Πείραμα 4 Επίδραση του Cistanche Deserticola Phenylethanol Glycoside σε ποντίκι Περιεμμηνοπαυσιακό Σύνδρομο Κατάθλιψης Μοντέλο Υλικά και Μέθοδοι 1 Πειραματικά Υλικά

1.1 Πειραματόζωα

Ποντίκια βαθμού SPF, ράτσας Kunming, θηλυκά, 18~22g, που παρέχονται από την Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., αυτή η παρτίδα ποντικών αριθμός πιστοποιητικού: 0016003; αριθμός πιστοποιητικού εργαστηρίου SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Πειραματικά φάρμακα

Γλυκοζίτης φαινυλαιθανόλης Cistancheπαρασκευάστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του Πειράματος 1, και η περιεκτικότητα έφτασε το 66,47%. Κάψουλα Gengnian'an, συστατικά: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, φλοιός παιώνιας, Poria cocos, φίλντισι, curculigo, Schisandra chinensis, μαγνητίτης, Polygonum multifloratum multicaria, . Λειτουργίες και ενδείξεις:Θρέψτε το γιν και υποτάξτε το γιανγκ, ανακουφίσει τα προβλήματακαιηρεμήστε το μυαλό. Χρησιμοποιείται για τις εξάψεις της εμμηνόπαυσης και την εφίδρωση, τη ζάλη, τις εμβοές, την ευερεθιστότητα και την αϋπνία. Προδιαγραφές: 0.3 g ανά κάψουλα. Χρήση και δοσολογία: Από του στόματος, 3 κάψουλες τη φορά, 3 φορές την ημέρα. Κατασκευαστής: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Αριθμός παρτίδας παραγωγής: 121104. Αριθμός έγκρισης: Εθνική έγκριση φαρμάκου Αρ. Z14021848.

ΠΟΣΟ ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΝΑ ΔΟΥΛΕΨΕΙ ΤΟ CISTANCHE;

Ισοφλαβόνες σόγιας και μαλακές κάψουλες βιταμίνης Ε, λίστα συστατικών: ισοφλαβόνες σόγιας σε σκόνη, βιταμίνη Ε, ηλιέλαιο, ζελατίνη, γλυκερίνη, νερό, ταρτραζίνη, διοξείδιο του τιτανίου. Εμβληματικά συστατικά και περιεχόμενο: Κάθε 100g περιέχει 55,2 mg ισοφλαβόνες σόγιας (υπολογιζόμενες ως γενιστεΐνη) και 608,5 mg βιταμίνη Ε. Λειτουργίες υγείας: Αύξηση της οστικής πυκνότητας. Οδηγίες και δοσολογία: Λαμβάνετε 1 κάψουλα 2 φορές την ημέρα με ζεστό νερό. Προδιαγραφές: 500mg×100 κάψουλες. Κατασκευαστής: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Αριθμός παρτίδας παραγωγής: 13070302. Αριθμός έγκρισης: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Πειραματικά αντιδραστήρια

Νατριούχος καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., αριθμός παρτίδας: 20120418; πενικιλίνη νάτριο για ένεση, North China Pharmaceutical Co., Ltd., προδιαγραφή: 4 εκατομμύρια μονάδες, αριθμός παρτίδας παραγωγής: c1206807; διάλυμα φορμαλδεΰδης (αναλυτικής ποιότητας), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., αριθμός παρτίδας παραγωγής: 20130902; 0,9% ένεση χλωριούχου νατρίου, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; προδιαγραφή: 250ml, αριθμός παρτίδας παραγωγής: 1301265303;

Ένυδρο χλωράλη, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, αριθμός παρτίδας 20120827; Κιτ ανίχνευσης ποντικιού E2 ELISA, Εταιρεία Ε&Α, αριθμός παρτίδας: 20140101A; Κιτ ανίχνευσης ποντικιού T ELISA, Εταιρεία Ε&Α, αριθμός παρτίδας: 20140101A; ποντίκι LH ELISA ανίχνευσης Kit, R&D Company, αριθμός παρτίδας: 20140101A; Κιτ ανίχνευσης ποντικιού FSH ELISA, R&D Company, αριθμός παρτίδας: 20140101A;

Κιτ ανίχνευσης Mouse DA ELISA, Εταιρεία Ε&Α, αριθμός παρτίδας: 20140101A; Ποντίκι 5-Κιτ ανίχνευσης HT ELISA, Εταιρεία Ε&Α, αριθμός παρτίδας: 20140101A. 1.4 Πειραματικά όργανα

