Έκφραση ανοσοσφαιρίνης G σε ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG et al

Αφηρημένη. Εγγύτατοςσωληνοειδήςεπιθηλιακά κύτταρα (PTEC) έχουν εγγενή ανοσοποιητικά χαρακτηριστικά και παράγουν προφλεγμονώδεις παράγοντες, χημειοκίνες και συστατικά συμπληρώματος που οδηγούν την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT). Οι προηγούμενες μελέτες μας αποκάλυψαν ότι τα ανθρώπινα μεσαγγειακά κύτταρα και τα ποδοκύτταρα ήταν σε θέση να συνθέσουν και να εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνη (Ig)A και IgG, αντίστοιχα. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει την έκφραση των Igs σε PTEC. Πρώτον, ανιχνεύθηκε IgG στο κυτταρόπλασμα, την κυτταρική μεμβράνη και τον αυλό τουPTECστον φυσιολογικό νεφρικό φλοιό απόανοσοϊστοχημεία. Δεύτερον, η μεταγραφή γονιδίου Ig και ο ανασυνδυασμός V(D)J ανιχνεύθηκαν σε μεμονωμένα PTEC με ένθετη PCR και αλληλουχία Sanger. Τρίτον, τα Ig, Igκ και Igλ ανιχνεύθηκαν ξεκάθαρα σε μια απαθανατισμένη σειρά PTEC (HK-2) με ανοσοχρώση και western blotting, στην οποία χρησιμοποιήθηκε το RP215 (ένα αντίσωμα που δεσμεύεται κυρίως με IgG που προέρχεται από μη Β κύτταρα). Επιπλέον, μεταγραφές γονιδίων Ig, Igκ και Igλ, συντηρητικός ανασυνδυασμός V(D)J στη μεταβλητή περιοχή Ig, γονίδιο ενεργοποίησης ανασυνδυασμού 1/2 και επαγόμενη από την ενεργοποίηση απαμινάση κυτιδίνης ανιχνεύθηκαν όλα στα κύτταρα HK-2. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα PTEC μπορεί να εκφράζουν IgG με παρόμοιο τρόπο με τα Β κύτταρα. Επιπλέον, η έκφραση IgG ρυθμίστηκε προς τα πάνω από τον TGF-1 και μπορεί να εμπλέκεται στην EMT.

Λέξεις-κλειδιά:εγγύτατοςσωληνοειδήςεπιθηλιακά κύτταρα, μονοκύτταρα, HK‑2, IgG, επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Εισαγωγή

Εγγύτατοςσωληνοειδήςεπιθηλιακά κύτταρα (PTEC) είναι ο πιο άφθονος τύπος κυττάρων στονεφρόκαι έχουν σημαντικό ρόλο στη νεφρική αποκατάσταση ή/και στην εξέλιξη των χρόνιων νεφρικών παθήσεων. Τα PTEC ασκούν ανοσολογικές λειτουργίες εκφράζοντας πολλαπλούς υποδοχείς τύπου Toll (TLRs), όπως TLR 1, 2, 3, 4 και 9 (1,2) και μόρια που σχετίζονται με την αντιγονοπαρουσιαστική κυτταρική λειτουργία, συμπεριλαμβανομένων των MHCII, CD74, CD80 , και CD86 (3). Αυτά τα έμφυτα ανοσοποιητικά χαρακτηριστικά των PTECs τους επιτρέπουν να ενεργούν ως ανοσοανταποκριτές σε ένα ευρύ φάσμα ερεθισμάτων, με την επακόλουθη παραγωγή και απελευθέρωση βιοδραστικών μεσολαβητών, συμπεριλαμβανομένων των προφλεγμονωδών κυτοκινών, χημειοκινών και συστατικών του συμπληρώματος, που οδηγούν τη διάμεση φλεγμονή και ίνωση (4). Τα PTEC εκφράζουν επίσης νεογνικούς υποδοχείς Fc και διατηρούν την ικανότητα ειδικής εξαρτώμενης από το pH δέσμευσης και διακυττάρωσης της ανοσοσφαιρίνης (Ig)G (5). Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε, παραμένει άγνωστο εάν τα PTEC εκφράζουν Igs.

Είχε προηγουμένως υποτεθεί ότι τα Igs παράγονται αποκλειστικά από ώριμα Β κύτταρα και κύτταρα πλάσματος και ότι τα Igs δρουν ως αντισώματα για την αναγνώριση και εξουδετέρωση διαφόρων παθογόνων. Ωστόσο, αυτή η θεωρία αμφισβητήθηκε τις τελευταίες δεκαετίες, καθώς αυξανόμενα στοιχεία αναφέρουν ότι τα Igs, συμπεριλαμβανομένων των IgA, IgG και IgM, μπορούν να παραχθούν και να εκκριθούν από μη-Β κύτταρα, όπως τα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα (6,7) και φυσιολογικά μη Β κύτταρα (8,9), καθώς και σε προνομιούχες ανοσολογικές θέσεις, όπως τα μάτια (10), οι κεντρικοί νευρώνες (11,12), ο πλακούντας (13) και οι όρχεις και η επιδιδυμίδα (14)

Παρόμοια με τα Igs που προέρχονται από Β-κύτταρα (B-Igs), τα μη-B-Igs είναι επίσης τα προϊόντα της μεταγραφής και αναδιάταξης του γονιδίου Ig και εμφανίζουν κλασικά μοτίβα ανασυνδυασμού V(D)J με προσθήκες νουκλεοτιδίων στις συνδέσεις και σωματικές υπερμεταλλαγές(7, 11,14). Σε αντίθεση με τα B-Igs, τα non-B-Ig εμφανίζουν περιορισμένα μοτίβα ανασυνδυασμού V(D)J και λιγότερη ποικιλομορφία (7). Λειτουργικά, οι μη-Β-Ιg όχι μόνο ασκούν φυσική δραστηριότητα αντισωμάτων στο δέρμα και τον βλεννογόνο (8), αλλά μπορούν επίσης να λειτουργήσουν ως αυξητικοί παράγοντες για την προώθηση του πολλαπλασιασμού και της προσκόλλησης των κυττάρων και μπορεί να ενισχύσουν την έναρξη και τη μετάσταση του καρκίνου δεσμεύοντας τις ιντεγκρίνες. 15-17). Για παράδειγμα, το αναγνωρισμένο με RP215 καρκίνο IgG εκτελεί την ογκογόνο λειτουργία του αλληλεπιδρώντας με το σύμπλεγμα ιντεγκρίνης 6 4 και ενεργοποιώντας τις οδούς FAK και Src (15).

Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι τα μεσαγγειακά κύτταρα (18) και τα ποδοκύτταρα (19) μπορούν να συνθέσουν και να εκκρίνουν IgA και IgG και να συμμετέχουν στην κυτταρική ανάπτυξη και κυτταρική προσκόλληση in vitro. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να αξιολογήσει τα επίπεδα έκφρασης των Igs σε PTEC και να διερευνήσει τον πιθανό ρόλο τους στην επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT).

Επιδράσεις του cistanche: ωφελούν τα νεφρά

Υλικά και μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία.Μια απαθανατισμένη σειρά PTEC HK‑2 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα HK-2 καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 συμπληρωμένο με 100 U/ml πενικιλλίνη, 0,1 mg/ml στρεπτομυκίνη (όλα Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) και 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS; Αυστραλιανής προέλευσης, Biological Industries USA, Inc.) στους 37˚C σε ατμόσφαιρα που περιέχει 95 τοις εκατό αέρα και 5 τοις εκατό CO2. Προκειμένου να αποφευχθεί η παρεμβολή της Ig στο FBS, το μέσο αντικαταστάθηκε με ένα μέσο χωρίς ορό 24-48 ώρες πριν από τη συλλογή των κυττάρων. Τα κύτταρα HK-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (2, 5 και 10 ng/ml) TGF-1 (Sigma-Aldrich, Merck KGaA).

Απλή απομόνωση PTEC και σύνθεση cDNA.Δείγμα ανθρώπινου νεφρού μακροσκοπικά φυσιολογικού φλοιού ιστού ελήφθη από ασθενή (άνδρας, 31 ετών) που υποβλήθηκε σε νεφρεκτομή ως αποτέλεσμα νεφρικού καρκινώματος χωρίς εμφανή νεφρική δυσλειτουργία. Παρασκευάστηκε ένα εναιώρημα μονοκυττάρου με πέψη του νεφρικού φλοιού με 1 mg/ml κολλαγενάσης Ι (Sigma-Aldrich, Merck KGaA) στους 37°C για 20 λεπτά. Τα PTEC ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένο με φυκοερυθρίνη (PE) αντι-CD10 (αρ. κατ. 312203) και συζευγμένο με αλλοφυκοκυανίνη (APC) αντι-CD13 (αρ. κατ. 301705, και τα δύο BioLegend, Inc.) από flutingore Σύστημα Ειδικής Παραγγελίας BD FACSAria II) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (20). Τα αντίστοιχα αντισώματα ελέγχου ισοτύπου (αριθ. κατ. 400111 και 400119, και τα δύο BioLegend, Inc.) χρησιμοποιήθηκαν για να αποκλειστεί η μη ειδική χρώση. Διπλά θετικά επισημασμένα ζωντανά κύτταρα απομονώθηκαν ως PTECs. Ένα μόνο PTEC επιλέχθηκε χειροκίνητα σε μικροσκόπιο ανεστραμμένου φωτός χρησιμοποιώντας τριχοειδές σιφώνιο και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε σωλήνα PCR λεπτού τοιχώματος 0,2 ml που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (21). Η απλή εκχύλιση PTEC RNA και η σύνθεση cDNA διεξήχθησαν σύμφωνα με μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως(21). Συνολικά πέντε μεμονωμένα PTEC χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση μεταγραφής και αναδιάταξης γονιδίου Ig.

Ενίσχυση PCR.Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα HK-2, μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος [PBMCs, που απομονώθηκαν από μια υγιή γυναίκα 31 ετών με χρήση Ficoll (αρ. κατ. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] και τον φλοιό των νεφρών (από τον ίδιο ασθενή που χρησιμοποιήθηκε σε απλή απομόνωση PTEC) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) και η συγκέντρωση RNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Στη συνέχεια, 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA First Strand RevertAid (αρ. κατ. K1622, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Πραγματοποιήθηκε PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν τις σταθερές περιοχές Ig, Igκ, Igλ και απαμινάσης κυτιδίνης (AID) που προκαλείται από την ενεργοποίηση. Πραγματοποιήθηκε ένθετη PCR για την ενίσχυση της μεταβλητής περιοχής της Ig, της πρωτεΐνης 2 που σχετίζεται με υποδοχέα λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LRP2) και του γονιδίου ενεργοποίησης ανασυνδυασμού (RAG)1 και RAG2. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,0 τοις εκατό και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GelRed (αρ. κατ. 41003, Biotium, Inc.). Οι εκκινητές του AID, RAG1/2, και οι σταθερές περιοχές των Ig, Igκ, Igλ που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη αναφέρονται σε εκκινητές που χρησιμοποιούνται από τους Jing et al (19). Οι εκκινητές της μεταβλητής περιοχής Ig αναφέρονται σε εκκινητές που χρησιμοποιούνται από τους van Dongen et al (22). Οι άλλοι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για PCR αναφέρονται στον Πίνακα SI. Οι συνθήκες θερμοκυκλοποίησης παρατίθενται στον Πίνακα SII.

