Η έκθεση στα καυσαέρια ντίζελ αλλάζει την έκφραση των δικτύων που εμπλέκονται σε νευροεκφυλισμό στον εγκέφαλο Zebrafish Μέρος 1

Αφηρημένη

Οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες είναι μια κύρια αιτία αναπηρίας στον κόσμο, αλλά οι αιτιολογίες τους παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφείς. Οι γενετικοί παράγοντες μπορούν να αποτελούν μόνο μια μειοψηφία κινδύνου για τις περισσότερες από αυτές τις διαταραχές, υποδηλώνοντας ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αυτών των ασθενειών.

Οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες αναφέρονται σε ένα είδος ασθένειας που προκαλεί τον εκφυλισμό των εγκεφαλικών κυττάρων για διαφορετικούς λόγους. Οι κοινές περιλαμβάνουν τη νόσο του Αλτσχάιμερ, τη νόσο του Πάρκινσον, τη νόσο του Χάντινγκτον, κ.λπ. Αυτές οι ασθένειες επηρεάζουν τους νευρώνες στον εγκέφαλο, με αποτέλεσμα την εξασθενημένη εγκεφαλική λειτουργία και συμπτώματα όπως η μνήμη, η σκέψη και οι αλλαγές στη συμπεριφορά.

Ωστόσο, δεν χρειάζεται να χάσουμε τη θετική μας στάση εξαιτίας αυτών των ασθενειών. Υπάρχουν πολλοί τρόποι για να βοηθήσετε τους ασθενείς να βελτιώσουν τη μνήμη και να ανακουφίσουν τα συμπτώματα. Ας ρίξουμε μια ματιά σε μερικές από αυτές τις μεθόδους:

Πρώτα, κάντε σωματική άσκηση. Η έρευνα δείχνει ότι η σωματική δραστηριότητα βελτιώνει την κυκλοφορία του αίματος στον εγκέφαλο και αυξάνει την απελευθέρωση χημικών ουσιών όπως η ντοπαμίνη και οι ενδορφίνες, οι οποίες βοηθούν στην προστασία και βελτίωση της λειτουργίας των νευρώνων. Ταυτόχρονα, η άσκηση μπορεί επίσης να βοηθήσει στη μείωση προβλημάτων όπως το άγχος, η κατάθλιψη και η αϋπνία, κάνοντας τους ασθενείς πιο ευχάριστο να αντιμετωπίζουν τη ζωή.

Δεύτερον, διατηρήστε κοινωνικές σχέσεις. Είναι επίσης πολύ σημαντικό τα κοινωνικά μας δίκτυα να συνδέονται στενά με σχετικές περιοχές του εγκεφάλου και η κοινωνική αλληλεπίδραση μπορεί όχι μόνο να μειώσει το άγχος, αλλά και να βελτιώσει την υγεία του εγκεφάλου αυξάνοντας την ευτυχία, καταπολεμώντας την κατάθλιψη και πολλά άλλα.

Τέλος, τρώτε καλά και κοιμάστε αρκετά. Και οι δύο αυτές πτυχές μπορούν να έχουν σημαντικές επιπτώσεις στην υγεία του εγκεφάλου. Μια καλή διατροφή όχι μόνο πρέπει να περιλαμβάνει αρκετά θρεπτικά συστατικά, αλλά πρέπει επίσης να αποφεύγει την επανειλημμένη κατανάλωση υπερβολικής ποσότητας ζάχαρης, κορεσμένων λιπαρών και χοληστερόλης. Επιπλέον, ο επαρκής ύπνος μπορεί να βοηθήσει στην καταπολέμηση προβλημάτων μνήμης σε διάφορα στάδια, ειδικά σε ασθένειες όπως η νόσος του Αλτσχάιμερ.

Εν ολίγοις, οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες δεν σημαίνουν εγκατάλειψη των προσδοκιών για τη ζωή. Διατηρώντας μια θετική στάση, είναι επίσης απαραίτητο να υιοθετηθούν επιστημονικές και αποτελεσματικές μέθοδοι για τη βελτίωση της ποιότητας ζωής. Περισσότερο γέλιο και περισσότερη ηλιοφάνεια θα σας βοηθήσουν να παραμείνετε υγιείς. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό που έχει πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του Cistanche deserticola προέρχεται από τα πολλαπλά ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου μέσω ποικίλων οδών.

