Το ELOVL2 προάγει την εξέλιξη του καρκίνου αναστέλλοντας την κυτταρική απόπτωση στο νεφρικό καρκίνωμα

edmund.chen@wecistanche.com

Αφηρημένη. ΝεφρώνΤο κυτταρικό καρκίνωμα (RCC) είναι μια επιθετική κακοήθεια του ουρογεννητικού συστήματος που έχει συσχετιστεί με κακή πρόγνωση, ιδιαίτερα σε ασθενείς με μετάσταση, με κύριους υποτύπους του να είναι διαυγών κυττάρων RCC(ccRCC), θηλώδες PCC(pRCC) και χρωμοφοβικό RCC(chRCC). Η παρουσία ενδοκυτταρικών σταγονιδίων λιπιδίων (LDs) θεωρείται ότι είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα του ccRCC. Η σημασία του αλλοιωμένου μεταβολισμού λιπιδίων στο ccRCC έχει αναγνωριστεί ευρέως. Η επιμήκυνση λιπαρού οξέος πολύ μακράς αλυσίδας (ELOVL) καταλύει την επιμήκυνση των λιπαρών οξέων (FAs), ρυθμίζοντας τη λιπιδική σύνθεση και απαιτείται για φυσιολογικές σωματικές λειτουργίες. Ωστόσο, η συμμετοχή των ελονγκασών στο RCC παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, εξετάστηκε η έκφραση του ELOVL2 σε ccRCC. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα επτά ELOVLisozymes σε πρωτοπαθείς όγκους. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυξημένα επίπεδα έκφρασης ELOVL2 παρατηρήθηκαν σε ccRCC, καθώς και σε pRCC και chRCC. Επιπλέον, ένα υψηλότερο επίπεδο ELOVL2 συσχετίστηκε σημαντικά με την αυξημένη συχνότητα κακής πρόγνωσης ασθενών με ccRCC και pRCC. Η διαμεσολάβηση CRISPR/Cas9-του ELOVL2 είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της επιμήκυνσης των πολυακόρεστων FA μακράς αλυσίδας και την αύξηση της παραγωγής LD σενεφρώνκαρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, η κατάλυση ELOVL2 είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω της επαγωγής απόπτωσης in vitro και της εξασθένησης της ανάπτυξης του όγκου in vivo. Συνολικά, η παρούσα μελέτη παρέχει νέα εικόνα για τους μηχανισμούς πολλαπλασιασμού των όγκων που περιλαμβάνουν μεταβολισμό λιπιδίων και προτείνει ότι το ELOVL2 μπορεί να είναι ένας ελκυστικός νέος στόχος για τη θεραπεία RCC.

Λέξεις-κλειδιά:καρκίνωμα νεφρού, σταγονίδιο λιπιδίων, κυτταρικός πολλαπλασιασμός, νεφρός, νεφρός

Εισαγωγή

Το νεφρικό καρκίνωμα (RCC) είναι μια κοινά συναντώμενη και θανατηφόρα κακοήθεια, που ευθύνεται για το ~2 τοις εκατό όλων των περιπτώσεων καρκίνου και των σχετικών θανάτων παγκοσμίως (1), με κύριους υποτύπους του διαυγούς κυττάρου RCC (ccRCC), θηλώδη PCC (pRCC) και χρωμοφοβικό RCC (RCC). Από όλους τους υποτύπους RCC, το ccRCC είναι η πιο κοινή ιστολογική εκδήλωση και η παθογένειά του χαρακτηρίζεται από τη συστατική ενεργοποίηση παραγόντων που προκαλούν υποξία (HIFs) λόγω της απώλειας λειτουργίας στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο von Hippel-Lindau (VHL). (1). Έχουν αναπτυχθεί διάφορες στοχευμένες θεραπείες κατά του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) ή του στόχου θηλαστικών της σηματοδότησης ραπαμυκίνης (mTOR) και των αναστολέων του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου για μεταστατική νόσο. Ωστόσο, η εξέλιξη της νόσου είναι αναπόφευκτη στην πλειοψηφία των ασθενών (1,2).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΡΥΣΗ

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του ccRCC είναι η αφθονία των ενδοκυτταρικών σταγονιδίων λιπιδίων (LDs), που αποτελούνται από έναν ουδέτερο πυρήνα λιπιδίων που περιέχει τριγλυκερίδια (TGs) και εστέρες χοληστερόλης (CEs) που περιβάλλονται από μια μονοστιβάδα φωσφολιπιδίων (3). Τα LDs είναι δυναμικά οργανίδια υπεύθυνα για την πρόσληψη λιπιδίων και αποθήκευσης και χρησιμοποιούνται για τη διατήρηση της ομοιόστασης, τη διευκόλυνση της παραγωγής ενέργειας και την προστασία από διάφορους τύπους στρες ή για τη διατήρηση της βιογένεσης της μεμβράνης κατά την ταχεία ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε διάφορους τύπους καρκίνου (4). Στην πραγματικότητα, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα LDs συμβάλλουν στο ccRCC εξέλιξη (5,6).

Τα λιπαρά οξέα (FAs) που αποτελούν το κύριο συστατικό των λιπιδίων έχει αναφερθεί ότι χρησιμεύουν ως υποστρώματα για αποθήκευση ενέργειας, σύνθεση μεμβράνης και παραγωγή μορίων σηματοδότησης. Η επιμήκυνση και ο αποκορεσμός είναι κεντρικά στάδια της σύνθεσης των FA μακράς αλυσίδας (LC-FAs), το μήκος και ο βαθμός ακόρεστου είναι καθοριστικοί παράγοντες της λειτουργίας FA και της μεταβολικής μοίρας (7). Stearoyl-CoA δεσατουράση 1 (SCD1), μέλος της οικογένειας των λιπαρών ακυλοδεσατουρασών, έχει μελετηθεί εκτενώς στο ccRCC(6.8.9). Έχει αποδειχθεί ότι η αυξημένη έκφραση SCD1 υποστηρίζει τη βιωσιμότητα, ενώ ένας αναστολέας μικρού μορίου SCD1 (A939572) έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στο ccRCC(8.9). Εξάλλου. Οι Yang et al (10) απέδειξαν ότι η πρωτεΐνη 1 που δεσμεύει το στοιχείο ρυθμιστικής στερόλης (SREBP1) προώθησε τον αποκορεσμό των λιπιδίων μέσω της δεσατο-ουράσης FA οξέος 1 (FADSI) πριν από την ενεργοποίηση της σηματοδότησης NF-xB για την προώθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ccRCC. Ωστόσο, τυχόν πιθανοί ρόλοι των ελονγκασών στο RCC παραμένουν ασαφείς.