Αλληλουχία Sanger και αναλύσεις δεδομένων αλληλουχίας.Τα προϊόντα PCR της μεταβλητής περιοχής Ig που ελήφθησαν από μεμονωμένα PTEC, κύτταρα HK-2 και PBMCs κλωνοποιήθηκαν αντίστοιχα σε ένα pGEM-T Easy Vector System I (αρ. κατ. A1360; Promega Corporation), το οποίο μετασχηματίστηκε σε TOP10 Competent κύτταρα (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Εν συντομία, 5 μl προϊόντων απολίνωσης προστέθηκαν σε 30 μl ικανά κύτταρα TOP10, επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά, υποβλήθηκαν σε θερμικό σοκ στους 42°C για 90 δευτερόλεπτα και επωάστηκαν σε πάγο για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 500 μl LB και αφέθηκαν σε ηρεμία στους 37˚C για 40 λεπτά πριν εμβολιαστεί μέρος του βακτηριακού υγρού σε τρυβλία Petri επικαλυμμένα με 0,1 mmol/l IPTG και 20 μg/ml X-Gal. Τα πιάτα αναποδογυρίστηκαν στους 37°C κατά τη διάρκεια της νύχτας. Συνολικά, 5-16 λευκές αποικίες ανά δείγμα επιλέχθηκαν τυχαία και αναλύθηκαν η αλληλουχία τους χρησιμοποιώντας έναν γενετικό αναλυτή ABI 3730XL (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Οι αναδιαταγμένες αλληλουχίες V(D)J συγκρίθηκαν με εκείνες στο βασικό εργαλείο αναζήτησης τοπικής ευθυγράμμισης (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) για τον εντοπισμό των καλύτερων ταιριασμένων τμημάτων και συνδέσεων γονιδίου βλαστικής γραμμής μετά την περικοπή του εκκινητή .

Ανάλυση Western blot.Τα κύτταρα HK-2 λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης TSD [1 τοις εκατό SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM DTT] που περιείχε ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Applygen Technologies Inc.), που υποβλήθηκε σε υπερήχους σε παγωμένο νερό για 1 λεπτό ( εργασία 5 δευτερόλεπτα και ανάπαυση 15 δευτερόλεπτα, 3 φορές) και λύθηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από φυγοκέντρηση στους 12,000 xg για 10 λεπτά στους 4˚C, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κυτταρολύματος χρησιμοποιώντας κιτ BCA (Applygen Technologies Inc.). Ακολούθως, 5 φορές αναγωγικό ρυθμιστικό φόρτωσης προστέθηκε στο προϊόν λύσης, βράστηκε στους 100˚C για 10 λεπτά και τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν αμέσως για ανάλυση western blot. Ο ορός, που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας για Ig, απομονώθηκε από έναν υγιή δότη (τον ίδιο δότη που χρησιμοποιήθηκε στα PBMCs) με φυγοκέντρηση στα 2.103 xg για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

Επιδράσεις του cistanche: ωφελούν τα νεφρά

Η κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες. Εν συντομία, 3{{4{43}}}} μg πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε πηκτές 10 τοις εκατό και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Στη συνέχεια, η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε σε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και επωάστηκε με πρωτογενή αντισώματα στους 4°C όλη τη νύχτα, συμπεριλαμβανομένου Ig αντι-ανθρώπινου κουνελιού (αρ. κατ. ab109489; 1:1,{{8} }), rabbit anti-human Ig 4 (αρ. κατ. ab109493; 1:1,000), anti-Igκ (αρ. κατ. ab124727; 1:10,000), αντι- Igλ (αρ. κατ. ab124719; 1:20,000), αντι-ανθρώπινη ακτίνη κουνελιού (αρ. κατ. ab8227; 1:2,000) (όλα από Abcam) και RP215 μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) (δωρεά από τον καθηγητή Xiaoyan Qiu, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου, Πεκίνο, Κίνα· 1:1,000), το οποίο εντόπισε συγκεκριμένα έναν επίτοπο που σχετίζεται με υδατάνθρακες σε μη-B-Ig. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με δευτερεύοντα αντισώματα κατσίκας κατά κουνελιού (αρ. κατ. 926-32211) ή αντι-ποντικού (αρ. κατ. 926-32210) IgG-IRDyeTM680CW (και τα δύο 1:10,{37}; LI‑COR Biosciences) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Το σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Odyssey Imaging και το λογισμικό Odyssey V3.0 (και τα δύο LI‑COR Biosciences). Το λογισμικό ImageJ (έκδοση 1.8.0; Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας) χρησιμοποιήθηκε για ημιποσοτικοποίηση.

Καθαρισμός IgG και φασματομετρία μάζας.Αφού τα κύτταρα HK‑2 είχαν καλλιεργηθεί σε DMEM/F12 χωρίς FBS για 48 ώρες, το υπερκείμενο της καλλιέργειας συλλέχθηκε μετά από φυγοκέντρηση στα 2,103 xg για 10 λεπτά στους 4˚C. Το κυτταρικό υπερκείμενο καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη G Sepharose, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (αρ. κατ. 17-0618-02, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Το υγρό έκλουσης υπερδιηθήθηκε για να αντικαταστήσει το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (0,1 Μ Γλυκίνη, ρΗ 2,4) με PBS. Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε γέλες 10 τοις εκατό, ανιχνεύθηκαν με στύπωμα western και αναλύθηκαν περαιτέρω με φασματομετρία μάζας, που πραγματοποιήθηκε από την Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Ανοσοφθορισμός.Τα κύτταρα HK-2 καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες, οι οποίες σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή αδιάλυτη ακετόνη για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό FBS/PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά, και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα στους 4°C όλη τη νύχτα. Τα αντισώματα ήταν τα ίδια με εκείνα που χρησιμοποιήθηκαν στο western blotting: Rabbit anti-human Ig (1:150), anti-human Igκ (1:250), anti-human Igλ (1:250) και RP215 mAb (1:200 ) Το PBS χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά το πλύσιμο σε PBS, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με αντισώματα κατσίκας κατά κουνελιού (αρ. κατσίκας A11008) ή αντισώματα κατσίκας (αρ. κατ. A11001) με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (1:1,{18}}). Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI. Οι εικόνες ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού Leica DFC300 FX (Leica Microsystems GmbH).

