Η υπερέκφραση GRP78 ενεργοποιεί ΡΟΖ1-Νευροπροστατευτική μιτοφαγία με τη μεσολάβηση IP3R Μέρος 2

2.5. Δυτική Κηλίδα

Αναισθητοποιήσαμε σε βάθος τους αρουραίους με Dolethal (n=4) στα 7 dpi για να λάβουμε τμήματα νωτιαίου μυελού L4–L5 (μήκος 5-mm) για ανάλυση western blot. Καταψύξαμε τα δείγματα σε υγρό άζωτο.

Τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερα ερευνητικά αποτελέσματα έχουν δείξει ότι υπάρχει στενή σχέση μεταξύ του στυπώματος πρωτεΐνης και της μνήμης. Το Protein blotting είναι μια αναλυτική τεχνική για την ανίχνευση της πρωτεϊνικής έκφρασης, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στην έρευνα της νευροεπιστήμης.

Η σύνδεση μεταξύ των νευρώνων σχετίζεται στενά με την αποθήκευση της μνήμης. Η αποτύπωση πρωτεΐνης μπορεί να ανιχνεύσει την κατάσταση σύνδεσης μεταξύ των νευρώνων και την έκφραση των προ- και μετασυναπτικών πρωτεϊνών, αποκαλύπτοντας περαιτέρω τον σημαντικό ρόλο των πρωτεϊνών στο σχηματισμό και την αποθήκευση μνήμης.

Μελέτες έχουν βρει ότι η έκφραση των προσυναπτικών νευρωνικών πρωτεϊνών σχετίζεται στενά με το σχηματισμό και την αποθήκευση της μνήμης. Για παράδειγμα, κατά τη διαδικασία της μάθησης και της μνήμης, οι νευρώνες αλλάζουν την έκφραση των προσυναπτικών πρωτεϊνών και αυτή η αλλαγή σχετίζεται με το σχηματισμό και την αποθήκευση νέων αναμνήσεων. Επιπλέον, ορισμένες μελέτες έχουν επίσης βρει ότι οι αλλαγές στην έκφραση ορισμένων πρωτεϊνών σχετίζονται με νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως η νόσος του Αλτσχάιμερ.

Ως εκ τούτου, η στύπωση πρωτεΐνης μπορεί να παρέχει μια εις βάθος κατανόηση της κατάστασης σύνδεσης μεταξύ των νευρώνων και των αλλαγών στην έκφραση των σχετικών πρωτεϊνών, αποκαλύπτοντας τον μοριακό μηχανισμό των νευρώνων. Αυτό έχει μεγάλη σημασία για τη μελέτη του μηχανισμού σχηματισμού μνήμης και νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Εν ολίγοις, η σχέση μεταξύ αποτύπωσης πρωτεΐνης και μνήμης δείχνει το ρόλο των πρωτεϊνών στη σύνδεση μεταξύ των νευρώνων και της αποθήκευσης μνήμης. Αυτό παρέχει νέες ιδέες και κατευθύνσεις για τη μελέτη του μηχανισμού σχηματισμού μνήμης και των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Ας προωθήσουμε ενεργά την έρευνα της νευροεπιστήμης και ας συμβάλουμε στην υγεία και τη μακροζωία! Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή έχει αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και αντιγηραντικά αποτελέσματα, τα οποία μπορούν να βοηθήσουν στη μείωση των οξειδωτικών και φλεγμονωδών αποκρίσεων στον εγκέφαλο, προστατεύοντας έτσι την υγεία του νευρικού συστήματος. σύστημα. Επιπλέον, το Cistanche μπορεί επίσης να προωθήσει την ανάπτυξη και την επισκευή των νευρικών κυττάρων, ενισχύοντας έτσι τη συνδεσιμότητα και τη λειτουργία των νευρωνικών δικτύων. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να βοηθήσουν στη βελτίωση της μνήμης, της ικανότητας μάθησης και της ταχύτητας σκέψης, και μπορούν επίσης να αποτρέψουν την εμφάνιση γνωστικής δυσλειτουργίας και νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη λειτουργία του εγκεφάλου

Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν ή υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία με ομογενοποίηση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM HEPES, ρΗ 7,7, 251 mM σακχαρόζη, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, και ένα κοκτέιλ πρωτεάσης (Sigma-Aldrich) και αναστολείς φωσφατάσης (Switzer, Baselland), ) με ομογενοποιητή Πότερ σε πάγο.