Έχει αναφερθεί ότι, στα θηλαστικά, οι αρχικές και οι ελεγχόμενες από τον ρυθμό αντιδράσεις συμπύκνωσης FA καταλύονται από μια οικογένεια ενζύμων ελονγκάσης που αναφέρεται ως επιμήκυνση FAs πολύ μακράς αλυσίδας (ELOVL). Μέχρι σήμερα, έχουν εντοπιστεί επτά μέλη ELOVL, τα οποία μπορούν γενικά να χωριστούν σε αυτά που είναι ειδικά για κορεσμένα και μονοακόρεστα FA (ELOVL1, ELOVL3, ELOVL6 και ELOVL7) ή για πολυακόρεστα FAs (PUFAs, ELOVL2, ELOVL4 και ELOVL5). Οι Lucarelli et al (9) αποκάλυψαν σημαντική συσσώρευση PUFAs και αυξημένη έκφραση των ELOVL2 και ELOVL5 σε ccRCC. Αξίζει να σημειωθεί ότι έχει αποδειχθεί ότι το συστηματικό εικοσιδυοεξανοϊκό οξύ (DHA) παράγεται ενδογενώς και ελέγχει τη de novo λιπογένεση, ενώ ρυθμίζει επίσης την αποθήκευση λιπιδίων με τρόπο ανεξάρτητο από τον μεταγραφικό παράγοντα 1 που δεσμεύει το στοιχείο στερόλης (SREBPF1), λόγω της κατάλυσης ELOVL2 ποντίκια (11). Επιπλέον, η υπερέκφραση ELOVL2 έχει αποδειχθεί ότι προάγει τη συσσώρευση LD με ενισχυμένη πρόσληψη FA τόσο στα κύτταρα προλιποκυτταρικής σειράς 3T3-LI όσο και στα κύτταρα F442A(12). Προηγούμενες in vitro μελέτες, με DHA, που χορηγήθηκε εξωγενώς για καρκινικά κύτταρα. έχουν αποδείξει ότι το DHA ασκεί αντιογκογόνο, αντιφλεγμονώδη και προ-αποπτωτική δράση στα καρκινικά κύτταρα (13-15). Ωστόσο, οποιοσδήποτε πιθανός ρόλος του ELOVL2 στην εξέλιξη του ccRCC μέσω της ρύθμισης του μεταβολισμού των λιπιδίων παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητος.

Στην παρούσα μελέτη, οι ρόλοι της προόδου ELOVL2 inccRCC διερευνήθηκαν πραγματοποιώντας το μεταγραφικό προφίλ πρωτογενούς ccRCC και φυσιολογικούνεφρόδείγματα, αποκαλύπτοντας ότι το ELOVL2 υπερεκφράζεται σε ccRCC και υπερεκπροσωπείται μεταξύ των ισοενζύμων ELOVL. Αξίζει να σημειωθεί ότι το ELOVL2 υπερεκφράστηκε επίσης σε ccRCC, καθώς και σε pRCC και RCC, γεγονός που σχετίζεται σημαντικά με κακή πρόγνωση ασθενών με CCR CCR pRCC. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η αναστολή του ELOVL2 επηρεάζει τον μεταβολισμό των λιπιδίων και καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της προαγωγής της απόπτωσης, τουλάχιστον εν μέρει μέσω της διαταραχής της ομοιόστασης του ενδοπλασματικού δικτύου (ER)καρκίνο του νεφρούκύτταρα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης πρότειναν ότι το ELOVL2 μπορεί να είναι ένας πιθανός νέος θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία RCC.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

Υλικά και μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές και καλλιέργειες. Οι κυτταρικές σειρές 293T (RCB2202) και OS-RC-2 (RCB0735) αγοράστηκαν από το RIKEN BioResource Center, ενώ κυτταρικές σειρές 786-O και ACHN αγοράστηκαν από την ATCC. Τα κύτταρα SK‑RC‑52 ήταν ένα ευγενικό δώρο από τον DrJ.G.Old (Memorial Sloan Kettering Cancer Center). Κυτταρική σειρά RPTEC, η οποία προέρχεται από επιθηλιακά κύτταρα του ανθρώπουνεφρώνεγγύς σωληνάριο, αγοράστηκε από την Lonza Group, Ltd. (CC‑2553). Τα κύτταρα ACHN, 786‑O, SK‑RC‑52 και OS‑RC‑2 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI‑1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό ορό βοοειδών (FBS) στους 37˚C με 5 τοις εκατό υγροποιημένη ατμόσφαιρα CO2. Τα κύτταρα 293Τ καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) στους 37°C με 5 τοις εκατό υγροποιημένη ατμόσφαιρα CO2. Τα κύτταρα RPTEC καλλιεργήθηκαν σενεφρώνμέσο ανάπτυξης επιθηλίου (REGM™) Bulletkit™ (CC‑3190; Lonza Bioscience) στους 37˚C με 5 τοις εκατό υγροποιημένη ατμόσφαιρα CO2.

Ασθενείς και δείγματα ccRCC. RCC ιστοί και παρακείμενοι φυσιολογικοίνεφρόιστοί από 46 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζικές ή μερικές νεφρεκτομές ελήφθησαν από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Tsukuba, μεταξύ 2006 και 2015 σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Tsukuba (αρ. έγκρισης H28-104). Όλοι οι ασθενείς παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση πριν υποβληθούν σε χειρουργική επέμβαση. Τα στάδια του όγκου εκχωρήθηκαν σύμφωνα με τη σταδιοποίηση TNM της Ένωσης για τον Διεθνή Ελέγχο Καρκίνου (16). Οι παθολογικοί βαθμοί ταξινομήθηκαν, σύμφωνα με το σύστημα βαθμολόγησης Fuhrman τεσσάρων επιπέδων (17). Όλα τα χαρακτηριστικά του ασθενούς συνοψίζονται στον πίνακα SI RNA εκχύλιση και σύνθεση cDNA. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τους κατεψυγμένους ιστούς καινεφρώνκαρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Μετά τον καθαρισμό RNA, το RNA στη συνέχεια μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ αντίστροφης μεταγραφής cDNA υψηλής χωρητικότητας (αρ. κατ. 4368814; Thermo Fisher Scientific, Inc.), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Αντίστροφη μεταγραφή-ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT‑qPCR). Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μηχανή PCR 7500 Fast Real-Time PCR με Fast SYBR-Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Οι συνθήκες κύκλου ήταν οι εξής: Αρχική διατήρηση στους 95˚C για 20 δευτερόλεπτα, 40 κύκλοι στους 95˚C για 3 δευτερόλεπτα και στους 60˚C για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από μια καμπύλη τήξης που κυμαίνεται από 95˚C για 15 δευτερόλεπτα έως 60˚ C για 1 λεπτό. Ως εσωτερικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η υποξανθινο φωσφοριβοσυλτρανσφεράση 1 (HPRT1). Όλες οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα SII. Προκειμένου να αξιολογηθούν τα γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των προαποπτωτικών γονιδίων, πρωτεΐνη X που σχετίζεται με Bcl-2 (BAX), Bcl-2 ομόλογος ανταγωνιστής/δολοφόνος (BAK), φορβόλη-12-μυριστικός-13- Αναλύθηκαν η πρωτεΐνη 1 (PMAIP1/NOXA) που προκαλείται από οξικό άλας και ο ρυθμιστής της απόπτωσης με ρ53 προς τα πάνω (BBC3/PUMA) και του αντιαποπτωτικού γονιδίου BCL2 και του γονιδίου πρωτεΐνης διαφοροποίησης των κυττάρων της επαγόμενης μυελογενούς λευχαιμίας (MCL1). Τα σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2‑ΔΔCq (18).

