Η αναστολή GSK3 με φωσφορυλίωση στο Ser389 Ελέγχει τη νευροφλεγμονή
Oct 24, 2023
Αφηρημένη: Η αναστολή της γλυκογόνου συνθάσης κινάσης 3 (GSK3) με φωσφορυλίωση Ser9 επηρεάζει πολλές φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανοσοαπόκρισης. Ωστόσο, οι συνέπειες της αναστολής της GSK3 από εναλλακτική φωσφορυλίωση Ser389 παραμένουν ελάχιστα χαρακτηρισμένες. Εδώ εξετάσαμε τη νευροφλεγμονή σε ποντίκια GSK3 Ser389 knock-in (KI), στα οποία η φωσφορυλίωση του Ser389 GSK3 είναι εξασθενημένη. Ο αριθμός των ενεργοποιημένων μικρογλοίων/διηθημένων μακροφάγων, αστροκυττάρων και διεισδυμένων ουδετερόφιλων ήταν σημαντικά υψηλότερος σε αυτά τα ζώα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα C57BL/6J άγριου τύπου (WT), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αποτυχία αδρανοποίησης του GSK3 από τη φωσφορυλίωση Ser389 οδηγεί σε παρατεταμένη χαμηλής ποιότητας νευροφλεγμονή. Επιπλέον, η ενεργοποίηση των γλοιακών κυττάρων και η διήθηση του εγκεφάλου των ανοσοκυττάρων σε απόκριση στον λιποπολυσακχαρίτη (LPS) απέτυχε σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI. Τέτοιες επιδράσεις ήταν ειδικά για τον εγκέφαλο, καθώς η περιφερική ανοσία δεν επηρεάστηκε παρόμοια. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση του συμπλέγματος κινάσης IkB (IKK) σε απόκριση στο LPS απέτυχε σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI, ενώ η φωσφορυλίωση STAT3 διατηρήθηκε πλήρως, υποδηλώνοντας ότι η οδός σηματοδότησης NF-κB επηρεάζεται ειδικά από αυτή τη ρυθμιστική οδό GSK3. Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η απενεργοποίηση της GSK3 με φωσφορυλίωση Ser389 ελέγχει τη φλεγμονώδη απόκριση του εγκεφάλου, αυξάνοντας την ανάγκη αξιολόγησης του ρόλου της στην εξέλιξη των νευροφλεγμονωδών παθολογιών.
cistanche tubulosa - Αντιφλεγμονώδες
Λέξεις-κλειδιά: νευροφλεγμονή; μικρογλοία? αστροκύτταρα; ουδετερόφιλα; Σηματοδότηση NF-κB; κυτταρομετρία ροής
Τι κάνει το βότανο cistanche—Αντί-φλεγμονώδης
Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche
【Ζήτα περισσότερα】Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Εισαγωγή
Η κινάση συνθάσης γλυκογόνου 3 (GSK3) είναι μια κινάση σερίνης-θρεονίνης με ευρεία εξειδίκευση. Το GSK3 ρυθμίζει διαδικασίες τόσο διαφορετικές όπως η φλεγμονή, η κυτταρική ανάπτυξη, η διαφοροποίηση των κυττάρων και ο ενεργειακός μεταβολισμός και εμπλέκεται σε ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία όπως ο διαβήτης, η νόσος του Αλτσχάιμερ και ο καρκίνος [1]. Και οι δύο ισομορφές GSK3, GSK3 και GSK3, εκφράζονται παντού, αλλά οι λειτουργίες τους δεν επικαλύπτονται πλήρως [2]. Η GSK3 είναι ιδιοσυστατικά ενεργή, αν και η δράση της μπορεί να ανασταλεί με απομόνωση σε σύμπλοκα κυτοσολίου καθώς και με φωσφορυλίωση στα υπολείμματα Ser9 και Ser389 [3]. Η επαγόμενη από Akt φωσφορυλίωση της GSK3 στο Ser9 είναι μια ρυθμιστική οδός GSK3 που υπάρχει στους περισσότερους τύπους κυττάρων και είναι η προεπιλεγμένη οδός για τον περιορισμό της ενεργοποίησης της GSK3 και την πρόληψη του κυτταρικού θανάτου. Αντίθετα, βρήκαμε ότι η επαγόμενη από το p38 MAPK φωσφορυλίωση Ser389 περιορίζεται σε συγκεκριμένους ιστούς όπως ο εγκέφαλος, ο θύμος και ο σπλήνας [4] και ότι η έκφραση του εγκεφάλου του φωσφο-Ser389 GSK3 ρυθμίζεται αναπτυξιακά [5]. Η φωσφορυλίωση του GSK3 από το Ser389 πυροδοτείται κυρίως από την απόκριση θραύσης διπλού κλώνου DNA και είναι κρίσιμο να επιτραπεί η επιδιόρθωση του DNA [6,7]. Έτσι, ενώ η φωσφορυλίωση στο Ser9 είναι η κύρια οδός για την απενεργοποίηση της κυτταροπλασματικής GSK3, η φωσφορυλίωση Ser389 χρησιμοποιείται για την αδρανοποίηση της πυρηνικής δεξαμενής της GSK3 για την αύξηση της επιβίωσης κατά την επιδιόρθωση του DNA DSB [8]. Η αποτυχία αδρανοποίησης της GSK3 μέσω της φωσφορυλίωσης Ser389 σε απόκριση στο DSB οδηγεί σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο από νεκρόπτωση [6,7]. Αυτό είναι πολύ σημαντικό επειδή ο νεκροπτωτικός τύπος θανάτου είναι πιο φλεγμονώδης και έχει βρεθεί σε φλεγμονώδεις ασθένειες [9]. Ωστόσο, σε αντίθεση με τη φωσφορυλίωση του Ser9, οι επιπτώσεις της φωσφορυλίωσης του GSK3 στο Ser389 παραμένουν ελάχιστα χαρακτηρισμένες. Ένας αριθμός μελετών έχει υποστηρίξει τη συσχέτιση μεταξύ GSK3 και φλεγμονής. Έτσι, η ενεργοποίηση της GSK3 από φλεγμονώδη ερεθίσματα όπως το στρες, η μόλυνση ή το τραύμα προάγει την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών όπως η IL-6, η IL-1 και η IFN, ενώ η αναστολή της GSK3 καταστέλλει τη σύνθεση προφλεγμονώδεις μεσολαβητές και αυξάνει την παραγωγή IL-10 από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού [10]. Η GSK3 μπορεί να ενεργοποιηθεί από λιποπολυσακχαρίτη (LPS), μία από τις κύριες ανοσοδιεγερτικές ενδοτοξίνες των Gram-αρνητικών βακτηρίων [11,12]. Κατά τη δέσμευση του βακτηριακού LPS σε υποδοχείς τύπου Toll (TLRs), το GSK3 μεσολαβεί στην απελευθέρωση φλεγμονωδών κυτοκινών στα κύτταρα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος [13]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η χορήγηση αναστολέων GSK3 σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με μια θανατηφόρα δόση LPS αυξάνει σημαντικά την επιβίωση των ζώων [14]. Παρά αυτές τις προφλεγμονώδεις επιδράσεις που σχετίζονται με το GSK3, έχουν επίσης τεκμηριωθεί αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα [15,16]. Έτσι, η ρύθμιση της GSK3 είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ των προ- και αντιφλεγμονωδών κυτοκινών μετά την ενεργοποίηση του TLR [17]. Ο πυρηνικός παράγοντας kB (NF-kB) μεσολαβεί στην παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών και είναι ένας από τους κύριους μεταγραφικούς παράγοντες που ενεργοποιούνται από τα TLR. Αρκετοί συγγραφείς έχουν επιβεβαιώσει ότι το GSK3 είναι σε θέση να ενεργοποιήσει τη σηματοδότηση NF-kB μέσω φωσφορυλίωσης του συμπλόκου κινάσης IkB (IKK), το οποίο φωσφορυλιώνει το IkB και απελευθερώνει ενεργό NF-kB. Ένας άλλος μεταγραφικός παράγοντας που φωσφορυλιώνεται από το GSK3 είναι ένας μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής-3 (STAT3), ο οποίος μεσολαβεί στη νευροφλεγμονή στο πλαίσιο του σηπτικού σοκ [18]. Η φωσφορυλίωση STAT3 από το GSK3 οδηγεί σε πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση. Επιπλέον, η GSK3 αναστέλλει τις αντιφλεγμονώδεις μεταγραφικές δραστηριότητες CREB και AP-1, ενισχύοντας την έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών [10,19]. Τα κύτταρα μικρογλοίας είναι μακροφάγα που κατοικούν στο ΚΝΣ. Μαζί με τα διηθημένα λευκοκύτταρα, η ενεργοποίηση της μικρογλοίας παίζει κρίσιμο ρόλο στη νευροφλεγμονή. Τα αστροκύτταρα είναι επίσης νευρογλοιακά κύτταρα με νευροάνοσες λειτουργίες καθώς συνομιλούν με μικρογλοία, λευκοκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα, ρυθμίζοντας έτσι τόσο τις εγγενείς όσο και τις προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις [20]. Η ενεργοποίηση των μικρογλοίων και των αστροκυττάρων ως απόκριση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα (γλοίωση) χαρακτηρίζεται από σημαντικές κυτταρικές αλλαγές που περιλαμβάνουν πολλαπλασιασμό, υπερτροφία και απελευθέρωση κυτοκίνης [21]. Το GSK3 έχει εμπλακεί στην ανάπτυξη γλοίωσης ως απόκριση στο LPS ή με υπερέκφραση του νευρικού GSK3 [22]. Υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι η νευρογλοιακή αντιδραστικότητα και η νευροφλεγμονή που προκαλείται από το GSK3 μπορεί να μεσολαβούν από την ενεργοποίηση της οδού NF-kB στον εγκέφαλο [19,23]. Αντίθετα, η απενεργοποίηση της GSK3 μειώνει τη γλοιακή αντιδραστικότητα, περιορίζει τη νευροφλεγμονώδη απόκριση και αυξάνει την αντιφλεγμονώδη δραστηριότητα CREB στα νευρικά κύτταρα [24]. Κατά συνέπεια, έχει προταθεί ότι η GSK3 παίζει θεμελιώδη ρόλο στην εξέλιξη νευροφλεγμονωδών διαταραχών, όπως η νόσος του Αλτσχάιμερ και η σκλήρυνση κατά πλάκας [25]. Η φωσφορυλίωση είναι ένας ρυθμιστικός μηχανισμός της δραστηριότητας της GSK3 με σημαντικές επιπτώσεις στον έλεγχο της ανοσολογικής απόκρισης. Έτσι, η αναστολή της GSK3 από την κλασική φωσφορυλίωση Ser9 ρυθμίζει προς τα πάνω την παραγωγή αντιφλεγμονωδών μεσολαβητών και μειώνει την απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών [26], αν και εμπλέκεται επίσης στην επίλυση της φλεγμονής σε ένα μοντέλο πειραματικής κολίτιδας που προκαλείται από τρινιτροβενζολοσουλφονικό οξύ [27]. Εντός του εγκεφάλου, η ελαττωματική αναστολή της GSK3 από τη φωσφορυλίωση Ser9 έχει συσχετιστεί με φλεγμονώδεις νευροπαθολογίες όπως η νόσος του Πάρκινσον [28] και η σχιζοφρένεια [29]. Αντίθετα, παρά τα υψηλά επίπεδα φωσφο-Ser389 GSK3 που βρίσκονται στον εγκέφαλο [4], παραμένει άγνωστο εάν αυτή η οδός για την απενεργοποίηση της GSK3 παίζει ρόλο στον συντονισμό της νευροφλεγμονής. Εδώ, διερευνούμε τον πιθανό ρόλο της αδρανοποίησης GSK3 που προκαλείται από φωσφορυλίωση Ser389 στη νευροφλεγμονή χρησιμοποιώντας ποντίκια GSK3 KI στα οποία το GSK3 Ser389 αντικαταστάθηκε από Ala για να αποτραπεί η C-τερματική φωσφορυλίωση της GSK3 [7,8]. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι η αποτυχία αδρανούς GSK3 με φωσφορυλίωση στο Ser389 κάτω από φυσιολογικές συνθήκες οδηγεί σε χρόνια χαμηλού βαθμού νευροφλεγμονή καθώς και στην έλλειψη απόκρισης σε φλεγμονώδη ερεθίσματα όπως το LPS. Αυτή η χρόνια φλεγμονή φαίνεται να είναι ειδική για τον εγκέφαλο, καθώς το περιφερειακό ανοσοποιητικό σύστημα είναι σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστο. Δείχνουμε επίσης ότι η απουσία φωσφο-Ser389 GSK3 στον εγκέφαλο ποντικών GSK3 KI ρυθμίζει τη σηματοδότηση NF-kB, η οποία είναι ένα κεντρικό γεγονός στον έλεγχο της νευροφλεγμονής. Ως εκ τούτου, τα ευρήματά μας παρέχουν υποστήριξη για τη συμμετοχή της αδρανοποίησης GSK3 με φωσφορυλίωση Ser389 σε φλεγμονώδεις νευροπαθολογίες.
