Μέρος 2: Η ανεπάρκεια DHHC21 εξασθενεί τη νεφρική δυσλειτουργία κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης

Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

Συζήτηση

Στην παρούσα εργασία, αναφέρουμε το DHHC21 ως νέο ρυθμιστή της νεφρικής αιμάτωσης και λειτουργίας κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης. Τα νέα ευρήματά μας δείχνουν: (1) Zdhhc21devde? Τα ποντίκια παρουσιάζουν καλύτερη νεφρική λειτουργία και λιγότερη νεφρική βλάβη μετά από σηπτικό τραυματισμό σε σύγκριση με τα ποντίκια WT. απαιτείται για την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης alAR και τη στένωση των νεφρικών αρτηριών που προκαλείται από το alAR. Αυτή η μελέτη παρέχει νέα μηχανιστική εικόνα για τη ρύθμιση της νεφρικής αιμάτωσης και λειτουργίας κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης. Προτείνουμε ότι η λειτουργική ανεπάρκεια DHHC21 προσδίδει προστατευτικά αποτελέσματα σενεφρική λειτουργίασε σηπτικό τραυματισμό και ότι η αναστολή του DHHC21 μπορεί να χρησιμεύσει ως θεραπευτική στρατηγική για την καταπολέμησηνεφρική δυσλειτουργίακατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε τα οφέλη του εκχυλίσματος cistanche tubulosa

Η υποαιμάτωση/υποξία νεφρικού ιστού είναι μία από τις κύριες αιτίες νεφρικής δυσλειτουργίας κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης3-5. Ανιχνεύσαμε νεφρική υποαιμάτωση σε ποντίκια μετά από CLP που αποδεικνύεται από εξασθενημένη ένταση σήματος MSOT της ολικής αιμοσφαιρίνης, μειωμένο κορεσμό οξυγόνου στον νεφρικό ιστό και μειωμένο RBF μετά από σηπτική βλάβη. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, η μείωση της RBF έχει παρατηρηθεί σε ασθενείς με σηψαιμία με νεφρική βλάβη καθώς και σε μοντέλα μεγάλων ζώων σηπτικής βλάβης7,10l1. Αξίζει να σημειωθεί ότι αρκετές μελέτες αναφέρουν ότι μπορεί να αναπτυχθεί νεφρική δυσλειτουργία σε ζώα με σηψαιμία με αμετάβλητο ή ακόμα και αυξημένο RBF334. Αυτά τα ασυμβίβαστα ευρήματα μπορεί να αποδοθούν σε διαφορετικά ζωικά μοντέλα και μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της ροής του αίματος. Για παράδειγμα, ενώ ο πολυμικροβιακός σηπτικός τραυματισμός που προκαλείται από το CLP χρησιμοποιείται συνήθως, ορισμένες μελέτες χρησιμοποιούν ενδοφλέβια ένεση Escherichia coli35.

Η παλμιτοϋλίωση πρωτεΐνης έχει πρόσφατα αναφερθεί ως ένας νέος ρυθμιστής της πρωτεϊνικής λειτουργίας, που εμπλέκεται στην παθογένεση και την εξέλιξη πολλών ασθενειών. Αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένας νέος τύπος μετα-μεταφραστικής τροποποίησης από τους Schmidt et al.3637. Η ανακάλυψη της οικογένειας DHHC είχε από τότε προωθήσει την ταχεία επέκταση αυτού του πεδίου38,39. Οι ρόλοι της παλμιτοϋλίωσης και των PAT έχουν αναφερθεί σε πολυάριθμες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού των λιπιδίων,Καρκίνος, καρδιαγγειακές παθήσεις, και νευρολογικές διαταραχές23,0,4. Αν και η εμπλοκή της παλμιτοϋλίωσης στην πολυκυστική νεφρική νόσο και τον καρκίνο του νεφρού έχει αναφερθεί στο παρελθόν23., έχουν υπάρξει πολύ περιορισμένες μελέτες που εξετάζουν τον λειτουργικό ρόλο των ΠΑΤ στηννεφρικές παθήσεις, ειδικά σε νεφρική δυσλειτουργία κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης. Από όσο γνωρίζουμε, είμαστε οι πρώτοι που διερευνήσαμε τον ρόλο του DHHC2l στη νεφρική δυσλειτουργία σε σηπτική βλάβη. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η αναστολή του DHHC21 σώζει σε μεγάλο βαθμό τη λειτουργία των νεφρών και διατηρεί τη δομή των νεφρών σε σηπτική βλάβη.