Μετά από φυγοκέντρηση των προϊόντων λύσης στα 800 x g για 20 λεπτά στους 4°C, συλλέξαμε το υπερκείμενο ως το μεταπυρηνικό κλάσμα και ποσοτικοποιήσαμε τις πρωτεΐνες με BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Για το western blotting, φορτώσαμε 30 μg μεταπυρηνικών κλασμάτων τμημάτων L4-L5 από κάθε ζώο σε πηκτώματα 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου για να πραγματοποιήσουμε ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό των πρωτεϊνών που ακολουθείται από μεταφορά σε μεμβράνη PVDF σε σύστημα BioRadcuvette σε 25 mM Tris, ρΗ 8,4, 192 mM γλυκίνη, 20% (ν/ν) μεθανόλη.

Αποφράξαμε τις μεμβράνες με 5% BSA σε PBS συν 0.1% Tween-20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάσαμε στους 4 ◦C όλη τη νύχτα με πρωτογενές αντίσωμα: αντι- -ακτίνη ποντικού ( 1:10000, SigmaAldrich), ποντίκι anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), ποντίκι anti-CV (1:1000, Invitrogen), κουνέλι anti-HSP60 (1:500, Αντισώματα-online), ποντίκι anti- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), ποντίκι anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), κουνέλι κατά του Πάρκιν (1:500, Abcam, Cambridge, UK), ποντίκι anti-PINK1 (1:500, Abcam), κουνελιού αντι-NRF2 (1:500, Abcam), αντι-MNF2 (1:500, Abcam), κουνελιού αντι-GRP75 (1:500, Abcam).

Μετά από αρκετές πλύσεις, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες με ένα κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (1:5000, Vector). Η μεμβράνη οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μίγμα χημειοφωταύγειας 1:1 (0,5 Μ λουμινόλη, 79,2 mM ρ-κουμαρικό οξύ, 1 Μ Tris-HCl, ρΗ 8,5) και (8,8 Μ υπεροξείδιο του υδρογόνου, 1 Μ Tris-HCl, ρΗ 8,5) και το Οι εικόνες λήφθηκαν με μια συσκευή Gene Genome και αναλύθηκαν με το λογισμικό Gene Snap και Gene Tools (Syngene).

2.6. Μοντέλο In Vitro

Τα κύτταρα NSC34 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle με υψηλή περιεκτικότητα σε γλυκόζη (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Sigma-Aldrich), 100 μονάδες/mL πενικιλλίνη και 0,5 Χ διάλυμα πενικιλίνης/στρεπτομυκίνης (Sigma-Aldrich) και διατηρείται σε υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ◦C υπό 5% CO2, ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

Μετά από 4 ημέρες κυτταρικής καλλιέργειας χωρίς αλλαγή του μέσου, τα κύτταρα NSC34 είχαν έναν διαφοροποιημένο φαινότυπο που χαρακτηρίζεται από την παρουσία μακρών νευριτών. Την 4η ημέρα, τα φάρμακα προστέθηκαν στα κύτταρα. Τα διαλύματα Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) και EFV (Bristol-Myers Squibb, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) παρασκευάστηκαν σε συγκέντρωση 10Χ και διαλύθηκαν σε DMEM.

Μετά από 24 ώρες, αποτίμησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων επωάζοντας τα κύτταρα με 4 mg/mL διάλυμα ΜΤΤ για 3 ώρες. Οι σχηματισμένοι μπλε κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε DMSO και η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Νουκλεοφεκτιόν

Επιμολύναμε ένα εκατομμύριο κύτταρα με 2 μg πλασμιδίου για έκφραση GFP, GRP78, HAPARK, sh-eGFP ποντικού, sh-PINK1 ποντικού (ID 68943, Tebu-bio), ποντικού sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) και /ή ποντικιού sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) χρησιμοποιώντας το Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Switzerland) και το κιτ Nucleofactor V (Lonza) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Για στατική κυτταρομετρική ανάλυση, σπάραμε τα κύτταρα σε {{0}}φρεάτιο επικαλυμμένο με κολλαγόνο 10%. Μετά την καλλιέργεια, σταθεροποιήσαμε τα κύτταρα με 4% PFA, ξεπλύσαμε δύο φορές με PBS και αποθηκεύσαμε ή στη συνέχεια προσθέσαμε ρυθμιστικό αποκλεισμού που περιέχει PBS 0,3% (v/v)Triton X-100 και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Μετά από 3 ημέρες κυτταροκαλλιέργειας, προστέθηκαν φάρμακα διαλυμένα σε DMEM.