2. Αποτελέσματα
2.1. Η αποτυχία απενεργοποίησης του GSK3 από τη φωσφορυλίωση Ser389 οδηγεί σε αυξημένη βασική νευροφλεγμονή
Η απενεργοποίηση της GSK3 με φωσφορυλίωση στο Ser9 έχει συσχετιστεί με ένα αντιφλεγμονώδες στάδιο στον εγκέφαλο [30]. Αν και η απενεργοποίηση της GSK3 με φωσφορυλίωση στο Ser389 είναι σημαντική για τη μείωση του νευρωνικού θανάτου που προκαλείται από θραύσματα διπλής έλικος DNA στον εγκέφαλο, καμία μελέτη δεν έχει διερευνήσει εάν αυτή η οδός θα μπορούσε επίσης να ρυθμίσει τη νευροφλεγμονώδη απόκριση. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε τα προηγουμένως περιγραφέντα ποντίκια GSK3 Ser389 KI, στα οποία το Ser389 αντικαθίσταται από Ala, για να αποτρέψουμε τη φωσφορυλίωση του Ser389. Εξετάσαμε μόνιμα και διηθημένα ανοσοκύτταρα σε ολόκληρο τον εγκέφαλο (εκτός της παρεγκεφαλίδας και των οσφρητικών βολβών) από ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI με μηχανική διάσταση του ιστού και διαβάθμισης Percoll, ακολουθώντας ένα προηγουμένως βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο για τη λήψη ενός ισορροπημένου μείγματος μόνιμων και διηθημένων κυττάρων στον εγκέφαλο, συμπεριλαμβανομένων μικρογλοίων/μακροφάγων, αστροκυττάρων, διηθημένων ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων [31]. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τυπικούς δείκτες (Εικόνα S1 στα Συμπληρωματικά Υλικά) [31-33]. Τα ενεργοποιημένα και ηρεμούντα μικρογλοία/μακροφάγοι ταυτοποιήθηκαν ως CD11b+CD45high και CD11b+CD45low, αντίστοιχα, ενώ ο λεμφοκυτταρικός πληθυσμός σημειώθηκε ως CD45+CD11b- [32,34]. Τα ουδετερόφιλα χαρακτηρίστηκαν ως κύτταρα CD45+Ly6G+. και τα αστροκύτταρα ορίστηκαν εντός του πληθυσμού CD45- από την έκφραση του αντιγόνου κυτταρικής επιφάνειας-2 (ACSA-2). Αυτός ο δείκτης χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αναπτυσσόμενων και ενηλίκων αστροκυττάρων [35]. Ανοδική ρύθμιση του ACSA-2 έχει παρατηρηθεί σε αντιδραστικά αστροκύτταρα που σχετίζονται με φλεγμονώδεις καταστάσεις, όπως η αυτοάνοση απομυελίνωση [36]. Βρήκαμε προηγουμένως ότι ο αριθμός των αστροκυττάρων ACSA-2+ σε εγκεφάλους ποντικών αυξάνεται μετά τη θεραπεία με LPS, υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι το επίπεδο έκφρασης ACSA-2 συσχετίζεται με την ενεργοποίηση αστροκυττάρων ως απόκριση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα [31]. Αν και το ACSA{39}} μπορεί επίσης να εκφραστεί σε έναν μικρό υποπληθυσμό μικρογλοίων και μακροφάγων [35], αυτά τα κύτταρα βρίσκονται εντός του πληθυσμού CD45+. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των απομονωθέντων κυττάρων εγκεφάλου από ποντικούς υπό φυσιολογικές συνθήκες αποκάλυψε μια αξιοσημείωτη αύξηση στο κλάσμα των ενεργοποιημένων μικρογλοίων/μακροφάγων σε ποντικούς GSK3 Ser389 KI σε σύγκριση με ποντίκια WT (Εικόνα 1α). Αντίθετα, το ποσοστό των μικρογλοίων ηρεμίας μειώθηκε στους εγκεφάλους των ποντικών GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 1β). Επιπλέον, υπήρξε αξιοσημείωτη αύξηση στην παρουσία αστροκυττάρων ACSA-2+ (δηλαδή, ενεργοποιημένων αστροκυττάρων) σε ποντικούς GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 1γ). Όσον αφορά τη διήθηση των ανοσοκυττάρων στον εγκέφαλο, υπήρξε σαφής συσσώρευση ουδετερόφιλων στον εγκέφαλο ποντικών GSK3 Ser389 KI σε σχέση με ποντίκια WT (Εικόνα 1δ), καταδεικνύοντας περαιτέρω την παρουσία συνεχιζόμενης φλεγμονώδους απόκρισης στον εγκέφαλο ποντικών GSK3 Ser389 KI υπό φυσιολογική συνθήκες. Ωστόσο, η συχνότητα των CD45+CD11b- λευκοκυττάρων (κυρίως λεμφοκυτταρικά κύτταρα) στον εγκέφαλο δεν επηρεάστηκε σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 1e). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αποτυχία αναστολής της GSK3 με φωσφορυλίωση στο Ser389 οδηγεί σε μια χρόνια έμφυτη φλεγμονώδη απόκριση στον εγκέφαλο που προκαλεί αντιδραστικότητα μεταξύ μικρογλοίας και αστροκυττάρων.
Εικόνα 1. Η απενεργοποίηση της GSK3 με φωσφορυλίωση Ser389 επηρεάζει τους πληθυσμούς των εγκεφαλικών κυττάρων που εμπλέκονται στη νευροφλεγμονή. Εγκέφαλοι από ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI αφαιρέθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των (α) CD11b++CD45 ενεργοποιημένων μικρογλοίων/μακροφάγων υψηλού επιπέδου, (β) CD11b{{9}CD45 μικρογλοίας χαμηλής ηρεμίας, (γ) ACSA -2+ αστροκύτταρα, (δ) ουδετερόφιλα Ly6G+ και (ε) CD11b− λεμφοκύτταρα. Τα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των κυττάρων, εκφρασμένο ως το ποσοστό των κυττάρων CD45− (αστροκύτταρα) ή των κυττάρων CD45+ (όλοι οι άλλοι πληθυσμοί). Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SEM (n=7–9). Το Student t-test εφαρμόστηκε για να συγκριθούν οι γονότυποι. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, άγριου τύπου; KI και GSK3 Ser389 knockin.
2.2. Έλλειψη επίδρασης της φωσφορυλίωσης GSK3 στο Ser389 στα κύτταρα της σπλήνας
Για να διερευνήσουμε εάν η αλλοιωμένη φλεγμονώδης κατάσταση που ανιχνεύθηκε σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI περιορίζεται στον εγκέφαλο ή εάν η επίδραση είναι επίσης συστηματική, πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τους διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς στον σπλήνα. Τα ουδετερόφιλα ταυτοποιήθηκαν ως κύτταρα Ly6G+. Η έκφραση του Ly6G ήταν εξαιρετικά μεταβλητή αφού εξαρτάται από το στάδιο ωρίμανσης των κυττάρων, όπως φαίνεται προηγουμένως [37]. Επιπλέον, μονοκυτταρικά μυελοειδή κύτταρα επισημάνθηκαν ως κύτταρα Ly6G–CD38+CD11b+. Αυτά τα μονοκύτταρα/μακροφάγα παρουσίασαν δύο σαφώς διακριτούς πληθυσμούς με βάση τα επίπεδα έκφρασης του CD38, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [38]. Κύτταρα CD8+, κύτταρα CD4+ και κύτταρα Β220+ (κύτταρα Β) αξιολογήθηκαν επίσης (Εικόνα S2 στο Συμπληρωματικό Υλικό).
