Η επιγαλλοκατεχίνη-3-γαλλικό βελτίωσε τη συσσώρευση και την απόπτωση σιδήρου και προώθησε την αναγέννηση των νευρώνων και τη μνήμη/ τις γνωστικές λειτουργίες στον ιππόκαμπο που προκαλούνται από την έκθεση σε ένα χρόνιο περιβάλλον υποξίας σε μεγάλο υψόμετρο

Αφηρημένη

Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τις προστατευτικές επιδράσεις και τον πιθανό μηχανισμό θεραπείας της Επιγαλλοκατεχίνης-3-γαλλικής (EGCG) σε ένα ζωικό μοντέλο χρόνιας έκθεσης σε ένα φυσικό περιβάλλον υποξίας σε μεγάλο υψόμετρο (HAH). Οι αλλαγές συμπεριφοράς αξιολογήθηκαν με τη δοκιμή υδατικού λαβύρινθου Morris. Η συσσώρευση σιδήρου στον ιππόκαμπο ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας χρώση Perl's ενισχυμένη με DAB, MRI, qPCR και χρωματομετρία, αντίστοιχα. Το οξειδωτικό στρες (μηλονοδιαλδεΰδη, MDA), η απόπτωση (Κασπάση-3) και η νευρική αναγέννηση (νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο, BDNF) ανιχνεύθηκαν με χρήση ELISA και western blotting. Οι νευρικές υπερδομικές αλλαγές αξιολογήθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM).

Η σχέση μεταξύ απόπτωσης και μνήμης ήταν πάντα ένα από τα καυτά θέματα των νευροεπιστημόνων. Η απόπτωση αναφέρεται στη διαδικασία του τακτικού κυτταρικού θανάτου μέσω μιας σειράς εσωτερικών ρυθμιστικών μηχανισμών. Υπό κανονικές συνθήκες, η κυτταρική απόπτωση δεν προκαλεί καμία βλάβη στον ανθρώπινο οργανισμό, αλλά βοηθά στη διατήρηση της καλής υγείας. Ωστόσο, υπό ορισμένες παθολογικές καταστάσεις, η ανεξέλεγκτη απόπτωση μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση διαφόρων ασθενειών.

Ταυτόχρονα, η μνήμη έχει επίσης αποδειχθεί ότι σχετίζεται στενά με την απόπτωση των κυττάρων. Ορισμένες μελέτες υποδηλώνουν ότι η κατάλληλη απόπτωση παίζει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και την εδραίωση της μνήμης. Αυτή η σχέση ακολουθεί έναν απλό κανόνα: ορισμένοι περιττοί ή ληγμένοι νευρώνες καθαρίζονται μέσω της απόπτωσης, δημιουργώντας περισσότερο χώρο και πόρους για το σχηματισμό νέων νευρώνων και αποθήκευση μνήμης. Επιπλέον, η κατάλληλη απόπτωση μπορεί επίσης να προστατεύσει τους νευρώνες από βλάβη εξαλείφοντας τις τοξικές πρωτεΐνες στους νευρώνες.

Ωστόσο, εάν υπάρχει υπερβολική ή ανεπαρκής απόπτωση, θα επηρεάσει τη φυσιολογική λειτουργία της μνήμης. Η υπερβολική απόπτωση μπορεί να οδηγήσει σε υπερβολική απώλεια νευρώνων, οδηγώντας σε απώλεια μνήμης. Από την άλλη πλευρά, εάν δεν υπάρχει αρκετή απόπτωση για την εκκαθάριση των περιττών νευρώνων και κυττάρων, αυτά τα κύτταρα θα καταναλώσουν πολύ περιορισμένο χώρο και πόρους, γεγονός που μπορεί επίσης να οδηγήσει σε μείωση της μνήμης. Επομένως, είναι απαραίτητο να αποφευχθεί η υπερβολική ή ανεπαρκής απόπτωση διατηρώντας παράλληλα τον φυσιολογικό βαθμό απόπτωσης.

Η απόπτωση είναι μια πολύπλοκη βιολογική διαδικασία με πολλούς παράγοντες που επηρεάζουν. Ενώ η σχέση με τη μνήμη δεν είναι πλήρως κατανοητή, αυτό το φαινόμενο μας επιτρέπει να αποκτήσουμε μια βαθύτερη κατανόηση του νευρικού συστήματος και ανοίγει νέους δρόμους για τη βελτίωση της μνήμης. Συνοπτικά, η κατάκτηση της κατάλληλης απόπτωσης είναι ζωτικής σημασίας για την υγεία της μνήμης. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή το Cistanche deserticola είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό με πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του κιμά προέρχεται από τα διάφορα ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με διάφορους τρόπους.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη λειτουργία του εγκεφάλου

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απόδοση μάθησης και μνήμης των αρουραίων μειώθηκε όταν εκτέθηκαν στο περιβάλλον HAH. Ακολούθησε συσσώρευση σιδήρου, δυσλειτουργικός μεταβολισμός σιδήρου, μειωμένος BDNF και ανοδική ρύθμιση του MDA και της Κασπάσης-3. Το TEM επιβεβαίωσε τις υπερδομικές αλλαγές στους νευρώνες και τα μιτοχόνδρια. Το EGCG μείωσε τη γνωστική εξασθένηση που προκαλείται από HAH, την εναπόθεση σιδήρου, το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση και προώθησε την αναγέννηση των νευρώνων έναντι της χρόνιας νευρικής βλάβης που προκαλείται από HAH.