Για αυτά τα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε 1 μM Tun (Sigma-Aldrich), 10 μMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 μM CsA (Sigma-Aldrich) ή 10 μM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). Μετά από 5 ώρες μετά τη θεραπεία, είτε στερεώσαμε τα κύτταρα για ανοσοκυτταροχημεία με 4% PFA είτε τα ομογενοποιήσαμε σε τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,5,150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1% NP-40, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, κοκτέιλ πρωτεάσης και φωσφατάσης) για ανοσοστύπωμα. Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία με έκπλυση των δειγμάτων δύο φορές με PBS και επώαση με ρυθμιστικό αποκλεισμού που περιέχει PBSplus 0,3% (v/v) Triton X-100 και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό.

Επωάσαμε με τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα: κουνελιού anti-IP3R (1:200, Abcam), ποντικού anti-HA (1:2000, Abcam), ποντικού anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) και κουνελιού anti-HSP60 (1:500, Antibodies-online). Για να αξιολογήσουμε τη βιωσιμότητα με ΜΤΤ όπως περιγράφεται παραπάνω, αφήσαμε τη θεραπεία για 24 ώρες.

2.8. Μέτρηση Παραγωγής Μιτοχονδριακού Υπεροξειδίου και ΔψM

Τα κύτταρα επωάστηκαν με 2,5 μΜ MitoSOX για ανάλυση υπεροξειδίου ή με 2,5 μMTMRM για ανάλυση ΔψΜ, αμφότερα από Molecular Probes και Invitrogen κατά τη διάρκεια των τελευταίων 30 λεπτών της θεραπείας. Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε με μικροσκόπιο IX81 Olympus και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό στατικής κυτταρομετρίας.

2.9. Ηλεκτροχημική Μέτρηση Κατανάλωσης Οξυγόνου

Τα κύτταρα (1 × 106 ανά 1 mL σε HBSS) αναδεύτηκαν σε αεροστεγές θάλαμο στους 37 ◦C. Οι μετρήσεις λήφθηκαν με ένα ηλεκτρόδιο Ο2 τύπου Clark (Rank Brothers, Cambridge, UK) και καταγράφηκαν με τα δεδομένα Dup.18 συσκευή απόκτησης (WPI) αμέσως μετά την 5-θεραπεία με όχημα ή Tun.

2.10. Μιτοχονδριακή και κυτοσολική κλασματοποίηση

Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (10 mM HEPES, ρΗ 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM σακχαρόζη, και ένα κοκτέιλ πρωτεασών (Sigma-Aldrich) και αναστολέων φωσφατάσης (Roche)) με ομογενοποιητή Potter σε πάγο.

Μετά από φυγοκέντρηση των προϊόντων λύσης στα 2000x g για 5 λεπτά, το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στα 10.000x g για 12 λεπτά. Το υπερκείμενο θεωρήθηκε το διαλυτό κλάσμα (S2) και περιέχει κυτοσολικές πρωτεΐνες και μικροσώματα.

Το σφαιρίδιο (P2) ήταν το εμπλουτισμένο μιτοχονδριακό κλάσμα, το οποίο επαναιωρήθηκε σε τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8 }}, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, κοκτέιλ πρωτεάσης και φωσφατάσης) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA. Τα δείγματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για στύπωμα western.

2.11. Ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης

Βυθίσαμε τμήματα L{{0}}L5 του νωτιαίου μυελού (1-mm φέτες) σε ένα σταθεροποιητικό διάλυμα 2% (w/v) PFA και 2,5% (v/v) γλουταραλδεΰδης (βαθμού EM) σε 0.1 M PBS, pH 7,4 και τα τοποθέτησαν σε μια κουνιστή πλατφόρμα για 2 ώρες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 1% (w/v) PFA και στη συνέχεια στερεώθηκαν με 1% (w/v) τετροξείδιο του οσμίου (TAAB Lab ) που περιέχει 0,08% (w/v) εξακυανοσιδηρικό κάλιο (Sigma-Aldrich) σε PBS για 2 ώρες.

Πραγματοποιήσαμε τέσσερις πλύσεις με απιονισμένο νερό και διαδοχική αφυδάτωση σε ακετόνη. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν στους 4 ◦C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Ενσωματώσαμε δείγματα σε ρητίνη EPON και πολυμερίσαμε στους 60 ◦C για 48 ώρες.

Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για να ληφθούν ημίλεπτες τομές (1 μm) με μικροτόμο Leicaultracut UCT, χρωματισμένο με 1% (β/ο) υδατικό διάλυμα κυανού της τολουιδίνης και εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φωτός για να αναγνωριστούν οι περιοχές του κοιλιακού κέρατος εμπλουτισμένες με MNs.