Ηλεκτρονική ζυγαριά, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., μοντέλο: JY601; ηλεκτρονική αναλυτική ισορροπία, Ohaus (Shanghai) Company, μοντέλο: AR1140/C; επιτραπέζιος φυγόκεντρος υψηλής ταχύτητας, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, μοντέλο: TGL-168 ; Ηλεκτρικό θερμοστατικό λουτρό νερού, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., μοντέλο: HWS12; Ελεγκτής αυτόνομης δραστηριότητας ποντικιού, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., μοντέλο: ZZ-6; Μετρητής αποφυγής σκοταδιού ποντικιού, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd. , μοντέλο: BA-200; Ελεγκτής ανάρτησης ουράς, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., μοντέλο: TS-200; φυγόκεντρος ψύξης υψηλής ταχύτητας, Zhongjia Branch της HKUST Innovation Co., Ltd., μοντέλο: KDC-160HR; ρυθμιζόμενο όργανο πιπέτας, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;

Αναγνώστης μικροπλάκας, American BIO-RAD Company, μοντέλο: 680;

Ηλεκτρικό μικροσκόπιο, Japan OLYMPUS Company, μοντέλο: BX61.

2 Πειραματικές μέθοδοι

2.1 Μοντελοποίηση και χορήγηση φαρμάκων

Επιλέχθηκαν 9 0 θηλυκά ποντίκια Κουνμίνγκ με σωματικό βάρος 23-25g και 10 επιλέχθηκαν τυχαία ως κενή ομάδα και υποβλήθηκαν σε ψευδή χειρουργική επέμβαση και τα υπόλοιπα ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία περιεμμηνοπαυσιακά μοντέλα. Μετά το ζύγισμα, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 10% ένυδρης χλωράλης (0,03 ml/10 g) και η κοιλιακή θέση σταθεροποιήθηκε. Στη συνέχεια, κόπηκε το τρίχωμα από το πίσω μέρος του ποντικιού κάτω από την τελευταία πλευρά, στη διασταύρωση της μέσης μασχαλιαίας γραμμής και περίπου 1 cm από το εξωτερικό της σπονδυλικής στήλης και στη συνέχεια κόπηκε μετά την απολύμανση. Το δέρμα και οι μύες της πλάτης έχουν πλάτος περίπου 0,5-1cm. Μια γαλακτώδης λευκή γυαλιστερή μάζα λίπους μπορεί να φανεί στο πεδίο της τομής και η ωοθήκη είναι ενσωματωμένη σε αυτό. Χρησιμοποιήστε μικρά τσιμπιδάκια για να πιάσετε απαλά τη λιπώδη μάζα και τραβήξτε την έξω από την τομή, διαχωρίστε τη λιπώδη μάζα και θα δείτε μια ομάδα από λεπτές, ακανόνιστες, κιτρινοκόκκινες ωοθήκες. Κατά την κοπή, συνδέστε πρώτα τις σάλπιγγες (συμπεριλαμβανομένου του λίπους) κάτω από τις ωοθήκες με λεπτές κλωστές και, στη συνέχεια, αφαιρέστε τις ωοθήκες. Μετά την επέμβαση, τα κέρατα της μήτρας επανατοποθετούνται στην κοιλιακή κοιλότητα, ράβονται οι μύες και το δέρμα και αφαιρούνται και οι δύο ωοθήκες με τον ίδιο τρόπο. Μετά την επέμβαση, τα ζώα ανατράφηκαν προσεκτικά και εγχύθηκε ενδομυϊκά πενικιλίνη 200,000 u/kg (0,1 mL το καθένα) για να αποφευχθεί η μόλυνση για 3 διαδοχικές ημέρες, μία φορά την ημέρα. 5 ημέρες μετά την επέμβαση, πραγματοποιήθηκε εξέταση κολπικού επιχρίσματος σε κάθε ποντίκι ένα προς ένα, μία φορά την ημέρα για 5 συνεχόμενες ημέρες για να διαπιστωθεί εάν οι ωοθήκες αφαιρέθηκαν πλήρως. Τα ποντίκια που εμφάνισαν οιστρική αντίδραση στο επίχρισμα απορρίφθηκαν και 60 πλήρως ευνουχισμένα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία και ομοιόμορφα σε 6 ομάδες για πειραματικούς σκοπούς, συγκεκριμένα ομάδα μοντέλου, ομάδα Mengnianan, ομάδα ισοφλαβόνης σόγιας, μεγάλα, μεσαία καιΟμάδα γλυκοσιδίου φαινυλαιθανόλης Cistanche χαμηλής δόσης. Τα ζώα σε κάθε ομάδα έλαβαν αντίστοιχα φάρμακα τη 10η ημέρα μετά την επέμβαση. Μετά από 6 ημέρες χορήγησης, τα ποντίκια στην τυφλή ομάδα ανατράφηκαν στα 5 ανά κλουβί, με κανονική τροφή και νερό, χωρίς καμία διέγερση. Οι 6 ομάδες μοντέλων ανατράφηκαν όλες με 1 ποντίκι ανά κλουβί και τους δόθηκαν διαφορετικά ερεθίσματα τυχαία κάθε μέρα. Εφτά παράγοντες στρες εφαρμόστηκαν τυχαία μέσα σε 18 ημέρες: υγρή στρωμνή (1g γέννα/1 ml νερό). κολύμπι σε παγωμένο νερό (4 βαθμοί, 5 λεπτά). θερμική καταπόνηση (45 βαθμοί, 5 λεπτά). ολονύκτιος φωτισμός (24 ώρες) σύσφιξη ουράς (1 λεπτό). στέρηση νερού (24 ώρες); νηστεία (24 ώρες). Ένα ερέθισμα χορηγούνταν τυχαία κάθε μέρα και κάθε ερέθισμα δεν μπορούσε να εμφανίζεται συνεχώς για 18 ημέρες.

