Τμήμα Βιομηχανικής, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ντένβερ, CO

9 Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών, University of Colorado, Denver, CO

10 Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Georgetown, Washington DC

11 Department of Orthopaedics, University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO *University of California Berkeley – University of California San Francisco Graduate Program in Bioengineering, San Francisco, CA

# Τμήμα Έρευνας, Hospital for Special Surgery, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη

Το Cistanche μπορεί να βοηθήσει με νεφρική νόσο

Αφηρημένη

Η χρόνια νεφρική νόσος (ΧΝΝ) είναι μια κοινή ασθένεια της γήρανσης και αυξάνει τον κίνδυνο κατάγματος μόνο σε προχωρημένη ηλικία. Η γήρανση και η ΧΝΝ επηρεάζουν διαφορετικά τον οστικό κύκλο και την ανοργανοποίηση. Υποθέτουμε λοιπόν ότι η απώλεια της ποιότητας των οστών θα ήταν μεγαλύτερη με τον συνδυασμό προχωρημένης ηλικίας και ΧΝΝ. Αξιολογήσαμε τα οστά νεαρών ενηλίκων (6 μηνών), μέσης ηλικίας (18 μηνών) και ηλικιωμένων (24 μηνών) αρσενικών ποντικών C57Bl/6 τρεις μήνες μετά από είτε την 5/6η νεφρεκτομή, για να προκαλέσουμε CKD ή Sham επεμβάσεις. Η ΧΝΝ επιδείνωσε τις απώλειες της μικροαρχιτεκτονικής του φλοιού και της δοκιδωτής που σχετίζονται με τη γήρανση. Η γήρανση και η ΧΝΝ είχαν ως αποτέλεσμα λεπτότερους, πιο πορώδεις φλοιούς και λιγότερες και λεπτότερες δοκίδες. Η ποιότητα του οστικού υλικού μειώθηκε επίσης με τη ΧΝΝ και αυτές οι αλλαγές στο οστικό υλικό ήταν διαφορετικές από εκείνες που οφείλονταν στην ηλικία. Η γήρανση μείωσε την αντοχή και τον συντελεστή κάμψης ολόκληρου του οστού, το μέτρο νανοοδοντώσεως σε κλίμακα μικρομέτρου και το στέλεχος ιστού και κολλαγόνου κλίμακας νανομέτρων (σκέδαση ακτίνων Χ μικρής γωνίας (SAXS)). Αντίθετα, η ΧΝΝ μείωσε την εργασία έως το κάταγμα και τη διακύμανση του συντελεστή και της σύνθεσης του οστικού ιστού (φασματοσκοπία Raman) και αύξησε το ποσοστό του στελέχους κολλαγόνου. Το αυξημένο φορτίο καταπόνησης κολλαγόνου συσχετίστηκε με απώλεια σκληρότητας στη ΧΝΝ. Επιπλέον, τα κενά οστεοκυττάρων έγιναν μικρότερα, αραιότερα και πιο διαταραγμένα με την ηλικία για τα ποντίκια Sham, ωστόσο αυτές οι αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία δεν παρατηρήθηκαν ξεκάθαρα στη ΧΝΝ. Ωστόσο, για τη ΧΝΝ, μεγαλύτερα κενά συσχετίστηκαν θετικά με αυξημένα επίπεδα φωσφορικών ορού, υποδηλώνοντας ότι τα οστεοκύτταρα παίζουν ρόλο στη συστηματική ομοιόσταση των ανόργανων αλάτων. Αυτή η εργασία καταδεικνύει ότι η ΧΝΝ μειώνει την ποιότητα των οστών, συμπεριλαμβανομένων των ιδιοτήτων της μικροαρχιτεκτονικής και του οστικού υλικού, και ότι η απώλεια της ποιότητας των οστών με την ηλικία επιδεινώνεται από τη ΧΝΝ. Αυτά τα ευρήματα μπορεί να βοηθήσουν να συμφιλιωθεί γιατί η οστική μάζα δεν προβλέπει με συνέπεια κάταγμα στον πληθυσμό της ΧΝΝ, καθώς και γιατί τα ηλικιωμένα άτομα με ΧΝΝ διατρέχουν υψηλό κίνδυνο ευθραυστότητας.

Λέξεις-κλειδιά: ΧΝΝ; γηράσκων; ποιότητα των οστών? ευθραυστότητα των οστών? κολλαγόνο

1. Εισαγωγή

Η χρόνια νεφρική νόσος (ΧΝΝ) επηρεάζει περίπου το 23-36 τοις εκατό του ηλικιωμένου πληθυσμού και σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο κατάγματος και θνησιμότητας που σχετίζεται με κατάγματα (1,2). Αν και η απώλεια οστικής μάζας (όπως μετράται με απορρόφηση ακτίνων Χ διπλής ενέργειας) προβλέπει μελλοντικό κάταγμα σε όλα τα στάδια της ΚΝΝ, τα ηλικιωμένα άτομα με χαμηλή οστική μάζα και ΧΝΝ είναι πιο πιθανό να υποστούν κάταγμα σε σύγκριση με αυτά με χαμηλή οστική μάζα και υγιή νεφρό. λειτουργία (3). Ο κίνδυνος κατάγματος των οστών είναι γενικά αυξημένος με τη ΧΝΝ έναντι των επιπτώσεων της γήρανσης μόνο (4,5). Για παράδειγμα, σε μια μελέτη τριών ετών, τα άτομα 40-65 με μέτρια έως τελικού σταδίου ΧΝΝ είχαν 1,7-5,1 φορές αύξηση στον επιπολασμό των καταγμάτων σε σύγκριση με τους μάρτυρες που ταιριάζουν με την ηλικία, ενώ για τις ηλικίες 65 και άνω, η ΧΝΝ συνέχισε να αυξάνει τη συχνότητα εμφάνισης. κατάγματος 1,8 – 4,3 φορές πάνω από τους ελέγχους (4).