Κάντε κλικ στο Μάθετε 10 τρόπους για να βελτιώσετε τη μνήμη

Η παρατεταμένη έκθεση στην ατμοσφαιρική ρύπανση έχει πρόσφατα εντοπιστεί ότι αυξάνει τον κίνδυνο της νόσου του Αλτσχάιμερ και του Πάρκινσον, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους δρα δεν είναι καλά κατανοητοί.

Τα Zebrafishembryos που εκτίθενται σε εκχύλισμα σωματιδίων καυσαερίων ντίζελ (DEPe) οδηγούν σε δυσλειτουργική αυτοφαγία και απώλεια νευρώνων. Εδώ, εκθέσαμε έμβρυα zebrafish σε DEPe και πραγματοποιήσαμε αναλύσεις πρωτεωμικής και μεταγραφικής έκφρασης υψηλής απόδοσης από τον εγκέφαλό τους για να εντοπίσουμε παθογόνα μονοπάτια που προκαλούνται από την ατμοσφαιρική ρύπανση. Η θεραπεία με DEPe άλλαξε αρκετές βιολογικές διεργασίες και μονοπάτια σηματοδότησης που σχετίζονται με νευροεκφυλιστικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του ξενοβιοτικού μεταβολισμού, της ωρίμανσης του φαγοσώματος και της επεξεργασίας αμυλοειδούς. Η μεγαλύτερη επαγωγή γονιδιακής έκφρασης του εγκεφάλου ήταν στο Cyp1A (πάνω από 30-).

Η συνάφεια αυτής της αλλαγής έκφρασης επιβεβαιώθηκε με τον αποκλεισμό της επαγωγής χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9, η οποία είχε ως αποτέλεσμα μια δραματική αύξηση της ευαισθησίας στην τοξικότητα DEPe, επιβεβαιώνοντας ότι η επαγωγή Cyp1A ήταν ένας αντισταθμιστικός προστατευτικός μηχανισμός.

Αυτές οι μελέτες εντόπισαν διαταραγμένες μοριακές οδούς που μπορεί να συμβάλλουν στην παθογένεση νευροεκφυλιστικών διαταραχών. Τελικά, ο προσδιορισμός της μοριακής βάσης της ατμοσφαιρικής ρύπανσης αυξάνει τον κίνδυνο νευροεκφυλισμού θα βοηθήσει στην ανάπτυξη θεραπειών τροποποίησης της νόσου.

Λέξεις-κλειδιά

Ατμοσφαιρική ρύπανση · Άνοια · Νόσος του Πάρκινσον · Νόσος Αλτσχάιμερ · Μεταγραφοτομική · Πρωτεομική.

Εισαγωγή

Η ατμοσφαιρική ρύπανση συμβάλλει σημαντικά στη θνησιμότητα και σχετίζεται με αναπνευστικές παθήσεις, καρδιακές παθήσεις, εγκεφαλικό επεισόδιο, καρκίνο του πνεύμονα και διαβήτη. Τα αναδυόμενα επιδημιολογικά στοιχεία υποστηρίζουν μια σύνδεση μεταξύ της έκθεσης στην ατμοσφαιρική ρύπανση και της ανάπτυξης νευροεκφυλιστικών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των νόσων του Alzheimer και του Parkinson (AD και PD) (Fu et al. 2019). Υπάρχει έλλειψη ερευνών που διερευνούν τους μηχανισμούς με τους οποίους η ατμοσφαιρική ρύπανση μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο AD και PD, αλλά λίγοι που υπάρχουν υποστηρίζουν μια αιτιώδη σχέση (Fu et al. 2019).

Η συσσώρευση πρωτεϊνών στον εγκέφαλο είναι ένα καθολικό χαρακτηριστικό των νευροεκφυλιστικών διαταραχών και είναι πιθανώς μια κοινή οδός που οδηγεί σε νευρωνική δυσλειτουργία και θάνατο. Για παράδειγμα, ο σχηματισμός δομών αμυλοειδούς-βήτα (Α-βήτα) και ταυ είναι τα παθολογικά χαρακτηριστικά των συσσωματωμάτων AD και -συνουκλεΐνης (-syn) ή Lewy Bodies inPD (Ross and Poirier 2004; Woulfe 2008).