Ανάλυση Western blot. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (19). Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 τοις εκατό SDS και αναστολέας πρωτεάσης) και υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στο 1,000 xg για 20 λεπτά στους 4°C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν ως δείγματα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προσδιορισμού Quick Start Bradford Protein (αρ. κατ. 5000202JA, Bio-Rad Laboratories, Inc.). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε 10 τοις εκατό SDS-PAGE και τα διαχωρισμένα προϊόντα μεταφέρθηκαν στη συνέχεια σε μεμβράνες PVDF.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ

Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με παράγοντα αποκλεισμού ECL Prime (αρ. κατ. RPN418V, Cytiva) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C με τα ακόλουθα αντισώματα: Αντι-σερίνη/θρεονινο-πρωτεϊνική κινάση/ενδοριβονουκλεάση ινοσιτόλη που απαιτεί ένζυμο 1 (anti-IRE1; 1:200; #3294, Technology, Cell Signal), αντιφωσφορυλιωμένη IRE1 (anti‑p‑IRE1; 1:200; NB100‑2323, Novus Biologicals, LCC), ομόλογη πρωτεΐνη anti‑C/EBP (anti‑CHOP; 1:200; MA1‑250 Scientificr, The .). Αντι-κουνελιού ή ανοσοσφαιρίνης ποντικού G HRP, ολόκληρο το Ab γαϊδουριού (αρ. κατ. NA934V, NA931VS; GE Healthcare; Cytiva) χρησιμοποιήθηκαν στο 1:10,000 ως δευτερεύοντα αντισώματα. Οι κηλίδες western οπτικοποιήθηκαν με ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) χρησιμοποιώντας έναν απεικονιστή Fujifilm LAS‑4000 και LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). Η -ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος (1:10.000, αρ. κατ. A5316, Sigma-Aldrich).

Βιοπληροφορική ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Τα δεδομένα κλινικής και αλληλουχίας RNA (RNA-seq) πρωτογενών όγκων που συλλέχθηκαν από ασθενείς με RCC στη βάση δεδομένων The Cancer Genome Atlas (TCGA) λήφθηκαν από την πύλη δεδομένων Genomic Data Commons (GDC) (20). Εξετάστηκαν συνολικά 1.005 δείγματα (880 ασθενείς και 125 μάρτυρες), συμπεριλαμβανομένων 530 ασθενών και 71 δειγμάτων ελέγχου για τηννεφρός νεφρόςκοόρτη διαυγών κυττάρων καρκινώματος (KIRC; ccRCC), 286 ασθενείς και 31 υγιή δείγματα για τον τράχηλο της μήτραςνεφρός νεφρόςκοόρτη καρκινώματος θηλωδών κυττάρων (KIRP; pRCC) και 64 νοσούντα και 23 υγιή δείγματα για την κοόρτη χρωμοφοβικών νεφρών (KICH; chRCC). Η έκφραση του γονιδίου ELOVL2 στα δείγματα καρκίνου του ουρογεννητικού συστήματος αναλύθηκε με τη χρήση της βάσης δεδομένων Gene Expression of Normal and Tumor tissues (GENT2). Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης λήφθηκαν από το δημόσιο χώρο αποθήκευσης γονιδιακής έκφρασης omnibus (GEO) της πλατφόρμας U133 Plus 2 (GPL570) (http://gent2.appex.kr/gent2/) (21).

Πλασμίδια και φακοϊική μεταγωγή. Μικρά RNA φουρκέτας (shRNAs) για ELOVL2 που χαρακτηρίστηκαν σε προηγούμενες μελέτες (22,23) υποκλωνοποιήθηκαν στον φακοϊικό φορέα pLKO.1 (πλασμίδιο #8453, Addgene, Inc.). Οι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται στην κατασκευή του φορέα shRNA παρατίθενται στον Πίνακα SIII. Οι φακοϊοί δημιουργήθηκαν σε κύτταρα 293Τ με συν-επιμόλυνση τεσσάρων πλασμιδίων σε trans, συμπεριλαμβανομένου του φορέως φακού (pLKO-shControl ή pLKO-shELOVL2), pMDLg/pRRE (πλασμίδιο #12251; Addgene, Inc.), pRSV3‑Rev2 (πλασμίδιο #12Rev2). Addgene, Inc.), και pMD2.G (πλασμίδιο #12259, Addgene, Inc.) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine 2000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Στις 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα υπερκείμενα που περιείχαν ιό συλλέχθηκαν και διηθήθηκαν μέσω φίλτρου 0,45 μm για μόλυνση. Για ιικές μεταγωγές, οι φακοϊοί pLKO‑shControl ή pLKO‑shELOVL2 επωάστηκαν με τα κύτταρα 786‑O, ACHN και SK‑RC‑52 κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 37˚C σε επωαστήρα υγροποιημένης κυτταροκαλλιέργειας. Τα κύτταρα επιλέχθηκαν παρουσία πουρομυκίνης 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Για να σταθεροποιηθούν οι υποκλώνοι, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο με πουρομυκίνη για 1 μήνα στους 37°C σε υγροποιημένο επωαστήρα κυτταροκαλλιέργειας και χρησιμοποιήθηκαν οι επιζώντες δεξαμενές για αναλύσεις έκφρασης και πολλαπλασιασμού.

