Διερεύνηση του μηχανισμού της φόρμουλας Cistanche που ρυθμίζει την πυρόπτωση που προκαλείται από φλεγμονές NLRP3 στη θεραπεία της χρόνιας προστατίτιδας
Jun 05, 2025
Σκοπός:
Η μελέτη αυτή είχε ως στόχο να διερευνήσει τηνμηχανισμός με τον οποίο μια φυτική φόρμουλα με βάση το Cistancheρυθμίζει την ενεργοποίηση τουNLRP3 φλεγμονώδεςκαι αναστέλλειπυρόπτωσηστη θεραπεία τουΧρόνια προστατίτιδα τύπου III (CP/CPPS).
Μέθοδοι:
(1) Πείραμα σε ζώα:
Πενήντα αρσενικοί αρουραίοι SD χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες: μάρτυρες, μοντέλο και ομάδες που έλαβαν φόρμουλα Cistanche σεχαμηλό (4,9 g/kg), μεσαίο (9,8 g/kg) και υψηλό (19,6 g/kg)δόσεις, με 10 αρουραίους σε κάθε ομάδα. Εκτός από την ομάδα ελέγχου, όλοι οι αρουραίοι προκλήθηκαν μεΠροστατίτιδα τύπου IIIμέσω ενδοπροστατικής ένεσης εκχυλίσματος πρωτεΐνης προστάτη σε συνδυασμό με CFA. Μετά από επιτυχημένη μοντελοποίηση, οι αρουραίοι έλαβαν καθημερινή ενδογαστρική χορήγηση είτε φυσιολογικού ορού (ομάδες ελέγχου και μοντέλου) είτεΦόρμουλα με βάση το Cistancheγια 30 ημέρες.
Η φλεγμονή του προστατικού ιστού αξιολογήθηκε απόΧρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (ΗΕ).. ΟρρόςIL-1καιIL-18μετρήθηκαν απόELISA, ενώ δείκτες οξειδωτικού στρες (MDA, ΧΛΟΟΤΑΠΗΤΑΣ, καιGSH-Px) αξιολογήθηκαν βιοχημικά.Έκφραση NLRP3στον ιστό του προστάτη ανιχνεύθηκε απόανοσοϊστοχημεία, καιΕπίπεδα πρωτεΐνης NLRP3, κασπάσης-1 και GSDMDαναλύθηκαν χρησιμοποιώνταςWestern blot.
(2) Πείραμα κυττάρων:
Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (RWPE-1)χωρίστηκαν σε έλεγχο, μοντέλο,Φόρμουλα Cistanche, καιΑναστολέας NLRP3 (MCC950)ομάδες. Εκτός από την ομάδα ελέγχου, όλα τα κύτταρα διεγέρθηκαν μεLPS (100 ng/mL, 4 ώρες)καιATP (5 mmol/mL, 30 λεπτά)να προκαλέσει πυρόπτωση. Μετά τη μοντελοποίηση, οι ομάδες ελέγχου και μοντέλου έλαβαν τυφλό ορό, ενώ τοΟμάδα Cistancheέλαβε6,25 ug/mL ορός που περιέχει φάρμακο. Η ομάδα αναστολέα υποβλήθηκε σε θεραπεία μεMCC950.
Πρόσληψη PIκαιΈκφραση κασπάσης-1αξιολογήθηκαν μέσωκυτταρομετρία ροής. Απελευθέρωση LDHμετρήθηκε βιοχημικά.Επίπεδα υπερκείμενου IL-1 και IL-18ποσοτικοποιήθηκαν με ELISA.Western blotχρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευσηNLRP3, Caspase-1 και GSDMDέκφραση.
Αποτελέσματα:
(1) Πείραμα σε ζώα:
Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η ομάδα μοντέλου εμφάνισε σημαντική διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, επιθηλιακό εκφυλισμό και διάμεσο οίδημα στον ιστό του προστάτη. ΟΟμάδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Cistancheέδειξε δοσοεξαρτώμενες μειώσεις σε αυτές τις παθολογικές αλλαγές.