Σχήμα 2. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής δείχνει παρόμοιους πληθυσμούς σπληνικών κυττάρων σε ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI. Μετά τη διάσταση των κυττάρων της σπλήνας, χρησιμοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής για την αξιολόγηση του αριθμού των (α) Ly6G+ ουδετερόφιλων, (β) CD38+CD11b+ μονοκυττάρων/μακροφάγων, (γ) κυττάρων CD4+, (δ) Κυψέλες CD8+ και (ε) Β220+ κύτταρα. Τα ιστογράμματα δείχνουν αριθμούς κυττάρων που εκφράζονται ως ποσοστό των συνολικών κυττάρων. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στη μέση τιμή ± SEM (n=5–7). Το Student t-test εφαρμόστηκε για να συγκριθούν οι γονότυποι. WT, άγριου τύπου; KI, GSK3 Ser389 knockin.
2.3. Το LPS δεν μπορεί να αυξήσει τη νευροφλεγμονή σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI
Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν η κατάργηση της φωσφορυλίωσης Ser389, εκτός από την πρόκληση βασικής τονωτικής φλεγμονής, θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει τη φλεγμονώδη απόκριση που προκαλείται από το LPS. Τα ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με μια υποθανατηφόρα δόση (0,5 mg/kg) βακτηριακού λιποπολυσακχαρίτη (LPS). Η φλεγμονώδης απόκριση του εγκεφάλου εξετάστηκε τρεις ημέρες αργότερα, καθώς αυτή η θεραπεία είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι προκαλεί φλεγμονή χαμηλού βαθμού σε εγκεφάλους ποντικών [39,40]. Αυτή η απόκριση LPS μοιάζει επίσης με τη χρόνια φλεγμονώδη κατάσταση που παρατηρείται σε αρκετές νευρολογικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της κατάθλιψης, του άγχους και της νόσου του Πάρκινσον [41,42]. Όπως αναμενόταν, το LPS προκάλεσε γλοιακή αντιδραστικότητα σε ποντίκια WT, όπως προσδιορίστηκε από την αύξηση της συχνότητας των ενεργοποιημένων μικρογλοίων/μακροφάγων (Εικόνα 3α) και τη μειωμένη συχνότητα των μικρογλοίων ηρεμίας (Εικόνα 3β). Αντίθετα, το LPS απέτυχε να προκαλέσει οποιαδήποτε περαιτέρω φλεγμονώδη απόκριση σε ποντικούς GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 3a,b). Ο Πίνακας 1 συγκρίνει άμεσα το μέγεθος των αποκρίσεων LPS μεταξύ των δύο γονότυπων. Επιπλέον, αυτή η θεραπεία LPS αύξησε το ποσοστό των αστροκυττάρων ACSA-2+ σε ποντίκια WT, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [31], αλλά όχι σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 3γ). Όσον αφορά τη διήθηση του εγκεφάλου των ανοσοκυττάρων, το LPS προκάλεσε συσσώρευση ουδετερόφιλων σε ποντικούς WT αλλά δεν είχε καμία επίδραση σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 3δ). Τέλος, η χορήγηση LPS δεν προώθησε τη συσσώρευση λεμφοκυττάρων στον εγκέφαλο σε ποντικούς WT ή GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 3e). Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η απενεργοποίηση της GSK3 με φωσφορυλίωση Ser389 είναι απαραίτητη για την πρόληψη μιας τονωτικής φλεγμονώδους κατάστασης στον εγκέφαλο, αλλά συμβάλλει στην οξεία φλεγμονή του εγκεφάλου ως απόκριση σε ερεθίσματα όπως το LPS.
Πίνακας 1. Διαφορές στα αποτελέσματα LPS μεταξύ ποντικών WT και GSK3 Ser389 KI. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον αριθμό κυττάρων μετά την επεξεργασία LPS σε κάθε γονότυπο και εκφράζονται ως αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες που έχουν υποστεί αγωγή με όχημα (μέσος όρος ± SEM). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιδράσεων του LPS σε ζώα WT και GSK3 Ser389 KI. WT, άγριου τύπου; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, λιποπολυσακχαρίτης. *, p < 0.{10}}5; **, p < 0,01.
Εικόνα 3. Νευροάνοσα κύτταρα από ποντίκια GSK3 Ser389 KI αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στο LPS. Ενήλικα ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με LPS (0,5 mg/kg). Τρεις ημέρες αργότερα, πληθυσμοί εγκεφάλου (α) CD11b++CD45 υψηλά ενεργοποιημένων μικρογλοίων/μακροφάγων, (β) CD11b+CD45 μικρογλοίας χαμηλής ηρεμίας, (γ) αστροκυττάρων ACSA-2+, (δ) ουδετερόφιλων Ly6G+ και ( ε) Τα CD11b− λεμφοκύτταρα αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα ιστογράμματα δείχνουν επιδράσεις LPS στον αριθμό των κυττάρων και στους δύο γονότυπους. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστά κυττάρων CD45− (αστροκύτταρα) ή CD{18}} κυττάρων (όλοι οι άλλοι πληθυσμοί) και οι τιμές αντιστοιχούν σε μέσο όρο ± SEM (n=7–9). Το Student t-test εφαρμόστηκε για να αξιολογηθεί η σημασία των αλλαγών που προκαλούνται από το LPS σε κάθε γονότυπο. ** p < 0.01. WT, άγριου τύπου; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, λιποπολυσακχαρίτης.
Στη συνέχεια, εξετάσαμε την πιθανή επίδραση της φωσφορυλίωσης του ιππόκαμπου GSK3 Ser389 στην ενεργοποίηση της βασικής γλοίας και τη γλοιακή απόκριση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα. Για αυτόν τον σκοπό, η επισήμανση Iba-1 αξιολογήθηκε με μικροσκοπία στην οδοντωτή έλικα (Εικόνα 4α). Αρχικά, αξιολογήθηκαν ποντίκια WT. Οι μικρογραφίες αποκαλύπτουν χαμηλή βασική νευρογλοιακή ενεργοποίηση, αλλά μια ισχυρή αύξηση στη νευρογλοιακή ανοσοαντιδραστικότητα σε απόκριση στην έγχυση LPS (0,5 mg/kg, 3 ημέρες) (Εικόνα 4β). Η ποσοτικοποίηση της ολοκληρωμένης πυκνότητας για την ανοσοχρώση Iba-1 έδειξε τιμές που ήταν 53% υψηλότερες σε ποντίκια WT μετά τη θεραπεία (Εικόνα 4δ). Αυτές οι αλλαγές ήταν στατιστικά σημαντικές και συνάδουν με την προεξέχουσα κυτταρική υπερτροφία που προκαλείται από το LPS στον ιππόκαμπο του ποντικού που αναφέρθηκε προηγουμένως [43,44].
Σχήμα 4. Η γλοίωση σε απόκριση στο LPS μεταβάλλεται σε ποντικούς GSK3 Ser389 KI. Ενήλικα ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με LPS ή φορέα (C). Μετά από 3 ημέρες, οι εγκέφαλοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για μικροσκοπία φθορισμού. (α) Ένα τμήμα στεφανιαίου ιππόκαμπου προσαρμοσμένο από τον άτλαντα του εγκεφάλου του ποντικιού [45] υποδεικνύει τον εντοπισμό των εικόνων, οι οποίες περιλαμβάνουν την οδοντωτή έλικα. (β) Οι τομές εγκεφάλου ανοσοεπισημάνθηκαν για δείκτες μικρογλοίας/μακροφάγου Iba-1. Τα γραφήματα απεικονίζουν την ολοκληρωμένη πυκνότητα της ανοσοαντιδραστικότητας Iba-1, η οποία είναι μια μέτρηση της νευρογλοιακής αντιδραστικότητας που αντανακλά τόσο την ένταση όσο και την επέκταση της γλοιακής χρώσης. (γ) Σύγκριση των ζώων ελέγχου WT και KI. (δ) Απόκριση LPS σε κάθε γονότυπο ποντικού. Όλες οι τιμές εκφράζονται σε σχέση με τους ελέγχους WT που έχουν υποστεί επεξεργασία με όχημα (μέσος όρος ± SEM, n=4–5). Εφαρμόστηκε το Student t-test. *, p < 0.05. Μπάρα κλίμακας, 100 μm. WT, άγριου τύπου; KI, GSK3 Ser389 knockin; C, όχημα; LPS, λιποπολυσακχαρίτης.
Η ανάλυση του ιππόκαμπου ποντικών Ser389 KI αποκάλυψε διαφορές στη βασική μικρογλοιακή ενεργοποίηση σε σχέση με τα ποντίκια WT. Έτσι, αν και η οπτική επιθεώρηση των μικρογραφιών έδειξε μια μέτρια νευρογλοιακή ενεργοποίηση σε μεταλλαγμένα ζώα (Εικόνα 4β), οι ολοκληρωμένες μετρήσεις πυκνότητας έδειξαν ότι η αύξηση της νευρογλοιακής ανοσοαντιδραστικότητας ήταν στατιστικά σημαντική (Εικόνα 4γ). Είναι ενδιαφέρον ότι τα ποντίκια Ser389 KI δεν έδειξαν σημάδια περαιτέρω ενεργοποίησης μετά τη θεραπεία με LPS (Εικόνα 4β) και η ποσοτική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι το LPS δεν ήταν σε θέση να αυξήσει την ανοσοχρώση Iba-1 στον ιππόκαμπο (Εικόνα 4δ), υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση των γλοιακών κυττάρων με Το LPS είναι εξασθενημένο απουσία φωσφορυλίωσης GSK3 Ser389.
