Οι πολυσακχαρίτες Cistanche Deserticola έχουν νευροπροστατευτική δράση

για περισσότερες πληροφορίες:Ali.ma@wecistanche.com

Yue Liu, et al

Αφηρημένη:

Το ισχαιμικό εγκεφαλικό είναι μια ασθένεια με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα.CistanchedeserticolaπολυσακχαρίτεςΤο (CDP) έχει ένα ευρύ φάσμα ευεργετικών επιδράσεων, συμπεριλαμβανομένης της ηπατοπροστασίας και της ομοιόστασης του ανοσοποιητικού. Από όσο γνωρίζουμε, η προστατευτική επίδραση του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)σε νευρώνες που τραυματίστηκαν από στέρηση/επαναδιάχυση οξυγόνου-γλυκόζης (OGD/RP) δεν έχει διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, το OGD/RP τραυμάτισε ένα μοντέλο κυττάρων PC12. Εν συντομία, CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)({0}}.05, 0,5 και 5 ug/ml) χορηγήθηκε πριν από την επαναιμάτωση. Η προστατευτική επίδραση του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)Στη συνέχεια αξιολογήθηκε με βάση τη βιωσιμότητα των κυττάρων, η διαρροή γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), το [Ca2 plus] I, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP) και η κυτταρική απόπτωση, η κατάσταση του andredox μετά την επαναιμάτωση αξιολογήθηκε με προσδιορισμό αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), καταλάσης ( CAT), υπεροξειδάση γλουταθειόνης (GSH-Px) και συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα. Με βάση το γεγονός ότι η πρωτεΐνη DJ που σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον-1 συμμετέχει στην ενδογενή αντιοξείδωση και εκτελείνευροπροστατευτικόεπιδράσεις μετά το ισχαιμικό εγκεφαλικό, διερευνήσαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)και DJ{{0}}. Η έκφραση του DJ-1 ανιχνεύθηκε μέσω ELISA και ανάλυσης στυπώματος Western και η μετατόπιση του DJ-1 αξιολογήθηκε μέσω ανοσοφθορισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CDP (0.05, 0.5 και 5 ug/ml) μείωσε τον κυτταρικό θάνατο του PC12, διατήρησε την MMP και την ομοιόσταση του ασβεστίου. ανέστειλε το οξειδωτικό στρες και μειωμένη κυτταρική απόπτωση. Επιπλέον, το CDP (5 ug/ml) διεγείρει σημαντικά την έκκριση και την έκφραση του DJ{10}}. Συνολικά, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ασκεί ανευροπροστατευτικόεπίδραση έναντι τραυματισμού που προκαλείται από OGD/RP αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες και ρυθμίζοντας την οδό του DJ-1

Λέξεις-κλειδιά:Cistanche deserticola, Πολυσακχαρίτες, Νευροπροστατευτικό, Στέρηση/επαναδιάχυση γλυκόζης οξυγόνου, Οξειδωτικό στρεςDJ-1