Οι αλλαγές στην πρωτεόσταση φαίνεται ότι τουλάχιστον εν μέρει αποτελούν τη βάση του σχηματισμού αυτών των συσσωματωμάτων, αλλά οι ακριβείς μηχανισμοί είναι ακόμα άγνωστοι και μπορεί να διαφέρουν στα άτομα ανάλογα με τους γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες κινδύνου. Γνωρίζουμε ότι η αυξημένη έκφραση ή η μειωμένη αποικοδόμηση του A-betaor-syn μπορεί να οδηγήσει σε AD και PD (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Άλλα κοινά χαρακτηριστικά στις νευροεκφυλιστικές διαταραχές είναι η φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες. Η ενεργοποιημένη μικρογλοία, τα φλεγμονώδη κύτταρα στο ΚΝΣ, μπορούν εύκολα να εκτιμηθούν σε αυτοψίες εγκεφάλων AD και PD και πιθανότατα συμβάλλουν στην παθογένεση του νευροεκφυλισμού (Kannarkat et al. 2013). Αυτή η φλεγμονή και πιθανώς η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία πιστεύεται ότι οδηγεί σε οξειδωτικό στρες το οποίο εκτιμάται επίσης στους εγκεφάλους που έχουν υποβληθεί σε αυτοψία (Picca et al. 2020).

Η πλειονότητα των μηχανιστικών μελετών για την ατμοσφαιρική ρύπανση και τον νευροεκφυλισμό μέχρι σήμερα έχει επικεντρωθεί στη φλεγμονή (Jayaraj et al. 2017). Η ατμοσφαιρική ρύπανση φαίνεται να αυξάνει τόσο τη φλεγμονή του ΚΝΣ όσο και το οξειδωτικό στρες στον εγκέφαλο ζώων και ανθρώπων (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a,b and c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; 2017; Yokota et al.2013a, b).

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ευρήματα ότι η ατμοσφαιρική ρύπανση αυξάνει την έκφραση ορισμένων φλεγμονωδών γονιδίων στον οσφρητικό βολβό (OB) των ποντικών, μια περιοχή του εγκεφάλου όπου η παθολογία της PD εμφανίζεται πολύ νωρίς στη νόσο (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a) . Φλεγμονή παρατηρήθηκε επίσης σε ινδοβίκους που ζούσαν σε αστικές περιοχές σε σύγκριση με αυτούς που ζούσαν σε αγροτικές περιοχές και οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι αυτές οι αλλαγές οφείλονταν σε υψηλά επίπεδα ατμοσφαιρικής ρύπανσης (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Οι ίδιοι συγγραφείς πρότειναν επίσης ότι το -syn συσσωρεύτηκε στους εγκεφάλους των ανθρώπων που ζουν σε πόλεις λόγω της ατμοσφαιρικής ρύπανσης (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). Σε μια πρόσφατη μελέτη σε μοντέλο ζέβρα, η έκθεση στο DEPe αναφέρθηκε ότι προκαλεί νευροτοξικότητα και σημαντική μείωση στον αριθμό των νευρώνων διαταράσσοντας την αυτοφαγία (Barnhill et al. 2020).

Το DEPe περιέχει πολλά από τα τοξικά συστατικά της ατμοσφαιρικής ρύπανσης και χρησιμοποιείται συνήθως για τη μοντελοποίηση της έκθεσης σε συστήματα κυτταροκαλλιέργειας (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). Η αυτοφαγία είναι ένας ουσιαστικός ενδοκυτταρικός μηχανισμός για την αφαίρεση και την εξάλειψη των λανθασμένων πρωτεϊνών και των κατεστραμμένων οργανιδίων.

Πράγματι, η ακριβής αυτοφαγική δραστηριότητα είναι απαραίτητη για την κυτταρική ομοιόσταση και η δυσλειτουργική αυτοφαγία στους νευρώνες οδηγεί σε αλλοιωμένη επιβίωση και νευροεκφυλισμό (Kesidou et al. 2013). Υπάρχουν σαφείς περιορισμοί σε πολλές από αυτές τις μελέτες, αλλά όλες υποδηλώνουν ότι η έκθεση στην ατμοσφαιρική ρύπανση αυξάνει τον κίνδυνο AD και Π.Δ. Η κατανόησή μας για τους μηχανισμούς με τους οποίους η ρύπανση αυξάνει αυτόν τον κίνδυνο είναι περιορισμένη, αλλά τα εξαιρετικά λεπτά σωματίδια και διάφορα συστατικά της ατμοσφαιρικής ρύπανσης μπορούν να εισέλθουν στον εγκέφαλο είτε απευθείας μέσω του οσφρητικού βολβού μέσω των πνευμόνων μέσω της κυκλοφορίας του αίματος (Kilian andKitazawa 2018).