Υπερλεπτές τομές (70 nm) κόπηκαν με ένα διαμαντένιο μαχαίρι, τοποθετήθηκαν σε επικαλυμμένα πλέγματα και ήρθαν σε αντίθεση με συμβατικά διαλύματα οξικού ουρανυλίου και κιτρικού μολύβδου Reynolds.

Τέλος, παρατηρήσαμε τις τομές με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (Jeol 1400) εξοπλισμένο με κάμερα GatanUltrascan ES1000CCD. Επιλέξαμε τρεις φέτες ανά συνθήκη, αναλύσαμε τρία MNs ανά τομή και μετρήσαμε τις περιοχές των πυρήνων σε σύγκριση με τη συνολική επιφάνεια του MN χρησιμοποιώντας εργαλεία ImageJ.

2.12. Βιοπληροφορική και Στατιστική

Χρησιμοποιήσαμε αναλύσεις διακύμανσης (ANOVA) για να συγκρίνουμε τις τιμές μεταξύ διαφορετικών πειραματικών ομάδων για δεδομένα που πληρούσαν την υπόθεση της κανονικότητας. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA, ακολουθούμενη από τη δοκιμασία πολλαπλών εύρους post hoc του Tukey ή χρησιμοποιώντας τη δοκιμή t Student. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0.05 για σημαντικότητα).

3. Αποτελέσματα

3.1. Κείμενο

3.1.1. Η πρωτεομική ανάλυση της υπερέκφρασης GRP78 αποκάλυψε τα μιτοχόνδρια ως τον κύριο στόχο

Προκειμένου να εντοπιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν σε νευροπροστασία με τη μεσολάβηση της υπερέκφρασης GRP78, πραγματοποιήσαμε μια συγκριτική πρωτεομική ανάλυση χωρίς ετικέτα για να εντοπίσουμε τόσο ποσοτικές όσο και ποιοτικές διαφορές μεταξύ τραυματισμένων από ΡΑ ζώων που έχουν μολυνθεί με αδενοϊούς για υπερέκφραση του GRP78 (Ad-GRP78 to be neuroprotective) των MNs, ή της βήτα-γαλακτοσιδάσης (Ad-ß-Gal) ως ελέγχου [20].

Επτά ημέρες μετά τον τραυματισμό (dpi) ήταν το επιλεγμένο χρονικό σημείο για την ανάλυση σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας [20,25]. Σε μια προηγούμενη σύγκριση μεταξύ ενός μοντέλου αναγέννησης μετά από περιφερική αξονοτομή και ράμματος του ισχιακού νεύρου έναντι του εκφυλιστικού μας μοντέλου RA, παρατηρήσαμε ότι τα συμβάντα σηματοδότησης ήταν παρόμοια μέχρι τα 7 dpi, όταν εμφανίστηκαν αποκλίνοντα προ-εκφυλιστικά συμβάντα μετά από ΡΑ [20,25].

Η ανάλυση χωρίς σήμανση LC-MS/MS των μεταπυρηνικών κλασμάτων από τμήματα νωτιαίου μυελού L4-L5 οδήγησε στην ταυτοποίηση 1420 πρωτεϊνών, με τουλάχιστον δύο πεπτίδια ανά πρωτεΐνη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για άλλα δείγματα και μελέτες [25] .

Συνολικά 566 και 732 πρωτεΐνες ή πεπτίδια άλλαξαν σημαντικά λόγω της υπερέκφρασης Ad-GRP78 ή Ad-ß-Gal, αντίστοιχα, σε ζώα που έχουν τραυματιστεί από ΡΑ σε σχέση με ζώα που έχουν τραυματιστεί από ΡΑ που δεν έχουν μολυνθεί με ιό (p < {{8} .05) (Πίνακες S1 και S2).

Συγκρίναμε και τις δύο λίστες και διαπιστώσαμε ότι 220 είχαν αλλάξει μοναδικά λόγω της υπερέκφρασης του Ad-GRP78 (Πίνακας S3). Ο λειτουργικός σχολιασμός αυτών των πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας το εργαλείο Βάσης δεδομένων για σχολιασμό, οπτικοποίηση και ολοκληρωμένη ανακάλυψη (DAVID) μας επέτρεψε να αναγνωρίσουμε τις πιο σημαντικές βιολογικές λειτουργίες στο σύνολο δεδομένων (FDR < 0,05) [34,35].