Μέθοδος παρασκευής: 0.5% CMC Μέθοδος παρασκευής: Ζυγίζουμε 4 g νατριούχου καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης και ανακατεύουμε με απεσταγμένο νερό για να γίνουν 800 ml.

Οι δόσεις των μεγάλων, μεσαίων και μικρών δόσεων της ομάδας γλυκοσίδης φαινυλαιθανόλης Cistanche ήταν 200mg/kg, 10{{2{0}}mg/kg και 50mg/kg αντίστοιχα (όγκος χορήγησης 0,1 ml/10 g). Τρόπος παρασκευής: Ζυγίστε 2000 mg, 1000 mg και 500 mg φαινυλαιθανοειδούς γλυκοσίδης Cistanche αντίστοιχα, διαλύστε τα με μια μικρή ποσότητα 0,5% CMC, μετά ρυθμίστε τον όγκο στα 100 ml, ανακατέψτε καλά και τέλος. Κάψουλες Gengniangan (675 mg/kg, αναμεμειγμένα με απεσταγμένο νερό έως 67,5 mg/ml, 0,1 ml/10 g, ισοδύναμο με 15 φορές την κλινική δόση). μέθοδος προετοιμασίας: πάρτε 9 κάψουλες Gengniangan, χρησιμοποιήστε πρώτα μια μικρή ποσότητα 0,5% CMC Dissolve, μετά ρυθμίστε τον όγκο στα 40 ml και ανακατέψτε καλά για να λάβετε τη δόση του εναιωρήματος κάψουλας Gengnianan (675 mg/kg). Μαλακή κάψουλα ισοφλαβόνης βιταμίνης Ε σόγιας (250 mg/kg, χρησιμοποιήστε απεσταγμένο νερό για να φτιάξετε 25 mg/ml, 0,1 ml/10 g, που ισοδυναμεί με 15 φορές την κλινική δόση). Τρόπος παρασκευής: Πάρτε 2 μαλακές κάψουλες ισοφλαβόνης βιταμίνης Ε σόγιας, χρησιμοποιήστε το πρώτα Διαλύστε μια μικρή ποσότητα 0,5% CMC, στη συνέχεια ρυθμίστε τον όγκο στα 40 ml και ανακατέψτε καλά για να λάβετε τη δόση του εναιωρήματος μαλακής κάψουλας ισοφλαβόνης βιταμίνης Ε σόγιας (250 mg/kg ). Τρόπος αποθήκευσης: φυλάξτε το στο ψυγείο, διατηρήστε το ζεστό κατά τη χρήση.