Ανοσοϊστοχημική χρώση.Παρακαρκινικοί νεφρικοί φλοιοί συλλέχθηκαν από τέσσερις άνδρες ασθενείς (ηλικίας, 38-49 ετών) με νεφρικό καρκίνωμα. Οι φυσιολογικοί παρακαρκινικοί νεφρικοί φλοιοί μετά από νεφρεκτομή στερεώθηκαν με 10 τοις εκατό φορμαλίνη για 48 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε παραφίνη. Δείγματα ανθρώπινου νεφρού ενσωματωμένα σε παραφίνη κόπηκαν σε τομές 3 μm και αποπαραφινώθηκαν και επανυδατώθηκαν μέσω μιας σειράς διαβαθμισμένων συγκεντρώσεων αιθανόλης. Η ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε με βρασμό σε 0.05 M Tris-EDTA (pH 9,0) σε χύτρα ταχύτητας για 3 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με διάλυμα H2O2 3 τοις εκατό για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για την εξάλειψη της ενδογενούς υπεροξειδάσης και επωάστηκαν με κανονικό ορό κατσίκας (αρ. κατ. ZLI‑9022, ZSGB‑BIO, Κίνα) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για αποκλεισμό μη ειδικών θέσεις δέσμευσης αντισωμάτων σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έμμεση ανοσοϊστοχημική χρώση με πρωτογενή αντισώματα στους 4˚C κατά τη διάρκεια της νύχτας, συμπεριλαμβανομένων RP215 mAb (1:200; 5 μg/ml), αντιανθρώπινη Ig κουνελιού (1:2,000), αντιανθρώπινη Igκ (1:1,000), Igλ κατά του ανθρώπου (1:1,000) (τα ίδια αντισώματα που χρησιμοποιούνται στο western blotting). Τομές χωρίς πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με μη αραιωμένα δευτερογενή αντισώματα επισημασμένα με υπεροξειδάση χρένου (αριθ. κατ. PV-6001 και PV-6002, και οι δύο OriGene Technologies, Inc.) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη. Τέλος, οι αντικειμενοφόροι αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Οι εικόνες καταγράφηκαν με χρήση μικροσκοπίου φωτός (μεγέθυνση x200). Στατιστική ανάλυση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 20.0 για Windows (IBM Corp.). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές. Οι διαφορές μεταξύ πολλαπλών ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και το posthoc τεστ Tukey. Π<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Επιδράσεις του cistanche: ωφελούν τα νεφρά

Αποτελέσματα

Έκφραση IgG σε νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα του φλοιού των νεφρών.Φυσιολογικοί νεφρικοί φλοιοί, οι οποίοι συλλέχθηκαν από δότες που υποβλήθηκαν σε νεφρεκτομή ως αποτέλεσμα καρκινώματος νεφρικών κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της έκφρασης IgG σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρικών σωληναριών με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα κατά του ανθρώπινου Ig, Igκ, Igλ και RP215 (ένα αντίσωμα που κυριαρχεί δεσμεύεται σε μη-B-IgG). Η θετική χρώση των βαριών και ελαφρών αλυσίδων IgG δεν ανιχνεύθηκε μόνο στα PTECs αλλά και στα απομακρυσμένα επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων, είτε στο κυτταρόπλασμα, στην κυτταρική μεμβράνη ή στο σωληναριακό αυλό (Εικ. 1).

Μεταγραφή και V(D)J ανασυνδυασμός IgG σε μεμονωμένα PTEC. Για να αποφευχθεί η παρεμβολή του υπολειπόμενου αίματος, η δέσμευση και η διακυττάρωση του IgG από PTEC στον φλοιό των νεφρών και για να ληφθούν άμεσες ενδείξεις έκφρασης IgG σε PTEC, τα μεμονωμένα PTEC ταξινομήθηκαν από τον φλοιό του ανθρώπινου νεφρού χρησιμοποιώντας συνεπισήμανση CD10 και CD13 κατά ροή κυτταρομετρία (20). Όπως φαίνεται στην Εικ. 2Α, τα διπλά θετικά PTEC CD10/CD13 αντιπροσώπευαν το 4,1 τοις εκατό των βιώσιμων κυττάρων στο δείγμα. Τα απομονωμένα PTEC επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας το ειδικό γονίδιο δείκτη LRP2 και η μόλυνση των Β-κυττάρων εξαλείφθηκε από το CD19. Τα μεταγραφήματα μεταβλητής περιοχής Ig ενισχύθηκαν σε πέντε μεμονωμένα PTEC με ένθετη PCR (Εικ. 2Β και C). Τα αποτελέσματα της αλληλουχίας Sanger αποκάλυψαν ότι τα PTEC εμφάνισαν λειτουργικό και συντηρητικό VDJ ανασυνδυασμό της βαριάς αλυσίδας IgG (Πίνακας I), υποδεικνύοντας ότι η έκφραση IgG μπορεί να συμβεί σε PTEC.