Η μελέτη μας χρησιμοποιεί Zdhhc21dp/d4; ποντίκια αποδεικνύουν ότι τα ευεργετικά αποτελέσματα της λειτουργικής ανεπάρκειας DHHC21 στη λειτουργία των νεφρών αποδίδονται στην ικανότητά του να βελτιώνει την αιμάτωση του νεφρικού ιστού κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης. Υπό βασικές συνθήκες, τα ποντίκια Zdhhc21ewaeP δεν παρουσιάζουν σημάδια ανισορροπίας αλατιού/νερού ή νεφρικής δομικής/λειτουργικής βλάβης5. Ωστόσο, η απώλεια λειτουργίας του DHHC21 καταστέλλει τη μείωση της RBF που προκαλείται από σηπτική βλάβη, της νεφρικής αιμάτωσης και του νεφρικού κορεσμού οξυγόνου. Η αυξημένη νεφρική αγγειακή αντίσταση που προκαλείται από την υπερβολική νεφρική αγγειοσύσπαση θεωρείται κύριος λόγος για την εξασθενημένη αιμάτωση του νεφρικού ιστού σε σηπτική βλάβη6.9. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν τη συμμετοχή του alAR στη μεσολάβηση της υποαιμάτωσης νεφρικού ιστού που προκαλείται από σηπτική βλάβη, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση της παλμιτοϋλίωσης alAR και την ενεργοποίηση μιας οδού σηματοδότησης alAR σε σηπτική βλάβη. Ωστόσο, η λειτουργική ανεπάρκεια DHHC21 αναστέλλει την alARpalmitoylation και έχει ως αποτέλεσμα μια αμβλύτερη ικανότητα του alAR να ενεργοποιεί τον κατάντη τελεστή του και να μεσολαβεί στην επαγόμενη από φαινυλεφρίνη αγγειοσυστολή στις νεφρικές αρτηρίες.

"Ο μοριακός μηχανισμός στον οποίο βασίζεται η ρύθμιση της λειτουργίας alAR από το DHHC21 παραμένει ακόμη να διευκρινιστεί πλήρως. Το ελάττωμα στη λειτουργία alAR που προκαλείται από την απώλεια λειτουργίας του DHHC21 μπορεί να αποδοθεί στη διαμορφωτική αλλαγή του alAR. Πολλοί GPCR βασίζονται στην παλμιτοϋλίωση για τον κατάλληλο τρόπο ενδοκυτταρική διαμόρφωση, Το προσκολλημένο παλμιτικό στις C-τερματικές ουρές των GPCRs εισάγεται στην πλασματική μεμβράνη για να δημιουργήσει τον τέταρτο ενδοκυτταρικό βρόχο, ο οποίος είναι απαραίτητος για την αλληλεπίδραση των GPCR με τις πρωτεΐνες συνεργατών τους και τη διάδοση των σημάτων GPCR17,4. έχει υποδείξει ότι η παλμιτοϋλίωση του Albar λαμβάνει χώρα επίσης στην C-τερματική του περιοχή44. Επομένως, η έλλειψη παλμιτοϋλίωσης lAR που προκαλείται από DHHC21-μπορεί να αλλάξει την ενδοκυτταρική διαμόρφωση του alAR, εμποδίζοντας έτσι τη διάδοση των σημάτων lAR. Αυτό μπορεί να υποστηριχθεί από τα αποτελέσματά μας που δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του ERK, ενός συμβάντος κατάντη σηματοδότησης της ενεργοποίησης alAR, αναστέλλεται σε ποντίκια Zdhhc21devider που υποβλήθηκαν σε Sept IC τραυματισμός. Ωστόσο, η ρυθμιζόμενη τοπολογία DHHC{11} του καρβοξυλικού τερματικού alAR πρέπει να επιβεβαιωθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ.