Λέξεις-κλειδιά
Μεγάλο υψόμετρο · Υποξία · Ποσοτική χαρτογράφηση ευαισθησίας · Συσσώρευση σιδήρου · Φαρμακευτική παρέμβαση.

Εισαγωγή
Οι ανθρώπινες δραστηριότητες σε περιοχές με μεγάλο υψόμετρο (πάνω από 3000 m) έχουν πρόσφατα αυξηθεί σημαντικά [1]. Μεταξύ των 140 εκατομμυρίων ανθρώπων παγκοσμίως που ζουν μόνιμα σε μεγάλα υψόμετρα [2, 3] και άλλοι για τουρισμό ή υπεράσπιση των ορίων, το 5-10% κινδυνεύει να αναπτύξει χρόνια ασθένεια του βουνού που χαρακτηρίζεται από υπερβολική ερυθροκυττάρωση και σοβαρή υποξαιμία [4, 5] . Ο εγκέφαλος, ως ένα από τα όργανα που καταναλώνουν περισσότερο οξυγόνο, είναι ευαίσθητος στην υποξία [6]. Επιπλέον, η υποξία σε μεγάλο υψόμετρο (HAH) διαταράσσει σοβαρά τη δομική ακεραιότητα των κύριων νευρώνων και τη μιτοχονδριακή μορφολογία στον ιππόκαμπο [7]. Τα συμπτώματα που προκαλούνται από τη χρόνια έκθεση σε περιβάλλον HAH περιλαμβάνουν πονοκέφαλο, ζάλη, διαταραχές ύπνου, κόπωση και έλλειψη νοητικής συγκέντρωσης [5, 8, 9]. Επιπλέον, το HAH μπορεί επίσης να προκαλέσει νευρογνωστικές δυσλειτουργίες όπως η χωρική μάθηση, η μνήμη και η διάθεση [10]. Η θεραπεία της νευρικής βλάβης που προκαλείται από HAH έχει γίνει έτσι το επίκεντρο της προσοχής στον τομέα της ιατρικής σε μεγάλο υψόμετρο [11, 12].

Έχει μεγάλη σημασία η εύρεση κατάλληλων σκευασμάτων για την πρόληψη εγκεφαλικής βλάβης που προκαλείται από HAH. Τα φύλλα πράσινου τσαγιού περιέχουν (−)-επιγαλλοκατεχίνη-3-γαλλική (EGCG) (50–60%), (−)-επιγαλλοκατεχίνη (EGC) (15–20%), (−)-επικατεχίνη-3- γαλλική (ΗΚΓ) (10–15%) και (−)-επικατεχίνη (EC) (5–10%) [13, 14]. Το EGCG, το οποίο αναφέρεται ότι είναι πιο άφθονο στα φύλλα πράσινου τσαγιού (7,1 g ανά 100 g) από ότι στο τσάι oolong (3,4 g ανά 100 g) και τα φύλλα μαύρου τσαγιού (1,1 g ανά 100 g) [15], έχει μια ισχυρή αντιοξειδωτική ιδιότητα λόγω στις οκτώ ομάδες υδροξυλίου και δύο τριφαινολικές ομάδες στη βασική του δομή [16, 17]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να διασχίσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και να φτάσει στο παρέγχυμα του εγκεφάλου σε μελέτες σε ζώα [18, 19]. Έχουν υπάρξει κάποιες αναφορές για τους νευροπροστατευτικούς μηχανισμούς του EGCG, όπως οι ιδιότητες χηλίωσης μετάλλων, η καταστολή του οξειδωτικού στρες, η φλεγμονή, η απόπτωση και η επιτάχυνση της αναγέννησης των νεύρων [20-22]. Οι Zhang et al. επανεξέτασε την επίδραση του EGCG σε πολλές ασθένειες και επεσήμανε ότι το EGCG προστατεύει τα νευρωνικά κύτταρα προκαλώντας αυτοφαγία. Συνόψισαν επίσης ότι οι αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές ιδιότητες του EGCG ήταν ζωτικής σημασίας για τον προστατευτικό του ρόλο σε ασθένειες του κεντρικού νευρικού συστήματος [23].

Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν αναφέρει τη νευροπροστατευτική δράση του EGCG έναντι της χρόνιας νευρικής βλάβης που προκαλείται από HAH. Για να καλύψουμε αυτό το κενό, σε αυτή τη μελέτη, δημιουργήσαμε ένα μοντέλο χρόνιας έκθεσης αρουραίου σε ένα φυσικό περιβάλλον HAH σε μια προσπάθεια να επαληθεύσουμε τον πιθανό μηχανισμό θεραπείας του EGCG. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ποσοτική χαρτογράφηση ευαισθησίας (QSM), με μαγνητική τομογραφία βαθμίδωσης ηχούς στους 7 Τ, η οποία μπορεί να ξεπεράσει τη μη τοπική επίδραση του μαγνητικού πεδίου και να παρέχει έναν μηχανισμό αντίθεσης για τους ιστούς in vivo, για να ποσοτικοποιήσει την περιεκτικότητα σε σίδηρο στον εγκέφαλο [24].
Υλικά και μέθοδοι

Των ζώων

Συνολικά 120 αρσενικοί αρουραίοι Sprague–Dawley βάρους 130–150 g ελήφθησαν από την Chengdu Dashuo Laboratory Animal Co., Ltd. Διατηρήθηκαν σε ένα σπίτι ζώων στους 18–22 βαθμούς σε κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών με τροφή και νερό παρέχεται ad libitum. Όλες οι διαδικασίες που πραγματοποιήθηκαν σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Νοσοκομείου Δυτικής Κίνας.