μικροαρχιτεκτονική του δοκιδωτού οστού (10, 13), ενώ άλλοι δεν αναφέρουν αλλαγές σε σύγκριση με τον έλεγχο (9). Αν και αυτές οι μελέτες ποικίλλουν ως προς το είδος και το στέλεχος των τρωκτικών, τη μέθοδο πρόκλησης ΧΝΝ και τα αποτελέσματα που μετρήθηκαν, αυτές οι προηγούμενες εργασίες παρέχουν ουσιαστικές ενδείξεις ότι η ΧΝΝ μεταβάλλει την ποιότητα των οστών.

Αρκετά βασικά ερωτήματα παραμένουν σχετικά με το πώς μειώνεται η ποιότητα των οστών από τη ΧΝΝ, ο βαθμός στον οποίο η μειωμένη ποιότητα των οστών οφείλεται σε ελαττώματα της ορυκτής έναντι της οργανικής φάσης, καθώς και πώς οι αλλαγές στην ποιότητα των οστών επηρεάζουν την απώλεια σκληρότητας του οστικού ιστού. Συγκεκριμένα, αν και μερικές μελέτες έχουν εντοπίσει αλλαγές στις σταυροδεσμούς κολλαγόνου και στην ωριμότητα των ιστών (δηλαδή, χρόνο από τον σχηματισμό οστού) στη ΧΝΝ, είναι άγνωστο εάν οι αλληλεπιδράσεις σε νανοκλίμακα των ινών κολλαγόνου κατά τη μηχανική φόρτωση μεταβάλλονται από τη ΧΝΝ και εάν αυτές οι αλλαγές στη νανομηχανική επηρεάζουν το σύνολο -σκληρότητα οστών (11, 12). Γενικότερα, δεν έχει ακόμη αναφερθεί αξιολόγηση των αλλαγών στην ποιότητα και τη μηχανική των οστών ως απόκριση στη ΧΝΝ από τις κλίμακες μήκους νανο έως ολικού οστού.

Ο ρόλος των οστεοκυττάρων στην επιρροή της ποιότητας των οστών στη ΧΝΝ και τη γήρανση είναι επίσης αβέβαιος. Αυτά τα κύτταρα συμπεριφέρονται ανώμαλα αυξάνοντας ουσιαστικά την έκφραση του FGF23 νωρίς στην εξέλιξη της ΧΝΝ (7, 14). Το οστεοκύτταρο είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της ποιότητας του οστικού υλικού και για τη ρύθμιση της αντίστασης στα κατάγματα των οστών (15–17). Η υγεία των οστεοκυττάρων ενδείκνυται, εν μέρει, μέσω της λανθάνουσας μορφολογίας. Οι μορφολογίες του κενού των οστεοκυττάρων μεταβάλλονται όταν το οστεοκύτταρο συμμετέχει στην ομοιόσταση ορυκτών, όπως στη γαλουχία (18, 19) και στη συνδεδεμένη με χ υποφωσφαταιμία (20). Οι λακουνικές γεωμετρίες μπορούν επίσης να γίνουν μικρότερες, πιο αραιές και πιο διαταραγμένες τόσο με τη γήρανση όσο και με την αχρηστία (21-23). Οι αλλαγές στη μορφολογία του κενού οστεοκυττάρου με ΧΝΝ έχουν τη δυνατότητα να επηρεάσουν τα στελέχη του οστικού ιστού, τη δομική ακεραιότητα και τη μηχανοευαισθησία των οστεοκυττάρων (24). Δεν είναι ακόμη γνωστό εάν η ΧΝΝ επηρεάζει τις μορφολογίες του κενού των οστεοκυττάρων και εάν μια τέτοια σχέση μπορεί να αλλάξει με τη γήρανση.

Αν και οι πιο συχνοί πληθυσμοί ΧΝΝ περιλαμβάνουν ηλικιωμένους ενήλικες, οι συνδυασμένες επιδράσεις της γήρανσης και της ΧΝΝ στην ποιότητα των οστών δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί. Προηγούμενη εργασία έχει αποδείξει ότι η γήρανση μειώνει το συντελεστή ολικής οστικής μάζας, τη δύναμη και την εργασία έως το κάταγμα στην κάμψη (25), τη σκληρότητα στο κάταγμα (26), τη μικροαρχιτεκτονική του φλοιού και του δοκιδωτού οστού (27-29) και αυξάνει την περιεκτικότητα σε μεταλλικά στοιχεία και την ωριμότητα (30, 31). Αυτές οι αλλαγές στο οστό με τη γήρανση προκαλούν σύγχυση και συμβαίνουν σε κλίμακες πολλαπλών μήκους, με τη μηχανική του ολικού οστού να επηρεάζεται από αλλαγές στο υλικό του οστικού ιστού καθώς και στη δομή. Οι αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία στο οστικό υλικό και τον όγκο των οστών επηρεάζονται εν μέρει από τη μειωμένη ανακύκλωση του οστικού ιστού (δηλ. υψηλότερη ωριμότητα ιστού) και ένα αρνητικό ισοζύγιο στην πολυκυτταρική μονάδα των οστών, αντίστοιχα (30,32). Τέτοιες αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία έρχονται σε αντίθεση με την ανώμαλη ανανέωση των οστών και την ανοργανοποίηση που συμβαίνει συχνά με τη ΧΝΝ. Η απώλεια της μικροαρχιτεκτονικής σχετίζεται με αρνητικό ισοζύγιο, το οποίο αναμένεται με τη γήρανση και μπορεί να εμφανιστεί στη ΧΝΝ (9, 10, 13). Ωστόσο, η ωριμότητα των ιστών αυξάνεται με τη γήρανση και μειώνεται στο πλαίσιο της ΧΝΝ με υψηλό κύκλο εργασιών. Υπάρχουν σημαντικά κενά στην κατανόηση της βάσης της ευθραυστότητας των οστών στη ΧΝΝ, καθώς και στο πώς η γήρανση και η ΧΝΝ, όταν συνδυάζονται, μειώνουν την ποιότητα των οστών και την αντοχή στα κατάγματα. Η αποσαφήνιση των συνδυασμένων επιπτώσεων της γήρανσης και της ΧΝΝ στην ποιότητα των οστών θα κάλυπτε αυτά τα κενά γνώσης.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει τις συνδυασμένες επιδράσεις της γήρανσης και της ΧΝΝ στην ποιότητα των οστών, από κλίμακες μήκους νανο-μέσω ολόκληρου του οστού, σε ένα χειρουργικό μοντέλο ΧΝΝ σε ηλικιωμένους ποντικούς. Υποθέσαμε ότι η ΧΝΝ και η γήρανση μειώνουν την ποιότητα των οστών, αλλά ότι αυτοί οι δύο παράγοντες θα επηρέαζαν διαφορικά και αρνητικά τις ιδιότητες του υλικού του οστικού ιστού. Υποθέσαμε περαιτέρω ότι οι συνδυασμένες επιπτώσεις της ηλικίας και της ΧΝΝ είναι πιο επιζήμιες για την ποιότητα των οστών. Για να αξιολογήσουμε αυτές τις υποθέσεις, αξιολογήσαμε την ποιότητα των οστών, συμπεριλαμβανομένης της μικροαρχιτεκτονικής του φλοιού και της δοκιδωτής και των ιδιοτήτων του υλικού του φλοιού οστού, σε νεαρούς ενήλικες μέσω ηλικιωμένων ποντικών με ΧΝΝ που προκαλείται από νεφρεκτομή 5/6 (5/6 Nx) ή εικονικές επεμβάσεις.