Η υπερέκφραση GRP78 είχε ως αποτέλεσμα διαφορές στα επίπεδα των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στις μιτοχονδριακές διεργασίες, τη λειτουργία και τα συστατικά (Πίνακας S4A–C, Εικόνα S1A–C). Οι όροι Gene Ontology (GO) και η ανάλυση εμπλουτισμού μονοπατιού KEGG αυτών των δεδομένων αποκάλυψαν ότι σε ζώα που είχαν μολυνθεί με Ad-GRP78 υπήρχαν σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα πολλών πρωτεϊνών με μιτοχονδριακές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών από το εξωτερικό και εσωτερικό μιτοχονδριακό πρόσωπο, πρωτεΐνες του αναπνευστικού συμπλέγματος. και πρωτεΐνες μήτρας.

Επιβεβαιώσαμε διαφορές στα επίπεδα πρωτεϊνών που αποκαλύφθηκαν στη λίστα πρωτεϊνών, όπως το GRP75, το οποίο ρυθμίστηκε προς τα πάνω (p < 0.05) και η υπομονάδα του συμπλέγματος V (CV ), μειωμένη ρύθμιση (p=0.03) στις ομάδες GRP78 όπως αναμενόταν (Εικόνα 1Α).

Σε ολόκληρη τη λίστα, οι πιο υψηλά υπορυθμισμένες ήταν το 2-οξογλουταρικό/μηλικό-φορέας πρωτεΐνης OGC (SCL25A11), MT-ND3 (ένας καταστολέας όγκων που συμμετέχει στη μεταφορά θεμαλικού-ασπαρτικού και αναγεννά τη δεξαμενή NADH στο σύμπλεγμα μιτοχονδριακής μήτρας προς το σύμπλεγμα I λειτουργία), την υπομονάδα NADH αφυδρογονάσης 3 του συμπλόκου Ι, την αμινοτρανσφεράση γαμμαμινοβουτυρικού οξέος ABAT και την υπομονάδα ουβικινόλης-κυτοχρώματος C αναγωγάσης του συμπλόκου III. Αντίθετα, πολύ λίγες πρωτεΐνες ρυθμίστηκαν προς τα πάνω (Εικόνα 1Β).

Μία προς τα πάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνη ήταν η GRP78 όπως αναμενόταν και οι άλλες προς τα πάνω ρυθμισμένες πρωτεΐνες ήταν ο μεταφορέας του αμινοξέος EAAT2, ο οποίος βρίσκεται κυρίως στην πλασματική μεμβράνη και μερικές φορές στα μιτοχόνδρια στις διεγερτικές συνάψεις, και η υδροξυακυλο-CoA αφυδρογονάση HADHA, η οποία καταλύει τα τρία τελευταία στάδια του mitochondr -οξείδωση λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας.

Επεκτείναμε την ανάλυση για να διερευνήσουμε εάν άλλες πρωτεΐνες σε πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη λειτουργία των μιτοχονδρίων ορμιτοχόνδρια τροποποιήθηκαν εκτός της πρωτεωμικής λίστας προκειμένου να επιβεβαιωθεί η λειτουργική επίδραση των μιτοχονδρίων (Εικόνα 1C).

Παρατηρήσαμε ότι η οπτική ατροφία 1 της GTPase που σχετίζεται με τη δυναμίνη με το μιτοχόνδριο (OPA1), η οποία εμπλέκεται στη σύντηξη [36], ήταν μειωμένη ρύθμιση (p < 0.1). Η LONP1, μια εξαρτώμενη από το ATP πρωτεάση που μεσολαβεί στην επιλεκτική αποικοδόμηση των κακώς διπλωμένων πολυπεπτιδίων, παρουσίασε τάση για αύξηση, αλλά δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα της ουβικινόνης NDUFA9, του μεταγραφικού παράγοντα NRF2, ο οποίος ρυθμίζει γονίδια που περιέχουν στοιχεία αντιοξειδωτικής απόκρισης ή άλλη δυναμίνη -σχετική GTPase που εμπλέκεται στην έγχυση, όπως η μιτοφουσίνη 2 (MFN2) [36].

Μια περιεκτική περίληψη των αλλαγών που βρέθηκαν μέσα στα μιτοχόνδρια παρουσιάζεται στο σχήμα στο Σχήμα 1D. Η μιτοχονδριακή δυναμική είναι σημαντική για τις αποκρίσεις στρες καθώς τα κατεστραμμένα μιτοχονδριακά συγχωνεύονται για την ανταλλαγή υλικού και η μιτοχονδριακή σχάση επιτρέπει τον διαχωρισμό των κατεστραμμένων μιτοχονδρίων και την επακόλουθη μιτοφαγία [37].

Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο κύριος αριθμός των προς τα κάτω ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια και δεν παρατηρήθηκαν εμφανείς αλλαγές σχετικά με τη δραστηριότητα σύντηξης των μιτοχονδρίων αναλύοντας το MFN2 και την αναλογία των μορφών L/S OPA1 (Εικόνα 1C), ερευνήσαμε δείκτες που σχετίζονται με τη μιτοφαγία.

Κλασικά, η εξαρτώμενη από την αυτοφαγία αποικοδόμηση των μιτοχονδρίων συμβαίνει μετά την εκπόλωση και συνήθως προκαλείται από την αυξημένη συσσώρευση της υποθετικής κινάσης 1 (PINK1) πλήρους μήκους που προκαλείται από τη φωσφατάση και την τενσινομόλογη (PTEN) στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη.

Στη συνέχεια, ο ενδιάμεσος δακτύλιος Ε3 ουβικιτίνη-πρωτεϊνική λιγάση Parkin στρατολογείται για να επισημάνει την πρωτεΐνη της μιτοχονδριακής εξωτερικής μεμβράνης της αποπολωμένης ουβικιυλίωσης μιτοχονδρίων [38-41]. Το επάνω μέρος του Σχήματος 2Α δεν δείχνει αλλαγές στα επίπεδα Parkin αλλά μια σημαντική μείωση του πλήρους μήκους PINK1 που προκαλείται από τραυματισμό RA στο ομόπλευρο τμήμα L4-L5 νωτιαίου μυελού σε σχέση με τον έλεγχο στα 7 dpi. Αντίθετα, η υπερέκφραση του GRP78 μείωσε το Parkin αλλά διπλασίασε τα επίπεδα PINK1 μετά από ΡΑ σε σύγκριση με την έκφραση ελέγχου της μη σχετιζόμενης πρωτεΐνης -Gal (Εικόνα 2Α, κάτω).

Η ανοδική ρύθμιση του πλήρους μήκους PINK1 είναι σύμφωνη με την επαγωγή μιτοφαγίας [42] και η μείωση του Parkin μπορεί να σχετίζεται με μια προχωρημένη κατάσταση αποσυναρμολόγησης οργανιδίων όπως παρατηρείται από τις υπόλοιπες πρωτεΐνες μιτοχονδρίων.

Διερευνούμε περαιτέρω τον συνεντοπισμό των μιτοχονδρίων και των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τους μικροσωληνίσκους 1A/1B θετικά σημεία ελαφριάς αλυσίδας 3 (LC3), ένα βασικό συστατικό του πυρήνα του μηχανισμού μακροαυτοφαγίας και απαραίτητο για τη διαδικασία της μιτοφαγίας [43].

Χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στον συνεντοπισμό των μιτοχονδρίων, που επισημάνθηκε με χρήση αντι-COX IV, με θετικό LC3-μετά από ΡΑ μόνο σε κατεστραμμένα MN που υπερεκφράζουν το GRP78 στα 7 dpi (Εικόνα 2Β).

Επιβεβαιώσαμε την ύπαρξη μιτοφαγίας σε αποκομμένα ΜΝ μόνο κατά την υπερέκφραση του GRP78 με την ανάλυση δειγμάτων που χρησιμοποιεί ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης.

Παρατηρήσαμε άφθονα κενοτόπια με καταποντισμένα μιτοχόνδρια, χαρακτηριστικό γνώρισμα της μιτοφαγίας [37], που μοιάζουν με μιτοφαγοσώματα και αρκετά ERcisternae σε στενή σύνδεση με μιτοχόνδρια εντός MNs από ζώα Ad-GRP78, αλλά δεν τα εντοπίσαμε στο Ad{3}Gal RA-inju δείγματα αρουραίου στα 5 dpi (Εικόνα 2C).

Εικόνα 1. Η υπερέκφραση GRP78 σε ζώα που έχουν τραυματιστεί από ΡΑ στοχεύει τις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες. (Α) Ανοσοκηλίδωση και γραφήματα ράβδων που δείχνουν τις μέσες αλλαγές πτυχής (± SEM) των επιπέδων πρωτεΐνης GRP78, GRP75 και CV σε τμήματα L4-L5 νωτιαίου μυελού σε GRP78 έναντι.