Οφέλη συμπληρώματος κιστάνζης-Αντι-φλεγμονώδης
2.5. Η περιφερειακή ανοσολογική απόκριση στο LPS δεν επηρεάστηκε σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI
Τα προηγούμενα πειράματά μας αποκαλύπτουν τις βαθιές συνέπειες της αδρανοποίησης του GSK3 από τη φωσφορυλίωση Ser389 στην απόκριση του εγκεφάλου στο LPS. Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν υπάρχουν παρόμοια αποτελέσματα στη συστηματική ανοσία. Δεδομένου ότι το LPS είναι γνωστό ότι προκαλεί ενεργοποίηση των έμφυτων ανοσοκυττάρων της σπλήνας [46], οι πληθυσμοί κυττάρων σπλήνας από ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI αξιολογήθηκαν 3 ημέρες μετά την ένεση LPS (0,5 mg/kg). ο αριθμός των ουδετερόφιλων Ly6G+ (Εικόνα 5α) και CD{11}}CD11b++Ly6G− μονοκυττάρων/μακροφάγων (Εικόνα 5β) αυξήθηκε σημαντικά σε ποντίκια WT ως απόκριση στη θεραπεία με LPS. Αυτά τα αποτελέσματα LPS, αναμενόμενα σε ποντίκια WT, παρατηρήθηκαν επίσης σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 5a,b). Δεν προέκυψαν διαφορές μεταξύ των γονότυπων ούτε όταν αναλύθηκαν οι πληθυσμοί λεμφοκυττάρων από τη σπλήνα, καθώς τα ποσοστά των κυττάρων CD4+ σπλήνας (Εικόνα 5γ) και CD{21}} κυττάρων (Εικόνα 5δ) μειώθηκαν από το LPS επίσης σε και οι δύο κλώνοι ποντικών (η μείωση στα μεταλλαγμένα ποντίκια ήταν στατιστικά σημαντική μόνο για τα CD4+ κύτταρα). και Β220+ Β κύτταρα δεν επηρεάστηκαν από LPS ανεξάρτητα από τον γονότυπο (Εικόνα 5e). Αυτές οι παρατηρήσεις έρχονται σε αντίθεση με τις διαφορικές επιδράσεις του LPS που βρίσκονται στους εγκεφάλους και των δύο γονότυπων. Έτσι, ενώ τα ποντίκια GSK3 Ser389 KI είναι ανθεκτικά στη νευροφλεγμονή που προκαλείται από το LPS, αυτά τα ποντίκια δεν είναι συστηματικά απευαισθητοποιημένα στο LPS. Επομένως, τα αποτελέσματα της φωσφορυλίωσης του GSK3 Ser389 φαίνεται να είναι επιλεκτικά στον εγκέφαλο.
Εικόνα 5. Παρόμοια περιφερειακή ανοσοαπόκριση σε LPS σε ποντικούς GSK3 Ser389 KI και WT. Ενήλικα ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με LPS. Μετά από 3 ημέρες, τα κύτταρα της σπλήνας εκχυλίστηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για να αξιολογηθεί, με κυτταρομετρία ροής, ο αριθμός των (α) Ly6G+ ουδετερόφιλων, (β) CD38+CD11b+ μονοκυττάρων/μακροφάγων, (γ) CD8+, (δ) CD4+ και (ε) Β220+ κύτταρα. Τα ιστογράμματα δείχνουν τις επιδράσεις του LPS στον αριθμό των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ποντικών WT και KI. Το Student t-test εφαρμόστηκε για να αξιολογηθεί η σημασία των αλλαγών που προκαλούνται από το LPS σε κάθε γονότυπο. Εμφανίζεται η μέση τιμή ± SEM (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, άγριου τύπου; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, ενδοπεριτοναϊκή? C, όχημα; LPS, λιποπολυσακχαρίτης.
2.6. Η ενεργοποίηση της οδού NF-κB που προκαλείται από LPS στον ιππόκαμπο καταργείται σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI
Ο NF-κB είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για το LPS να προκαλεί φλεγμονή [47]. Επιπλέον, το NF-κB έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται από το GSK3 στον εγκέφαλο [2,19,23]. Επομένως, εξετάσαμε την ενεργοποίηση του NF-κΒ στον εγκέφαλο ως απόκριση στο LPS με την ανάλυση της φωσφορυλίωσης IKK, ένα πρώιμο βήμα στην οδό ενεργοποίησης του NF-kB. Τα ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με LPS (0,5 mg/kg) και μετά από 4 ώρες, ο ιππόκαμπος συλλέχτηκε. Εκχυλίσματα ολικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση φωσφο-ΙΚΚ/ και ολικού ΙΚΚ/ με στύπωμα Western. Όπως αναμενόταν, το LPS αύξησε τη φωσφορυλίωση IKK στον ιππόκαμπο σε ποντίκια WT (Εικόνα 6a,b). Αντίθετα, το LPS απέτυχε να προκαλέσει φωσφορυλίωση IKK σε ποντικούς GSK3 Ser389 KI (Εικόνα 6a,b). Η ενεργοποίηση του STAT3 έχει επίσης συσχετιστεί με φλεγμονή που προκαλείται από LPS [48]. Εξετάσαμε λοιπόν τη φωσφορυλίωση του STAT3 με ανάλυση Western blot. Σε αντίθεση με την ενεργοποίηση NF-kB, η φωσφορυλίωση του STAT3 προκλήθηκε έντονα στον ιππόκαμπο και των ποντικών WT και GSK3 Ser389 KI σε απόκριση στο LPS (Εικόνα 6a,c). Έτσι, η αποτροπή της αδρανοποίησης της GSK3 από τη φωσφορυλίωση Ser389 εξασθενεί επιλεκτικά τη σηματοδότηση NF-κB, η οποία είναι σύμφωνη με τον ρόλο της GSK3 ως ρυθμιστή προς τα πάνω της οδού NF-κΒ στον ιππόκαμπο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η οδός GSK3 επηρεάζει τη νευροφλεγμονή ελέγχοντας βασικούς φλεγμονώδεις μεσολαβητές, όπως ο NF-κB.
Εικόνα 6. Η αποτυχία αδρανοποίησης της GSK3 με φωσφορυλίωση Ser389 επηρεάζει διαφορετικά τη σηματοδότηση NF-κB και STAT3 σε ποντικούς που έλαβαν LPS. Η ενεργοποίηση των οδών NF-κB και STAT3 εξετάστηκε σε προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων από τον ιππόκαμπο 4 ώρες μετά την ενδοπεριτοναϊκή ένεση LPS ({{0}}.5 mg/kg) ή φορέα (C) και στα δύο Ποντίκια WT και GSK3 Ser389 KI. Οι κηλίδες απεικονίζουν την ανάλυση στυπώματος Western του φωσφόρου-IKK/, του ολικού ΙΚΚ/, του φωσφόρου-STAT3 και του ολικού STAT3. (α) - η ανίχνευση τουμπουλίνης συμπεριλήφθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα σχετικά γραφήματα αντιστοιχούν σε (β) αναλογίες φωσφο-ΙΚΚ//ΙΚΚ/ και (γ) φωσφο-STAT3/STAT3, που ελήφθησαν από την πυκνομετρική ανάλυση ζωνών στυπώματος Western. Το Student t-test εφαρμόστηκε για να συγκριθούν οι μάρτυρες χωρίς θεραπεία (C) και τα ζώα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS σε κάθε γονότυπο (μέσος όρος ± SEM, n=5-6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων για pIKK/IKK και τριών ανεξάρτητων πειραμάτων για pSTAT3/STAT3. WT, άγριου τύπου; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, ενδοπεριτοναϊκή? C, όχημα; LPS, λιποπολυσακχαρίτης.
3. Συζήτηση
Στον εγκέφαλο, η απορύθμιση της δραστηριότητας της GSK3 συνδέεται με πολλαπλές νευροπαθολογίες στις οποίες η χρόνια φλεγμονή είναι κοινό χαρακτηριστικό [25]. Δεδομένου ότι μια μεγάλη βιβλιογραφία υποστηρίζει ότι η αναστολή της GSK3 από φωσφορυλίωση Ser9 ρυθμίζει προς τα πάνω τους αντιφλεγμονώδεις μεσολαβητές και μειώνει τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες [23,28,30], ο μηχανισμός που προτείνεται συνήθως για να εξηγήσει την ελαττωματική απενεργοποίηση της GSK3 σε νευροφλεγμονώδεις παθολογίες είναι ο αποτυχία φωσφορυλίωσης Ser9 [3]. Ωστόσο, ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα φωσφο-Ser389 GSK3 έχουν ανιχνευθεί στον εγκέφαλο [4], υποδηλώνοντας ότι αυτή η εναλλακτική οδός για την απενεργοποίηση της GSK3 μπορεί επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον εγκέφαλο. Τα πειράματα που παρουσιάζονται εδώ αποκαλύπτουν την επίπτωση της φωσφορυλίωσης του GSK3 Ser389 στη νευροφλεγμονή, η οποία προσθέτει σε προηγούμενα στοιχεία που υποδηλώνουν τη συμμετοχή αυτής της οδού στην επιδιόρθωση του DNA του εγκεφάλου και την επιβίωση των νευρώνων [6,7]. Ένα από τα βασικά ευρήματα στην παρούσα εργασία είναι ότι ο εγκέφαλος ποντικών GSK3 Ser389 KI εμφανίζει παρατεταμένη γλοίωση και αυξημένη διήθηση ανοσοκυττάρων, κάτι που συνάδει με την ιδέα ότι η πρόληψη της αδρανοποίησης της GSK3 μέσω της φωσφορυλίωσης Ser389 οδηγεί σε νευροφλεγμονή. Τα δεδομένα από τα πειράματά μας κυτταρομετρίας ροής δείχνουν σαφώς αυξημένη νευροφλεγμονή σε αυτά τα ζώα, καθώς ο αριθμός των ενεργοποιημένων μικρογλοίων/μακροφάγων, αστροκυττάρων ACSA 2+ και διεισδυμένων ουδετερόφιλων στον εγκέφαλο ποντικών Ser389 GSK3 KI ήταν σημαντικά υψηλότερος. Ωστόσο, παρά το γεγονός ότι η μικροαστρογλοίωση παρατηρήθηκε ξεκάθαρα με κυτταρομετρία ροής, η ανάλυση μικρογραφιών ιππόκαμπου από τομές εγκεφάλου ποντικών Ser389 GSK3 KI αποκάλυψε ότι η υπερτροφία μικρογλοίας/μακροφάγων ήταν μόνο ήπια. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν αναλύθηκαν άλλες περιοχές του εγκεφάλου για να εκτιμηθεί η έκταση και η ένταση της γλοίωσης (δεν φαίνεται). Επομένως, συμπεραίνουμε ότι, ελλείψει προφλεγμονωδών ερεθισμάτων, η έλλειψη φωσφορυλίωσης GSK3 Ser389 οδηγεί σε έναν βαθμό νευροφλεγμονής που θα πρέπει να ταξινομηθεί ως χαμηλού βαθμού. Πολυάριθμες μελέτες υποστηρίζουν τη συσχέτιση μεταξύ υπερκινητικότητας GSK3 και νευροεκφυλισμού σε νευρολογικές διαταραχές [25]. Σε αυτό το πλαίσιο, η φλεγμονώδης απόκριση που παρατηρήσαμε σε ποντίκια Ser389 GSK3 KI θα μπορούσε να είναι συνέπεια νευροεκφυλισμού, καθώς προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει νευρωνικό θάνατο στον φλοιό και τον ιππόκαμπο αυτών των ζώων [6]. Αυτό είναι σύμφωνο με την παρατήρηση ότι η βλάβη του DNA απενεργοποιεί το GSK3 μέσω της φωσφορυλίωσης Ser389 ως μηχανισμού για την πρόληψη του κυτταρικού θανάτου και την προώθηση της επιδιόρθωσης του DSB [7,8]. Κατά συνέπεια, ο εγκέφαλος ποντικών KI, στους οποίους αποτρέπεται η φωσφορυλίωση Ser389, δεν προστατεύεται από τον επαγόμενο από DSB νευρωνικό θάνατο. Η σύνδεση μεταξύ της έκφρασης του φωσφόρου-Ser389 GSK3 και της κυτταρικής επιβίωσης προτάθηκε για πρώτη φορά στα λεμφοκύτταρα, ως μηχανισμός που εμπλέκεται στην προσαρμοστική ανοσοαπόκριση. Έτσι, η απουσία φωσφορυλίωσης GSK3 Ser389 σε ποντικούς KI βρέθηκε ότι επάγει νεκρόπτωση στα Β κύτταρα κατά την όψιμη ωρίμανση, που είναι ένας εξαιρετικά φλεγμονώδης τύπος κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με διάφορες παθολογίες [9]. Είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι όχι μόνο η φωσφορυλίωση Ser389 αλλά και η φωσφορυλίωση Ser9 μπορεί να ενεργοποιηθεί για να απενεργοποιήσει το GSK3 ως απόκριση σε βλάβη του DNA. Ωστόσο, τα ποντίκια Ser389 GSK3 KI παρουσιάζουν νευροεκφυλιστικό φαινότυπο [6] που δεν υπάρχει σε ποντίκια Ser9 GSK3 KI [49,50], υποδεικνύοντας ότι η φωσφορυλίωση Ser389 παίζει συγκεκριμένους ρόλους στον έλεγχο της δραστηριότητας GSK3 και ότι υπάρχουν σενάρια στα οποία η φωσφορυλίωση Ser9 δεν μπορεί να αντισταθμίσει για την απώλεια της φωσφορυλίωσης Ser389. Κατά συνέπεια, η ενδιαφέρουσα σχέση μεταξύ της απορρύθμισης του Ser389 GSK3, της νευροφλεγμονής και του νευροεκφυλισμού που αποκαλύπτεται εδώ πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω για να διευκρινιστεί εάν η τροποποιημένη φωσφορυλίωση GSK3 στο Ser389 μπορεί να είναι βασικός παράγοντας σε νευροπαθολογίες στις οποίες η χρόνια φλεγμονή είναι διακριτική, όπως η νόσος Alzheimer. Επιπλέον, η ήπια αλλά επίμονη ενεργοποίηση των νευροάνοσο κυττάρων που παρατηρήθηκε σε ποντίκια GSK3 Ser389 KI είναι σύμφωνη με την υπόθεση ότι η αποτυχία φωσφορυλίωσης Ser389 μπορεί να σχετίζεται με ανοσολογισμό. Αυτή είναι μια διαδικασία που σχετίζεται με την ηλικία που χαρακτηρίζεται από μείωση των λειτουργιών του ανοσοποιητικού σε συνδυασμό με αύξηση της έκφρασης των προφλεγμονωδών μεσολαβητών. που οδηγεί σε χρόνια, χαμηλού βαθμού φλεγμονή [1,51]. Αρκετοί συγγραφείς έχουν επισημάνει τη συμμετοχή της απορρύθμισης της GSK3 στη φλεγμονή που σχετίζεται με την ηλικία [1,52]. Έχει επίσης προταθεί ότι η ανώμαλη λειτουργία της μικρογλοίας που παρατηρείται στο πλαίσιο της ανοσολογίας του εγκεφάλου μπορεί τελικά να προκαλέσει νευροεκφυλισμό [53]. Έτσι, ο επιταχυνόμενος ανοσολογισμός σε ποντίκια Ser389 GSK3 KI θα μπορούσε να συμβάλει στην απώλεια νευρώνων που αναφέρθηκε προηγουμένως σε αυτά τα ζώα [6]. Το LPS έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την πρόκληση φλεγμονής σε μοντέλα "in vivo" και "in vitro". Ωστόσο, υπάρχουν ενδείξεις ότι η δόση του LPS που χορηγείται καθορίζει σε μεγάλο βαθμό τον τύπο της φλεγμονώδους απόκρισης που προκαλείται [54-56]. Υψηλές δόσεις LPS προκαλούν σηπτικές αποκρίσεις σαν σοκ. ενώ μέτριες δόσεις LPS πυροδοτούν μια επίμονη φλεγμονή χαμηλού βαθμού πιο κοντά σε αυτή που παρατηρείται σε πολλές χρόνιες ασθένειες [42]. Σε αυτό το πλαίσιο, είναι σημαντικό να τονίσουμε ότι η δόση LPS που επιλέχθηκε για τα πειράματά μας (0,5 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκώς) είναι μέτρια και απέχει πολύ από την LD50 που αναφέρεται για LPS σε ποντικούς (10–25 mg/kg) [57,58 ]. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [40,59], βρήκαμε ότι μια τέτοια δόση LPS δεν είναι θανατηφόρα και αρκεί για να αυξήσει τη γλοίωση και τη διήθηση των ουδετερόφιλων στον εγκέφαλο σε ζώα WT, ενώ η διήθηση λεμφοκυττάρων δεν επηρεάζεται. Αξιοσημείωτα, μια τέτοια μέτρια (αλλά σημαντική) απόκριση LPS καταργήθηκε στον εγκέφαλο ποντικών KI με μειωμένη αδρανοποίηση της GSK3 με φωσφορυλίωση Ser389. Σύμφωνα με αυτή την παρατήρηση, η εκτεταμένη υπερενεργοποίηση του GSK3 στον εγκέφαλο μπορεί τελικά να μειώσει την ευαισθησία σε προφλεγμονώδεις προσβολές. Είναι αξιοσημείωτο ότι η ελαττωματική απόκριση στο LPS στα μεταλλαγμένα ποντίκια είναι συμβατή με τον μηχανισμό της ανοσοανοχής ή αντίστασης, μια κοινή διαδικασία στο ΚΝΣ που στοχεύει στη μείωση της ενεργοποίησης των νευρογλοιακών κυττάρων και στον περιορισμό της εγκεφαλικής βλάβης από υπερβολική φλεγμονή [60,61]. Σε συμφωνία με αυτή την ιδέα, μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η ενεργοποίηση της GSK3 σε ποντίκια μπορεί να προκαλέσει ανοσοανοχή και να καταστέλλει τις αποκρίσεις LPS [62].
Οφέλη από σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος
Είναι επίσης ενδιαφέρον να θεωρηθεί ότι τα αποτελέσματα του εγκεφάλου που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη δείχνουν υψηλή ειδικότητα. Έτσι, σε αντίθεση με τον εγκέφαλο, οι περισσότεροι πληθυσμοί κυττάρων σπλήνας που αξιολογήθηκαν σε ζώα WT και Ser389 GSK3 KI παρουσίασαν το ίδιο προφίλ σε μη διεγερμένες συνθήκες, καθώς και παρόμοια απόκριση στο LPS. Αυτό υποδηλώνει ότι η οδός απενεργοποίησης GSK3 που εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση Ser389 παίζει συγκεκριμένους ρόλους στη ρύθμιση της νευροφλεγμονής. Σε συμφωνία με αυτή την υπόθεση, τα εγκεφαλικά κύτταρα εμφανίζουν υψηλή έκφραση του φωσφο-Ser389 GSK3 σε σύγκριση με άλλους ιστούς και αυτή η έκφραση ρυθμίζεται στενά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου [5]. Τέλος, σύμφωνα με τα ευρήματά μας, η ρύθμιση της GSK3 με φωσφορυλίωση στο Ser389 μεσολαβείται ειδικά από τη οδό σηματοδότησης NF-kB, αφού η ενεργοποίηση STAT3 δεν επηρεάστηκε στο Ser389 GSK3 KI. Πολλοί κατάντη φλεγμονώδεις μεσολαβητές ρυθμίζονται από την ενεργοποίηση του NF-kB, συμπεριλαμβανομένων των κυτοκινών, των υποδοχέων, των παραγόντων μεταγραφής και των ενζύμων. Ο προσδιορισμός του ποιοι από αυτούς τους στόχους NF-kB επηρεάζονται από τη φωσφορυλίωση Ser389 GSK3 είναι πέρα από το εύρος της δουλειάς μας, αλλά θα είναι ένας συναρπαστικός στόχος για μελλοντικές μελέτες που στοχεύουν στην αποσαφήνιση των μηχανισμών της νευροφλεγμονής.
4. Υλικά και Μέθοδοι
4.1. Των ζώων
Ποντίκια C57BL/6J άγριου τύπου (WT) αγοράστηκαν από την Jackson Laboratories. Τα ποντίκια C57BL/6 GSK3 Ser389 KI, στα οποία το υπόλειμμα Ser389 της GSK3 αντικαταστάθηκε από Ala για να αποτραπεί η φωσφορυλίωση, δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Όλα τα ποντίκια στεγάστηκαν σε εγκαταστάσεις ζώων που σχετίζονται με την Ιατρική Σχολή του Albacete υπό 12-κύκλο φωτός/σκότους. Τροφή και νερό παρείχαν κατά βούληση. Για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν ενήλικα ποντίκια ηλικίας τεσσάρων έως έξι μηνών.