Σχετικά με το cistanche

2. Μέθοδοι

2.1 Ζωικό μοντέλο και προετοιμασία δειγμάτων

Αρσενικά ποντίκια C57Bl/6 ελήφθησαν από μια αποικία του Εθνικού Ινστιτούτου για τη Γήρανση σε ηλικίες 3, 15 και 21 μηνών. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε κύκλο 12-h φωτός / {12-h σκότους, στεγάστηκαν μεμονωμένα σε πολυανθρακικά κλουβιά με τυπική κλινοστρωμνή, τροφοδοτήθηκαν με Harlan Teklad 2920X τροφή και επετράπη ελεύθερη πρόσβαση στο νερό. Για καθεμία από τις τρεις ηλικίες, τα ποντίκια κατατάχθηκαν τυχαία σε ομάδες CKD ή Sham. Η ομάδα ΧΝΝ υποβλήθηκε σε νεφρεκτομή δύο σταδίων. Αυτές οι διαδικασίες περιγράφηκαν προηγουμένως (33). Εν συντομία, έγινε προσπέλαση του αριστερού νεφρού μέσω μιας τομής στη μέση γραμμή, αποκαψουλώθηκε για να αποφευχθεί η βλάβη του ουρητήρα και των επινεφριδίων και στη συνέχεια αφαιρέθηκε. Μία εβδομάδα αργότερα, ο δεξιός νεφρός αποκαψουλώθηκε και ο άνω και κάτω πόλος αφαιρέθηκαν μερικώς για να επιτευχθεί μείωση κατά 2/3 του όγκου των νεφρών. Η ομάδα ελέγχου έλαβε επεμβάσεις Sham (δηλαδή, τομή στη μέση γραμμή χωρίς βλάβη στους νεφρούς) εντός του ίδιου χρονικού πλαισίου. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 1,5 τοις εκατό ισοφλουράνιο κατά τη διάρκεια των διαδικασιών. Μια μετεγχειρητική δόση βουπρενορφίνης (0,5 mg/kg) χορηγήθηκε μετά από αυτές τις επεμβάσεις και πριν από την ανάρρωση, καθώς και κάθε 12 ώρες για τις επόμενες δύο ημέρες. Τα ποντίκια υπέστησαν ευθανασία μετά από τρεις μήνες μέσω CO2 και εξάρθρημα του τραχήλου της μήτρας. Στο τελικό σημείο της μελέτης, τα ποντίκια ήταν 6 (νεαροί ενήλικες, Sham: n=6, CKD: n {= 7), 18 (μέση ηλικία, Sham: n=8· CKD: n { {25}}) και 24 (ηλικίας; Sham: n=8; ΧΝΝ: n=8) μηνών. Όλες οι διαδικασίες για τα ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Χρήσης και Φροντίδας Ζώων στο Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Ντένβερ.

Το αριστερό μηριαίο οστό, η κνήμη, το βραχιόνιο, η ακτίνα και η ωλένη δεσμεύτηκαν για αναλύσεις ποιότητας των οστών. Η αριστερή κνήμη διατηρήθηκε σε αιθανόλη 70 τοις εκατό στους 4 βαθμούς C. Όλα τα άλλα οστά τυλίχτηκαν με γάζα βρεγμένη με φωσφορικά άλατα και αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς Κελσίου μέχρι την ανάλυση.

2.2 Χημεία ορού και ούρων

Πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές αναλύσεις ορού σε αίμα και ούρα που συλλέχθηκαν στο τελικό σημείο της μελέτης. Η ουρία ορού και ούρων, καθώς και οι συγκεντρώσεις φωσφορικού, ασβεστίου και PTH ορού, μετρήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BioAssays Systems και Immunotropics, αντίστοιχα).