-Gal υπερεκφράζει αρουραίους τραυματισμένους από ΡΑ κατά 7 dpi. Τα επίπεδα κανονικοποιήθηκαν σε τιμές ακτίνης (n=4; * p < 0.05 έναντι Ad- -Gal, Student's t-test). (Β) Ιστόγραμμα αλλαγών πτυχής μιτοχονδριακής πρωτεΐνης που ελήφθη με πρωτεομική ανάλυση τμημάτων L4-L5 νωτιαίου μυελού σε ζώα τραυματισμένα με ΡΑ που υπερεκφράζουν το GRP78 σε σύγκριση με την ομάδα Ad- -Gal κατά 7 dpi. (C) Ανοσοκηλίδωση και γραφήματα ράβδων που δείχνουν τις μέσες αλλαγές πτυχής (± SEM) των NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 κανονικοποιημένες σε ακτίνη. (Δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων. Student's t-test). (Δ) Σχηματικά μιτοχόνδρια με πρωτεΐνες αλλαγμένες από την υπερέκφραση του GRP78 σε τμήματα νωτιαίου μυελού L4-L5 από ζώα που έχουν τραυματιστεί από ΡΑ που επισημαίνονται με κίτρινο (μειωμένο) ή με μπλε (αυξημένο) στα 7 dpi.

Εικόνα 2. Η μιτοφαγία διαμορφώνεται in vivo μετά από ΡΑ σε αρουραίους που υπερεκφράζουν GRP78. (Α) Ανοσοκηλιώσεις και αντίστοιχες ραβδώσεις για ανάλυση αλλαγής πτυχής PINK1 και PARK των επιπέδων πρωτεΐνης (μέσος όρος ± SEM) κανονικοποιημένοι σε επίπεδα ακτίνης, στα τμήματα L{3}}L5 νωτιαίου μυελού των τραυματισμένων με ρευματοειδή αρθρίτιδα αρουραίων έναντι.

έλεγχος (πάνω) ή από τις ομάδες Ad{{0}}Gal και Ad-GRP78 (κάτω) κατά 7 dpi. (n=4; * p < 0,05,Student's t-test). (Β) Αριστερά, μικροφωτογραφίες αντιπροσωπευτικών ΜΝ στην ομόπλευρη τοποθεσία από τραυματισμένα ζώα που έλαβαν ενδορραχιαία ένεση ομάδων AAVrh10-GFP ή AAVrh10-GRP78 στα 7 dpi. Τα δείγματα χρωματίστηκαν για COX IV (κόκκινο) και LC3 (πράσινο) και αντιχρωματίστηκαν με φθορίζον Nissl (μπλε).

Γραμμή κλίμακας=10 μm και ψηφιακό ζουμ σε ένθετα 10X.

Σημειώστε ότι ο συντοπισμός παρατηρείται μόνο στην ομάδα AAVrh10-GRP78. Δεξιά, ραβδόγραμμα που δείχνει την ανάλυση του % των κουκκίδων συνεντοπισμού των COX IV και LC3. Μέσος όρος ± SEM συνεντοπισμού COX IV και LC3 (n=4; ** p < 0.01,Student's t-test). (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης όπου τα μιτοχόνδρια διακρίνονται εντός των MNs του νωτιαίου μυελού: α, εικόνα κυτταροπλάσματος MN που δείχνει ζώο ανεξέλεγκτου μιτοχονδρίων. β, εικόνα κυτταροπλάσματος ΜΝ από αρουραίο που έχει τραυματιστεί με ΡΑ από την ομάδα Ad- - γ, εικόνα κυτταροπλάσματος ΜΝ από αρουραίο τραυματισμένο με ΡΑ από την ομάδα Ad-GRP78 με μερικά μιτοχόνδρια που έχουν κατακλυστεί και υποδεικνύονται με κόκκινους αστερίσκους. d, η εικόνα υψηλότερης μεγέθυνσης εμφανίζεται στο (C) υποδεικνύοντας μια επαφή μεγάλων μιτοχονδρίων και ER. Οι ράβδοι κλίμακας υποδεικνύονται στα σχήματα.

Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση GRP78 μπορεί να επάγει MN που έχουν αποσυνδεθεί με μιτοφαγαγίνη μετά από ΡΑ και θα μπορούσε να προάγει τη νευροπροστασία.

3.1.2. Η υπερέκφραση GRP78 αποκαθιστά την κατεστραμμένη μιτοχονδριακή λειτουργία

Στη συνέχεια ερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση της υπερέκφρασης GRP78 στη μιτοχονδριακή χρήση ενός in vitro μοντέλου στρες ER, καθώς αυτή η προσβολή εμφανίζεται νωρίς μετά από τραυματισμό RA in vivoas που αναφέρθηκε προηγουμένως [20,26] και είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για τον έλεγχο νέων νευροπροστατευτικών παραγόντων [2,44 ].