4.2. Διοίκηση LPS
Για να προκληθεί μια φλεγμονώδης απόκριση, τα ποντίκια έλαβαν μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή (IP) ένεση {{0}},5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (ορότυπος typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Μαδρίτη, Ισπανία) διαλύθηκε σε στείρο, απαλλαγμένο από ενδοτοξίνες 0, 9% αλατούχο διάλυμα στα 10 mg/mL. Τρεις ημέρες μετά τη θεραπεία, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και ο εγκέφαλος και ο σπλήνας αφαιρέθηκαν για ανοσοϊστοχημεία ή ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των νευρογλοιακών κυττάρων και των διηθημένων ανοσοκυττάρων. Για ανάλυση Western blotting, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία 4 ώρες μετά την ενδοπεριτοναϊκή έγχυση 0,5 mg/kg LPS, καθώς το LPS έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω τις φλεγμονώδεις πρωτεΐνες σε εγκεφάλους ποντικών και αρουραίων 2-4 ώρες μετά την ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση [63,64].
4.3. Κυτταρομετρία Ροής
Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής εγκεφαλικού ιστού και σπληνικών κυττάρων, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση τριβρωμοαιθανόλης, η οποία έχει προταθεί για μελέτες οξείας τελικής ανάλυσης. Η χαμηλή δόση τριβρωμοαιθανόλης που χρησιμοποιείται (200 mg/kg) παρέχει ελαφριά αναισθησία χωρίς σοβαρές δυσμενείς επιπτώσεις ή επίδραση στην έκφραση της φλεγμονώδους κυτοκίνης [65]. Πραγματοποιήθηκαν επεμβάσεις σε ζώα μετά από επαλήθευση της απουσίας αντανακλαστικών.
4.3.1. Διάσπαση ιστού εγκεφάλου και απομόνωση κλίσης Percoll των νευρικών κυττάρων
Τα ποντίκια εγχύθηκαν ενδοκαρδιακά με 50 mL 0,9% NaCl πριν από τη συλλογή ιστού για να αφαιρεθούν τα κυκλοφορούντα κύτταρα από τα αιμοφόρα αγγεία του εγκεφάλου. Μετά την έγχυση, οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν, οι μήνιγγες και το χοριοειδές πλέγμα διαχωρίστηκαν προσεκτικά και η παρεγκεφαλίδα και οι οσφρητικοί βολβοί απορρίφθηκαν. Ο υπόλοιπος ιστός τοποθετήθηκε σε ψυχρό διάλυμα Hank's Balanced Salt Solution, το οποίο δεν περιέχει χλωριούχο ασβέστιο και χλωριούχο μαγνήσιο (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Μαδρίτη, Ισπανία, 14175). Τα δείγματα ιστού στη συνέχεια ψιλοκόπηκαν με νυστέρι πριν από την πέψη. Ο τεμαχισμένος ιστός στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε σωλήνες MACS C (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Ισπανία, 130-093-237) σε συνολικό όγκο 5 mL και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μηχανικό διαχωριστή στις 6 rpm για 30 λεπτά. Ο ενζυματικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το δικό μας πρωτόκολλο [31] χρησιμοποιώντας παπαΐνη (100 U; Worthington, LK003178) και dispase II (6 U; Sigma-Aldrich, Μαδρίτη, Ισπανία, D4963) στο Earle's Balanced Salt Solution (EBSS [+]CaCl2 /[+]MgSO4, Gibco, Μαδρίτη, Ισπανία, 24010). Η DNAse I (100 U, Sigma-Aldrich, Μαδρίτη, Ισπανία, DN25) προστέθηκε στο διάλυμα για να αφαιρεθεί η βλέννα του DNA που επηρεάζει δυσμενώς τη βιωσιμότητα των κυττάρων [66]. Πριν από τη χρήση, η παπαΐνη ενεργοποιήθηκε για 30 λεπτά στους 37 ◦C σε 5% CO2. Για να σταματήσει η πέψη, τα δείγματα αραιώθηκαν με ψυχρό HBSS και τοποθετήθηκαν σε πάγο. Αυτό το διάλυμα στη συνέχεια μεταφέρθηκε με πιπέτα 10 φορές χρησιμοποιώντας σιφώνια των 5 mL και διηθήθηκε μέσω ενός φίλτρου κυττάρων 70 μm (BD, 352350). Το προκύπτον εναιώρημα ενός κυττάρου φυγοκεντρήθηκε στα 300 χ g για 10 λεπτά σε ΘΔ. Μια διαβάθμιση 30% PercollTM (GE Healthcare, Μαδρίτη, Ισπανία, 17-0891-01) χρησιμοποιήθηκε για την αφαίρεση της μυελίνης και τον εμπλουτισμό του ομογενοποιήματος σε βιώσιμα νευρογλοιακά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, παρασκευάστηκε ένα αποθεματικό διάλυμα ισοτονικού Percoll (SIP) (9:1 Percoll σε 10× HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2· Gibco, 14185) και τα σφαιρίδια κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε 30% (ν/ v) SIP (σε 1× HBSS). Η διαβάθμιση 30% Percoll διεξήχθη προσθέτοντας 3 mL SIP σε 7 mL 1 × HBSS που περιέχει το κυτταρικό εναιώρημα σε σωλήνα πολυπροπυλενίου 14 mL. Κάθε βαθμίδωση φυγοκεντρήθηκε χωρίς φρένο στα 300 × g για 30 λεπτά στους 18 ◦C. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα κύτταρα από το κάτω στρώμα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με 1 × HBSS, φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 300 × g και επαναιωρήθηκαν σε 10 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ερυθρών αιμοσφαιρίων 1 × στους 4 °C. Μετά τη λύση, το κυτταρικό εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 300 × g για 10 λεπτά, και το προκύπτον κυτταρικό ίζημα τελικά επαναιωρήθηκε σε 50 μL ρυθμιστικού αποκλεισμού πριν από τη χρώση για κυτταρομετρία ροής.
4.3.2. Διάσπαση κυττάρων σπλήνας
Οι σπλήνες τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri που περιείχε RPMI 1640 και κόπηκαν σε μικρά κομμάτια. Ο ιστός που προέκυψε πέρασε σε ένα φίλτρο κυττάρων 70 μm (BD, 352350) και διασπάστηκε με κυκλική κίνηση με το ραβδωτό πάνω μέρος του εμβόλου μιας σύριγγας. Στη συνέχεια, το RPMI 1640 πέρασε μέσω του φίλτρου. Ο αποσαθρωμένος ιστός μεταφέρθηκε σε σωλήνες των 50 mL (Sarstedt, Barcelona, Spain, 62.547.254) και φυγοκεντρήθηκε στα 100 g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο που περιέχει το κυτταρικό εναιώρημα στη συνέχεια συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε ξανά στα 300 g για 10 λεπτά. Το προκύπτον υπερκείμενο αφαιρέθηκε και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 10 mL ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) με 1% FBS για να μετρηθεί ο αριθμός των κυττάρων κάτω από το μικροσκόπιο, και μετά φυγοκεντρήθηκε εκ νέου στα 300 g για 5 λεπτά. Χρησιμοποιήθηκαν μόνο 500,000 κύτταρα ανά δείγμα. Κάθε δείγμα στη συνέχεια επαναιωρήθηκε σε 50 μL ρυθμιστικού αποκλεισμού πριν από τη χρώση για κυτταρομετρία ροής.
4.3.3. Χρώση με εξωκυτταρική κυτταρομετρία ροής
Πίνακας 2. Αντισώματα και αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.
4.4. Ανοσοϊστοχημεία
Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε βαθιά αναισθησία και εγχύθηκαν ενδοκαρδιακά με φυσιολογικό ορό {{0}},9% (w/v). Οι εγκέφαλοί τους συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 24 ώρες. Μετά τη στερέωση, κρυοπροστατεύτηκαν με 30% σακχαρόζη και καταψύχθηκαν στους -20 ◦C μέχρι την κοπή. Οι τομές ιστού (20 μm) κόπηκαν με χρήση κρυοστάτη (ThermoFisher, Microm™ HM550), τοποθετήθηκαν απόψυξη σε αντικειμενοφόρες πλάκες Superfrost Plus (ThermoFisher, J1800AMNZ) και τελικά αποθηκεύτηκαν στους -20 ◦C μέχρι τη χρώση. Η ανοσοϊστοχημική χρώση των τομών ιστού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [67]. Τα πρωτογενή και δευτερογενή διαλύματα αντισωμάτων αραιώθηκαν σε 1 × PBS με 1% BSA. Οι τομές επωάστηκαν με το πρωτεύον αντίσωμα αντι-κουνελιού Iba-1 (αραίωση 1:500, Wako Chemicals, Βαρκελώνη, Ισπανία, 019-19741). Ως δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε συζευγμένο Alexa Fluor 488-συζευγμένο IgG κατσίκας αντι-κουνελιού (1:2000 αραίωση· ThermoFisher, Μαδρίτη, Ισπανία, Α11031). Συμπεριλήφθηκε κατάλληλος θετικός ιστός ελέγχου, καθώς και πρωτογενείς και δευτερεύοντες αρνητικοί μάρτυρες. Οι εικόνες σήμανσης φθορισμού αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ZEISS Apotome. 2 μικροσκόπιο με μονοψηφιακή κάμερα axiom 503 και το λογισμικό ελέγχου Zen Blue έκδοση 2.3 (Carl Zeiss). Ένας αντικειμενικός φακός 10× (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση του ιππόκαμπου. Η ολοκληρωμένη πυκνότητα εντός των περιοχών ενδιαφέροντος υπολογίστηκε με το λογισμικό ImageJ. Αυτή η παράμετρος αντιστοιχεί στο άθροισμα των τιμών έντασης για κάθε pixel στην επιλεγμένη περιοχή. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων που βάφονται σε συνδυασμό με την ένταση χρώσης κάθε κυττάρου.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
4.5. Ανάλυση Western Blot
Οι εγκέφαλοι ποντικιών αφαιρέθηκαν γρήγορα και οι ιππόκαμποι αφαιρέθηκαν αμέσως και καταψύχθηκαν. Ο ιστός παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα υπερτονικής λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [68]. Τα κύρια αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-κουνελιού φώσφορο-IKK / (1:1000 αραίωση· Cell Signaling, Alcobendas, Ισπανία, 2861), αντι-κουνελιού IKK / (1:1000 αραίωση; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany, sc{{ 9}}), αντικουνελιού φωσφόρου-STAT3 (1:1000 αραίωση· Cell Signaling, 9145) και anti-mouse STAT3 (1:1000 αραίωση; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Ως μάρτυρας φόρτωσης χρησιμοποιήθηκε η αντι-τουμπουλίνη ποντικού (1:2000 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology, sc-32293). Ως δευτερεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν HRP κατά κουνελιού (1:5000 αραίωση, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Βαλτιμόρη, ΗΠΑ, 111-035-144) και HRP κατά ποντικού (1:5000 αραίωση· Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003). . Η ποσοτικοποίηση της ζώνης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με ανάλυση πυκνομετρίας ζώνης με το λογισμικό NIH ImageJ (Έκδοση 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, πρόσβαση την 1η Μαρτίου 2022). Για να εξασφαλιστούν ίσα φορτία, η ολοκληρωμένη πυκνότητα που λήφθηκε για κάθε ζώνη εκφράστηκε ως σχετική τιμή σε σχέση με τον κατάλληλο έλεγχο φόρτωσης οικιακής χρήσης.