2,3 microCT

Η μικροαρχιτεκτονική αξιολογήθηκε για το φλοιώδες οστό του μεσαίου άξονα του μηριαίου οστού και το δοκιδωτό οστό της εγγύς κνήμης χρησιμοποιώντας microCT για όλα τα ποντίκια της μελέτης (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Ελβετία). Τα μηριαία οστά αποψύχθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς C πριν από τη σάρωση. Η σάρωση πραγματοποιήθηκε με μέγεθος voxel 10 μm, ακολουθώντας τις μεθόδους λήψης και ανάλυσης που περιγράφηκαν προηγουμένως (10). Οι παράμετροι του φλοιού περιελάμβαναν όγκο οστού / συνολικό όγκο (BV/ TV), οστική επιφάνεια / συνολική επιφάνεια (BA/TA), φλοιώδες πορώδες (Ct. Po), πάχος φλοιού (Ct. Th), ολική ανόργανη πυκνότητα (TMD), μια στιγμή αδράνειας ως προς τον έσω-πλάγιο άξονα (IML), την απόσταση μεταξύ του κέντρου και της επιφάνειας του οστού στην πρόσθια-οπίσθια κατεύθυνση (C) και την πολική ροπή αδράνειας (pMOI) (34). Οι παράμετροι της δοκιδωτής περιελάμβαναν τον αριθμό δοκιδωτών (Tb.N), την απόσταση των δοκιδωτών (Tb.Sp), το πάχος της δοκιδωτής (Tb.Th), τον όγκο οστού (BV), τον συνολικό όγκο (TV), τον όγκο οστού / συνολικό όγκο (BV/TV), ογκομετρική οστική πυκνότητα (vBMD) και πυκνότητα συνδεσιμότητας (Conn.D). Μετά από microCT, τα μηριαία οστά τυλίχτηκαν και πάλι σε γάζα βρεγμένα με φωσφορικά και αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς C για επακόλουθο μηχανικό χαρακτηρισμό ολόκληρου του οστού.

2.4 Μηχανικές και υλικές ιδιότητες ολόκληρου του οστού

Μετά από microCT, τα αριστερά μηριαία οστά υπέστησαν κάμψη τριών σημείων (Insight II Material Testing System, 250 N load cell, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Τα μηριαία οστά αφαιρέθηκαν από γάζα εμποτισμένη με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά και δοκιμάστηκαν μέχρι αποτυχίας χρησιμοποιώντας ρυθμό εκτροπής 5 mm/min σε προσαρμοσμένο αμόνι με άνοιγμα 8 mm. Οι καμπύλες φορτίου-μετατόπισης αναλύθηκαν για μηχανικές ιδιότητες που περιλαμβάνουν ακαμψία, μέγιστο φορτίο, μετατόπιση στο μέγιστο φορτίο, ενέργεια στο μέγιστο φορτίο, φορτίο σε διαρροή, μετατόπιση σε διαρροή, ενέργεια σε διαρροή, μετατόπιση μετά τη διαρροή, φορτίο σε θραύση, μετατόπιση σε θραύση, και ενέργεια στο κάταγμα. Το σημείο διαρροής ορίστηκε ως η τομή μιας γραμμής τομής που χαράσσεται με 10 τοις εκατό μείωση της κλίσης από την αρχική ακαμψία εφαπτομένης και την καμπύλη φορτίου-μετατόπισης. Χρησιμοποιώντας τα IML και C από το μCT, υπολογίσαμε τις ιδιότητες του υλικού συμπεριλαμβανομένου του συντελεστή κάμψης, της τάσης διαρροής, της τελικής τάσης και της σκληρότητας από τα δεδομένα κάμψης τριών σημείων χρησιμοποιώντας τυπικές εξισώσεις κάμψης δέσμης όπως εφαρμόζονται στο μηριαίο οστό του ποντικού (35).

2.5 Ανάλυση πεπερασμένων στοιχείων ακαμψίας της εγγύς κνήμης

Για τη διερεύνηση της μηχανικής συμπεριφοράς του οστού, χρησιμοποιήθηκε υπολογιστική μοντελοποίηση πεπερασμένων στοιχείων (FE) για την προσομοίωση της αξονικής συμπίεσης της εγγύς κνήμης σε κάθε μοντέλο. Η εγγύς κνήμη επιλέχθηκε επειδή η κνήμη είναι μια δομή που φέρει φορτίο σε ποντίκια και είναι μια κοινή θέση ανάλυσης των ιδιοτήτων των οστών χρησιμοποιώντας microCT. Τα δεδομένα εικόνας MicroCT της εγγύς κνήμης (φλοιώδες και δοκιδωτό οστό) εξήχθησαν ως τομές εικόνας DICOM 16-bit για περαιτέρω τμηματοποίηση και κατασκευή των Μοντέλων Πεπερασμένων Στοιχείων για το συγκεκριμένο θέμα. Τα δεδομένα εικόνας DICOM εισήχθησαν στο Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Leuven Belgium) για επεξεργασία και τμηματοποίηση εικόνας, ώστε να δημιουργηθεί ένα αντίστοιχο μοντέλο FE για την ίδια εγγύς περιοχή της κνήμης του οστού που αναλύθηκε με microCT. Ο οστικός ιστός διαχωρίστηκε από άλλους ιστούς στην εικόνα χρησιμοποιώντας ένα κατώφλι κατάτμησης 313 mg/cm3 (36,37). Μόλις τμηματοποιήθηκε η περιοχή του οστού, εξήχθη το ειδικό για το θέμα πλέγμα FE, το οποίο περιείχε τόσο το φλοιώδες όσο και το δοκιδωτό διαμέρισμα. Το μοντέλο FE χρησιμοποίησε ένα εξαεδρικό πλέγμα FE με μέγεθος ισοτροπικού στοιχείου 10 μm.

Τα πλέγματα FE που εξήχθησαν από το Mimics εισήχθησαν στο ABAQUS CAE 6.9 για την εκχώρηση ιδιοτήτων υλικού, την εφαρμογή των οριακών συνθηκών και την προσομοίωση αξονικής μηχανικής φόρτισης. Οι ιδιότητες του υλικού του οστού προσδιορίστηκαν ως ομοιογενείς, ισότροπες και γραμμικές ελαστικές (Young's Modulus, E= 10 GPa and Poisson's Ratio, v= 0.3). Για την προσομοίωση της αξονικής συμπίεσης, εφαρμόστηκε μια σταθερή οριακή συνθήκη στους κόμβους στην κάτω επιφάνεια του οστού και μια μετατόπιση προς τα κάτω 5μm (0.5 τοις εκατό του ύψους του οστικού τμήματος) εφαρμόστηκε στους κόμβους στο την ανώτερη επιφάνεια του οστού. Η δομική ακαμψία των οστών υπολογίστηκε ως η δύναμη αντίδρασης (Ν) επί της εφαρμοζόμενης μετατόπισης.