Επίπεδα ορού IL-1 και IL-18αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα μοντέλων (P<0.01) και μειώθηκε σημαντικά στοCistanche ομάδες χαμηλής, μεσαίας και υψηλής δόσης (P<0.01).
Επίπεδα MDAήταν ανυψωμένα στην ομάδα μοντέλων (P<0.01) αλλά μειώνεται σημαντικά από τη θεραπεία με Cistanche (P<0.01).
Επίπεδα SOD και GSH-Pxμειώθηκαν στην ομάδα μοντέλων (P<0.05) και αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις ομάδες που έλαβαν Cistanche (P<0.01, P<0.05).
Ανοσοϊστοχημείαέδειξε ανυψωμένοΈκφραση NLRP3στην ομάδα μοντέλων, η οποία μειώθηκε σημαντικά από τη θεραπεία με Cistanche.
Western blotΤα αποτελέσματα αποκάλυψαν αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνηςNLRP3, Caspase-1 και GSDMDστην ομάδα μοντέλων (P<0.01), τα οποία όλα παρεμποδίστηκαν σημαντικά από το Cistanche (P<0.01).
(2) Πείραμα κυττάρων:
ΟΡυθμός πρόσληψης PI, Έκφραση κασπάσης-1, καιΑπελευθέρωση LDHαυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα μοντέλων (P<0.01), αλλά μειώθηκε σημαντικά και στα δύοCistancheκαιMCC950ομάδες (P<0.01).
Επίπεδα IL-1 και IL-18στο υπερκείμενο υγρό ήταν σημαντικά αυξημένα στην ομάδα μοντέλου (P<0.01) και μειώθηκε σημαντικά στοCistancheκαιομάδες αναστολέων (P<0.01).
Western blotέδειξε σημαντικά αυξημένη έκφραση πρωτεϊνών NLRP3, Caspase-1 και GSDMD στην ομάδα μοντέλου (P<0.01), οι οποίες υπορυθμίστηκαν σημαντικά στοCistancheκαιομάδες αναστολέων (P<0.01).
Σύναψη:
ΟΦυτική φόρμουλα με βάση το Cistancheασκεί θεραπευτικά αποτελέσματα σεΧρόνια προστατίτιδα τύπου IIIμεαναστέλλοντας την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3, μειώνοντας έτσιΕνεργοποίηση κασπάσης-1, πρόληψηΔιάσπαση GSDMD και πυρόπτωση, και καταστολήπροφλεγμονώδης απελευθέρωση κυτοκίνης. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότιCistancheμπορεί να είναι πολλά υποσχόμενοφυσικό φυτικό φάρμακο για CP/CPPS, προσφοράαντιφλεγμονώδες, αντιοξειδωτικό, καιπυρόπτωση-ανασταλτικήεπιδράσεις μέσω διαμόρφωσης τουNLRP3/Caspase-1/GSDMDμονοπάτι σηματοδότησης.
Λέξεις κλειδιά: χρόνια προστατίτιδα; τύπος Guihuang;Φλεγμονώδες NLRP3; πυρόπτωση ; προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος
το cistanche οφέλη από την υγεία του προστάτη
Φυτική φόρμουλα με βάση το Cistanche για τη χρόνια προστατίτιδα: Πειραματική μελέτη μηχανισμού και αποτελεσματικότητας
Χρόνια προστατίτιδα (ΧΠ)είναι μια από τις πιο συχνές παθήσεις στην ουρολογία και την υγεία των ανδρών. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι περίπου8.4%των ενήλικων ανδρών στην Κίνα εμφανίζουν συμπτώματα προστατίτιδας [1]. Σύμφωνα με τοΕθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH)ταξινόμηση, η προστατίτιδα κατηγοριοποιείται σε τέσσερις τύπους, μεΠροστατίτιδα τύπου III (σύνδρομο χρόνιου πυελικού πόνου, CP/CPPS)αντιπροσωπεύουν περισσότερο από90%όλων των χρόνιων περιπτώσεων [2]. Η προστατίτιδα τύπου III οδηγεί σε πυελικό πόνο και δυσλειτουργία του ουροποιητικού συστήματος και συχνά συνοδεύεται από ψυχολογική δυσφορία όπως άγχος και κατάθλιψη, μειώνοντας σημαντικά την ποιότητα ζωής [3-4].
Στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική (TCM), η χρόνια προστατίτιδα αντιστοιχεί σε σύνδρομα όπως το «σύνδρομο Lin» ή το «Jing Zhuo» και προκαλείται κυρίως από παθογόνους παράγοντες όπωςυγρασία, ζέστη, στάση αίματος και στασιμότητα[5-7]. ΟΦόρμουλα Guihuang, που χρησιμοποιείται παραδοσιακά για τη θεραπεία της CP/CPPS με υγρή θερμότητα και στάση αίματος, έχει τροποποιηθεί σε αυτή τη μελέτη για χρήσηCistancheως βασικό συστατικό, που διαμορφώνει ένα μυθιστόρημαΦυτική φόρμουλα με βάση το Cistanche. Αυτή η τροποποιημένη φόρμουλα στοχεύει στη βελτίωση των συμπτωμάτων του ουροποιητικού και της πυελικής φλεγμονής και με τα δύοκλινική αποτελεσματικότητα και ασφάλεια [8–10].
Cistanche tubulosa στην έρημο
Χάπια με βάση τη φόρμουλα cistanche με 75% γλυκοσίδη
Υποστήριξη της Wecistanche-Επικοινωνήστε μαζί μας για να λάβετε μια τιμή χονδρικής
Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Ιστορικό και Μηχανισμός
Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η φυτική φόρμουλα με βάση το Cistanche ανακούφισε σημαντικά τις βλάβες που μοιάζουν με προστατίτιδα σε μοντέλα αρουραίων μειώνοντας την παθολογική φλεγμονή και καταστέλλοντας τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες. Αυτή η επίδραση σχετίζεται με την αναστολή τουPI3KκαιNF-κBμονοπάτια σηματοδότησης [11].
Περαιτέρω προσοχή έχει στραφεί προς τοNLRP3 φλεγμονώδες, ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα που ρυθμίζει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις. Η ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 οδηγεί στην απελευθέρωση φλεγμονωδών κυτοκινών όπως οι IL-1 και IL-18, συμβάλλοντας στον καταρράκτη της φλεγμονής στο CP/CPPS [12-13]. Διερεύνηση εάνCistancheμπορεί να ρυθμίσει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόησή τουαντιφλεγμονώδη μηχανισμόστη θεραπεία της χρόνιας προστατίτιδας.
1. Υλικά
1.1 Ζώα και κύτταρα
Αρσενικοί αρουραίοι SD (ηλικίας 6 εβδομάδων, 240–260 g) ελήφθησαν από την SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. [SCXK (Jing) 2019-0010], που στεγάζονται σε συνθήκες SPF με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Η θερμοκρασία δωματίου διατηρήθηκε στους (23±2) βαθμούς και η υγρασία στο (60±5)%. Όλες οι διαδικασίες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Νοσοκομείου Xiyuan, Ακαδημία Κινεζικών Ιατρικών Επιστημών της Κίνας (Αριθμός Δεοντολογίας: 2020XLC005-3). φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (RWPE-1, ATCC, Catalog No. IM-H299) χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα in vitro στο απόσπασμα 5.
1.2 Φόρμουλα με βότανα
ΟΦόρμουλα με βάση το Cistancheαποτελείται από τα ακόλουθα παραδοσιακά βότανα (σε γραμμάρια):
Cistanche 12 g
Curcuma longa (κουρκουμάς) 10 γρ
Angelica sinensis 12 γρ
Magnolia officinalis 10 γρ
Boswellia carteri (Λιβάνι) 5 γρ
Commiphora myrrha (Myrrh) 5 γρ
Lonicera japonica (Μαγιόκλημα) 15 γρ
Hedyotis diffusa 15 γρ
Plantago asiatica (Plantain Herb) 15 γρ
Citrus reticulata (Φλούδα μανταρινιού) 10 γρ
Οι κόκκοι βοτάνων παρασχέθηκαν από το Τμήμα Φαρμακευτικών του Νοσοκομείου Xiyuan και κατασκευάστηκαν από την Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (Αρ. παρτίδας: 19018391).