Σχεδιασμός Μελέτης

Οι αρουραίοι τυχαιοποιήθηκαν και χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες. Οι αρουραίοι στην ομάδα υποξίας και στην ομάδα h-EGCG τράφηκαν και στεγάστηκαν στο Yushu της Κίνας σε υψόμετρο 4500 m. Οι αρουραίοι στην ομάδα κανονικού υψομέτρου (ομάδα n) και την ομάδα n-EGCG τράφηκαν στο Chengdu της Κίνας σε υψόμετρο 500 m. Σε αυτούς τους αρουραίους δόθηκε κανονική τροφή για ένα μήνα, ακολουθούμενη από διαφορετικές θεραπείες. (1) Ομάδα υποξίας: στους αρουραίους χορηγούνταν ενδοπεριτοναϊκή ένεση κάθε μέρα με φυσιολογικό ορό (0,9%) για ένα μήνα. (2) Ομάδα h-EGCG: στους αρουραίους χορηγούνταν ενδοπεριτοναϊκή ένεση κάθε μέρα με 50 mg/kg EGCG (καθαρότητα, 98%· Cas, 989-51-5· Sigma-Aldrich· αποθηκεύτηκε στους 4 βαθμούς ) για ένα μήνα. (3) n ομάδα: στους αρουραίους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση κάθε μέρα με φυσιολογικό ορό (0,9%) για ένα μήνα. (4) Ομάδα n-EGCG: στους αρουραίους χορηγούνταν ενδοπεριτοναϊκή ένεση κάθε μέρα με 50 mg/kg EGCG για ένα μήνα.

Το EGCG (5 mg/mL) διαλύθηκε σε νερό σε αναλογία 1:1. Ο όγκος που εγχύθηκε σε αρουραίους προσδιορίστηκε από το βάρος των αρουραίων, οι οποίοι έφτασαν σε μια τελική ποσότητα ένεσης 50 mg/kg. Μετά από αυτή τη θεραπεία, ορισμένοι αρουραίοι χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμασία λαβύρινθου νερού Morris (n=10 για κάθε ομάδα) και την ανάλυση MRI εγκεφάλου (n=10 για κάθε ομάδα), αντίστοιχα. Μερικοί άλλοι αρουραίοι θυσιάστηκαν και συλλέχθηκαν εγκεφαλικοί ιστοί για χρώση Perls με ενισχυμένη DAB (n=3 για κάθε ομάδα), για στύπωμα Western, βιοχημικές αξιολογήσεις και προσδιορισμούς qPCR (n=6 για κάθε ομάδα) , και ανάλυση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μετάδοσης (n=1 για κάθε ομάδα).

Πείραμα Συμπεριφοράς

Ο λαβύρινθος νερού Morris (MWM) διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως για την ανάλυση της μάθησης και της μνήμης των αρουραίων [25], πραγματοποιήθηκε στην ίδια τοποθεσία όπου στεγάστηκαν οι αρουραίοι. Το MWM αποτελούνταν από μια στρογγυλή χαλύβδινη πισίνα (160 cm σε διάμετρο, 60 cm σε ύψος και 31 cm σε βάθος) γεμάτη με νερό σε επίπεδο 1 cm πάνω από την κορυφή μιας πλατφόρμας (10 cm σε διάμετρο και 30 cm σε βάθος ). Η θερμοκρασία του νερού διατηρήθηκε στους 22±2 βαθμούς και αδιαφανοποιήθηκε με λαμπρό μαύρο μελάνι. Η πλατφόρμα στερεώθηκε σε ένα από τα τέσσερα τεταρτημόρια που δημιουργήθηκαν κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης για τέσσερις συνεχόμενες ημέρες. Η δοκιμή ολοκληρώθηκε μόλις οι αρουραίοι έφτασαν στην πλατφόρμα. Η καθυστέρηση διαφυγής καταγράφηκε. Εάν οι αρουραίοι απέτυχαν να φτάσουν στην πλατφόρμα εντός 60 δευτερολέπτων, στη συνέχεια οδηγήθηκαν χειροκίνητα στην πλατφόρμα και αφέθηκαν να παραμείνουν σε αυτήν για 15 δευτερόλεπτα. Την πέμπτη ημέρα, μετά την αφαίρεση της πλατφόρμας, οι αρουραίοι εισήλθαν στο τεταρτημόριο απέναντι από αυτό της αρχικής πλατφόρμας. Στη συνέχεια, ο αριθμός των διασταυρώσεων πλατφόρμας και των διαδρομών κίνησης καταγράφηκε μέσα σε 60 δευτερόλεπτα.