2.6 Σκέδαση ακτίνων Χ μικρής γωνίας

Η παραμόρφωση των ινιδίων κολλαγόνου κατά τη διάρκεια της μονοαξονικής δοκιμής τάσης συνδυασμένων ωλένων και ακτίνων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας σκέδαση ακτίνων Χ μικρής γωνίας synchrotron (SAXS) στη γραμμή δέσμης 7.3.3 στην Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Τα οστά στερεώθηκαν με κόλλα και γυαλόχαρτο ανάμεσα στους σφιγκτήρες στο άπω και στο εγγύς άκρο τους. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές insitutile δοκιμές με ένα TST350 Tensile Testing Stage (Linkam Scientific Inc.) σε ενυδατωμένα δείγματα με ρυθμό μετατόπισης 2,5 μm/s. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, η διάφυση των οστών εκτέθηκε σε ακτίνες Χ 10 keV για 0,1 s κάθε 5 δευτερόλεπτα. Η συνολική ακτινοβολία περιορίστηκε στα 30 kGy για να μετριαστούν τυχόν επιπτώσεις της έκθεσης στη μηχανική απόδοση (39). Το διάκενο κολλαγόνου d, αντιπροσωπευτικό των επαναλαμβανόμενων περιοχών κενού εντός της υπερ-δομής κολλαγόνου, εμφανίζεται ως μια εξέχουσα κορυφή περίθλασης Bragg στο πρότυπο SAXS. Η ειδική για το κολλαγόνο παραμόρφωση κατά τη διάρκεια της δοκιμής εφελκυσμού μετρήθηκε παρακολουθώντας τη μετατόπιση στις θέσεις κορυφής Bragg σε αυξανόμενες ποσότητες φορτίου. Χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο πρόγραμμα LabVIEW, αυτή η προοδευτική αλλαγή στο μοτίβο σκέδασης μετατράπηκε σε στέλεχος ινιδίων κολλαγόνου με κανονικοποίηση στην απόσταση d σε μηδενικά φορτία, όπως συζητήθηκε προηγουμένως (40). Η τάση του ιστού υπολογίστηκε από τις δυνάμεις που καταγράφηκαν στο στάδιο της δοκιμής διαιρεμένες με τις μετρήσεις της περιοχής διατομής των οστών που δοκιμάστηκαν. Οι αθροιστικές περιοχές διατομής της ωλένης και της ακτίνας μετρήθηκαν από το μέσο του μήκους της ωλένης χρησιμοποιώντας ανακλαστική απεικόνιση φωτεινού πεδίου (Leica DM, 20x αντικειμενικός φακός) και ποσοτικοποιήθηκαν με ImageJ (41). Στελέχη ολικού ιστού οστού ελήφθησαν με ένα προσαρμοσμένο πακέτο MATLAB Συσχέτισης Ψηφιακής Εικόνας (DIC), το οποίο παρακολουθούσε και μέτρησε τις αποστάσεις μεταξύ ενός πλέγματος σημείων που επικαλύπτονταν στο δείγμα οστών καθ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Τα στελέχη που ελήφθησαν από το DIC συνδυάστηκαν με τάσεις σε επίπεδο ιστού για να δημιουργήσουν τυπικές καμπύλες τάσης-παραμόρφωσης. Από αυτές τις καμπύλες εξήχθη ο γραμμικός συντελεστής ελαστικότητας καθώς και η τάση διαρροής και η τάση διαρροής όπως ορίζονται από το σημείο απόδοσης μετατόπισης 0,2 τοις εκατό. Το στέλεχος του ιστού αντιστοιχίστηκε χρονικά με τα στελέχη κολλαγόνου από το SAXS στην απόδοση και στη μέγιστη τάση προκειμένου να παραχθούν συγκρίσεις των συστατικών που φέρουν πίεση με το οστό κατά τη διάρκεια της παραμόρφωσης.

Η ελεγχόμενη ανάλυση του σύνθετου υλικού ωλένης/ακτίνας κατά τη διάρκεια της δοκιμής εφελκυσμού πραγματοποιήθηκε με αντιστοίχιση της καταπόνησης σε επίπεδο ιστού από τις εικόνες της ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής με τα στελέχη που υπολογίστηκαν από τα μοτίβα σκέδασης ακτίνων Χ. Τα ψηφιακά βίντεο εξετάστηκαν ανεξάρτητα από δύο εκπαιδευμένους παρατηρητές για κάταγμα και ολίσθηση ιστού (π.χ. ολίσθηση μεταξύ της ωλένης και της ακτίνας). Αυτά τα συμβάντα στη συνέχεια αντιστοιχίστηκαν χρονικά με τις καμπύλες παραμόρφωσης και όλα τα δεδομένα τάσης-παραμόρφωσης περικόπηκαν στο πρώτο κάταγμα. Στην ανάλυση λήφθηκαν υπόψη μόνο δεδομένα μέχρι το πρώτο κάταγμα. Τα δείγματα αποκλείστηκαν εάν υπήρχε ολίσθηση μεταξύ των λαβών εφελκυσμού και των οστών ή εάν υπήρχε ολίσθηση μεταξύ της ακτίνας πριν από το πρώτο κάταγμα. Τα δείγματα αποκλείστηκαν επίσης εάν υπήρχε κακή αντιστοιχία μεταξύ των καμπυλών καταπόνησης ιστού και SAXS, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κηλίδα της δέσμης εστιαζόταν στην ωλένη αλλά το μεγαλύτερο μέρος της καταπόνησης μεταφέρθηκε στην ακτίνα.