Μια άλλη νέα πτυχή της μελέτης μας είναι η χρήση του MSOT για την αξιολόγηση της αιμάτωσης και της λειτουργίας των νεφρών κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης. Το MSOT έχει αναφερθεί ως μέθοδος χωρίς ετικέτα για τη μέτρηση της αιμάτωσης διαφορετικών οργάνων και ως αξιόπιστη τεχνική απεικόνισης για τον προσδιορισμό της νεφρικής λειτουργίας2832,45. Σε σύγκριση με το ροόμετρο Doppler που δεν επιτρέπει την οπτικοποίηση της μικροαγγείωσης45, το MSOT δημιουργεί εικόνες με υψηλή χωρική ανάλυση στα 150 um ενώ παρέχει μια ποσοτική αξιολόγηση της κατάστασης αιμάτωσης στο μικροαγγειακό σύστημα των νεφρών. Το υδατοδιαλυτό IRDye800CW είναι ένας ασφαλής ιχνηθέτης για χρήση για τη μέτρηση της νεφρικής κάθαρσης και δεν προκαλεί τοξικότητα σε δόση τόσο υψηλή όσο 20 mg/kg. Η κίνηση δύο φάσεων του IRDye800CW που παρατηρήσαμε είναι σύμφωνη με προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες. Οι καταγραφές μας MSOT υποδεικνύουν μεγαλύτερη καθυστέρηση Tmax στους νεφρούς σήψης, υποδηλώνοντας μειωμένη νεφρική κάθαρση. Μια μελέτη νεφροπάθειας καταδεικνύει ότι η εξασθενημένη νεφρική λειτουργία που ανιχνεύθηκε από τους MSOTis συσχετίστηκε σημαντικά με τη σπειραματική ιστολογική βλάβη30. Τα δεδομένα μας, σύμφωνα με προηγούμενες δημοσιεύσεις, υποδηλώνουν ότι το MSOT είναι μια ελάχιστα επεμβατική και αξιόπιστη τεχνική για την παρακολούθηση της νεφρικής αιμάτωσης και λειτουργίας.

Προς το παρόν, δεν υπάρχουν διαθέσιμοι ειδικοί αναστολείς DHHC21-. Ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος αναστολέας PAT είναι η 2-BP που έχει ευρεία επίδραση σε πολλαπλά DHHC και επίσης παρεμβαίνει στον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων47. Επομένως, η ανάπτυξη μικρών μορίων αναστολέων που στοχεύουν ειδικά το DHHC21 θα ήταν μια πολλά υποσχόμενη κατεύθυνση. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι το alAR δεν είναι το μόνο υπόστρωμα του DHHC21. Πολλά άλλα υποστρώματα DHHC21 έχουν πρόσφατα ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένου του μορίου προσκόλλησης ενδοθηλιακών κυττάρων αιμοπεταλίων (PFCA M-1), του υποδοχέα οιστρογόνων caveolin-1, της συνθάσης του ενδοθηλιακού μονοξειδίου του αζώτου (eNOS), του Fyn, της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD{{{{ 8}}), και PLCB122,41,4s,49, Αν και είναι εκτός του πλαισίου της παρούσας μελέτης, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι αυτά τα υποστρώματα μπορεί επίσης να επηρεάσουν τη νεφρική λειτουργία κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης.

Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει για πρώτη φορά ότι το DHHC21 παίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της νεφρικής αιμάτωσης κατά τη διάρκεια της σηπτικής βλάβης μέσω μηχανισμών που περιλαμβάνουν παλμιτοϋλίωση alAR και αγγειοσύσπαση που προκαλείται από το alAR. Επιπλέον, η αναστολή του DHHC21 ασκεί προστατευτικά αποτελέσματα στη νεφρική λειτουργία κατά τη διάρκεια σηπτικής βλάβης.

Υλικά και μέθοδοι

Αντιδραστήρια. Όλα τα αντιδραστήρια παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

Των ζώων. Τα ποντίκια Zdhhc21depher και τα ποντίκια ελέγχου άγριου τύπου (B6C3Fe) αγοράστηκαν από το Jackson Laboratory. Ο γονότυπος του Zdhhc21dephe; ποντίκια επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας (Genewiz, Inc., NJ, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας ήταν: AGCTGACTGAAGGGCACC (εμπρός) και AAAACCTGTAACGCATTTCCA (αντίστροφα)23. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 12/12-h με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Για αυτήν τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια (16-20 εβδομάδες) και των δύο φύλων. Όλα τα πειράματα σε ζώα έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου της Νότιας Φλόριντα και συμμορφώνονται με τον Οδηγό NIH για τη φροντίδα και τη χρήση του εργαστηρίου