Έκφραση βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας IgG σε κύτταρα HK-2. Δεδομένου ότι ήταν δύσκολο να ανιχνευθεί η έκφραση της πρωτεΐνης IgG σε ένα μόνο PTEC και να ληφθούν αρκετά PTEC για western blotting, η κυτταρική σειρά HK-2, η οποία αποτελείται από απαθανατισμένα PTEC, επιλέχθηκε για να επιβεβαιώσει περαιτέρω την έκφραση της πρωτεΐνης IgG. Η ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε θετική χρώση των Ig, Igκ και Igλ στο κυτταρόπλασμα και ισχυρότερη θετική χρώση του RP215 κυρίως στο κυτταρόπλασμα και την κυτταρική μεμβράνη (Εικ. 3Α).

Στη συνέχεια, η έκφραση των βαριών και ελαφρών αλυσίδων IgG σε κύτταρα HK-2 ανιχνεύθηκε με στύπωμα western υπό αναγωγικές συνθήκες. Για την εξάλειψη της παρεμβολής FBS στο μέσο καλλιέργειας, το μέσο που περιέχει FBS κηλιδώθηκε με αντίστοιχα αντισώματα και κηλιδώθηκε αρνητικά. Ένα εμπορικό αντίσωμα IgG μπόρεσε να ανιχνεύσει IgG που προέρχεται από τον ορό αλλά όχι IgG προερχόμενο από HK-2. Αντίθετα, το RP215 θα μπορούσε να ανιχνεύσει IgG που προέρχεται από HK‑2, αλλά όχι IgG ορού. Τόσο το εμπορικό αντίσωμα IgG όσο και το RP215 μπόρεσαν να ανιχνεύσουν Ig στα 55 kDa. Μια ζώνη Ig 4 (36 kDa) ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HK-2, σύμφωνα με το προβλεπόμενο μοριακό βάρος. Περαιτέρω, εκφράσεις Igκ (25 kDa) και Igλ (50 kDa, διμερές) παρατηρήθηκαν στα κυτταρολύματα (Εικ. 3Β). Στη συνέχεια, το IgG στο υπερκείμενο του κυττάρου καθαρίστηκε με πρωτεΐνη G, επιβεβαιώθηκε με στύπωμα western και αλληλουχήθηκε με φασματομετρία μάζας, η οποία έδειξε ότι η ζώνη των 55 kDa περιείχε θραύσματα της μεταβλητής περιοχής της αλυσίδας Igκ και της βαριάς αλυσίδας Ig, σύμφωνα με το Εθνικό Κέντρο για Βάση δεδομένων Biotechnology Information (NCBI) (Εικ. 3C-E). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα HK-2 παρήγαγαν και εκκρίνανε πρωτεΐνη IgG.

Μεταγραφή και V(D)J ανασυνδυασμός βαριών και ελαφρών αλυσίδων IgG σε κύτταρα HK-2. Η μεταγραφή του γονιδίου Ig και ο λειτουργικός ανασυνδυασμός V(D)J είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την έκφραση Ig. Για να επιβεβαιωθεί η έκφραση του IgG σε κύτταρα HK-2, τα μεταγραφήματα Ig, Igκ και Igλ αξιολογήθηκαν με ενίσχυση των σταθερών και μεταβλητών περιοχών στα κύτταρα HK-2 (Εικ. 4Α και Β). Η αλληλούχιση των σταθερών προϊόντων PCR έδειξε υψηλή ομολογία με τη δημοσιευμένη αλληλουχία στη βάση δεδομένων NCBI. Η κλωνοποίηση T-A και η αλληλουχία Sanger έδειξαν ότι η Ig σε κύτταρα HK-2 εμφάνισε συντηρητικό ανασυνδυασμό V(D)J με VH4-4/D2-8/JH5. Αντίθετα, η ποικιλομορφία του ανασυνδυασμού V(D)J παρατηρήθηκε στα PBMC, τα οποία εξαλείφουν την προκατάληψη του εκκινητή (Πίνακας II). Παρόμοια με τα Β κύτταρα, το IgG που προέρχεται από HK-2 εμφάνισε τυπικό παραγωγικό ανασυνδυασμό V(D)J με τις συνδέσεις V-D και D-J (Εικ. 4C). Επιπλέον, οι σωματικές υπερμεταλλαγές ανιχνεύθηκαν σε Ig που προέρχεται από HK-2 (εύρος, 6,8-8,4 τοις εκατό ) με 7 από τα 15 μοτίβα hotspot (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) που παρουσιάζουν μεταλλάξεις.

Επιπλέον, μεταγραφές AID (ένα ουσιαστικό στοιχείο για τη σωματική υπερμετάλλαξη και τον ανασυνδυασμό διακόπτη τάξης στα Β κύτταρα) και τα RAG1 και RAG2 [απαραίτητα για τον ανασυνδυασμό V(D)J] εντοπίστηκαν σε κύτταρα HK-2 (Εικ. 4Β), υποδεικνύοντας ότι ο μηχανισμός που διέπει τη σύνθεση Ig στα κύτταρα HK-2 μπορεί να είναι παρόμοιος με αυτόν στα Β κύτταρα.

Ο TGF-1 ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση IgG στα κύτταρα HK-2. Τα κύτταρα HK-2 διεγέρθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις TGF-1 για 48 ώρες. Η χρώση με ανοσοφθορισμό αποκάλυψε ότι η κυτταροπλασματική IgG εμφάνισε ενισχυμένη θετική χρώση σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 5Α). Το Western blotting επιβεβαίωσε ότι η IgG ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω από τον TGF-1 (Ρ<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Επιδράσεις του cistanche: ωφελούν τα νεφρά

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι τα PTEC εξέφρασαν IgG με γονιδιακή μεταγραφή και λειτουργικό συντηρητικό ανασυνδυασμό V(D)J, ο οποίος ήταν παρόμοιος με το non-B-IgG. Ο TGF-1 ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση IgG σε κύτταρα HK2.