4.6. Στατιστική ανάλυση
Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στατιστικά με το λογισμικό GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) γενικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων (n {{0}}–9). Μετά την επιβεβαίωση της κανονικής κατανομής των δεδομένων με το τεστ Shapiro-Wilk, η στατιστική σημασία μεταξύ των δύο ομάδων προσδιορίστηκε με το Student t-test για παραμετρικά δεδομένα. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν οι τιμές πιθανότητας (p) ήταν μικρότερες από 0.05 (*), 0,01 (**) ή 0,001 (***). Τα σχήματα δείχνουν αντιπροσωπευτικά πειράματα.
5. Συμπεράσματα
Συνοπτικά, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η αποτυχία αδρανοποίησης της GSK3 με φωσφορυλίωση Ser389 οδηγεί σε χρόνια φλεγμονή και ανοχή στην ενδοτοξίνη και ότι η αναστολή της GSK3 από τη φωσφορυλίωση Ser9 και Ser389 παίζει συμπληρωματικούς και όχι περιττούς ρόλους στη νευροάνοση απόκριση. Επομένως, θα πρέπει να διερευνηθούν οι συγκεκριμένες συνέπειες της φωσφορυλίωσης του GSK3 Ser389 για τη νευροπαθολογία και τη γήρανση του εγκεφάλου.
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Souder, DC; Anderson, RM Ένα διευρυνόμενο δίκτυο GSK3: Επιπτώσεις για την έρευνα για τη γήρανση. Geroscience 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]
2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, Μ.; Jin, Ο.; Woodgett, JR Απαίτηση για κινάση συνθάσης γλυκογόνου-3 στην επιβίωση των κυττάρων και την ενεργοποίηση του NF-κB. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]
3. Jope, RS; Johnson, GV Η αίγλη και η θλίψη της κινάσης της συνθάσης του γλυκογόνου-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [CrossRef]
4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, Β.; Ξύλο, CD; Aronshtam, Α.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, Β.; et al. Φωσφορυλίωση από p38 MAPK ως εναλλακτική οδός για την απενεργοποίηση του GSK3beta. Science 2008, 320, 667–670. [CrossRef]
5. Calvo, Β.; Thornton, TM; Rincon, Μ.; Tranque, Ρ.; Fernandez, M. Κανονισμός GSK3 από Ser 389 Phosphorylation κατά τη διάρκεια της νευρικής ανάπτυξης. ΜοΙ. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]
6. Thornton, TM; Hare, Β.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Failure to Inactivate Nuclear GSK3 by Ser 389-Η φωσφορυλίωση οδηγεί σε εστιακό νευρωνικό θάνατο και παρατεταμένη απόκριση στο φόβο. Neuropsychopharmacology 2018, 43, 393-405. [CrossRef] [PubMed]
7. Λαγός, BD; Thornton, TM; Rincon, Μ.; Golijanin, Β.; King, SB; Jaworski, DM; Falls, WA Δύο εβδομάδες μεταβλητού στρες αυξάνουν τα επίπεδα γάμμα-Η2ΑΧ στον πυρήνα του κρεβατιού του ποντικιού της ραβδωτής άκρου. Neuroscience 2018, 373, 137-144. [CrossRef]
8. Thornton, TM; Delgado, Ρ.; Chen, L.; Salas, Β.; Krementsov, D.; Fernandez, Μ.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; et al. Η απενεργοποίηση της πυρηνικής GSK3beta με φωσφορυλίωση Ser (389) προάγει την ικανότητα των λεμφοκυττάρων κατά την απόκριση θραύσης διπλού κλώνου DNA. Nat. Commun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]
9. Πασπαράκης, Μ.; Vandenabeele, P. Necroptosis και ο ρόλος της στη φλεγμονή. Nature 2015, 517, 311–320. [CrossRef]
10. Jope, RS; Cheng, Υ.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Στρεσαρισμένος και Φλεγμονή, Μπορεί να κατηγορηθεί το GSK3; Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [CrossRef]
11. Beutler, Β.; Rietschel, ET Η έμφυτη ανοσολογική αίσθηση και οι ρίζες της: Η ιστορία της ενδοτοξίνης. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]
12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Δυναμική διαμόρφωση της έμφυτης ανοσοαπόκρισης με ποικίλες δόσεις λιποπολυσακχαρίτη (LPS) σε ανθρώπινα μονοκυτταρικά κύτταρα. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [CrossRef]
13. Lu, YC; Ναι, WC; Ohashi, μονοπάτι μεταγωγής σήματος PS LPS/TLR4. Cytokine 2008, 42, 145-151. [CrossRef] [PubMed]
14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, το πεπτίδιο αναστολέα SY GSK3 προστατεύει τα ποντίκια από το σοκ ενδοτοξίνης που προκαλείται από LPS. Immune Netw. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]
15. Piazzi, Μ.; Bavelloni, Α.; Cenni, V.; Faenza, Ι.; Blalock, WL Επανεξέταση του ρόλου του GSK3, ενός ρυθμιστή της έμφυτης ανοσίας, στην ιδιοπαθή σωματική μυοσίτιδα. Cells 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]
16. Vines, Α.; Cahoon, S.; Goldberg, Ι.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Νέος αντιφλεγμονώδης ρόλος για την κινάση της συνθάσης του γλυκογόνου-3βήτα στην αναστολή της έκφρασης φλεγμονωδών γονιδίων που προκαλούνται από τον παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα- και την ιντερλευκίνη-1. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [CrossRef]
17. Hoffmeister, L.; Diekmann, Μ.; Brand, Κ.; Huber, R. GSK3: A Kinase Balancing Promotion and Resolution of Inflammation. Cells 2020, 9, 820. [CrossRef]
18. Beurel, Ε.; Η παραγωγή ιντερλευκίνης-6 που προκαλείται από το Jope, RS λιποπολυσακχαρίτης ελέγχεται από την κινάση συνθάσης του γλυκογόνου-3 και το STAT3 στον εγκέφαλο. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]
19. Wang, Μ.; Huang, Η.; Chen, W.; Chang, Η.; Kuo, J. Η απενεργοποίηση κινάσης συνθάσης γλυκογόνου-3 αναστέλλει την παραγωγή παράγοντα νέκρωσης όγκου σε μικρογλοία διαμορφώνοντας τους καταρράκτες σηματοδότησης πυρηνικού παράγοντα κΒ και MLK3/JNK. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]
20. Priego, Ν.; Valiente, M. Το δυναμικό των αστροκυττάρων ως ανοσοδιαμορφωτές σε όγκους εγκεφάλου. Εμπρός. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]
21. Vandenbark, AA; Offner, Η.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Μικρογλοία και εμπλοκή αστροκυττάρων στον νευροεκφυλισμό και τον καρκίνο του εγκεφάλου. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]
22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Μειωμένη πυρηνική βήτα-κατενίνη, ταυ υπερφωσφορική σύνδεση και νευροεκφυλισμός σε GSK-3βήτα διαγονιδιακά ποντίκια υπό όρους. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]
23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, Κ.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, Μ.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, Ρ.; Saez, MA; et al. Η αναστολή του Gsk3b μειώνει τη σηματοδότηση Nfkb1 και διασώζει τη συναπτική δραστηριότητα για τη βελτίωση του φαινοτύπου του συνδρόμου Rett σε ποντίκια Mecp2-Knockout. Κύτταρο. Απ. 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]
24. Martin, Μ.; Rehani, Κ.; Jope, RS; Michalek, SM Η παραγωγή κυτοκίνης που προκαλείται από υποδοχείς τύπου Toll ρυθμίζεται διαφορετικά από την κινάση συνθάσης γλυκογόνου. Nat. Immunol. 2005, 6, 777-784. [CrossRef]
25. Rippin, Ι.; Eldar-Finkelman, H. Μηχανισμοί και θεραπευτικές επιπτώσεις του GSK-3 στη θεραπεία του νευροεκφυλισμού. Cells 2021, 10, 262. [CrossRef]
26. Ανδρουλιδάκη, Α.; Ηλιόπουλος, Δ.; Arranz, Α.; Δοξάκη, C.; Schworer, S.; Ζαχαριουδάκη, Β.; Μαργιώρης, AN; Τσίχλης, ΠΝ; Τσατσάνης, Γ. Η κινάση Akt1 ελέγχει την απόκριση των μακροφάγων στον λιποπολυσακχαρίτη ρυθμίζοντας τα microRNAs. Immunity 2009, 31, 220-231. [CrossRef]
27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, Μ.; Obermeier, F.; Ruemmele, Ρ.; Kitani, Α.; Brunner, SM; Haimerl, Μ.; Geissler, EK; Το Strober, W. IL-13 ενορχηστρώνει την επίλυση της χρόνιας εντερικής φλεγμονής μέσω φωσφορυλίωσης της κινάσης συνθάσης γλυκογόνου-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [CrossRef]
28. Nagao, Μ.; Hayashi, H. Glycogen synthase kinase-3βήτα σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον. Neurosci. Κάτοικος της Λατβίας. 2009, 449, 103–107. [CrossRef]
29. Nadri, C.; Kozlovsky, Ν.; Agam, G.; Bersudsky, Y. GSK-3 παράμετροι σε λεμφοκύτταρα σχιζοφρενών ασθενών. Psychiatry Res. 2002, 112, 51–57. [CrossRef]
30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): Φλεγμονή, ασθένειες και θεραπευτικά. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [CrossRef]
31. Calvo, Β.; Rubio, F.; Fernández, Μ.; Tranque, P. Διάσπαση εγκεφάλου νεογνών και ενηλίκων ποντικών για ταυτόχρονη ανάλυση μικρογλοίας, αστροκυττάρων και διηθητικών λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής. IBRO Rep. 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]
32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, Α.; Arbour, N. Μια βελτιστοποιημένη μέθοδος για την επεξεργασία του ΚΝΣ ποντικού για την ταυτόχρονη ανάλυση νευρικών κυττάρων και λευκοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής. J. Neurosci. Methods 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]
33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, Τ.; Saido, Τ.; Fiers, Μ.; Belgard, TG; Holt, MG Μια μέθοδος με βάση την ανοσοσυγγένεια για την απομόνωση υπερκαθαρών ενήλικων αστροκυττάρων με βάση τη στόχευση ATP1B2 από το αντίσωμα ACSA-2. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]