Αυτό το μοντέλο χρησιμοποιεί τουνικαμυκίνη (Tun), η οποία είναι ένας επαγωγέας στρες ER που προκαλεί το σχηματισμό ενδιαμέσων Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης-λιπιδίων, εμποδίζοντας έτσι τη γλυκοζυλίωση των νεοσυντιθεμένων πρωτεϊνών και οδηγώντας σε λάθος αναδίπλωση των πρωτεϊνών. Το χρησιμοποιήσαμε επειδή μια σταματημένη εκκριτική οδός έχει επίσης αναφερθεί ότι είναι το κλειδί στη νευροεκφυλιστική διαδικασία μετά από ΡΑ [26].

Αρχικά επαληθεύσαμε ότι η πυρηνομόλυνση των κυττάρων που μοιάζουν με κινητικό νευρώνα NSC34 με έναν κατάλληλο φορέα οδήγησε στην παραγωγή του GRP78 (Εικόνα 3Α). Σε αυτά τα κύτταρα, η έκφραση του GRP78 αύξησε σημαντικά το μέσο επιβίωσης που περιέχει Tun (Εικόνα 3Β).

Αν και η θεραπεία Tun κανονικά προκαλεί την ίδια την GRP78, αυτή η ενδογενής υπερέκφραση είναι αρκετά αργά (κατά 24 ώρες) (Εικόνα S2). Αναρωτηθήκαμε επίσης εάν θα μπορούσαμε να προσδιορίσουμε εάν η υπερέκφραση GRP78 έχει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα σε ένα άλλο μοντέλο in vitro που αναφέραμε προηγουμένως ότι αναπαράγει πολλά χαρακτηριστικά του θανάτου ΜΝ μετά από τραυματισμό ΡΑ [26].

Αυτό το μοντέλο βασίζεται σε κυτταροσκελετική βλάβη που προκαλείται από τη νοκοδαζόλη, η οποία παρεμβαίνει στον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων. Η έκφραση GRP78 αύξησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν παρουσία νοκοδαζόλης επίσης (Εικόνα 3Β).

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τη μιτοχονδριακή λειτουργία μετρώντας τη δημιουργία ειδών αντιδραστικού οξυγόνου (ROS) στα μιτοχόνδρια χρησιμοποιώντας MitoSOX, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψm) χρησιμοποιώντας μεθυλεστέρα τετραμεθυλροδαμίνης (TMRM) και τον ρυθμό κατανάλωσης O2, στα κύτταρα NSC34 που υποβλήθηκαν σε στρες ER με ή χωρίς υπερέκφραση GRP78.

Ως θετικός έλεγχος, χρησιμοποιήσαμε το efavirenz (EFV), έναν μιτοτοξικό παράγοντα που μεταβάλλει και τις τρεις παραμέτρους [45]. Παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα MitoSOX αυξήθηκαν προοδευτικά μετά την προσθήκη Tun, φτάνοντας τη στατιστική σημασία κατά 24 ώρες και ότι η παραγωγή ROS αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με EFV από την πρώτη ώρα μετά τη θεραπεία σε σχέση με τους μάρτυρες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα (Εικόνα S3A).

Η υπερέκφραση του GRP78 οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα μιτοχονδρίων ROSin σε σχέση με κύτταρα που εκφράζουν GFP σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία Tun ή EFV (Εικόνα 3C). Το Δψm κατέρρευσε μετά από 5 και 24 ώρες θεραπείας Tun και μετά από 24 ώρες θεραπείας EFV (Εικόνα S3B). Η ανάκτηση αυτής της παραμέτρου επιτεύχθηκε με υπερέκφραση GRP78 σε κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με Tun ή EFV (Εικόνα 3D).

Ο ρυθμός κατανάλωσης O2 μειώθηκε κατά τη διάρκεια 80 λεπτών ανάλυσης μετά την προσθήκη Tun στα κύτταρα που εκφράζουν GFP (κλίση -0.063,R2=0.98), αλλά η κατανάλωση O2 ήταν σταθερό σε GRP78-που υπερεκφράζουν κελιά παρά την παρουσία του Tun (κλίση −0,221, R2=0,99) (Εικόνα 3Ε, αριστερά).

Μετά από 5 ώρες, η αναπνοή ήταν κανονική σε κύτταρα που υπερέκφραζαν GRP78- και ήταν σοβαρά σε κίνδυνο στα κύτταρα που εκφράζουν GFP (Εικόνα 3Ε, δεξιά). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το GRP78 εξασθενεί τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που προκαλείται από στρες ER ή μιτοτοξικότητα.

For more information:1950477648nn@gmail.com