Πρωτόκολλο MRI

Το QSM αξιολογήθηκε με μαγνητική τομογραφία, η οποία έχει αναφερθεί σε προηγούμενη μελέτη [26]. Η μαγνητική τομογραφία πραγματοποιήθηκε σε σαρωτή 7 Tesla (BioSpec 70/30, Bruker, Γερμανία). Μια τρισδιάστατη (3D) ακολουθία ηχούς με ανάκληση βαθμίδωσης πολλαπλής ηχούς (GRE) χρησιμοποιήθηκε για το QSM. Οι πειραματικές παράμετροι ορίστηκαν ως εξής: χρόνος επανάληψης (TR)=60 ms, γωνία fip=15 μοίρες, πάχος τομής=23 mm, μέγεθος μήτρας λήψης=256×256, πεδίο προβολής (FOV)=32 mm×32 mm, χρόνος ηχούς πρώτης ηχούς (TE1)=5 ms, απόσταση ηχούς (ΔTE)=5.77 ms, αριθμός ηχούς{{19 }} και εύρος ζώνης=50 kHz. Τόσο οι εικόνες μεγέθους όσο και οι εικόνες φάσης αποθηκεύτηκαν για ανακατασκευή QSM. Υπήρχαν τρία βήματα στους αλγόριθμους χαρτογράφησης QSM που εκτελέστηκαν με το MATLAB R2014a (The Math Works, Natick, MA), το ξετύλιγμα της τυλιγμένης φάσης, η αφαίρεση του πεδίου φόντου και η δημιουργία χαρτών ευαισθησίας από το πεδίο ιστού.

Προετοιμασία ιστού

Στους αρουραίους σε κάθε ομάδα χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά 10% ένυδρη χλωράλη για βαθιά αναισθησία (1,5 mg/kg) και στη συνέχεια εγχύθηκε διακαρδιακά με παγωμένο ορό (περίπου 30 λεπτά) με περισταλτική αντλία (BT100-2 J, LongerPump, Σανγκάη, Κίνα). Για τη χρώση Perls ενισχυμένη με DAB, οι εγκέφαλοι ανατέμθηκαν και μονιμοποιήθηκαν μετά σε 2,5% παραφορμαλδεΰδη όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Την επόμενη μέρα, λήφθηκαν στεφανιαίες τομές από τον ιππόκαμπο για χρώση. Για άλλους προσδιορισμούς εκτός από την ανοσοϊστοχημεία, ο ιππόκαμπος απογυμνώθηκε γρήγορα σε πάγο και αποθηκεύτηκε στους 80 βαθμούς.

DAB Enhanced Perls' Staining

Η χρώση Perls με ενισχυμένη DAB χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της κυτταρικής συσσώρευσης σιδήρου [27]. Τμήματα εγκεφαλικού ιστού βυθίστηκαν σε απεσταγμένο νερό για 3 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα Perls (2% σιδηροκυανιούχο κάλιο/2% υδροχλωρικό οξύ) για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) πλένει. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 0,3% σε μεθανόλη για 15 λεπτά, ακολουθούμενα από 3 πλύσεις σε PBS. Τα σήματα αναπτύχθηκαν με επώαση για 3 λεπτά σε 3,3-διαμινοβενζιδίνη (DAB) και αιματοξυλίνη (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν για αντιχρώση.

Βιοχημικές Εκτιμήσεις

Ο ιππόκαμπος απομονώθηκε και αναδεύτηκε ομοιόμορφα για να ληφθεί ένα ομογενοποιημένο προϊόν 10%, το οποίο στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 30,000–40,000 RPM για 10 λεπτά για να ληφθεί ένα υπερκείμενο υγρό για τον υπολογισμό του σιδήρου του ιππόκαμπου με ένα χρωματομετρικό κιτ. (E-BCK139S, Elabscience, Wuhan, Κίνα) και η μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) ανιχνεύθηκε στο υπερκείμενο με χρήση κιτ ELISA (Elabscience, Wuhan, Κίνα).

Δυτική Κηλίδες

Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας δικινχονικού οξέος (BCA, Biosharp, Beijing, China). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενοφθοριδίου (PVDF). Τα τελευταία μπλοκαρίστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη αραιωμένη με ρυθμιστικό και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς , συμπεριλαμβανομένης της κασπάσης κατά της διάσπασης κουνελιού-3 (1:1000 , Affinity Biosciences, Jiangsu, Κίνα), νευροτροφικός παράγοντας προερχόμενος από τον εγκέφαλο κουνελιού (BDNF) (1:1000, Affinity Biosciences, Jiangsu, Κίνα) και αντι-ακτίνη κουνελιού (1:5000, Affinity Biosciences, Jiangsu, Κίνα). Την επόμενη μέρα, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με TBST για 5 λεπτά κάθε φορά, και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα σημασμένο με HRP διάλυμα δευτερογενούς αντισώματος κατσίκας κατά κουνελιού (1:10.000, Servicebio, Wuhan, Κίνα) για 1 ώρα και πλύθηκαν τρεις φορές για 5 λεπτά.

Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο

Animal Total RNA Isolation Kit (Foregene), 5×All-In-One MasterMix (με AccuRT Genomic DNA Removal kit) (abm) και EvaGreen Express2×qPCR MasterMix-No Dye (abm) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Τα συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών ήταν τα εξής: Fpn, μπροστινός εκκινητής, 5'-CACCACAGGATATGCTTACAC TCAGG-3'; αντίστροφο αστάρι, 5ʹ-GAGAACAGACCAGTC CGAACAAGG-3ʹ; β-ακτίνη, μπροστινός εκκινητής, 5'-TGTCAC CAACTGGGACGATA-3'; αντίστροφο αστάρι: 5ʹ-GGGGTG TTGAAGGTCTCAAA-3ʹ. Το επίπεδο mRNA Fpn κάθε δείγματος κανονικοποιήθηκε σε αυτό του mRNA της β-ακτίνης.

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM)

Οι ιππόκαμποι μονιμοποιήθηκαν εκ των υστέρων σε σταθερό υγρό με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο γλουταραλδεΰδης 2,5% και στη συνέχεια αφυδατώθηκαν σε διαλύματα ακετόνης σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις και ενσωματώθηκαν με Epox 812. Στη συνέχεια, οι τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο. Στη συνέχεια καταγράφηκαν υπερδομικές εικόνες στο πεδίο CA3 του ιππόκαμπου με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) με JEM-1400-FLASH (JEOL, Τόκιο, Ιαπωνία).

Στατιστικές μέθοδοι

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τυπική απόκλιση (SD). Οι μεταβλητές που πληρούσαν τις συνθήκες παραμετρικής δοκιμής αξιολογήθηκαν με τη χρήση του Welch's t-test, μονόδρομης ή αμφίδρομης επαναλαμβανόμενης μέτρησης ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης του Tukey. Αυτές οι μεταβλητές που δεν πληρούσαν τις συνθήκες παραμετρικής δοκιμής αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Mann–Whitney U, τη δοκιμή Kruskal–Wallis ή την ANOVA Welch and Brown-Forsythe. Μια τιμή του P<0.05 was considered statistically significant. Statistical analysis and figures were obtained by GraphPad Prism Version 9.0 (GraphPad Software, CA, USA).

Αποτελέσματα

Επίδραση του EGCG στη μάθηση και τη μνήμη σε αρουραίους που εκτέθηκαν σε χρόνια HAH

Για να επαληθευτεί εάν το EGCG έχει επίδραση στη χωρική μάθηση και απόδοση της μνήμης των αρουραίων που εκτέθηκαν σε χρόνια HAH, πραγματοποιήθηκε η δοκιμή MWM. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ο αριθμός των διασταυρώσεων πλατφόρμας από την ομάδα υποξίας μειώθηκε σημαντικά (Ρ< 0.001, vs. the n group). The treatment of EGCG did not affect the number of crossings of rats in either the normal altitude group (n group vs. n-EGCG group, P>{{0}}.05) ή την ομάδα HAH (ομάδα υποξίας έναντι ομάδας h-EGCG, P > 0,05). Στη συνέχεια, η καθυστέρηση διαφυγής υπολογίστηκε ως ο χρόνος που χρειάστηκε ο αρουραίος για να φτάσει στην κρυφή πλατφόρμα (Εικ. 1Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τη δεύτερη έως την τέταρτη ημέρα εκπαίδευσης, ο λανθάνοντας χρόνος διαφυγής των αρουραίων στην ομάδα της υποξίας αυξήθηκε σημαντικά (όλες οι τιμές P<0.01, vs. the n group). Moreover, the h-EGCG group showed reduced escape latency than that in the hypoxia group (all P values<0.05). Also, the swimming speed and distance in MWM were measured. No significant difference was found among these four groups at different time points (All P values>0.05, Εικ. 1C). Στη συνέχεια, βρήκαμε ότι η ταχύτητα κολύμβησης των αρουραίων στην ομάδα υποξίας μειώθηκε σε σύγκριση με την ομάδα n τη δεύτερη και την τρίτη ημέρα (όλες οι τιμές P<0.01, Fig. 1D). Also, the swimming speed of rats in h-EGCG group was higher than that in hypoxia group (all P values<0.05, Fig. 1D).

DAB Enhanced Perls' Staining

Μετά από 8 εβδομάδες χρόνιας έκθεσης σε HAH, ο σίδηρος αυξήθηκε σημαντικά στις περιοχές CA1 και CA3 του ιππόκαμπου του εγκεφάλου σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας n (Όλες οι τιμές P<0.01). After EGCG intervention, iron accumulation in CA3 and CA1 of the hippocampus was reduced compared to that of the hypoxia group (P<0.0001, P<0.001, respectively; Fig. 2).

Αλλαγές μαγνητικής ευαισθησίας στις περιοχές του ιππόκαμπου

Οι τιμές ευαισθησίας στον ιππόκαμπο αυξήθηκαν σημαντικά μετά την έκθεση σε HAH σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας n (P<0.0001, Fig. 3A). After EGCG intervention, the values decreased compared to those of the hypoxia group (P<0. 0001, Fig. 3A).