Για να διερευνηθεί εάν τα PTECs εξέφραζαν IgG, η IgG ανιχνεύτηκε αρχικά στο κυτταρόπλασμα, τη μεμβράνη και τον αυλό των PTEC στον φυσιολογικό ανθρώπινο νεφρικό φλοιό με ανοσοϊστοχημεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα PTEC παρήγαγαν και εκκρίνανε IgG. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τη συνήθη παθολογική μας εξέταση, όπου δεν ανιχνεύθηκε εμφανής IgG σε PTEC. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε πολύ ασθενή χρώση PTEC, η οποία ήταν πολύ χαμηλή για να ανιχνευθεί, ιδιαίτερα σε σπειραματικές ασθένειες που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό, στις οποίες τα Igs είναι έντονα θετικά στα σπειράματα και η χρώση PTEC μπορεί να χαθεί ακούσια αλλά τεχνητά. Η διακυττάρωση IgG από την κυκλοφορία από τα PTECs μέσω του υποδοχέα Fc αποκλείστηκε εν μέρει, καθώς παρατηρήθηκε σαφής χρώση της IgG από το RP215 στην κυτταρική μεμβράνη και στο κυτταρόπλασμα. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η προερχόμενη από PTEC IgG ήταν παρόμοια με άλλες μη B-IgG και μπορεί να έχει μοναδικούς γλυκοζυλιωμένους επιτόπους, οι οποίοι μπορούν να αναγνωριστούν ειδικά από το RP215 αντί για ένα εμπορικό αντίσωμα αντι-IgG (15). Το εύρημα ότι μόνο μέρος των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων εκφράζει IgG μπορεί να εξηγηθεί από τη δυναμική έκφραση σε διαφορετικούς κυτταρικούς κύκλους, η οποία ήταν παρόμοια με το πρότυπο έκφρασης της IgA που προέρχεται από μεσαγγειακά κύτταρα (18). Η ταυτόχρονη χρώση του IgG με σωληνοειδείς δείκτες (όπως η ακουαπορίνη 1 και η ακουαπορίνη 3) θα ήταν χρήσιμη για περαιτέρω μελέτες για την ενίσχυση των ευρημάτων της παρούσας μελέτης.

Η αλληλουχία RNA ενός κυττάρου μπορεί να εμφανίσει ξεκάθαρα τη μεταγραφή ενός συγκεκριμένου γονιδίου σε ένα δεδομένο κύτταρο. Μεταγραφές της αλυσίδας Ig και του ανασυνδυασμού V(D)J ανιχνεύθηκαν σε μεμονωμένα PTEC. Αν και χρησιμοποιήθηκαν μόνο πέντε μεμονωμένα PTEC, η διαδικασία ήταν αυστηρή καθώς ο φλοιός του νεφρού συλλέχθηκε μακριά από τον όγκο και κάθε κύτταρο ταξινομήθηκε με κυτταρομετρία ροής με δύο γονίδια-ειδικά για το PTEC, τα οποία επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση ενός τρίτου ειδικού γονιδίου δείκτη (LRP2). και η μόλυνση από Β-κύτταρα εξαλείφθηκε. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι τα PTEC δεν παρουσιάζουν μόνο μεταγραφές γονιδίων IgG αλλά και τον κλασικό ανασυνδυασμό V(D)J στη μεταβλητή περιοχή ως Β κύτταρα, όπως ο παραγωγικός ανασυνδυασμός V(D)J με τα V-D και D-J συνδέσεις (Εικ. 4), υποδεικνύοντας ότι τα PTEC έχουν τη δυνατότητα να παράγουν IgG. Επιπλέον, ο πιο συντηρητικός ανασυνδυασμός V(D)J έδειξε ότι τα PTEC παρουσιάζουν μεταγραφές γονιδίου IgG και ανασυνδυασμό V(D)J που είναι παρόμοια με άλλα μη-Β κύτταρα.

Η HK‑2, μια απαθανατισμένη σειρά PTEC, είναι εύκολο να καλλιεργηθεί σε μεγάλες ποσότητες. Η παρούσα μελέτη επιβεβαίωσε την έκφραση της πρωτεΐνης IgG σε καλλιεργημένα κύτταρα HK-2. Το IgG ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HK-2 τόσο με ανοσοφθορισμό όσο και με στύπωμα western. Το Ig 4, μια υποκατηγορία του Ig, ανιχνεύθηκε επίσης σε μέγεθος ζώνης σύμφωνο με το προβλεπόμενο μοριακό βάρος. Η φασματομετρία μάζας αποκάλυψε ότι η πρωτεΐνη που καθαρίστηκε από το υπερκείμενο του κυττάρου χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη G περιείχε θραύσματα της μεταβλητής περιοχής βαριάς αλυσίδας Ig και της αλυσίδας Igκ, παρέχοντας στοιχεία για έκκριση IgG από PTECs. Η μεταγραφή IgG σε κύτταρα HK-2 υποστήριξε περαιτέρω την έκφραση IgG σε PTEC και ο συντηρητικός ανασυνδυασμός V(D)J με IGHV4-4/IGHD2-8/IGHJ5 σε κύτταρα HK-2 υποστήριξε περαιτέρω την παρουσία IgG σε κύτταρα HK-2 παρόμοια σε άλλα μη Β κύτταρα.