Για πειράματα υπερέκφρασης, τα κύτταρα OSRC-2 επιμολύνθηκαν με κενό φορέα pCMV6 (πλασμίδιο #PS100001; Origene Technologies, Inc.) ή pCMV6‑ELOVL2 (πλασμίδιο #RC209232; Origene Technologies, Inc.) σε κύτταρο 37 ˚C. θερμοκοιτίδα, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine 3000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τις ενδεικνυόμενες δοκιμασίες 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Σχεδιασμός και κλωνοποίηση CRISPR/Cas9. Το πλασμίδιο pX330‑U6‑Χιμερικό_BB‑CBh‑hSpCas9 (pX330) ήταν δώρο από τον Feng Zhang (Addgene, Inc.; πλασμίδιο #42230) (24). Οι αλληλουχίες απλού οδηγού CRISPR (sg) για το ELOVL2 στοχεύτηκαν ειδικά στο εξόνιο 2 (sgELOVL2 #1) και το εξόνιο 3 (sgELOVL2 #2 και #3) του ELOVL2 χρησιμοποιώντας το Εργαλείο Σχεδιασμού CRISPR (GE Healthcare Dharmacon, Inc.;‑discovery.com/gene‑editing/crispr‑cas9/crispr‑design‑tool/), πριν από την κλωνοποίηση στο pX330. Η ακολουθία καθοδήγησης CRISPR για τον έλεγχο ενός οδηγού (sgControl) είχε σχεδιαστεί προηγουμένως (25). Οι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες των RNA μονού οδηγού (sgRNAs) παρατίθενται στον Πίνακα SIII

Τα κύτταρα ACHN στη συνέχεια σπάρθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων (1,4x105 κύτταρα/φρεάτιο) και συν-επιμολύνθηκαν 2 ώρες αργότερα με 2 μg sgRNA που εκφράζονται στο pX330 και 0,2 μg pCI-neo φορέα (Promega Corporation; αρ. κατ. E1841) στους 37˚C σε επωαστήρα υγροποιημένης κυτταροκαλλιέργειας, χρησιμοποιώντας FuGENE HD (Promega Corporation, αρ. κατ. E2312). Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, εφαρμόστηκαν 400 μg/ml G418 για 7 έως 10 ημέρες και τα κύτταρα αφέθηκαν να ανακάμψουν για 2 ή 3 ημέρες. Όταν τα κελιά πλησίαζαν τη συρροή, επανασπάρθηκαν αραιά σε δίσκους 10 cm. Μετά από 2 ή 3 εβδομάδες, απομονώθηκαν ευδιάκριτες αποικίες με χρήση δίσκων κλωνοποίησης (MilliporeSigma, αρ. κατ. Z374431-100EA). Οι μεμονωμένοι κλώνοι επεκτάθηκαν και αξιολογήθηκαν ως προς την κατάσταση νοκ-άουτ με αλληλουχία Sanger για την περιοχή στόχο.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Δοκιμασίες κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTT με κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και προστέθηκαν 10 μl WST-8 μετά από 72 ώρες. Το OD460 μετρήθηκε μετά από επώαση 1 ώρας στους 37 °C. Υποδόρια ξενομόσχευμα. BALB/c γυμνά (nu/nu) θηλυκά ποντίκια (n=12, ηλικίας 6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Charles River Laboratories, Inc. h κύκλος φωτός/σκότους, με ad libitum πρόσβαση σε τροφή και νερό. Για δοκιμές υποδόριου ξενομοσχεύματος, 1x107 κύτταρα εναιωρημένα σε 100 μl PBS εγχύθηκαν υποδορίως στη δεξιά πλευρά με χρήση βελόνας 24G και οι όγκοι του όγκου μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον τύπο: mm3=μήκος x πλάτος x ύψος x 0,52 (26). Μετά από 90 ημέρες, όλα τα ζώα θυσιάστηκαν και οι όγκοι του ξενομοσχεύματος αφαιρέθηκαν. Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με 2 τοις εκατό ισοφλουράνιο πριν υποβληθούν σε ευθανασία με εξάρθρημα του τραχήλου της μήτρας

Δείγματα των όγκων του ξενομοσχευμένου με φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) κόπηκαν σε τομές πάχους 4 μm, πριν από την αποπαραφίνη και την επανυδάτωση. Για την ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φούρνο μικροκυμάτων για 21 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού οξέος. Μετά τη διαδικασία ανάκτησης αντιγόνου, η δραστηριότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης μπλοκαρίστηκε με 3 τοις εκατό H2O2 για 25 λεπτά και οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με αντίσωμα Ki-67 (1:200; Dako; Agilent Technologies, Inc.; M7240) στους 4˚C όλη τη νύχτα. Η ανοσοϊστοχημική αντίδραση οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το δευτερεύον αντίσωμα Histofine Simple Stain ΜΑΧ ΡΟ® (Nichirei Biosciences, Inc., αρ. κατ. 424151) χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη ως χρωμογόνο. Όλες οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Πειραμάτων με Ζώα του Πανεπιστημίου της Τσουκούμπα και όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του Κανονισμού Πειραμάτων σε Ζώα του Πανεπιστημίου της Τσουκούμπα (αρ. έγκρισης 20-370). Δοκιμασίες απόπτωσης. Η απόπτωση αξιολογήθηκε με χρήση του συστήματος ανάλυσης Caspase-Glo® 3/7 (Promega Corporation, αρ. κατ. G8090), κιτ χρώσης Annexin-V-FLUOS (Roche Diagnostics; αρ. κατ. 11858777001) και JCcho-Membrantial Κιτ ανάλυσης (Cayman Chemical Company, αρ. κατ. 10009172), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Χρώση LDs. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες σε τρυβλία 60mm και καλλιεργήθηκαν με μέσο που περιείχε ελαϊκό οξύ (200 μΜ)‑ στους 37°C όλη τη νύχτα σε επωαστήρα 5 τοις εκατό CO 2. Το μέσο στη συνέχεια αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS πριν από τη σταθεροποίηση με 4 τοις εκατό φορμαλδεΰδη (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν με 0.5 μΜ Lipi-Green (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 37°C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες χρησιμοποιώντας VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium με DAPI (Vector Laboratories, Inc., αρ. κατ. Η-1200). Οι εικόνες των χρωματισμένων κυττάρων αποκτήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού BZ-X710 (Keyence Corporation). Ζωντανά κύτταρα επωάστηκαν με 0,5 μΜ Lipi-Green σε Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) για 30 λεπτά πριν από την πλύση δύο φορές σε HBSS, επαναιωρήθηκαν σε 1 mM EDTA/PBS (ρΗ 8,0) με 0,5 τοις εκατό BSA και πέρασαν μέσω κυτταρικού φίλτρου . Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο ροής Gallios (Beckman-Coulter, Inc.) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo v10 (FlowJo LLC).