Λέξεις-κλειδιά SEO:
Cistanche για χρόνια προστατίτιδα, φυτικό φάρμακο για CPPS, TCM για το σύνδρομο πυελικού πόνου, Cistanche φλεγμονή του προστάτη, φυσικά αντιφλεγμονώδη βότανα για άνδρες, Ανοσολογική διαμόρφωση Cistanche.
1.3 Αντιδραστήρια και κιτ
BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Cat# P0010)
Κιτ ELISA IL-1 και IL-18 (Bioswamp, Cat# ZN2877, ZN2883)
Κιτ δοκιμασίας πυρόπτωσης/κασπάσης-1 (Immunochemistry, Cat# 9145)
NLRP3 αντίσωμα (Novus, Cat# NBP2-12446)
CFA (Complete Freund's Adjuvant, Sigma, Cat# C104202)
Συνηθισμένα αντιδραστήρια: ξυλόλιο, απόλυτη αιθανόλη, ουδέτερο κόμμι (Sinopharm)
Κιτ οξειδωτικού στρες: SOD, MDA, GSH-Px, LDH (Nanjing Jiancheng, Cat# A001-3, A003-2, BC1190, 20121225)
Αντισώματα: Anti-GSDMD, Κασπάση-1, GAPDH (Abcam, Cat# ab219800, ab179515, ab8245)
MCC950 (αναστολέας NLRP3, Selleck, Cat# S8930)
PYCARD/ASC Antibody (Thermo, Cat# PA5-95826)
1.4 Όργανα
Οπτικό μικροσκόπιο (Nikon Eclipse Ti-SR, Ιαπωνία)
Microtome (Leica RM2016, Σαγκάη)
Ψηφιακός σαρωτής διαφανειών (3D HISTECH Pannoramic MIDI, Ουγγαρία)
Ψυκτικός φυγόκεντρος υψηλής ταχύτητας (Thermo Fisher IECCL31R, ΗΠΑ)
Εξοπλισμός ηλεκτροφόρησης (CAVOY PP-1150, MP-8001, MP-3030, Πεκίνο)
Θερμοκοιτίδα σέικερ (Qilinbeier TS-2000A, Jiangsu)
Κρυογενικός μύλος (Jingxin JXFSTPRP-CL-BSC, Σαγκάη)
Θερμοκοιτίδα CO₂ (Sanyo MCO-20AIC, Ιαπωνία)
Αναγνώστης μικροπλακών (Bio-Rad DNM-9602, Πεκίνο)
Βιοχημικός αναλυτής (Rayto Chemray 800, Shenzhen)
Κυτταρόμετρο ροής (Beckman CytoFLEX S, ΗΠΑ)
2. Μέθοδοι
2.1 Μοντέλο ίδρυσης
(1) Ζωικό μοντέλο
Με βάση την προηγούμενη εμπειρία μοντελοποίησης, ένα μοντέλο αρουραίου αυτοάνοσουΧρόνια προστατίτιδα τύπου IIIιδρύθηκε απόενδοπροστατική ένεσηεκχυλίσματος καθαρισμένης πρωτεΐνης προστάτη αναμεμειγμένο με πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund (CFA) [14]. Η επιτυχής μοντελοποίηση προσδιορίστηκε από παθολογικά χαρακτηριστικά όπως: πάχυνση της κάψουλας του προστάτη, εξαφάνιση αδενικών πτυχών, καταστροφή κυψελών, σημαντικό στρωματικό οίδημα, θολή δομή, μαζική διήθηση λεμφοκυττάρων, μονοκυττάρων και πλασματοκυττάρων. Υπερπλασία λείων μυών και συνδετικού ιστού παρατηρήθηκε στα διαφράγματα του προστάτη, με αισθητήαγγειακή διαστολή και συμφόρηση. Βιοχημικά, το μοντέλο επιβεβαιώθηκε απόαυξημένα λευκοκύτταρακαιμειωμένα σώματα λεκιθίνηςσε ομογενοποιημένο προστάτη.