Επιδράσεις του EGCG στο οξειδωτικό στρες του ιππόκαμπου, τον σίδηρο και το Fpn
Σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας n, η περιεκτικότητα σε MDA και σίδηρος της ομάδας υποξίας ήταν αυξημένη (P<0.05, Fig. 3B, C). EGCG treatment reduced the levels of MDA and iron, indicating that alleviation of oxidative stress may facilitate EGCG to play a protective role in chronic HAH-induced brain injury in rats. To understand the mechanisms by which brain iron contents were changed by HAH, we further examined the mRNA expression of hippocampal Fpn and found that the Fpn decreased in the hypoxia group and increased in the h-EGCG group (P < 0.01, P < 0.05, respectively, Fig. 3D).

Αποτελέσματα Western Blotting

Αξιολογήσαμε τις επιδράσεις του EGCG στα επίπεδα κασπάσης{{0}} και BDNF. Η ανάλυση Western blotting (WB) έδειξε υψηλότερη έκφραση της Κασπάσης-3 και χαμηλότερη έκφραση του BDNF στον ιππόκαμπο της ομάδας υποξίας από εκείνη στην ομάδα n (όλες οι τιμές P < 0,0001, Εικ. 4). Επιπλέον, η θεραπεία με EGCG μείωσε τα επίπεδα της κασπάσης-3 και αύξησε τα επίπεδα του BDNF (όλες οι τιμές P<0.0001, Fig. 4).

Νευρικές Υπερδομικές Αλλαγές

Μετά από 2 μήνες χρόνιας έκθεσης σε HAH, τα μιτοχόνδρια στο CA3 του ιππόκαμπου της ομάδας υποξίας διογκώθηκαν λόγω της μείωσης ή της θραύσης της κορυφογραμμής. Επιπλέον, οι αρουραίοι της ομάδας υποξίας εμφάνισαν συμπυκνωμένη πυρηνική χρωματίνη, πυρηνική συρρίκνωση, υψηλό βαθμό διόγκωσης του ενδοπλασματικού δικτύου, αυξημένα λυσοσώματα και αυξημένη πυκνότητα ηλεκτρονίων. Μετά τη θεραπεία με EGCG, η διόγκωση των μιτοχονδρίων, η διάλυση των μιτοχονδριακών κρυστάλλων και η πυκνότητα ηλεκτρονίων μειώθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας υποξίας (Εικ. 5).

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με EGCG βελτίωσε σημαντικά τις ικανότητες μάθησης, μνήμης και χωρικής εξερεύνησης των αρουραίων της ομάδας υποξίας και μετριάστηκε τη νευρική βλάβη του ιππόκαμπου που προκαλείται από χρόνια έκθεση στο περιβάλλον HAH. Επιπλέον, διαπιστώσαμε επίσης ότι, παρά τις σημαντικές βελτιώσεις σε όλους τους δείκτες μετά τη θεραπεία με EGCG, αυτοί οι δείκτες σπάνια επέστρεφαν στα φυσιολογικά επίπεδα υποξίας.

Προηγούμενες μελέτες έχουν βρει ότι το EGCG έχει κάποιες επιπτώσεις σε διάφορους τύπους μοντέλων διαταραχής της μάθησης και της μνήμης [28, 29]. Οι Safar et al. διαπίστωσε ότι το EGCG μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη των αρουραίων που έλαβαν μορφίνη [30]. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματά τους, στη μελέτη μας, μετά από καθημερινή παρέμβαση με 50 mg/kg EGCG σε επίμυες που εκτέθηκαν χρόνια σε HAH, οι ικανότητες μάθησης, μνήμης και χωρικής εξερεύνησης των ατόμων βελτιώθηκαν, υποδηλώνοντας ότι το EGCG μπορεί να βελτιώσει τις βλάβες μάθησης και μνήμης σε μεγάλα υψόμετρα.

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερπαραγωγή σιδήρου στον εγκέφαλο έχει νευροτοξική δράση καθώς συμβάλλει στην οξειδωτική βλάβη [31]. Σε αυτή τη μελέτη, η συσσώρευση σιδήρου ανιχνεύθηκε με μαγνητική τομογραφία, χρώση ανοσοϊστοχημείας και βιοχημικές αξιολογήσεις. Επιπλέον, η FPN, ως η μόνη γνωστή πολυδιαμεμβρανική πρωτεΐνη εξαγωγής σιδήρου σε κύτταρα θηλαστικών, αξιολογήθηκε με PCR. Οι τιμές ευαισθησίας, τα θετικά κύτταρα του DAB ενίσχυσαν τη χρώση του Perls και η περιεκτικότητα σε σίδηρο στον ιππόκαμπο αυξήθηκε στην ομάδα υποξίας και μειώθηκε στην ομάδα h-EGCG ενώ η έκφραση FPN έδειξε την αντίθετη τάση. Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η επαγόμενη από HAH συσσώρευση σιδήρου μπορεί να συμβεί μέσω της αναστολής της εκροής σιδήρου μέσω μείωσης της έκφρασης FPN.