Χρώση ιχνηλάτη ER. Τα κύτταρα ACHN (ACHN/sgControl, ACHN/sgELOVL2‑1 και ACHN/sgELOVL2‑2) σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες σε δίσκους 6{{2{0}}‑mm και καλλιεργήθηκαν στους 37˚C για 48 ώρες σε έναν επωαστήρα 5 τοις εκατό CO 2. Στη συνέχεια, το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με HBSS πριν από τη σταθεροποίηση με φορμαλδεΰδη 4 τοις εκατό (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με HBSS και επωάστηκαν με 500 ηΜ ER Tracker Red (Thermo Fisher Scientific, Inc., αρ. κατ. E34250) για 2 ώρες στο σκοτάδι στους 37°C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες. Οι εικόνες των χρωματισμένων κυττάρων αποκτήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού BZ-X710 (Keyence Corporation). Ζωντανά κύτταρα επωάστηκαν με 500 nM ER Tracker σε HBSS για 30 λεπτά πριν από την πλύση δύο φορές σε HBSS, επαναιωρήθηκαν σε 1 mM EDTA/PBS (ρΗ 8,0) με 0,5 τοις εκατό BSA, και πέρασαν μέσω ενός φίλτρου κυττάρων. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο ροής Gallios και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo v10.

Αέρια χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (GC-MS). Η εκχύλιση των ολικών λιπιδίων από κυτταρικά σφαιρίδια πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (27). Πραγματοποιήθηκε η υδρόλυση και η παραγωγοποίηση των εκχυλισμάτων σε μεθυλεστέρες FA (FAMEs). Για τα εσωτερικά πρότυπα των συζευγμένων FA, C20:4 (ω‑6), C20:5 (ω‑3), C22:5 (ω‑6), C22:5 (ω‑3) και C22 :6 (ω‑3) Τα FAME αγοράστηκαν από την MilliporeSigma ή την Cayman Chemical Company. Η ανάλυση GC-MS πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα GCMS-TQ8040 (Shimadzu Corporation) με μια στήλη τριχοειδούς GC Omegawax® (MilliporeSigma, αρ. κατ. 24136). Η διαβάθμιση θερμοκρασίας αρχικά αυξήθηκε από 70 σε 150˚C με ρυθμό 20˚C ανά λεπτό και από 150 σε 280˚C με ρυθμό 8˚C ανά λεπτό πριν μειωθεί από 280 σε 200˚C με ρυθμό 15. ˚C ανά λεπτό. Η έγχυση του δείγματος πραγματοποιήθηκε χωρίς διαχωρισμό με 1,0 μl δείγματος που εγχύθηκε. Για ανάλυση MS, η πηγή ιόντων και η θερμοκρασία διεπαφής ορίστηκαν στους 200˚ και 270˚C, αντίστοιχα. Τα δεδομένα ελήφθησαν σε λειτουργία πλήρους σάρωσης (30-600 m/z) κάτω από 70 eV τάσης ιονισμού. Τα FAME αναγνωρίστηκαν σύμφωνα με το χρόνο κατακράτησης και το φάσμα ιοντισμού ηλεκτρονίων-MS (EI-MS) με τα πρότυπα αναφοράς FAME. Η σχετική ποσότητα των FAMEs υπολογίστηκε συγκρίνοντας τη μέση επιφάνεια κορυφής ανά μάζα δείγματος. Κάθε δείγμα μετρήθηκε ανεξάρτητα τρεις φορές.

Στατιστική ανάλυση. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό JMP 10 (SAS Institute, Inc.), GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) ή πακέτο R (έκδοση 4.0.2; RStudio, Inc.). Η σημασία των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο Student's t-test ή Mann-Whitney test. Η σημασία των διαφορών μεταξύ των τριών ή περισσότερων ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA με συγκρίσεις εκ των υστέρων χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Dunnett ή τη δοκιμή Kruskal-Wallis που ακολουθήθηκε από μια δοκιμασία Dunn's post hoc με διόρθωση Bonferroni. Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και η διαφορά μεταξύ των καμπυλών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή log-rank. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, μια ομάδα χαμηλής έκφρασης ή υψηλή έκφραση, χρησιμοποιώντας την αποκοπή των διάμεσων τιμών έκφρασης. Π<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Αποτελέσματα

Το ELOVL2 υπερεκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στο RCC. Η αφθονία επτά ισοενζύμων ELOVL σε αντίστοιχους φυσιολογικούς και όγκους ιστούς εξετάστηκε για πρώτη φορά στην παρούσα κοόρτη, αποκαλύπτοντας ότι τα επίπεδα έκφρασης ELOVL1, ELOVL2, ELOVL5 και ELOVL7 ήταν αυξημένα σε ιστούς ccRCC (Εικ. 1Α). Για την επικύρωση αυτών των αποτελεσμάτων, η έκφραση του γονιδίου του ισοενζύμου ELOVL σε αντίστοιχους φυσιολογικούς και όγκους ιστούς εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων TCGA (κοόρτη KIRC). Επιβεβαιώθηκε ότι η έκφραση του mRNA του ELOVL2 ήταν πιο πολύ και σημαντικά αυξημένη στους ιστούς ccRCC (Εικ. 1Β, P<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">

Τα επίπεδα έκφρασης ήταν σημαντικά αυξημένα στις κυτταρικές σειρές ACHN, 786-O και SK-RC-52, αν και τα επίπεδα έκφρασης mRNA στην κυτταρική σειρά OS-RC-2 ήταν χαμηλότερα σε σύγκριση με εκείνα της κυτταρικής σειράς RPTEC (Εικ. 1D) . Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η σχετιζόμενη με τον καρκίνο αλλοίωση της έκφρασης του γονιδίου ELOVL2 σε διάφορους τύπους καρκίνου χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων GENT2 (Εικ. 1Ε). Σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς, η έκφραση ELOVL2 βρέθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σενεφρό, καρκίνους του προστάτη, του πνεύμονα και του παχέος εντέρου, ενώ η έκφραση του ELOVL2 ήταν παρόμοια σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης ή του μαστού. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι ρόλοι των ισοενζύμων ELOVL διέφεραν ανάλογα με τον τύπο καρκίνου και ότι η υπερέκφραση του ELOVL2 μπορεί να σχετίζεται με την καρκινογένεση ή την εξέλιξη της νόσου του RCC, ιδιαίτερα του ccRCC.