Η παρούσα μελέτη διερεύνησε επίσης τον υποκείμενο μηχανισμό παραγωγής IgG σε PTECs εξετάζοντας τη μεταγραφή των RAG1, RAG2 και AID σε κύτταρα HK-2. Αποκαλύφθηκε ότι τα RAG1, RAG2 και AID μεταγράφηκαν σε κύτταρα HK-2. Επιπλέον, μεταγραφές RAG1, RAG2 ή AID έχουν ανιχνευθεί προηγουμένως σε πολλά άλλα μη Β κύτταρα, όπως τα ποδοκύτταρα (19) και αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές (23). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μη-Β κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των PTEC, μπορεί να έχουν παρόμοιους μηχανισμούς σύνθεσης Ig με τα Β κύτταρα. Ωστόσο, εάν το AID και/ή το RAG1/2 είναι απαραίτητα γονίδια για την IgG που προέρχεται από PTEC απαιτεί περαιτέρω έρευνα. Επιπλέον, τα βοηθητικά ωοθυλακικά CD4 Τ κύτταρα είναι σημαντικά για τη ρύθμιση της διαφοροποίησης των Β-κυττάρων του βλαστικού κέντρου σε πλασματοκύτταρα και για την υποστήριξη της παραγωγής Igs (24). Τα μη δημοσιευμένα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι οι μη B-Ig εξακολουθούσαν να ανιχνεύονται σε ποντίκια NOD-SCID με ανεπάρκεια Τ και Β κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι τα μη B-Igs δεν εξαρτώνται πλήρως από τα βοηθητικά κύτταρα Τ. Το εάν τα βοηθητικά κύτταρα Τ απαιτούνται για να εκφράζουν τα PTECs IgG απαιτεί περαιτέρω έρευνα.

Ο TGF-1 έχει βασικό ανοσοτροποποιητικό ρόλο στην παραγωγή Ig. Για παράδειγμα, ο TGF-1 προκάλεσε εναλλαγή και έκκριση κατηγορίας IgA σε διεγερμένα Β κύτταρα σε κύτταρα σπλήνας ποντικού (25) και Β κύτταρα ανθρώπινων αμυγδαλών (26). Οι McIntyre et al (27) απέδειξαν ότι ο TGF-1 διέγειρε εκλεκτικά την έκκριση IgG2b από κύτταρα Β που ενεργοποιούνται με λιποπολυσακχαρίτες, πιθανότατα προκαλώντας αλλαγή κατηγορίας IgM σε IgG2b. Οι Duan et al (28) απέδειξαν ότι ο TGF-1 αύξησε την έκφραση IgA ρυθμίζοντας προς τα πάνω τον μεταγραφικό παράγοντα Ets-1 στα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι ο TGF-1 ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση IgG σε κύτταρα HK-2. Δεδομένου ότι μόνο IgG ανιχνεύθηκε στα κύτταρα HK-2, υποτέθηκε ότι ο TGF-1 προκάλεσε έκφραση IgG ανεξάρτητα από την αλλαγή κατηγορίας Ig. Ο ρυθμιστικός μηχανισμός της παραγωγής IgG από τον TGF-1 απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Τα PTEC διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη σωληναριακή διάμεση ίνωση μέσω του EMT και ο TGF-1 δρα ως κύριος πλεονεκτικός μεσολαβητής. Στην παρούσα μελέτη, η προσθήκη TGF-1 σε καλλιεργημένα κύτταρα HK-2 αύξησε την έκφραση IgG, υποδεικνύοντας ότι η IgG που προέρχεται από HK-2 μπορεί να σχετίζεται θετικά με την EMT. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι ο καρκίνος-IgG συσχετίστηκε με μετάσταση και προήγαγε την EMT μειώνοντας την E-cadherin στο κυστικό καρκίνωμα του αδενοειδούς σάλιου (29) και στον καρκίνο του πνεύμονα (30). Αξίζει να διερευνηθεί εάν η IgG που προέρχεται από PTEC μπορεί να διαδραματίσει ρόλο στη νεφρική σωληναριακή ΕΜΤ και στη διάμεση ίνωση υπό συνθήκες νόσου, όπως τραυματισμός ισχαιμίας/επαναιμάτωσης ήχρόνια νεφρική νόσος.

Συμπερασματικά, από όσο γνωρίζουμε, η παρούσα μελέτη ήταν η πρώτη που έδειξε ότι τα PTEC μπορούν να εκφράζουν και να εκκρίνουν IgG και το TGF-1 μπορεί να ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση IgG στα κύτταρα HK-2. Ωστόσο, ο πιθανός ρόλος της IgG που προέρχεται από PTEC στη σωληναρισιακή διάμεση ίνωση απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Επιδράσεις του cistanche: ωφελούν τα νεφρά

Χρηματοδότηση

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθ. επιχορήγησης 82070736, 91642109 και 81870488), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Χαϊνάν (αρ. επιχορήγησης 819QN355), το Ίδρυμα Επιστημονικής Έρευνας του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Χαϊνάν (αριθ. επιχορήγησης. HYPY201926), και τα Βασικά Έργα Υποστήριξης του Μεγάλου Ερευνητικού Προγράμματος του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών (αρ. επιχορήγησης 91642206).

Διαθεσιμότητα δεδομένων και υλικών

Τα σύνολα δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν ή/και αναλύθηκαν κατά την τρέχουσα μελέτη είναι διαθέσιμα από τον αντίστοιχο συγγραφέα κατόπιν εύλογου αιτήματος.

Συνεισφορές συγγραφέων

Ως οι αντίστοιχοι συγγραφείς, οι YW και XQ συνέλαβαν και σχεδίασαν τη μελέτη. Ο ZD συμμετείχε στον ερευνητικό σχεδιασμό, πραγματοποίησε ιστολογικά και μονοκύτταρα πειράματα, ετοίμασε δείγματα για φασματομετρία μάζας, ανέλυσε δεδομένα και έγραψε το χειρόγραφο. Ο ZJ συμμετείχε στον ερευνητικό σχεδιασμό, στα περισσότερα πειράματα σχετικά με την έκφραση IgG σε κύτταρα HK‑2 και στη σχετική ανάλυση δεδομένων. Οι YG, JM, HD και YL πραγματοποίησαν μερικά πειράματα κυτταρικής γραμμής. Οι ZC και YP επέλεξαν τις κατάλληλες περιπτώσεις για πειράματα με ένα κύτταρο σύμφωνα με τα κλινικά χαρακτηριστικά. Οι HY και ZS συμμετείχαν σε πειράματα με ένα κύτταρο. Ο SW συμμετείχε στην ανοσοϊστοχημική χρώση, ανέλυσε δεδομένα χρώσης ιστών και συνέταξε και αναθεώρησε το χειρόγραφο. Οι YW, ZD και ZJ επιβεβαίωσαν την αυθεντικότητα όλων των ακατέργαστων δεδομένων. Όλοι οι συγγραφείς εξέτασαν το χειρόγραφο και αναθεώρησαν τα δεδομένα. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Έγκριση δεοντολογίας και συναίνεση συμμετοχής