2.7 Αξιολόγηση αντιστοίχισης θέσης της σύνθεσης και του συντελεστή οστικού ιστού σε μικροκλίμακα

Μετά από κάμψη τριών σημείων, τα μηριαία οστά αφυδατώθηκαν ιστολογικά σε μια διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης, καθαρίστηκαν σε ακετόνη και ενσωματώθηκαν σε PMMA. Τα ενσωματωμένα οστά τεμαχίστηκαν στο μηριαίο μεσαίο άξονα χρησιμοποιώντας ένα πριόνι με διαμάντια χαμηλής ταχύτητας (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Τα δείγματα αλέστηκαν χρησιμοποιώντας υγρό χαρτί καρβιδίου του πυριτίου (60{{1{{0}} και 1200 grit) και στη συνέχεια γυαλίστηκαν με πάστες αλουμίνας (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 μm) και εκλεκτά ρούχα Rayon (South Bay Technologies, San Clemente, CA) σε τελικό φινίρισμα 0,05 μm. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους μεταξύ κάθε σταδίου στίλβωσης.

Η φασματοσκοπία Raman πραγματοποιήθηκε σε χάρτες που καλύπτουν το πάχος του φλοιού με ένα προσαρμοσμένο σύστημα: ένα σύστημα ομοεστιακής μικροσκοπίας Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, UK) χρησιμοποιώντας φως λέιζερ μήκους κύματος 785 nm που δρομολογήθηκε μέσω καλωδίων οπτικών ινών 5 σε {4}}x αντικειμενικός στόχος (NA 0,75) τοποθετημένος σε ένα νανοindenter Z-stage (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Για κάθε τοποθεσία, συλλέχθηκαν 10 συσσωρεύσεις από 10-δεύτερες εκθέσεις. Σειρές τριών εσοχών που απέχουν μεταξύ τους 15 μm εκτείνονται κάθε 10 μm μέσω του πάχους του φλοιού.

Η βασική γραμμή φθορισμού αφαιρέθηκε με πολυωνυμική προσαρμογή 11ης τάξης και οι κοσμικές ακτίνες αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Renishaw WIRE. Ένα φάσμα αναφοράς PMMA αφαιρέθηκε από κάθε σημείο χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένο κώδικα MATLAB. Αυτά τα διορθωμένα φάσματα στη συνέχεια αναλύθηκαν για προλίνη (855 cm-1), φωσφορικό ν1 (961 cm-1) και ανθρακικό ν1 (1071 cm-1). Στη συνέχεια υπολογίστηκαν οι λόγοι επιφανειών για ορυκτό: μήτρα (φωσφορικό: προλίνη),

ανθρακικό: φωσφορικό άλας και κρυσταλλικότητα (αντίστροφο μισού πλάτους σε πλήρες μέγιστο ύψος της κορυφής φωσφορικού v1).

Έπειτα, πραγματοποιήθηκε η νανο-αυλάκωση σε θέσεις που ταιριάζουν με θέσεις που αξιολογήθηκαν με φασματοσκοπία Raman. Ένα σφαιρικό άκρο 5 μm οδήγησε το οστό στα 30 nm/s μέχρι να ληφθεί μέγιστο βάθος 500 nm. Αυτό το βάθος διατηρήθηκε για 120 δευτερόλεπτα για να επιτραπεί η διάχυση της ιξωδοελαστικής ενέργειας. Ο μειωμένος συντελεστής (Er) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Oliver-Pharr, λαμβάνοντας υπόψη το πρώτο 45 τοις εκατό της καμπύλης εκφόρτωσης (42,43).

2.8 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης

Το βραχιόνιο τμήμα αφαιρέθηκε από όλο τον μαλακό ιστό και ο μυελός των οστών αφαιρέθηκε με νερό. Τα Humeri ήταν C, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για να εξατμιστεί η περίσσεια HCl. Τα φιλτραρισμένα δείγματα αραιώθηκαν 1:5 σε 10 τοις εκατό ακετονιτρίλιο και 0.05 τοις εκατό επταφθοροβουτυρικό οξύ (HFBA), φορτώθηκαν σε Gemini-NX C αντίστροφης φάσης{{7} } στήλη (Phenomenex, Torrance, CA) και αναλύθηκαν για διασταυρούμενες συνδέσεις υδροξυλυσυλπυριδινολίνη (HP), λυσυλοπυριδινολίνη (LP) και πεντοσιδίνη σύμφωνα με μεθόδους που περιγράφονται από την Bank etal(44). Λεπτομέρειες του συστήματος HPLC (μοντέλο 126, Beckman- Coulter, Fullerton, CA) περιγράφονται εκτενώς στο Oren etal(45). Ο διαχωρισμός των σταυροδεσμών κολλαγόνου περιελάμβανε το ακόλουθο πρωτόκολλο: 15 λεπτά. του διαλύτη που περιέχει 24 τοις εκατό μεθανόλη και 0.15 τοις εκατό HFBA, 10 min. του διαλύτη που περιέχει 40 τοις εκατό μεθανόλη και 0,05 τοις εκατό HFBA, και 10 λεπτά. του διαλύτη που περιέχει 75 τοις εκατό ακετονιτρίλιο και 0,1 τοις εκατό HFBA. Η στήλη εξισορροπήθηκε σε 24 τοις εκατό μεθανόλη και 0,15 τοις εκατό HFBA για τουλάχιστον 10 λεπτά. μεταξύ δειγματοληψιών. Οι κορυφές σταυροσύνδεσης κολλαγόνου μετρήθηκαν με έναν ανιχνευτή φθορισμού (FP1520, JASCO, Easton, ML). Τα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής ήταν 295 nm και 400 nm, αντίστοιχα, για τα HP και LP. Η πεντοσιδίνη ανιχνεύθηκε με διέγερση 328 nm και εκπομπή 378 nm. Οι καμπύλες βαθμονόμησης δημιουργήθηκαν από τις μετρούμενες εντάσεις πέντε αραιώσεων ενός βαθμονομητή που περιείχε καθαρισμένο HP και LP (Quidel Corporation) και πεντοσιδίνη (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