Τρόπος χορήγησης: Στα ζώα σε κάθε ομάδα χορηγήθηκαν αντίστοιχα φάρμακα τη 10η ημέρα μετά την επέμβαση. Στην ομάδα Gengnian'an χορηγήθηκε από το στόμα εναιώρημα κάψουλας Gengnian'an 675 mg·kg-1, στην ομάδα ισοφλαβόνης σόγιας χορηγήθηκε από του στόματος εναιώρημα μαλακής κάψουλας ισοφλαβόνης βιταμίνης Ε σόγιας 250 mg·kg-1 και μεγάλο, μέτρια καιμικρές δόσεις Cistancheφαινυλαιθανόλη. Στην ομάδα γλυκοσιδών χορηγήθηκαν από το στόμα μεγάλες, μεσαίες και μικρές δόσεις γλυκοσίδης φαινυλαιθανόλης Cistanche 200mg·kg-1, 10mg·kg-1, 50mg·kg{{ 5}}, 0,1ml/10g αντίστοιχα. Η τυφλή ομάδα και η ομάδα μοντέλου χορηγήθηκαν με τον ίδιο όγκο διαλύματος CMC 0,5% μία φορά την ημέρα για 30 διαδοχικές ημέρες.

2.2 Στοιχεία παρατήρησης και μέθοδοι ανίχνευσης

Αναγκαστική κολύμβηση: Την πρώτη ημέρα μετά το τέλος της διέγερσης του χρόνιου στρες, ο χρόνος ακινησίας των ποντικών σε κάθε ομάδα εντός 6 λεπτών μετρήθηκε για 2-6 λεπτά. (Βάλτε τα ποντίκια σε κάθε ομάδα σε ένα ποτήρι ζέσεως 2000 mL. Η θερμοκρασία του νερού είναι 25 μοίρες. Εκτός από την απαραίτητη ελάχιστη κίνηση που απαιτείται για τη διατήρηση της αιώρησης, τα άκρα των ζώων σταματούν να κινούνται και καταγράφονται ως ακίνητα. Καταγράψτε τον συνολικό χρόνο ακινησίας από 2 έως 6 λεπτά μέσα σε 6 λεπτά ) Εθελοντική δοκιμή δραστηριότητας: Τη δεύτερη ημέρα μετά το τέλος της διέγερσης του χρόνιου στρες, μετρήθηκε ο αριθμός των αυθόρμητων δραστηριοτήτων των ποντικών σε κάθε ομάδα εντός 5 λεπτών.

Μέθοδος αποφυγής του σκοταδιού: Την 3η ημέρα μετά το τέλος της διέγερσης του χρόνιου στρες, βάλτε την ουρά του ποντικιού στο κουτί μέτρησης που βλέπει το μικρό άνοιγμα στο σκοτεινό θάλαμο και πραγματοποιήστε εκπαίδευση. Μετά από 24 ώρες, μετρήστε ξανά την καθυστέρηση του ποντικιού που εισέρχεται στο σκοτεινό θάλαμο για πρώτη φορά και το χρόνο που χρειάζεται για να μπει στο σκοτεινό θάλαμο εντός 5 λεπτών. Αριθμός ηλεκτροπληξίας.

Δοκιμή ανάρτησης ουράς: Την 5η ημέρα μετά το τέλος της διέγερσης του χρόνιου στρες, ο χρόνος ακινησίας των ποντικών σε κάθε ομάδα εντός 6 λεπτών μετρήθηκε για 2-6 λεπτά.

2 ώρες μετά την τελευταία δόση (12 ώρες χωρίς τροφή ή νερό), τα ποντίκια ζυγίστηκαν, οι βολβοί των ματιών αφαιρέθηκαν, συλλέχθηκε αίμα, διαχωρίστηκε ο ορός και τα περιεχόμενα των E2, T, LH και FSH στον ορό ήταν μετρημένος; τα ποντίκια στη συνέχεια θανατώθηκαν με εξάρθρωση των αυχενικών σπονδύλων και τα ποντίκια ανατέμθηκαν. , αφαιρέστε τον θύμο, τη σπλήνα και τον ιστό της μήτρας, ζυγίστε το υγρό βάρος τους και υπολογίστε τον δείκτη οργάνου (δείκτης οργάνου=υγρό βάρος οργάνου mg/βάρος ποντικού g), στη συνέχεια αφαιρέστε τον εγκέφαλο, κόψτε το μισό και προετοιμάστε τον εγκέφαλο ομογενοποίηση ιστού. Η ενζυμική ανοσοδοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των περιεχομένων των μονοαμινικών νευροδιαβιβαστών 5-HT και DA σε ομογενοποίηση εγκεφαλικού ιστού. Οι ιστοί του θύμου, της σπλήνας, της μήτρας και του εγκεφάλου σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 10%, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και χρωματίστηκαν με ΗΕ. Οι μορφολογικές αλλαγές κάθε ομάδας παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο φωτός. 2.3 Μέθοδος προσδιορισμού κιτ