Απολίνωση και παρακέντηση του τυφλού, Ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο (3 τοις εκατό επαγωγή και 1 τοις εκατό συντήρηση). Έγινε μια τομή στη μέση γραμμή στην ξυρισμένη κοιλιακή περιοχή και το τυφλό έντερο απολινώθηκε σφιχτά στα 5 mm κάτω από την ειλεοτυφλική βαλβίδα και τρυπήθηκε δύο φορές με μια 20-βελόνα μετρητή περιφερικά στο σημείο της απολίνωσης. Ένα mm περιττωμάτων εξωθήθηκε από κάθε οπή διάτρησης. Το τυφλό έντερο στη συνέχεια επανατοποθετήθηκε και η κοιλιά έκλεισε σε δύο στρώματα. Το διάλυμα Ringer 37 C Lactated εφαρμόστηκε τοπικά για να αποτραπεί η ξήρανση του τυφλού εντέρου. Τα ποντίκια στη συνέχεια έλαβαν φυσιολογικό ορό 37 βαθμών 0,9 τοις εκατό υποδορίως για αναζωογόνηση υγρού. Μια προεγχειρητική 0.5-1.5 mg/kg δόση παρατεταμένης αποδέσμευσης βουπρενορφίνης χορηγήθηκε για αναλγησία. Τα εικονικά ποντίκια υποβλήθηκαν στην ίδια χειρουργική επέμβαση αλλά χωρίς απολίνωση και παρακέντηση του τυφλού50,51.

Πολυφασματική οπτοακουστική τομογραφία. Εκτίμηση νεφρικής απέκκρισης IRDye800CW. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν μέσω ισοφλουρανίου και αποτριχώθηκαν γύρω από την περιοχή του κορμού. Τα ποντίκια απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης Altera Medical MSOT (Μόναχο, Γερμανία) σε πολλαπλά μήκη κύματος:700,730,760,775,785, 800,850 nm με ρυθμό 10 καρέ/δευτερόλεπτο. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση σε ένα στήριγμα και μετακινήθηκαν κατά μήκος της οριζόντιας γραμμικής βαθμίδας για να τοποθετήσουν τα νεφρά πάνω από τον σταθεροποιημένο κοίλο μετατροπέα. Μετά την καταγραφή της γραμμής αναφοράς, 60 nmol RDve800CW διαλυμένα σε l00 ul φυσιολογικού ορού 0,9 τοις εκατό εγχύθηκαν ενδοφλεβίως για περίοδο 10 δευτερολέπτων. Οι εικόνες ανακατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο οπισθοπροβολής και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πολυφασματική ανάλυση. Οι περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) σχεδιάστηκαν γύρω από τον νεφρικό φλοιό και την περιοχή του μυελού/λεκάνης και απεικονίστηκαν οι χρονικές αλλαγές του σήματος MSOT στα ROI.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Ιστοπαθολογία νεφρού. Τα νεφρά στερεώθηκαν, κόπηκαν κατά μήκος του οβελιαίου επιπέδου και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ενσωμάτωση παραφίνης. Οι τομές (5 μm) αποπαραφινώθηκαν, επανυδατώθηκαν και οξειδώθηκαν με περιοδικό οξύ για 8 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), ακολουθούμενη από επώαση με διάλυμα Schiff για 25 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Οι εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, ΗΠΑ). Η νεφρική δομική βλάβη αξιολογήθηκε με βάση τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: σπειραματική ανωμαλία, απώλεια του ορίου βούρτσας του εγγύς σωληνίσκου, κενοτοπίαση, διαστολή του επιθηλίου των σωληναρίων, αποκόλληση/νέκρωση σωληναριακών κυττάρων και διήθηση ουδετερόφιλων. Κάθε χαρακτηριστικό βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα 0-5 με βάση τη σοβαρότητα.

Μέτρηση κρεατινίνης και αζώτου ουρίας αίματος. Αίμα ποντικού συλλέχθηκε μέσω καρδιακής παρακέντησης 24 ώρες μετά τον σηπτικό τραυματισμό. Το πλάσμα δημιουργήθηκε με φυγοκέντρηση του αίματος στα 2500 g για 15 λεπτά σε RT. Μέτρηση κρεατινίνης: το πλάσμα αποπρωτεϊνοποιήθηκε με χρήση στήλης 10-kDa Spin. Τα επίπεδα κρεατινίνης στο διήθημα στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας κρεατινίνης. Το επίπεδο αζώτου ουρίας στο αίμα (BUN) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ χρωματομετρικής ανίχνευσης αζώτου ουρίας ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Μέτρηση RBF και MAP. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο. Ο μετατροπέας αρτηριακής πίεσης διασωληνώθηκε στην καρωτιδική αρτηρία. Έγινε μια τομή στη μέση γραμμή στην κοιλιακή περιοχή ακολουθούμενη από μια αριστερή εγκάρσια τομή για να αποκαλυφθεί η νεφρική αρτηρία. Το RBF μετρήθηκε με χρήση ροόμετρου χρόνου διέλευσης υπερήχων (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, ΗΠΑ). Μετά την τοποθέτηση του ανιχνευτή ροής γύρω από την εκτεθειμένη νεφρική αρτηρία, τα ποντίκια αφέθηκαν να σταθεροποιηθούν για τουλάχιστον 30 λεπτά. Το RBF και το MAP καταγράφηκαν ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό LabChart Pro έκδοση 74,55