Το MDA είναι το τελικό προϊόν της υπεροξείδωσης των λιπιδίων [32, 33] και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης υπεροξείδωσης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το οξειδωτικό στρες μπορεί να αυξηθεί με την αύξηση του υψομέτρου [34]. Η μελέτη μας αποκάλυψε επίσης ότι οι συγκεντρώσεις MDA αυξήθηκαν σημαντικά σε μεγάλα υψόμετρα. Επιπλέον, αναλύσαμε την έκφραση της Κασπάσης-3 και του BDNF. Η κασπάση-3 είναι ο πιο σημαντικός εκκινητής και εκτελεστής των τελικών ενζύμων διάσπασης και της απόπτωσης [35], ενώ το BDNF, ως νευροτροφίνη, που μπορεί να ρυθμίσει την επιβίωση και τη διαφοροποίηση των νευρώνων καθώς και να ενισχύσει τη συναπτική μετάδοση [36], προάγει την αναγέννηση. Οι Lin et al. ανέφερε ότι η υποξία μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα της κασπάσης-3 και να προκαλέσει απόπτωση στους νευρώνες του ιππόκαμπου [37]. Οι Lee et al. ανέφερε ότι μετά από 3 λεπτά σφαιρικής ισχαιμίας στο γερβίλο, το EGCG απέτρεψε τον επαγόμενο από ισχαιμία θάνατο των κυττάρων του ιππόκαμπου [38]. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε επίσης ότι το EGCG μείωσε τα επίπεδα της προαποπτωτικής πρωτεΐνης, Κασπάση-3 και αύξησε την έκφραση του BDNF.

Η δομική βλάβη και η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων είναι σημαντικά παθολογικά χαρακτηριστικά στον εγκέφαλο υπό υποξία [39]. Στη μελέτη μας, η υπερδομική παρατήρηση ανίχνευσε την παρουσία βαθιάς χρώσης, μιτοχονδριακού οιδήματος και εξαφάνισης των κριστών στους νευρώνες του ιππόκαμπου υπό HAH, ενώ οι νευρώνες του ιππόκαμπου μετά τη θεραπεία με EGCG προστατεύτηκαν σημαντικά από αυτούς τους τραυματισμούς όπως η καρυοπύκνωση. Ο Iwona Zwolak συνόψισε ότι το EGCG μπορεί να προστατεύει από την τοξικότητα των βαρέων μετάλλων διατηρώντας το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και ενισχύοντας τις αντιοξειδωτικές και αναπνευστικές λειτουργίες των μιτοχονδρίων [40]. Υποπτευόμαστε ότι αυτοί οι μηχανισμοί μπορεί επίσης να υπάρχουν στον προστατευτικό ρόλο του EGCG στην έκθεση του εγκεφάλου στο περιβάλλον HAH. Συμπερασματικά, το EGCG μπορεί να μειώσει τη συσσώρευση σιδήρου, να μειώσει τα επίπεδα οξειδωτικού στρες και την απόπτωση και να προάγει την αναγέννηση των νευρώνων, βελτιώνοντας έτσι τη βλάβη του εγκεφάλου του αρουραίου που προκαλείται από τη χρόνια έκθεση σε υποξία σε μεγάλο υψόμετρο. Ως εκ τούτου, έχει τη δυνατότητα να χρησιμεύσει ως ένα νέο φάρμακο για τη θεραπεία και την πρόληψη της χρόνιας ασθένειας του βουνού.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να εκφράσουμε την ειλικρινή μας ευγνωμοσύνη στις Βασικές Εγκαταστάσεις του Νοσοκομείου Δυτικής Κίνας, στο Πανεπιστήμιο Σιτσουάν, στο Τσενγκντού, Κίνα, που μας παρείχαν τις εγκαταστάσεις και τη βοήθεια, όπως η δοκιμή ανοιχτού πεδίου και η δοκιμή λαβύρινθου νερού Morris που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Οι CC και HC συνέλαβαν, σχεδίασαν και εκτέλεσαν επίσης αυτή τη μελέτη. Η CC επεξεργάστηκε τα δεδομένα και συνέταξε το χειρόγραφο. Ο JC τροποποίησε το χειρόγραφο. Οι BL, BH, YW, DZ και YQ βοήθησαν στην εκτέλεση των πειραμάτων και ο FG ήταν υπεύθυνος για όλες τις διαδικασίες.

Χρηματοδότηση

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αριθ. 81930046, 81771800 και 81829003).

Διαθεσιμότητα δεδομένων

Τα σύνολα δεδομένων που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια ή/και αναλύονται κατά τη διάρκεια της τρέχουσας μελέτης είναι διαθέσιμα από τον αντίστοιχο συγγραφέα κατόπιν εύλογου αιτήματος.

Δηλώσεις

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δεν έχουν σχετικά οικονομικά ή μη συμφέροντα προς αποκάλυψη.

Ηθική Έγκριση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι. Η έγκριση χορηγήθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Πειραματικών Ζώων του Νοσοκομείου Δυτικής Κίνας, Πανεπιστήμιο Sichuan, Chengdu, Κίνα.