Η παρούσα μελέτη συμμορφώθηκε με τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Τρίτου Νοσοκομείου Πεκίνου (αρ. έγκρισης S2020121) και διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Όλοι οι δότες δώρησαν εθελοντικά φλοιούς νεφρών και παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση πριν από τη δωρεά του φλοιού των νεφρών στη μελέτη. Όλες οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις σχετικές οδηγίες και κανονισμούς. Αυτά τα δείγματα ήταν αυστηρά ανώνυμα. Ο ανθρώπινος ορός και τα PBMC, που χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες στο western blotting ή στην αντίστροφη μεταγραφή-PCR στην παρούσα μελέτη, ελήφθησαν από το αίμα ενός υγιούς εθελοντή, ο οποίος παρείχε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση για δειγματοληψία.

Επιδράσεις του cistanche: ωφελούν τα νεφρά

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Schlondorff DO: Επισκόπηση των παραγόντων που συμβάλλουν στην παθοφυσιολογία της προοδευτικής νεφρικής νόσου. Kidney Int 74: 860‑866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Υποδοχείς τύπου Toll, ανοσοπρωτεάσωμα και ρυθμιστικά Τ κύτταρα σε παιδιά με πορφύρα Henoch-Schonlein και πρωτοπαθή νεφροπάθεια IgA. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G και Neumann K: Τα εγγύς νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ασκούν ανοσοτροποποιητική λειτουργία οδηγώντας φλεγμονώδεις αποκρίσεις CD4 συν Τ κυττάρων. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77‑F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL και Lan HY: Κάκωση νεφρικών σωληναρίων: Μια κινητήρια δύναμη προς τη χρόνια νεφρική νόσο. Kidney Int 93: 568-579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C και Tomino Y: Μεσολαβούμενη από FcRn διακυττάρωση της ανοσοσφαιρίνης G σε ανθρώπινα εγγύς νεφρικά επιθηλιακά κύτταρα. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358‑F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: Οι καρκίνοι του ανθρώπινου επιθηλίου εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνη g με μη αναγνωρισμένη εξειδίκευση για την προώθηση της ανάπτυξης και της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Τα μεταγραφήματα γονιδίων ανοσοσφαιρίνης έχουν διακριτά χαρακτηριστικά ανασυνδυασμού VHDJH σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: Τα IgG και IgA με πιθανή μικροβιακή δράση δέσμευσης εκφράζονται από φυσιολογικά επιδερμικά κύτταρα του ανθρώπινου δέρματος. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X και Wang B: Ανοσοσφαιρίνη Μ, ένα νέο μόριο μυοκαρδιακών κυττάρων ποντικών. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W και Gu J: Έκφραση και κατανομή της ανοσοσφαιρίνης G και των υποδοχέων της σε μια περιοχή με προνομιούχο ανοσοποιητικό: Το μάτι. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J και Qiu XY: Έκφραση γονιδίου ανοσοσφαιρίνης με κλασική αναδιάταξη V-(D)-J σε νευρώνες εγκεφάλου ποντικού. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C και Gu J: Έκφραση και κατανομή της ανοσοσφαιρίνης G και των υποδοχέων της στο ανθρώπινο νευρικό σύστημα. Int J Biochem Cell Biol 43: 556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W και Gu J: Δύο υπερδομικά πρότυπα κατανομής της ανοσοσφαιρίνης G στον ανθρώπινο πλακούντα και λειτουργικές επιπτώσεις. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P και Qiu X: Έκφραση γονιδίου ανοσοσφαιρίνης με κλασική αναδιάταξη V‑(D)‑J σε όρχεις και επιδιδυμίδα ποντικού. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Τα κύτταρα του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος του πνεύμονα εκφράζουν μη κανονικά γλυκοζυλιωμένη IgG που ενεργοποιεί τη σηματοδότηση ιντεγκρίνης-FAK. Cancer Lett 430: 148-159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q και Zhao Y: Η υψηλή έκφραση της προερχόμενης από καρκίνο γλυκοζυλιωμένης ανοσοσφαιρίνης G προβλέπει κακή πρόγνωση στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου. J Cancer 11: 2213-2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q και Zhao YP: Ανοσοσφαιρίνη G που προέρχεται από καρκίνο: Ένας νέος δείκτης για διαφορική διάγνωση και πρόβλεψη υποτροπής στο καρκίνωμα παραθυρεοειδούς. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X και Wang Y: Έκφραση ανοσοσφαιρίνης Α σε ανθρώπινα μεσαγγειακά κύτταρα και τα αποτελέσματά της στην απόπτωση και προσκόλληση των κυττάρων. Mol Med Rep 17: 5272-5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X και Wang Y: Έκφραση ανοσοσφαιρίνης G σε ανθρώπινα ποδοκύτταρα και ο ρόλος της στη βιωσιμότητα και την προσκόλληση των κυττάρων. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Απομόνωση και χαρακτηρισμός πρωτογενούς εγγύς σωληνοειδούς μοντέλου επιθηλιακών κυττάρων από τον ανθρώπινο νεφρό με διπλή επισήμανση CD10/CD13. PLoS One 8: e66750, 2013.