Σύλληψη με τη βοήθεια ρητίνης. Οι νεφρικές αρτηρίες συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μΜ παλμοστατίνη Β, αναστολείς πρωτεάσης, pH 7,4）22, 56. Τα προϊόντα λύσης ιστών επωάστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 τοις εκατό SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) στους 50 βαθμούς C για 30 λεπτά με συνεχή αναδίπλωση. σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στα 5000 g για 30 λεπτά και πλύθηκαν πέντε φορές με 70 τοις εκατό ψυχρή ακετόνη Τα σφαιρίδια πρωτεΐνης επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (100 mM HEPES, 1,0 τοις εκατό SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε και κανονικοποιήθηκε μεταξύ των ομάδων Κάθε δείγμα πρωτεΐνης χωρίστηκε σε δύο ίσα μέρη το καθένα έλαβε την ίδια ποσότητα σφαιριδίων ισοπροπυλοσεφαρόζης 6Β, Hydroxvlamine (0,2 M, pH 7,4) και NaCl (0,2 M) προστέθηκε σε κάθε μέρος, αντίστοιχα. Μετά από 4 ώρες επώασης σε RT με σταθερή περιστροφή, οι παλμιτοϋλιωμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με 50 mM DTT σε ρυθμιστικό διάλυμα 1x δείγματος και συλλέχθηκαν για SDS-PAGE.

Western blotting. Μέτρηση παλμιτοϋλιωμένου lAR. Τα δείγματα που συλλέχθηκαν από το RAC φορτώθηκαν σε πήκτωμα Tris-Glycine 4-20 τοις εκατό και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά από ηλεκτροφόρηση. Μετά από αποκλεισμό για 1 ώρα σε RT, το alAR ανιχνεύθηκε με πρωτεύον αντίσωμα anti-lAR κουνελιού (1:500) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Μετά από πλύση τρεις φορές με TBST, η μεμβράνη επωάστηκε με IRDye800CW δευτερεύον αντίσωμα γαϊδουριού κατά κουνελιού (1:20,000) για 45 λεπτά σε ΘΔ.

Μέτρηση φωσφορυλίωσης ERK. Οι νεφρικές αρτηρίες υποβλήθηκαν σε λύση σε 1×RIPA που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης. Η μεμβράνη διερευνήθηκε με αντισώματα αντι-ERK κουνελιού (1:1000) και αντιφωσφορυλιωμένα ERK (1:1000) ποντικού. Για δευτερογενή επώαση χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα αντι-ποντικού γαϊδουριού IRDye800CW και αντι-κουνελιού γαϊδουριού IRDye680RD (1:20.000). Οι μεμβράνες απεικονίστηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Li-COR Odyssey CLx.

Εκτίμηση της αγγειοδραστικότητας μέσω συρμάτινου μυογράφου. Νεφρικές αρτηρίες ποντικού. Οι νεφρικές αρτηρίες (διαμέτρου {{0}} μm) απομονώθηκαν από ποντίκια WTand Zdhhc21dp/de και βυθίστηκαν σε παγωμένο οξυγονωμένο (95 τοις εκατό O,/5 τοις εκατό CO.) φυσιολογικό αλατούχο διάλυμα (PSS, 13{ {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHC0, 5,5 mM γλυκόζη, 0,026 mM EDTA, και 1,6 mM CaCl, τμήματα σελ. pH 7,4 (V). μήκους 2 mm) τοποθετήθηκαν στον συρμάτινο θάλαμο μυογράφου (Living Systems Instrumentation, VT, USA) ανάμεσα σε δύο σύρματα βολφραμίου (διαμέτρου 30 um). Η ισομετρική τάση καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ρυθμιστή σήματος Living Systems (MYO-SC-1) σε συνδυασμό με το λογισμικό LabScribe v4 iWorks. Μετά από εξισορρόπηση για 30 λεπτά σε 37 βαθμούς Cin PSS, πραγματοποιήθηκε η διαδικασία κανονικοποίησης για τον προσδιορισμό της βέλτιστης εσωτερικής περιφέρειας L,=0.9×L(Lo=εσωτερική περιφέρεια που αντιστοιχεί σε διατοιχωματική πίεση 100 mmHg) . Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα του αγγείου δοκιμάστηκε με 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO. 1,17 mM MgSO.7H, O, 14,9 mM NaHC0, 5,5 mM γλυκόζη, 0,026 mM mH EDTA, 1 pM. 7.4). Οι αρτηρίες που δεν ανταποκρίθηκαν στο KPSS απορρίφθηκαν. Οι αρτηρίες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις φαινυλεφρίνης (10 nM-30 μΜ). Η ακεραιότητα του ενδοθηλίου στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ακετυλοχολίνη (10 μΜ). Κατασκευάστηκαν οι καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης.