Η υπερέκφραση ELOVL2 σχετίζεται με την εξέλιξη του RCC. Η συσχέτιση μεταξύ της γονιδιακής έκφρασης του ELOVL2 και των σταδίων μετάστασης κόμβου όγκου (TNM) στην κοόρτη KIRC εξετάστηκε, προκειμένου να διευκρινιστεί η κλινική σημασία του ELOVL2 στο ccRCC. Η έκφραση του ELOVL2 ήταν υψηλότερη σε τοπικά προχωρημένη και μεταστατική νόσο, αν και η έκφρασή του δεν συσχετίστηκε με την κατάσταση μετάστασης στους λεμφαδένες (Εικ. 2A-C). Συλλογικά, η έκφραση ELOVL2 αυξήθηκε σύμφωνα με το κλινικό στάδιο (Εικ. 2D). Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του ELOVL2 και της πρόγνωσης των ασθενών με RCC, προκειμένου να διευκρινιστεί η κλινική επίδραση του ccRCC. Σύμφωνα με την ανάλυση Kaplan-Meier, αποκαλύφθηκε ότι η υψηλή έκφραση του ELOVL2 συσχετίστηκε σημαντικά με κακή πρόγνωση στην παρούσα κοόρτη (P=0.0015, Εικ. 2Ε). Για την επικύρωση αυτών των αποτελεσμάτων, η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του ELOVL2 και της πρόγνωσης ασθενών με ccRCC εξετάστηκε περαιτέρω στην κοόρτη KIRC και αποδείχθηκε ότι, ομοίως, η υψηλή έκφραση του ELOVL2 συσχετίστηκε σημαντικά με κακή πρόγνωση (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">

Το ELOVL2 προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του νεφρού. Για να αξιολογηθεί η λειτουργία του ELOVL2 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων RCC, πραγματοποιήθηκε η καταστροφή shRNA του ELOVL2 σε κύτταρα 786-O, ACHN και SK-RC-52. Τα αποτελέσματα κάθε shRNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας RT-qPCR και επιβεβαιώθηκε σημαντική μείωση στην έκφραση του ELOVL2 (Εικ. 3Α). Στη συνέχεια διεξήχθησαν αναλύσεις ΜΤΤ για να εξεταστούν τα αποτελέσματα της καταστροφής του ELOVL2 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Παρατηρήθηκε ότι η καταστροφή του ELOVL2 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό όλων των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με το shRNA ελέγχου (Εικ. 3Β).

Αντίθετα, η υπερέκφραση ELOVL2 προκλήθηκε στα κύτταρα OS-RC-2, μια κυτταρική σειρά με χαμηλότερη βασική έκφραση του ELOVL2. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας RT‑qPCR και επιβεβαιώθηκε σημαντικά αυξημένη έκφραση του ELOVL2 (Εικ. 3C). Οι αναλύσεις MTT αποκάλυψαν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που υπερεκφράζουν το ELOVL2 προωθήθηκε σημαντικά, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 3D), υποδεικνύοντας ότι το ELOVL2 μπορεί να είναι προαγωγέας του πολλαπλασιασμούνεφρώνκαρκινικά κύτταρα.

Η κατάλυση ELOVL2 καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου in vivo, τη σύνθεση των PUFAs και την παραγωγή LDs σενεφρώνκαρκινικά κύτταρα. Για να διευκρινιστούν περαιτέρω οι ρόλοι του ELOVL2 στην εξέλιξη του RCC, δημιουργήθηκε μια κυτταρική σειρά ACHN ELOVL2-knockout, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα CRISPR/Cas9 (sgELOVL2-1 και sgELOVL2-2) (Εικ. S1). In vitro, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μειώθηκε σημαντικά με την κατάλυση ELVOVL2 στα κύτταρα ACHN (Εικ. S1). Το πιο σημαντικό είναι ότι η κατάλυση του ELOVL2 με τη μεσολάβηση CRISPR/Cas9 κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου όταν τα κύτταρα εμφυτεύτηκαν υποδόρια σε ποντίκια (Εικ. 4Α). Οι μέγιστοι όγκοι των όγκων υποδόριου ξενομοσχεύματος στο ACHN/μάρτυρα και στο ACHN/sgELOVL2-2 την ημέρα της θανάτωσης ήταν 241 και 109 mm3, αντίστοιχα. Αξίζει να σημειωθεί, ότι όλοι οι όγκοι ξενομοσχευμάτων στην ομάδα ACHN/sgELOVL2-1 υποχώρησαν αυθόρμητα στις 14 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση και δεν ανιχνεύθηκαν τη στιγμή της εκρίζωσης. Ο δείκτης Ki-67 εξετάστηκε επίσης στους όγκους ξενομοσχεύματος που διαμολύνθηκαν με μάρτυρα ή sgELOVL2 και παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα ACHN/sgELOVL2-2 εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερο δείκτη Ki-67 από τα κύτταρα ACHN/μάρτυρες (Εικ. 4B και C). . Αυτά τα αποτελέσματα υποστήριξαν περαιτέρω την πιθανότητα το ELOVL2 να αυξάνει την ανάπτυξη του όγκου in vivo. Καθώς το ELOVL2 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6p24.2 και κωδικοποιεί για μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη του ενδοπλασματικού δικτύου που ελέγχει την επιμήκυνση των C20–C24 PUFAs (7), τα συνολικά επίπεδα FA στη συνέχεια αξιολογήθηκαν στα κύτταρα ACHN/sgControl και ACHN/sgELOVL2 χρησιμοποιώντας ανάλυση GC‑ (Εικ. S2). Η μεταβολή των επιπέδων LC-PUFA φαίνεται στο Σχ. 4D. Το ELOVL2 είναι ένα βασικό ένζυμο στην ενδογενή παραγωγή εικοσιδυαεξανοϊκού οξέος (DHA, C22:6 n‑3) (28,29) και, όπως αναμενόταν, τα επίπεδα DHA μειώθηκαν σημαντικά από την κατάλυση του ELOVL2 στονεφρώνκαρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, το

Οι ποσότητες άλλων ειδών LC-PUFAs, συμπεριλαμβανομένου του αραχιδονικού οξέος (AA, C20:4 n-6), του εικοσαπεντανοϊκού οξέος (EPA) και του εικοσιπεντανοϊκού οξέος (DPA), μειώθηκαν επίσης σημαντικά. Από την άλλη πλευρά, η παραγωγή DPA δεν μεταβλήθηκε σταθερά στα κύτταρα ACHN/sgELOVL2. Η ποσότητα DPA στα κύτταρα ACHN ήταν πολύ χαμηλή και δεν ανιχνεύθηκε σε πολλά δείγματα (Εικ. S2). Δεδομένου ότι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το ELOVL2 προάγει τη συσσώρευση LDs μέσω της παραγωγής DHA (11,12), η αποθήκευση των LDs αξιολογήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας χρώση ουδέτερου λιπιδίου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αφθονία των LDs στα κύτταρα ACHN/sgELOVL2 μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα ACHN/sgControl (Εικ. 4E-4G), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αλλαγή του μεταβολισμού των λιπιδίων από την υπερέκφραση ELOVL2 μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων RCC.