Αυτά τα σωματίδια αποτελούνται από πυρήνα άνθρακα και προσροφημένες ενώσεις όπως πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες, μέταλλα, νιτρικά, θειικά και άλλα στοιχεία και αποτελούν σημαντικό ποσοστό των ατμοσφαιρικών ρύπων, ειδικά στις αστικές περιοχές. Πολλές από αυτές τις ενώσεις έχουν ενοχοποιηθεί για το ανοξείδωτο στρες και το κυτταρικό τοξικότητα προσθέτοντας αληθοφάνεια σε μια αιτιολογική συσχέτιση της ατμοσφαιρικής ρύπανσης και του νευροεκφυλισμού.

Λεπτομερείς διεπιστημονικές έρευνες, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικών και ζωικών μοντέλων, μπορούν να δώσουν πληροφορίες για τα αίτια της νόσου και άμεσες μελλοντικές θεραπευτικές προσεγγίσεις (Cannon και Greenamyre 2011). Μεταξύ των μοντέλων οργανισμών που χρησιμοποιούνται για in vivo μελέτες, το Danio rerio (ζέβρα) είναι ένα ισχυρό μοντέλο για τη μελέτη της τοξικολογίας, της μοριακής γενετικής, της τοξικογονιδιωματικής και της ανακάλυψης φαρμάκων.

Τα περισσότερα βιολογικά μονοπάτια διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό στα σπονδυλωτά και η πλειονότητα των λειτουργικών ανθρώπινων γονιδίων έχουν ομόλογα στα ψάρια ζέβρα (Vaz et al.2018). Επιπλέον, τα έμβρυα zebrafish αναπτύσσονται γρήγορα και ανεξάρτητα, επιτρέποντας την ανάλυση σε οποιοδήποτε επιθυμητό αναπτυξιακό στάδιο. Αυτά τα χαρακτηριστικά, σε συνδυασμό με την ταχεία αναπαραγωγή και το χαμηλό κόστος εκτροφής, καθιστούν το ζέβρα ένα ευνοϊκό μοντέλο για τη μελέτη των τοξικών επιπτώσεων της περιβαλλοντικής έκθεσης.

Για την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών πίσω από την παθογένεση της νόσου, έχει αναπτυχθεί ένα ευρύ φάσμα προσεγγίσεων προφίλ γονιδιακής έκφρασης υψηλής απόδοσης. Η πρωτεομική που βασίζεται στη φασματομετρία μάζας και ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA υψηλής απόδοσης υπόσχονται ιδιαίτερα τον εντοπισμό βιολογικών οδών ενδιαφέροντος. Αυτές οι τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την κατανόηση της απόκρισης κυτταρικών και ζωικών μοντέλων σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επιδιώξει αναλύσεις έκφρασης των επιπτώσεων της θεραπείας με DEPe τόσο στα προφίλ πρωτεώματος όσο και στα προφίλ μεταγραφής εντός των κεφαλών των εμβρύων zebrafish. Η απομόνωση δειγμάτων από το κεφάλι που αποτελείται κυρίως από τον εγκεφαλικό ιστό επέτρεψε τη λήψη περισσότερων ειδικών για τον ιστό προφίλ και ελαχιστοποιήθηκαν τα αποτελέσματα που προέρχονται από άλλους ιστούς. Περιγράφουμε εδώ τροποποιημένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης και πρωτεϊνών σε διάφορα μονοπάτια που εμπλέκονται στον νευροεκφυλισμό στα κεφάλια των ψαριών ζέβρα που εκτίθενται σε DEPe. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με τους πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους η ατμοσφαιρική ρύπανση αυξάνει τον κίνδυνο AD και PD.

Υλικό και μέθοδοι

Η θεραπεία ψαριών και το CRISPR/Cas9-μεσολάβησαν γενετικό νοκ ντάουν

Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δικαιωμάτων των Ζώων του UCLA. Το Zebrafish (ΑΒ) εκτράφηκε με διέγερση φωτός για 1 ώρα και ένας συνολικός αριθμός 200 αυγών επωάστηκαν για 24 ώρες στους 28 βαθμούς. Τα προκύπτοντα έμβρυα αποχοριώθηκαν σε προνάση (2 mg/ml) και υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με DEPe (Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) σε τελική συγκέντρωση 20 ug/ml είτε με φορέα μέχρι 5 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση (DPF).