Μικρές αρτηρίες από ανθρώπινα νεφρά. Μικρές αρτηρίες (~1000 um σε διάμετρο) αποκόπηκαν από άθικτους βιώσιμους ανθρώπινους νεφρούς που απορρίφθηκαν για χειρουργική επέμβαση μεταμόσχευσης. Τμήματα αγγείων (μήκους ~ 2 mm) τοποθετήθηκαν στις ράβδους I (διάμετρος 250 um) του θαλάμου συρμάτινου μυογράφου. Παρόμοιες διαδικασίες εξισορρόπησης και κανονικοποίησης πραγματοποιήθηκαν σε ανθρώπινες αρτηρίες. Στη συνέχεια, οι αρτηρίες επωάστηκαν με έλεγχο φορέα (0,02 τοις εκατό DMSO σε PSS) για 1 ώρα. Τα αγγεία στη συνέχεια δοκιμάστηκαν για βιωσιμότητα με 60 mM KPSS και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις φαινυλεφρίνης (10 ηΜ-30 uM). Μετά την έκπλυση, τα αγγεία επωάστηκαν με 2-BP(100 uM) για 1 ώρα. η βιωσιμότητα του σκάφους στη συνέχεια δοκιμάστηκε ξανά με 60 mM KPSS με 100 uM 2-BP. Οι μικρές αρτηρίες χωρίς ή μειωμένη ανταπόκριση στο KPSS απορρίφθηκαν. Οι αρτηρίες στη συνέχεια προκλήθηκαν με τις ίδιες συγκεντρώσεις φαινυλεφρίνης ακολουθούμενες από ακετυλοχολίνη (10 μΜ). Κατασκευάστηκαν και συγκρίθηκαν οι καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης των αρτηριών που έχουν υποστεί αγωγή με φορέα ελέγχου ή 2-BP.

Ανοσοφθορισμός. Οι ανθρώπινες νεφρικές αρτηρίες σταθεροποιήθηκαν σε 10 τοις εκατό φορμαλίνη για 48 ώρες, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και τεμαχίστηκαν. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια αποπαραφινώθηκαν, επανυδατώθηκαν και διαπερατήθηκαν με PBS που περιείχε 0,05 τοις εκατό Triton X-1002. Μετά τον αποκλεισμό, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επισημάνθηκαν με αντισώματα κουνελιού anti-DHHC21 και κατσίκας αντι- lAR (1:100) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς C. Μετά το πλύσιμο, έγινε δευτερεύουσα επώαση αντισωμάτων με Alexa Fluor 488 έναντι γαϊδουριού και Alexa κατά της κατσίκας Fluor 568 (1:500). Μετά τη στερέωση με μέσο στήριξης ProLong Diamond με DAPI, οι διαφάνειες απεικονίστηκαν με φασματικό ανεστραμμένο ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Leica SP8.

Στατιστική ανάλυση. Λεπτομερείς πληροφορίες (π.χ. το όνομα της δοκιμής, η μεταγενέστερη δοκιμή, η τιμή n, το επίπεδο άλφα, η τιμή p) για κάθε στατιστική δοκιμή παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Όλα τα δεδομένα πληρούν την υπόθεση της κανονικής κατανομής. Η δοκιμή κανονικότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Shapiro-Wilk με το επίπεδο άλφα ορισμένο στο 0.05. Οι συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test (two-tailed) και τρεις ομάδες ή περισσότερες συγκρίθηκαν μέσω μονόδρομης ANOVA με ανάλυση Tukey post-hoc. Η σύγκριση για τις καμπύλες συρμάτινου μυογράφου πραγματοποιήθηκε με χρήση αμφίδρομης ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">