Οι συγκεντρώσεις σταυροδεσμών στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν στη συγκέντρωση κολλαγόνου. Το κολλαγόνο υπολογίστηκε από τη συγκέντρωση της υδροξυπρολίνης στο δείγμα που αναλύθηκε για διασταυρώσεις. Ένα κλάσμα του δείγματος που αναλύθηκε για διασταυρώσεις αραιώθηκε 1:50 και παραγωγοποιήθηκε με 9-χλωρομυρμηκικό φθορονυλμεθυλεστέρα (46). Τα ακόλουθα διαλύματα χρησιμοποιήθηκαν για το πρωτόκολλο αμινοξέων (1) 20 mM κιτρικό οξύ, 5 mM χλωριούχο τετραμεθυλαμμώνιο και 0,01 τοις εκατό αζίδιο του νατρίου, pH 2,85. (2) 20 mM οξικό νάτριο, 5 mM χλωριούχο τετραμεθυλαμμώνιο και 0,01 τοις εκατό αζίδιο του νατρίου, ρΗ 4,5 και (3) 100 τοις εκατό ακετονιτρίλιο. Το προφίλ έκλουσης βαθμίδωσης ακολουθεί: από 0–11,5 λεπτά. κλίση 75 τοις εκατό (1) / 25 τοις εκατό (3) έως 60 τοις εκατό (1)/40 τοις εκατό (3), σε 13 λεπτά. εναλλαγή σε 64 τοις εκατό (2) / 36 τοις εκατό (1), από 13,1 −18 λεπτά. κλίση 64 τοις εκατό (2) / 36 τοις εκατό (3) έως 62 τοις εκατό (2) / 38 τοις εκατό (3), μετά στα 18 λεπτά. μια αλλαγή στο 25 τοις εκατό (2) / 75 τοις εκατό (3) μέχρι το τέλος της εκτέλεσης στα 23 λεπτά. Η στήλη εξισορροπήθηκε σε 75 τοις εκατό (1) / 25 τοις εκατό (3) για τουλάχιστον 10 λεπτά. μεταξύ δειγματοληψιών. Οι κορυφές αμινοξέων παρακολουθήθηκαν σε διέγερση 254 nm και εκπομπή 630 nm. Μια καμπύλη βαθμονόμησης δημιουργήθηκε από πέντε αραιώσεις ενός προτύπου αμινοξέος που παρασκευάστηκε από προϊόν υδρόλυσης κολλαγόνου (Sigma-Aldrich #Α9531, St. Louis, Missouri). Το κολλαγόνο έχει σταθερή συγκέντρωση υδροξυπρολίνης, επομένως η συγκέντρωση υδροξυπρολίνης μετατράπηκε σε συγκέντρωση κολλαγόνου (285 mol υδροξυπρολίνης ανά mol κολλαγόνου).

2.9 Μέτρηση Φθορισμού AGEs

Τα φθορίζοντα AGE σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκαν με μια φθορομετρική ανάλυση που συγκρίνει τον όγκο ενδογενή φθορισμό του οστικού ιστού με ένα πρότυπο κινίνης. Ένα κλάσμα του υδρολυμένου οστού που εναιωρήθηκε εκ νέου με το εσωτερικό πρότυπο για HPLC αραιώθηκε με νερό DI σε συγκέντρωση 1,6 ug οστού/ml διαλύματος. Ο φθορισμός του αραιωμένου προϊόντος υδρόλυσης και ενός σειριακά αραιωμένου μητρικού διαλύματος κινίνης (απόθεμα: 10 ug κινίνης/ml 0,1 N H2SO4) μετρήθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού (Προϊόν #3370, Corning) χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών (Synergy H1, BioTek) σε διέγερση 360 nm και εκπομπή 460 nm.

Τα μαζικά φθορίζοντα AGE κανονικοποιήθηκαν στο περιεχόμενο κολλαγόνου του οστικού ιστού χρησιμοποιώντας μια χρωματομετρική δοκιμασία υδροξυπρολίνης. Εν συντομία, το προϊόν υδρόλυσης αραιώθηκε περαιτέρω σε συσσωρευμένο μητρικό διάλυμα υδροξυπρολίνης (200 μg L-υδροξυπρολίνη/ml 0,001 Ν HCl). Στο αραιωμένο υδρόλυμα προστέθηκε χλωραμίνη-Τ για να ξεκινήσει η αντίδραση και τα διαλύματα επωάστηκαν για 20 λεπτά. σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση διακόπηκε με προσθήκη 3,15 Μ υπερχλωρικού οξέος και μετά από 5-λεπτό. περίοδο επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκε ρ-διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδη. Στη συνέχεια, το διάλυμα επωάστηκε σε λουτρό νερού 60 μοιρών για 20 λεπτά, και στη συνέχεια ψύχθηκε σε κρύο νερό στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Η απορρόφηση των δειγμάτων και των προτύπων μετρήθηκε σε μήκος κύματος 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Τα φθορίζοντα AGEs αναφέρονται σε μονάδες ng φθορισμού κινίνης/mg κολλαγόνου.

2.10 3Δ λανθάνουσα γεωμετρία οστεοκυττάρων

Η αριστερή κνήμη αφυδατώθηκε ιστολογικά σε μια διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης και χρωματίστηκε με 1 τοις εκατό βασική φουξίνη (47). Οι κνήμες στη συνέχεια καθαρίστηκαν με ακετόνη και ενσωματώθηκαν σε πολυ(μεθυλ)μεθακρυλικό (ΡΜΜΑ). Τα ενσωματωμένα δείγματα τεμαχίστηκαν εγκάρσια 1 mm εγγύς στη συμβολή κνήμης- περόνης με ένα πριόνι χαμηλής ταχύτητας (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Παρασκευάστηκε ένα τμήμα εδάφους από το περιφερικό τμήμα με ένα στόχο πάχους 200 um (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, ΟΚ).