Ανοιχτή πρόσβαση

Αυτό το άρθρο αδειοδοτείται με άδεια Creative Commons Attribution 4.0 Διεθνής Άδεια, η οποία επιτρέπει τη χρήση, την κοινή χρήση, την προσαρμογή, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο ή μορφή, αρκεί να αποδίδετε τα κατάλληλα εύσημα στον αρχικό δημιουργό ) και την πηγή, δώστε έναν σύνδεσμο προς την άδεια Creative Commons και υποδείξτε εάν έγιναν αλλαγές. Οι εικόνες ή άλλο υλικό τρίτων σε αυτό το άρθρο περιλαμβάνονται στην άδεια Creative Commons του άρθρου, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά σε ένα πιστωτικό όριο για το υλικό. Εάν το υλικό δεν περιλαμβάνεται στην άδεια Creative Commons του άρθρου και η χρήση για την οποία προορίζεται δεν επιτρέπεται από νομοθετική ρύθμιση ή υπερβαίνει την επιτρεπόμενη χρήση, θα χρειαστεί να λάβετε άδεια απευθείας από τον κάτοχο των πνευματικών δικαιωμάτων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Jain V (2016) Τροφή για τον εγκέφαλο σε μεγάλο υψόμετρο. Adv Neurobiol 12:307– 321. https://doi.org/10.1007/978-3-319-28383-8_16

2. Singh LC (2017) Δερματολογία μεγάλου υψομέτρου. Indian J Dermatol 62:59–65. https://doi.org/10.4103/0019-5154.198050

3. Shi J, Wang J, Zhang J, Li X, Tian X, Wang W, Wang P, Li M (2020) Ο πολυσακχαρίτης που εξάγεται από την Potentilla anserina L βελτιώνει την οξεία υποβαρική υποξία που προκαλείται από την εγκεφαλική βλάβη σε αρουραίους. Phytother Res 34:2397–2407. https://doi.org/10.1002/ptr.6691

4. Leon-Velarde F, Maggiorini M, Reeves JT, Aldashev A, Asmus I, Bernardi L, Ge RL, Hackett P, Kobayashi T, Moore LG, Penaloza D, Richalet JP, Roach R, Wu T, Vargas E, Zubieta -Castillo G, Zubieta-Calleja G (2005) Συναινετική δήλωση για χρόνιες και υποξείες ασθένειες μεγάλου υψομέτρου. High Alt Med Biol 6:147–157.https://doi.org/10.1089/ham.2005.6.147

5. Villafuerte FC, Corante N (2016) Χρόνια ασθένεια του βουνού: κλινικές πτυχές, αιτιολογία, διαχείριση και θεραπεία. High Alt Med Biol 17:61–69. https://doi.org/10.1089/ham.2016.0031

6. Germuska M, Chandler HL, Stickland RC, Foster C, Fasano F, Okell TW, Steventon J, Tomassini V, Murphy K, Wise RG (2019) Dual-calibrated fMRI μέτρηση του απόλυτου εγκεφαλικού μεταβολικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου και αποτελεσματική διαχυτικότητα οξυγόνου. Neuroimage 184:717-728. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2018. 09.035

7. Maiti P, Singh SB, Mallick B, Muthuraju S, Ilavazhagan G (2008) Η εξασθένηση της μνήμης σε μεγάλο υψόμετρο οφείλεται σε νευρωνική απόπτωση στον ιππόκαμπο, τον φλοιό και το ραβδωτό σώμα. J Chem Neuroanat 36:227– 238. https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2008.07.003

8. Turner CE, Barker-Collo SL, Connell CJ, Gant N (2015) Η οξεία αναπνοή με υποξικό αέριο βλάπτει σοβαρά τη γνώση και τη μάθηση εργασιών στους ανθρώπους. Physiol Behav 142:104–110. https://doi.org/10. 1016/j.physbeh.2015.02.006

9. McMorris T, Hale BJ, Barwood M, Costello J, Corbett J (2017) Επίδραση της οξείας υποξίας στη γνωστική λειτουργία: μια συστηματική ανασκόπηση και ανάλυση μετα-παλινδρόμησης. Neurosci Biobehav Rev 74:225–232.https://doi.org/10.1016/j.neubiorev.2017.01.019

10. Wilson MH, Newman S, Imray CH (2009) Οι εγκεφαλικές επιδράσεις της ανάβασης σε μεγάλα υψόμετρα. Lancet Neurol 8:175–191. https://doi. org/10.1016/S1474-4422(09)70014-6

11. Hu S, Shi J, Xiong W, Li W, Fang L, Feng H (2017) Η διέγερση με οξιρακετάμη ή ταχυκαρδία μειώνει τη γνωστική βλάβη σε μεγάλο υψόμετρο. Brain Behav 7:e00762. https://doi.org/10.1002/brb3.762

12. Zhang XY, Zhang XJ, Xv J, Jia W, Pu XY, Wang HY, Liang H, Zhuoma L, Lu DX (2018) Η κροσίνη εξασθενεί τα γνωστικά ελλείμματα των αρουραίων που προκαλούνται από την οξεία υποβαρική υποξία. Eur J Pharmacol 818:300-305. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2017.10.042

13. Graham HN (1992) Σύνθεση πράσινου τσαγιού, κατανάλωση και χημεία πολυφαινόλης. Prev Med 21:334–350. https://doi.org/10. 1016/0091-7435(92)90041-f 14. Musial C, Kuban-Jankowska A, Gorska-Poniowska M (2020) Ευεργετικές ιδιότητες κατεχινών πράσινου τσαγιού. Int J Mol Sci. https:// doi.org/10.3390/ijms21051744

15. Eng QY, Thanikachalam PV, Ramamurthy S (2018) Μοριακή κατανόηση της γαλλικής επιγαλλοκατεχίνης (EGCG) σε καρδιαγγειακές και μεταβολικές ασθένειες. J Ethnopharmacol 210:296-310.

For more information:1950477648nn@gmail.com