Η κατάλυση ELOVL2 επάγει την απόπτωση τουνεφρώνκαρκινικά κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η παραγωγή ενδοκυτταρικών LDs προάγει την απόπτωση κάτω από στρεσογόνα μικροπεριβάλλοντα όγκου (4). Επομένως, στην παρούσα μελέτη, η απόπτωση αξιολογήθηκε σε κύτταρα ACHN/sgControl ή ACHN/sgELOVL2 και ανιχνεύθηκε σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα της κασπάσης 3/7 στα κύτταρα ACHN/sgELOVL2 (Εικ. 5Α). Ομοίως, ένας μεγαλύτερος αριθμός αποπτωτικών κυττάρων ACHN/sgELOVL2 σε σύγκριση με κύτταρα ACHN/sgControl ταυτοποιήθηκε, όπως αποδεικνύεται από τη χρώση με Annexin V/PI (Εικ. 5Β). Ανάλογα με το κυτταρικό στρες, η ενδογενής απόπτωση (30) οδηγεί σε απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Έτσι, η παρούσα μελέτη αξιολόγησε περαιτέρω το ηλεκτρικό δυναμικό της μιτοχονδριακής διαμεμβράνης των κυττάρων ACHN/sgControl ή ACHN/sgELOVL2 χρησιμοποιώντας φθορίζον JC-1. Η αναλογία συσσωματώματος/μονομερούς μειώθηκε σημαντικά στα κύτταρα ACHN/sgELOVL2 (Εικ. 5C), υποδεικνύοντας την προώθηση της μιτοχονδριακής διαμεμβρανικής πόλωσης και την ενεργοποίηση της ενδογενούς αποπτωτικής οδού με κατάλυση ELOVL2. Πιο συγκεκριμένα, τα επίπεδα έκφρασης του προαποπτωτικού γονιδίου (BAX, BAK, PUMA και NOXA) αυξήθηκαν σημαντικά, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του αντιαποπτωτικού γονιδίου (BCL2 και MCL1) μειώθηκαν σημαντικά λόγω της κατάλυσης ELOVL2 (Εικ. 5D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ELOVL2 συμβάλλει στην κυτταρική επιβίωση μέσω της αναστολής της απόπτωσης των νεφρικών καρκινικών κυττάρων

Η υποβάθμιση της ικανότητας αποθήκευσης λιπιδίων σε μορφή LD μπορεί να οδηγήσει στην κατάρρευση της ομοιόστασης του ER, προκαλώντας την απόκριση ξεδιπλωμένης πρωτεΐνης (UPR) και την κυτταρική απόπτωση (4,5). Επομένως, προκειμένου να υποστηριχθεί η υπόθεση της εμπλοκής της έκφρασης ELOVL2 στην ομοιόσταση του ER, πραγματοποιήθηκε χρώση με ιχνηλάτη ER σε κύτταρα ACHN/sgControl ή ACHN/sgELOVL2. Η επακόλουθη απεικόνιση ER (Εικ. 5Ε) και η ποσοτικοποίηση με χρήση κυτταρομετρίας ροής (Εικ. 5F και G) έδειξαν επέκταση ER στα κύτταρα ACHN/sgELOVL2, λόγω στρες ER. Επιπλέον, η κατάλυση ELOVL2 προώθησε τη φωσφορυλίωση του IRE1, ενός ενεργοποιητή των αισθητήρων UPR (Εικ. 5Η), ενώ η έκφραση τουΤο CHOP, το οποίο παίζει κύριο ρόλο στην απόπτωση που προκαλείται από το στρες του ER, ρυθμίστηκε προς τα πάνω με κατάλυση ELOVL2 (Εικ. 5Η). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο μεταβολισμός των λιπιδίων που προκαλείται από το ELOVL2 καταστέλλει την κυτταρική απόπτωση σενεφρώνκαρκινικά κύτταρα και πρότειναν ότι η διακοπή της ομοιόστασης του ER μπορεί να είναι ένας πιθανός μηχανισμός επαγωγής.

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι το ELVOL2 μπορεί να μεταβάλλει τον μεταβολισμό των λιπιδίων και να προάγει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της αναστολής της απόπτωσης των νεφρικών καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι η έκφραση ELOVL2 σε ιστούς RCC ήταν αυξημένη και ότι

η υψηλότερη έκφραση του ELOVL2 συσχετίστηκε σημαντικά με κακή πρόγνωση ασθενών με RCC. Υπάρχουν περιορισμένες διαθέσιμες μελέτες σχετικά με τους ρόλους του ELOVL2 στην εξέλιξη του καρκίνου (22,31,32) και τα αποτελέσματά τους είναι αμφιλεγόμενα. Οι Simple et al (22) απέδειξαν ότι το ELOVL2 προώθησε τη σύνθεση LC-PUFA, υποστηρίζοντας την αποτελεσματική σηματοδότηση EGFR και τον πολλαπλασιασμό βλαστικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Αντίθετα, οι Kang et al (31) ανέφεραν ότι η κατάλυση ELOVL2 μπορεί να προάγει τη μετανάστευση των κυττάρων και τον σχηματισμό αποικιών καρκινικών κυττάρων του μαστού και αποκάλυψε ότι η μειωμένη έκφραση του ELOVL2 συσχετίστηκε με χειρότερη πρόγνωση ασθενών με καρκίνο του μαστού. Επιπλέον, οι Ding et al (32) ανέφεραν ότι το ELOVL2 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων νευροβλαστώματος και συσχετίστηκε με ευνοϊκά ποσοστά επιβίωσης. Σύμφωνα με τα αντικρουόμενα ευρήματα που αναφέρθηκαν σε προηγούμενες μελέτες, έχει αποδειχθεί μια λειτουργία πολλαπλών ρόλων για το ELOVL2 στην εξέλιξη του καρκίνου, η οποία ποικίλλει σαφώς ανάλογα με τον τύπο του καρκίνου.