Λήψη δειγμάτων ορού: Χρησιμοποιήστε δοκιμαστικούς σωλήνες που δεν περιέχουν πυρετογόνα και ενδοτοξίνες. Αποφύγετε οποιαδήποτε κυτταρική διέγερση κατά τη διάρκεια της επέμβασης. Αφού συλλέξετε το αίμα, φυγοκεντρήστε το στις 3000 rpm για 10 λεπτά για να διαχωριστούν γρήγορα και προσεκτικά ο ορός και τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Λήψη δειγμάτων ομογενοποίησης ιστού: Προσθέστε κατάλληλη ποσότητα φυσιολογικού ορού στον ιστό και πολτοποιήστε τον. Φυγοκεντρήστε στις 3000 rpm για 10 λεπτά και πάρτε το υπερκείμενο.

Η μέθοδος προσδιορισμού του κιτ ELISA οιστραδιόλης (Ε2) ποντικού είναι ίδια με το Πείραμα 2. Οι συγκεντρώσεις των τυπικών προϊόντων (S0-55) είναι: 0, 4, 8, 16, 32 και 64 pmol/L.

Η μέθοδος προσδιορισμού του κιτ ELISA τεστοστερόνης (Τ) ποντικού είναι η ίδια με αυτή της οιστραδιόλης (Ε2). Οι συγκεντρώσεις των τυπικών προϊόντων (S0-55) είναι: 0, 50, 100, 200, 400, 800 pg/mL.

Η μέθοδος προσδιορισμού του κιτ ELISA της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) ποντικού είναι η ίδια με εκείνη της οιστραδιόλης (Ε2). Οι συγκεντρώσεις των τυπικών προϊόντων (S0-55) είναι: 0, 5, 1{0, 20, 40 και 8{{30} }mIU/mL. Η μέθοδος προσδιορισμού του κιτ ELISA της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) ποντικού (ποντικού) είναι η ίδια με εκείνη της οιστραδιόλης (Ε2). Οι συγκεντρώσεις του προτύπου (S0-55) είναι: 0, 0,5, 1, 2, 4 και 8 mIU/mL. Η μέθοδος προσδιορισμού του κιτ ELISA 5-υδροξυτρυπταμίνης (5-HT) ποντικού είναι ίδια με εκείνη της οιστραδιόλης (Ε2). Οι συγκεντρώσεις των τυπικών προϊόντων (S0-55) είναι: 0, 15, 30, 60, 120, 240 ng/ml. Η μέθοδος προσδιορισμού του κιτ ανίχνευσης ELISA ντοπαμίνης (DA) ποντικού (ποντικιού) είναι η ίδια με εκείνη της οιστραδιόλης (Ε2). Οι συγκεντρώσεις των τυπικών προϊόντων (S0-55) είναι: 0, 7,5, 15, 30, 60 και 120 pg/ml.

Μπορεί να φανεί από τον Πίνακα 21 και το Σχήμα 25 ότι σε σύγκριση με την κενή ομάδα, ο χρόνος ακινησίας των ποντικών στην ομάδα μοντέλου αυξήθηκε σημαντικά στα πειράματα αναγκαστικής κολύμβησης και ανάρτησης ουράς (Ρ<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Επιδράσεις στις αυτόνομες δραστηριότητες σε ποντίκια με μοντέλα περιεμμηνοπαυσιακής κατάθλιψης

Τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτόνομης δραστηριότητας ποντικών σε κάθε πειραματική ομάδα φαίνονται στον Πίνακα 22 και στο Σχήμα 26.

Μπορεί να φανεί από τον Πίνακα 23 και τα Σχήματα 27 και 28 ότι σε σύγκριση με την κενή ομάδα, η περίοδος καθυστέρησης των ποντικών στην ομάδα μοντέλου μειώθηκε σημαντικά και ο αριθμός των ηλεκτροσόκ αυξήθηκε σημαντικά (Ρ<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Επιδράσεις στον δείκτη οργάνων σε ποντίκια με μοντέλα περιεμμηνοπαυσιακής κατάθλιψης

Μπορεί να φανεί από τον Πίνακα 24 και το Σχήμα 29 ότι σε σύγκριση με την κενή ομάδα, ο δείκτης θύμου, ο δείκτης σπλήνας και ο δείκτης της μήτρας της ομάδας μοντέλου ήταν σημαντικά μειωμένοι (Ρ<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Γλυκοζίτης φαινυλαιθανόλης Cistancheομάδα Ο δείκτης θύμου αδένα και ο δείκτης της μήτρας των ποντικών μπορεί να αυξηθούν σημαντικά (Π<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).