Η απεικόνιση των τμημάτων εδάφους πραγματοποιήθηκε σε μετάδοση με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Zeiss LSM 710, με διέγερση 555 nm, φίλτρο ζώνης 568–1000 nm και αντικειμενικό στόχο εμβάπτισης λαδιού 40x. Η ανάλυση στις κατευθύνσεις x, y και z ήταν 0,447 και 0,493 μm, αντίστοιχα. Λήφθηκαν κάθετες στοίβες z μέσω του ορατού εύρους κενών οστεοκυττάρων (50-100 μm βάθους απεικόνισης). Οι τρισδιάστατες εικόνες των κενών οστεοκυττάρων κατασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για λανθάνουσα γεωμετρία χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ανοιχτού κώδικα 3D Osteocyte Lacunae Analysis και MATLAB v17 (2 ). Εν συντομία, κάθε εικόνα 2D σε μια στοίβα z τμηματοποιήθηκε αυτόματα για να οριστούν κενά, τα οποία στη συνέχεια ανακατασκευάστηκαν σε 3D. Με βάση τα καλύτερα προσαρμοσμένα ελλειψοειδή, τα κενά αναλύθηκαν ως προς τον όγκο, το εμβαδόν επιφάνειας, το πλησιέστερο κέντρο μάζας, τη σφαιρικότητα (αναλογία μικρότερης προς τη μεγαλύτερη κενωτή ακτίνα, όπου 1=σφαίρα), span theta (απόλυτη τιμή της διαφοράς του Τρισδιάστατο διάνυσμα που περιγράφει την κατεύθυνση του κύριου άξονα από τη μέση κατεύθυνση όλων των κενών), την λοξότητα (−1=τέλεια προτεινόμενη, 1=τέλεια πλάγια) και την πυκνότητα του κενού αριθμού (αριθμός οστεοκυττάρων/όγκος εικόνας).

2.11 Ανάλυση δεδομένων

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Για κάθε συστοιχία από τη φασματοσκοπία Raman και η νανο-εσοχή υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο έτσι ώστε κάθε οστό είχε μία τιμή για κάθε μέτρο μικροκλίμακας. Ομοίως, υπολογίστηκε μια τυπική απόκλιση για κάθε συστοιχία για να εκτιμηθεί η χωρική μεταβλητότητα του οστικού ιστού σε μικροκλίμακα. Τα αποτελέσματα της γήρανσης και της ΧΝΝ, καθώς και η αλληλεπίδρασή τους, δοκιμάστηκαν με αμφίδρομη ANOVA για όλες τις παραμέτρους. Οι εξαρτημένες μεταβλητές μετασχηματίστηκαν εάν χρειαζόταν για να ικανοποιηθούν οι υποθέσεις της υπολειπόμενης κανονικότητας και ομοσκεδαστικότητας. Η σημασία για τα κύρια εφέ ορίστηκε εκ των προτέρων σε p < 0.05.="" στην="" περίπτωση="" σημαντικής="" αλληλεπίδρασης="" μεταξύ="" ηλικίας="" και="" χνν,="" διενεργήθηκε="" εκ="" των="" υστέρων="" έλεγχος="" για="" να="" ελεγχθεί="" η="" επίδραση="" της="" χνν="" σε="" κάθε="" ηλικία.="" ένα="" οικογενειακό="" σφάλμα="" ελέγχθηκε="" για="" αυτές="" τις="" εκ="" των="" υστέρων="" αναλύσεις="" χρησιμοποιώντας="" άλφα="" προσαρμοσμένο="" από="" το="" bonferroni,="" το="" οποίο="" οδήγησε="" σε="" κρίσιμο="" άλφα="" 0.05="" 3="0.017." τα="" αποτελέσματα,="" όπου="" οι="" συγκρίσεις="" απλών="" επιδράσεων="" είχαν="" τιμές="" p="" μεταξύ="" 0,017="" και="" 0,05,="" ερμηνεύτηκαν="" ως="" μη="">

Διεξήχθη γραμμική παλινδρόμηση για να ελεγχθεί εάν οι μετρήσεις ποιότητας οστού σε νανομικροκλίμακα προβλέπουν τη μηχανική σκληρότητα ολόκληρου του οστού. Επειδή οι μηχανικές ιδιότητες ολόκληρου του οστού δείχνουν ισχυρή εξάρτηση από την ηλικία, αυτή η γραμμική παλινδρόμηση περιελάμβανε την ηλικία ως συμμεταβλητή. Οι συσχετίσεις Spearman αξιολογήθηκαν επίσης για τις κενές γεωμετρίες των οστεοκυττάρων και τις μετρήσεις από τη χημεία του ορού και των ούρων και για την PTH και τις μετρήσεις της ποιότητας των οστών σε μικροκλίμακα. Η σημασία για γραμμικές παλινδρομήσεις και συσχετίσεις ορίστηκε στο p < 0.05.="" το="" minitab="" (v17)="" χρησιμοποιήθηκε="" για="" όλες="" τις="">

Τα ακραία σημεία προσδιορίστηκαν μέσω της δοκιμής Grubbs (επίπεδο σημαντικότητας=0.05). Αρκετές ακραίες τιμές εξαιρέθηκαν από τις αναλύσεις ασβεστίου και ουρίας ορού. Μια ακραία τιμή για κάθε 24-μήνα Sham και CKD εξαιρέθηκε για όλες τις αναλύσεις μικροαρχιτεκτονικής του φλοιού και της δοκιδωτής, καθώς και για την ανάλυση FEA. Ένα ακραίο στοιχείο εξαιρέθηκε από την 24-ομάδα CKD του μήνα για ανάλυση LP και ένα ακραίο στοιχείο εξαιρέθηκε για την ομάδα Sham 24-μήνα για σκληρότητα, εργασία έως θραύση και μετατόπιση μετά την απόδοση. Βρέθηκε ένα ξεχωριστό 24-μήνα Sham outlier για την τυπική απόκλιση του συντελεστή νανοοδοντοποίησης και την τυπική απόκλιση της κρυσταλλικότητας.