Ένας αλλοιωμένος μεταβολισμός των λιπιδίων επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την εξέλιξη του καρκίνου, μια επίδραση που παρατηρείται στα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, η οποία είναι σύμφωνη με την έρευνα που απεικονίζει τον ρόλο του ELOVL2 ως πρωταρχικού ελεγκτή της διαδικασίας επιμήκυνσης των LC-PUFAs και ενός κρίσιμου ενζύμου στη βιοσύνθεση DHA. 7). Στην παρούσα μελέτη, αποδείχθηκε ότι τα ενδογενή LC-PUFAs,

συμπεριλαμβανομένων των AA και DHA, μειώθηκαν λόγω της κατάλυσης ELOVL2 στα καρκινικά κύτταρα του νεφρού. Σε σχέση με αυτό, έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι η αναστολή της οδού ΑΑ από τους αναστολείς της λιποξυγενάσης (LOX) προκαλεί απόπτωση και μειώνει τη βιωσιμότητα τουνεφρώνκαρκινικά κύτταρα in vitro (33,34). Αν και τα αποτελέσματα υπερέκφρασης ELOVL2 της παρούσας μελέτης συμφωνούν με αυτά τα μηχανιστικά ευρήματα, έχει αναφερθεί προηγουμένως, ωστόσο, ότι η χορήγηση DHA μπορεί να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή νεφρικών καρκινικών κυττάρων in vitro (35,36). Ωστόσο, τα LC-PUFAs είναι γνωστό ότι έχουν διακριτές και αντίθετες επιδράσεις στην εξέλιξη του καρκίνου. Επομένως, η αλλαγή μιας λεπτής ισορροπίας μεταξύ μιας ποικιλίας LC-PUFA, λόγω της αναστολής του ELOVL2 μπορεί να σχετίζεται με τους διαφορετικούς φαινότυπους που παρατηρούνται σε διάφορους τύπους καρκίνου. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα LDs αυξάνονται μέσω της ενδογενούς παραγωγής DHA από το ELOVL2 σε ποντίκια (11,12). Ομοίως, αποκαλύφθηκε ότι η κατάλυση ELOVL2 μπορεί να καταστέλλει την παραγωγή DHA και LDs σε καρκινικά κύτταρα νεφρού, υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφραση του ELOVL2 μπορεί να προάγει την παραγωγή LD μέσω ενδογενούς παραγωγής DHA σε RCC. Τα καρκινικά κύτταρα βρίσκονται συχνά σε πιο σκληρές περιβαλλοντικές (μακρο και μικρο) συνθήκες, συμπεριλαμβανομένης της υποξίας και της στέρησης θρεπτικών ουσιών, αλλά εξακολουθούν να αναπτύσσονται γρήγορα κάτω από τόσο σοβαρούς στρεσογόνους παράγοντες. Οι λειτουργίες των LDs υπό συνθήκες κυτταρικού στρες, όπως η διατήρηση της ενέργειας και της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης, η ρύθμιση της αυτοφαγίας, η διατήρηση της ομοιόστασης του ER και η προστασία από τη λιποτοξικότητα, έχουν αποδειχθεί (4).

Οι Ackerman et al (6) αποκάλυψαν ότι τα LD αποτρέπουν τη συσσώρευση τοξικών, κορεσμένων λιπιδίων κατά τη διάρκεια της υποξίας μέσω της ρύθμισης του κορεσμού των κυτταρικών λιπιδίων μέσω της ανταλλαγής ακόρεστων FA που βρίσκονται σε TG σε ccRCC. Η κυτταρική λιποτοξικότητα λόγω κορεσμένων FAs (SFA), συμπεριλαμβανομένου του παλμιτικού (C16:0), μπορεί να προκαλέσει απόπτωση, οδηγώντας σε θάνατο καρκινικών κυττάρων (37,38). Πρόσφατα, το ELOVL2 χαρακτηρίστηκε ως κρίσιμο ένζυμο υπέρ της επιβίωσης, βοηθώντας στην πρόληψη της απόπτωσης των κυττάρων που προκαλείται από τη γλυκολιποτοξικότητα (39). Αξίζει να σημειωθεί ότι η λιπιδική κατανομή με τροποποιημένο άξονα ELOVL2/DHA έχει ως αποτέλεσμα μια μη τοξική χρήση του παλμιτικού SFA ευνοώντας τη μεταφορά του στα μιτοχόνδρια για οξείδωση FA (FAO) μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από το CPT1. Επιπλέον, οι Balaban et al απέδειξαν ότι τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη C4-2B και τα καρκινικά κύτταρα του μαστού MCF-7 προστατεύονται από την επαγόμενη από παλμιτικό απόπτωση από το μιτοχονδριακό FAO (37,38). Κατά τη διάρκεια λιποτοξικότητας που προκαλείται από παλμιτικό, τα κυτταρικά επίπεδα αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένου του BCL-2 ή του MCL-1, έχουν αναφερθεί ότι είναι μειωμένα (40,41) ενώ τα επίπεδα προαποπτωτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των PUMA ή NOXA, έχουν αναφερθεί να αυξηθεί (42,43). Στην παρούσα μελέτη αποκαλύφθηκε ότι η κατάλυση ELOVL2 μπορεί να προάγεινεφρώναπόπτωση καρκινικών κυττάρων μέσω της αλλαγής των προ- και αντι-αποπτωτικών γονιδίων με παρόμοιο τρόπο. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το ELOVL2 μπορεί να προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση που οφείλεται στη λιποτοξικότητα για να προάγει την ανάπτυξη όγκου στο RCC.

Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η κατάλυση ELOVL2 σε RCC μπορεί να προάγει το στρες ER και την ανοδική ρύθμιση CHOP, ρυθμίζοντας προς τα κάτω τα BCL-2 και MCL-1, ενώ ρυθμίζει προς τα πάνω τα BAK και BAX, μέσω μιας οδού που εξαρτάται από τα μιτοχόνδρια (44). Πράγματι, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι τα προ- και τα αντι-αποπτωτικά γονίδια αλλοιώθηκαν με παρόμοιο τρόπο με την κατάλυση ELOVL2. Σύμφωνα με τα ευρήματα της μελέτης των Qui et al (5), οι οποίοι ανέφεραν ότι τα LD που εξαρτώνται από HIF2 / PLIN2 προάγουν την αντίσταση έναντι του στρες ER και την επιβίωση των κυττάρων στο ccRCC, αυτά τα συλλογικά ευρήματα υποστηρίζουν το στρες ER που προάγει την κυτταρική απόπτωση από το ELOVL2 κατάλυση σενεφρώνκαρκινικά κύτταρα, μειώνοντας τα LD και αφαιρώντας το κυτταρικό ρυθμιστικό διάλυμα έναντι των τοξικών λιπιδίων.

Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά, εξ όσων γνωρίζουμε, ότι το ELOVL2 προάγει την ανάπτυξη του όγκου με την αναστολή της απόπτωσης μέσω της επιμήκυνσης των PUFAs, τουλάχιστον εν μέρει με τη διατήρηση της ομοιόστασης του ER σενεφρώνκαρκινικά κύτταρα. Συνολικά, προτάθηκε ότι τα LDs που προκαλούνται από το ELOVL2 μπορεί να συμβάλλουν στην εξέλιξη του καρκίνου λόγω πολλαπλών προστατευτικών επιδράσεων έναντι του κυτταρικού στρες στο RCC. Επιπλέον, προτάθηκε ότι το ELOVL2 μπορεί να είναι ένας ελκυστικός δυνητικός θεραπευτικός στόχος για ασθενείς με RCC.