34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Η χρήση της κυτταρομετρίας ροής για την αξιολόγηση των χρονικών αλλαγών σε φλεγμονώδη κύτταρα μετά από εστιακή εγκεφαλική ισχαιμία σε ποντικούς. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovic, J.; et al. Το Anti-ACSA-2 ορίζει ένα νέο μονοκλωνικό αντίσωμα για την προοπτική απομόνωση ζωντανών νεογνικών και ενηλίκων αστροκυττάρων. Glia 2017, 65, 990–1004. [CrossRef]
36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, Α.; Colomer, Τ.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης σηματοδότησης ενδοκανναβινοειδών αστροκυττάρων και μικρογλοίας κατά την αυτοάνοση απομυελίνωση. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]
37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Τα Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh ώριμα και Ly6Gint ανώριμα ουδετερόφιλα συμβάλλουν στην εκρίζωση του S. pneumoniae. J. Εχρ. Med. 2017, 214, 1333–1350. [CrossRef]
38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, Χ.; Lee, Β.; Chew, V.; Li, Η.; Tan, Β.; Lim, S.; et al. Η ανοσοϊστοχημική βαθμολόγηση του CD38 στο μικροπεριβάλλον του όγκου προβλέπει την ανταπόκριση στην ανοσοθεραπεία αντι-PD-1/PD-L1 στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. J. Immunother. Cancer 2020, 8, e000987. [CrossRef]
39. Okuyama, S.; Makihata, Ν.; Yoshimura, Μ.; Asakura, Υ.; Yoshida, Τ.; Nakajima, Μ.; Furukawa, Y. Η οινοθεΐνη Β καταστέλλει τη φλεγμονή που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες (LPS) στον εγκέφαλο του ποντικού. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [CrossRef]
40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, Ι.; Cifelli, G.; Madonna, Μ.; Cocozza, G.; Frati, Α.; Carullo, Ρ.; Carnevale, L.; et al. Ο ρόλος της νευροφλεγμονής στην παθολογία του αμυλοειδούς εγκεφάλου που προκαλείται από υπέρταση. Neurobiol. Γήρανση 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]
41. Zhang, J.; Xue, Β.; Jing, Β.; Tian, Η.; Zhang, Ν.; Li, Μ.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, Η.; Chen, Y. LPS ενεργοποιεί νευροφλεγμονώδεις οδούς για να προκαλέσει κατάθλιψη σε κατάσταση παρόμοια με τη νόσο του Πάρκινσον. Εμπρός. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4
2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Υ.; Sheridan, JF; Quan, N. Νευρικές και συμπεριφορικές αποκρίσεις στη φλεγμονή χαμηλού βαθμού. Συμπεριφορά. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]
43. Kang, J.; Park, D.; Shah, Μ.; Kim, Μ.; Ο Koh, P. Lipopolysaccharide επάγει την ενεργοποίηση της νευρογλοίας και την ενεργοποίηση του NF-κB στον εγκεφαλικό φλοιό ενηλίκων ποντικών. Εργαστήριο. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]
44. Khan, MS; Ali, Τ.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, Α.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Το Kim, MO Lithium βελτιώνει τη νευροτοξικότητα που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες στον φλοιό και τον ιππόκαμπο του εγκεφάλου του ενήλικου αρουραίου. Neurochem. Int. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]
45. Παξινός, Γ.; Franklin, KB Mouse Brain στις Στερεοταξικές Συντεταγμένες. 2001. Διαθέσιμο στο διαδίκτυο: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (πρόσβαση την 1η Μαρτίου 2022).
46. Bronte, V.; Pittet, MJ Ο σπλήνας στην τοπική και συστηματική ρύθμιση της ανοσίας. Immunity 2013, 39, 806–818. [CrossRef]
47. Liu, Τ.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-κB σηματοδότηση σε φλεγμονή. Μεταφορά σήματος. Στόχος. Εκεί. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]
48. Balic, JJ; Albargy, Η.; Luu, Κ.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, Ν.; Louis, C. Απαιτείται φωσφορυλίωση σερίνης STAT3 για τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό του TLR4 και την έκφραση της IL-1. Nat. Commun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]
49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Η δεξαμενή Wnt της γλυκογόνο συνθάσης κινάσης 3βήτα είναι κρίσιμη για τον νευρωνικό θάνατο που προκαλείται από τροφική στέρηση. ΜοΙ. Κύτταρο. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [CrossRef]
50. Eom, Τ.; Jope, RS Αποκλεισμένη ανασταλτική φωσφορυλίωση σερίνης της κινάσης συνθάσης γλυκογόνου-3 / βλάπτει τον in vivo πολλαπλασιασμό των πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Biol. Psychiatry 2009, 66, 494–502. [CrossRef] 5
1. Franceschi, C.; Campisi, J. Χρόνια φλεγμονή (φλεγμονή) και η πιθανή συμβολή της σε ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία. J. Gerontol. Ser. A Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]
52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA Ένας ρόλος για τα ανώριμα μυελοειδή κύτταρα στη γήρανση του ανοσοποιητικού. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]
53. Tang, Υ.; Le, W. Διαφορικοί ρόλοι μικρογλοίας Μ1 και Μ2 σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες. ΜοΙ. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]
54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Συστημική φλεγμονή και μικρογλοιακή ενεργοποίηση: Συστηματική ανασκόπηση πειραμάτων σε ζώα. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]
55. Furube, Ε.; Kawai, S.; Inagaki, Η.; Takagi, S.; Miyata, S. Ετερογένεια εξαρτώμενη από την περιοχή του εγκεφάλου και δοσοεξαρτώμενη διαφορά στην παροδική αύξηση του πληθυσμού μικρογλοίας κατά τη διάρκεια φλεγμονής που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες. Sci. Απ. 2018, 8, 2203. [CrossRef]
56. Brandi, Ε.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, Α.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Μικρογλοιακή και αστροκυτταρική ενεργοποίηση ειδική για την περιοχή του εγκεφάλου σε απόκριση σε συστημική έκθεση σε λιποπολυσακχαρίτες. Εμπρός. Γηράσκοντα Νευροσκί. 2022, 14, 910988. [CrossRef]
57. Radulovic, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, Β.; Steinert, Α.; Niess, JH Ενέσεις λιποπολυσακχαρίτη σε ποντίκια για μίμηση της εισόδου προϊόντων που προέρχονται από μικροβία μετά από παραβίαση του εντερικού φραγμού. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]
58. Fink, MP Ζωικά μοντέλα σήψης. Virulence 2014, 5, 143–153. [CrossRef]
59. Zhou, Η.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Ο ρόλος του ενδοθηλιακού TLR4 για τη στρατολόγηση ουδετερόφιλων σε μικροαγγεία του κεντρικού νευρικού συστήματος στη συστημική φλεγμονή. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [CrossRef]
60. Beurel, E. HDAC6 ρυθμίζει την ανοχή LPS στα αστροκύτταρα. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]
61. Yao, L.; Li, Ρ.; Chen, Q.; Hu, Α.; Wu, Υ.; Li, B. Προστατευτικές επιδράσεις της ανοχής στις ενδοτοξίνες σε περιφερειακή νευροφλεγμονή που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες και ντοπαμινεργική νευρωνική βλάβη. Immunopharmacol. Ανοσοτοξικόλη. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, Χ.; Ivashkiv, LB Ο παράγοντας νέκρωσης όγκου προκαλεί διασταυρούμενη ανοχή στην ενδοτοξίνη που προκαλείται από την κινάση GSK3 σε μακροφάγα. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]
63. Yamawaki, Υ.; Shirawachi, S.; Mizokami, Α.; Nozaki, Κ.; Ito, Η.; Asano, S.; Oue, Κ.; Aizawa, Η.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Η καταλυτικά ανενεργή πρωτεΐνη που σχετίζεται με τη φωσφολιπάση C ρυθμίζει την προκαλούμενη από λιποπολυσακχαρίτες την προκαλούμενη από υποθαλαμική φλεγμονή ανορεξία σε ποντίκια. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]
64. Shah, SA; Khan, Μ.; Jo, Μ.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Η μελατονίνη διεγείρει το μονοπάτι σηματοδότησης SIRT 1/Nrf2 που εξουδετερώνει το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες (LPS) για τη διάσωση του εγκεφάλου του μεταγεννητικού αρουραίου. CNS Neurosci. Εκεί. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]
65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Κινητική των προφλεγμονωδών κυτοκινών μετά από ενδοπεριτοναϊκή ένεση τριβρωμοαιθανόλης και συνδυασμού τριβρωμοαιθανόλης/ξυλαζίνης σε ποντικούς ICR. Εργαστήριο. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]
66. Posel, C.; Moller, Κ.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]
67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, Ι.; Calvo, S.; Κανό.; Tranque, P. Απόκριση του μεταγραφικού παράγοντα NFATc3 σε διεγερτικές και τραυματικές εγκεφαλικές προσβολές: Προσδιορισμός υποπληθυσμού αντιδραστικών αστροκυττάρων. Glia 2011, 59, 94–107. [CrossRef]
68. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, Ρ.; Έκφραση Calvo, S. Selenoprotein S σε αντιδραστικά αστροκύτταρα μετά από εγκεφαλική βλάβη. Glia 2011, 59, 959–972. [CrossRef]