Αυτή η συγκέντρωση επιλέχθηκε επειδή οδήγησε σε απώλεια νευρώνων όπως αναφέρθηκε προηγουμένως αλλά χωρίς σημαντική θνησιμότητα (Barnhillet al. 2020). Το Cyp1A knockdown fish παρασκευάστηκε ως εξής. Χρησιμοποιώντας εργαλεία διαθέσιμα στο http://crispr.mit.edu, theCRISPR RNA (Cyp1A-crRNA ) σχεδιάστηκε με βάση τη θέση των κατάλληλων θέσεων PAM στο πρώτο εξώνιο του γονιδίου Cyp1A.

Το καλύτερο σχέδιο αγοράστηκε από το IDT DNA (www.idtdna.com) μαζί με το πρότυπο CRISPR-Cas9 tracrRNA. Το crRNA για το Cyp1Agene και το tracrRNA επαναιωρήθηκαν ξεχωριστά σε 10 mM Tris–EDTA για να δώσουν τελική συγκέντρωση 100 μΜ. Στη συνέχεια, το tracrRNA συνδυάστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα crRNAin 1×duplex (100 mM οξικό κάλιο, 30 mM HEPES, pH 7,5, IDT DNA) για να δώσει μια τελική συγκέντρωση 10 μΜ. Το μίγμα θερμάνθηκε στους 95 βαθμούς για 5 λεπτά σε λουτρό ζέοντος νερού και ψύχθηκε αργά σε θερμοκρασία δωματίου για να επιτραπεί η ανόπτηση των συμπληρωματικών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών incrRNA και tracrRNA και ο σχηματισμός λειτουργικού οδηγού RNA (gRNA).

Στη συνέχεια, ένας όγκος 3 μL ανόπτησης gRNA συνδυάστηκε με τον ίδιο όγκο μονόκλωνου DNA δότη (ssDNA· 200 μΜ) ως αλληλουχία προτύπου για το μεταλλαγμένο Cyp1A. Ποσότητα 3 ug νουκλεάσης Cas9 (IDT) σε ρυθμιστικό διάλυμα 1 × έγχυσης (5 mM KCl, 0,1 Μ φωσφορικό νάτριο, ρΗ 6,8) προστέθηκε στο μίγμα για να σχηματίσει τα τελικά σύμπλοκα CRISPR/Cas9 ριβονουκλεοπρωτεΐνης (Cyp1A-RNP).

Για την παρασκευή του Scramble RNP (SC-RNP), το συγκεκριμένο Cyp1A-crRNA αντικαταστάθηκε από ένα εμπορικό Scramble-crRNA χωρίς στόχο στο γονιδίωμα. Αυτή η αλληλουχία όλων των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν την εργασία παρατίθεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1. Τα αυγά εγχύθηκαν υπό στερεομικροσκόπιο με περίπου 3 nL ενέσιμου μίγματος RNP.

Πραγματοποιήθηκαν πέντε βιολογικές επαναλαμβανόμενες ενέσεις (κάθε αντίγραφο περιελάμβανε 400–600 αυγά με ένεση Cyp1A-RNP και 100–200 με ένεση SC-RNP) και όλες οι μικροενέσεις ολοκληρώθηκαν μέσα σε 60 λεπτά. Τα αυγά τοποθετήθηκαν σε πλαστικά τρυβλία Petri 100 mm και επωάστηκαν στους 28 βαθμούς σε αυγόνερο. Ο ρυθμός επιβίωσης των εμβρύων παρακολουθήθηκε για έως και 7 ημέρες.

Οι εικόνες των επιζώντων ψαριών εξετάστηκαν για βαθμολογική δυσμορφία. Κάθε προνύμφη βαθμολογήθηκε με τυφλό τρόπο για την παρουσία 4 αναπτυξιακών δυσπλασιών, συμπεριλαμβανομένης της δυσπλασίας της κεφαλής, της δυσπλασίας της ουράς, του καρδιακού οιδήματος και του οιδήματος του κρόκου. Το στατιστικό T-test χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των σημαντικών διαφορών.

For more information:1950477648nn@gmail.com