(2) Μοντέλο Κυττάρου
Μετά από αναφορές βιβλιογραφίας και προηγούμενα προ-πειράματα [15-17], αμέθοδος διέγερσης δύο σταδίωνχρησιμοποιήθηκε για την ενεργοποίηση τουNLRP3 φλεγμονώδεςσε RWPE-1 κελιά. Βήμα 1: Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μεLPS (100 ng/mL)για 4 ώρες για να ξεκινήσει η φλεγμονώδης εκκίνηση. Βήμα 2: Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μεATP (5 mmol/mL)για 30 λεπτά ως σήμα ενεργοποίησης. Οι βέλτιστες συνθήκες μοντέλου εξετάστηκαν χρησιμοποιώνταςΡυθμός πρόσληψης PIως δείκτης.
2.2 Ομαδοποίηση
(1) Ομάδες Μελέτης Ζώων
Οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σεπέντε ομάδεςχρησιμοποιώντας έναν πίνακα τυχαίων αριθμών:
Ομάδα ελέγχου
Ομάδα μοντέλων
Ομάδα χαμηλής δόσης φόρμουλας Cistanche
Ομάδα μεσαίας δόσης φόρμουλας Cistanche
Ομάδα υψηλής δόσης φόρμουλας Cistanche
Κάθε ομάδα αποτελούνταν από 10 αρουραίους. Όλες οι ομάδες εκτός από την ομάδα ελέγχου υποβλήθηκαν σε μοντελοποίηση. Οισοδύναμη ανθρώπινη δόσητου τύπου που βασίζεται στο Cistanche υπολογίστηκε ως 109 ÷ 70 × 6.3=9.8 g/kg για τομέτρια δόση, μεχαμηλή δόσηστα 4,9 g/kg καιυψηλή δόσηστα 19,6 g/kg [11]. Από3η μέρα μετά το μόντελινγκ, οι ομάδες θεραπείας έλαβαν καθημερινά ενδογαστρική χορήγηση των αντίστοιχων δόσεων τουΦυτική φόρμουλα με βάση το Cistancheγια30 συνεχόμενες ημέρες, ενώ οι ομάδες ελέγχου και μοντέλου έλαβαν ίσους όγκους φυσιολογικού ορού.
(2) Ομάδες Κυτταρικής Μελέτης
RWPE-1 κελιά χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες:
Ομάδα ελέγχου: καλλιέργεια με τυφλό ορό
Ομάδα μοντέλων: κατεργάστηκε με LPS (100 ng/mL, 4 ώρες) και ATP (5 mmol/mL, 30 λεπτά)
Ομάδα Cistanche: αντιμετωπίζεται με6,25 ug/mL φαρμακευτικού ορού τύπου Cistanche
Ομάδα MCC950: μοντέλο +NLRP3 αναστολέας φλεγμονής MCC950
2.3 Συλλογή δειγμάτων
Μετά από 30 ημέρες θεραπείας, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο. Το αίμα συλλέχθηκε από την κοιλιακή αορτή και φυγοκεντρήθηκε στις 3000 rpm για 10 λεπτά για να απομονωθεί ο ορός, ο οποίος αποθηκεύτηκε στους -80 βαθμούς γιαELISAκαι βιοχημικές αναλύσεις.
Αριστερός λοβός προστάτη: σταθεροποιημένο σε 4% παραφορμαλδεΰδη για ιστοπαθολογία, ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμό.
Δεξιός λοβός προστάτη: διατηρούνται σευγρό άζωτογιαΑνάλυση Western blot.
2.4 Ανίχνευση ευρετηρίου ζώων
2.4.1 Χρώση HE
Η χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση της φλεγμονώδους διήθησης στους ιστούς του προστάτη. Οι μορφολογικές αλλαγές στους αδένες, τους πόρους και τις διάμεσες δομές αξιολογήθηκαν με μικροσκόπιο φωτός.
2.4.2 ELISA για IL-1 και IL-18
Για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκαν κιτ ELISAIL-1καιIL-18επίπεδα στον ορό αρουραίων. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο ELISA και αναλύθηκαν στο450 nmχρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.
2.4.3 Βιοχημική Ανίχνευση MDA, SOD, GSH-Px
Επίπεδα ορού τουMDA, ΧΛΟΟΤΑΠΗΤΑΣ, καιGSH-Pxμετρήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ για την αξιολόγηση του οξειδωτικού στρες στους ιστούς του προστάτη.
2.4.4 Ανοσοϊστοχημεία (IHC) για NLRP3
Τομές ιστού προστάτη υποβλήθηκαν σε αποπαραφίνιση, ανάκτηση αντιγόνου, αποκλεισμό και επώαση μεαντίσωμα αντι-NLRP3 (1:1000). Πραγματοποιήθηκε χρώση DAB και αντιχρωματίστηκε με αιματοξυλίνη. Η έκφραση του NLRP3 παρατηρήθηκε μικροσκοπικά.
2.4.5 Ανοσοφθορισμός για GSDMD
Κατεψυγμένα τμήματα προστάτη επωάστηκαν μεαντίσωμα κατά του GSDMD (1:100), ακολουθούμενο από φθορίζον δευτερεύον αντίσωμα και πυρηνική αντιχρώση DAPI. Η έκφραση GSDMD οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού.
2.4.6 Western Blot για NLRP3, Caspase-1, GSDMD
Η πρωτεΐνη εξήχθη από τους ιστούς του προστάτη γιαΑνάλυση Western blot. Επίπεδα έκφρασης τουNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), καιCaspase-1 (1:2000)εντοπίστηκαν. -ακτίνη που χρησιμεύει ως εσωτερικός έλεγχος. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώνταςImageJλογισμικό.
2.5 Ανίχνευση κυτταρικού δείκτη
2.5.1 Κυτταρομετρία ροής για πρόσληψη PI
Τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 1 χ 106 κύτταρα/mL, και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Οι ρυθμοί πρόσληψης PI αναλύθηκαν χρησιμοποιώνταςκυτταρομετρία ροήςκαιFlowJoλογισμικό.
2.5.2 Δοκιμασία απελευθέρωσης LDH
Μετά τη θεραπεία,LDHΤα επίπεδα στα υπερκείμενα της καλλιέργειας αξιολογήθηκαν ως δείκτης βλάβης της κυτταρικής μεμβράνης χρησιμοποιώντας μια χρωματομετρική ανάλυση σε490 nm.
2.5.3 Κυτταρομετρία ροής για Caspase-1
Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, διαπερατήθηκαν και χρωματίστηκαν μεΑντίσωμα κασπάσης-1 (1:1000). Η έκφραση μετρήθηκε μεκυτταρομετρία ροής.
2.5.4 ELISA για IL-1 και IL-18 στο υπερκείμενο
Μέσα καλλιέργειας συλλέχθηκαν για ανίχνευσηIL-1καιIL-18επίπεδα μέσω ELISA. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες στα κυτταρολύματα ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA για την ομαλοποίηση των επιπέδων κυτοκίνης.
2.5.5 Western Blot για NLRP3, Caspase-1, GSDMD
Διεξήχθη στύπωμα Western σε προϊόντα λύσης κυττάρων με αντισώματα κατάNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), καιCaspase-1 (1:2000). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με χρήση ECL και τα συστήματα απεικόνισης. -χρησιμοποιήθηκε η ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης.
2.6 Στατιστική Ανάλυση
Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώνταςGraphPad Prism 8.0. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ωςμέσος όρος ± SD. Οι συγκρίσεις ομάδων έγιναν χρησιμοποιώνταςανεξάρτητο δείγμα t-testήΜονόδρομη ANOVA. A Τιμή P < 0,05θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.