Κάντε κλικ στα προϊόντα Cistanche UK

1. Εισαγωγή

Το ισχαιμικό εγκεφαλικό είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας και η κύρια αιτία μακροχρόνιας αναπηρίας παγκοσμίως [1]. Οι θάνατοι λόγω εγκεφαλικών επεισοδίων αναμένεται να αυξηθούν στα 7,8 εκατομμύρια το 2030 [2]. Στην Κίνα, 58 έως 142 ανά 100,000 άνθρωποι πεθαίνουν από εγκεφαλικό κάθε χρόνο. Επομένως, πρέπει να αναπτυχθούν αποτελεσματικές στρατηγικές που αντιστρέφουν τον τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Εκτεταμένα στοιχεία υποστηρίζουν ότι το οξειδωτικό στρες είναι ένας σημαντικός παράγοντας που προάγει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του εγκεφαλικού εμφράγματος κατά την επαναιμάτωση[3,4]. Επομένως, ανακαλύπτοντας αποτελεσματικάνευροπροστατευτικόπαράγοντες ικανοί να μειώσουν το ROS και να καταστέλλουν το οξειδωτικό στρες έχει προσελκύσει σημαντικό ενδιαφέρον στην έρευνα. Η πρωτεΐνη DJ-1 που σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον μεσολαβεί στη νευροπροστασία διεγείροντας την αντι-αποπτωτική και αντιοξειδωτική γονιδιακή έκφραση [4,5]. Ο DJ-1 μπορεί να μεταφερθεί στα μιτοχόνδρια με οξειδωτικό στρες και διέγερση μιτογόνου και μπορεί να εκκριθεί στην εξωκυτταρική μήτρα υπό παθολογικές καταστάσεις, όπως ο καρκίνος του μαστού, το μελάνωμα και ο τραυματισμός OGD/RP [6]. Επιπλέον, ο DJ-1 είναι χρήσιμος στη θεραπευτική στόχευση για ισχαιμικό νευροεκφυλισμό λόγω του κρίσιμου ρόλου του στην αντιοξείδωση [4,7]. Τα τελευταία 10 χρόνια, πολλές ομάδες επιβεβαίωσαν ότι ο DJ-1 το έχεινευροπροστατευτικόεπιδράσεις σε μοντέλα in vivofocal εγκεφαλικής ισχαιμίας και in vitro μοντέλα OGD/RP [6-9]. Εν τω μεταξύ, ορισμένα φάρμακα, συμπεριλαμβανομένης της κυκλοσπορίνης Α και του φαινυλοβουτυρικού νατρίου, ακυρώνουν τον θάνατο νευρωνικών κυττάρων μέσω ινισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου DJ-1 προς τα πάνω [9,10 ].

Cistanchedeserticola, το αναπόσπαστο αποξηραμένο φυτό τουCistanchedeserticolaΤο YCMa and Cistanche tubulosa Wight, παράγεται κυρίως στις ερημικές περιοχές της βόρειας και βορειοδυτικής Κίνας [11]. Το C. deserticola είναι βρώσιμο και έχει τιμηθεί ως το «Ginseng των ερήμων». Στη συνταγογράφηση βελονισμού, χρησιμοποιείται ως θεραπεία για χρόνια νεφρική νόσο, σεξουαλική ανικανότητα, γυναικεία υπογονιμότητα, λευκόρροια, μετρορραγία και γεροντική δυσκοιλιότητα [12].C. πολυσακχαρίτες deserticola, ένα κύριο δραστικό συστατικό που απομονώνεται απόCistanche deserticola. CDP, ρυθμίζει τη λειτουργία του ανοσοποιητικού και την ισορροπία των λιπιδίων και παρέχει προστασία από τη γήρανση, την οξείδωση και τη βλάβη του ήπατος. Επιπλέον, το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)αποτρέπει τον τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης στην καρδιά και το ήπαρ [13,14]. Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)είναι μη τοξικά[12,15,16] και άλλες φυτοχημικές ουσίες που εξάγονται από το C. Deserticola, συμπεριλαμβανομένου του εχινακοσίδη, του ισοακτεοσιδίου, του ακτεοσιδίου και του σαλιδροζίτη, παρουσιάζουννευροπροστατευτικόεφέ [11,12]. Ωστόσο, η πιθανή χρήση του CDP για τη βελτίωση της βλάβης από ισχαιμικό εγκεφαλικό δεν έχει αναφερθεί μέχρι στιγμής.

Στην παρούσα μελέτη, υποθέτουμε ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)αναστέλλει το οξειδωτικό στρες για νευροπροστασία. Οι πιθανές προστατευτικές επιδράσεις του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)Οι βλάβες από εγκεφαλικό επεισόδιο ινισχαιμίας εξετάστηκαν με τη χρήση κυττάρων PC12 τραυματισμένων με OGD/RP. Στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι υποκείμενες αλληλεπιδράσεις που σχετίζονται με τον DJ-1.

2. Μέθοδοι

2.1. Κυτταρική καλλιέργεια και μοντέλο OGD/RP

Τα κύτταρα PC12 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 που περιείχε 10 τοις εκατό FBS στους 37 βαθμούς σε έναν νορμοξικό επωαστήρα που περιείχε 5 τοις εκατό CO2. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 48 ώρες. Ετοιμάστηκε το μοντέλο OGD/RP. Τα κύτταρα PC12 πλύθηκαν και εκτέθηκαν σε ισορροπημένο διάλυμα άλατος Earle. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε έναν αναερόβιο θάλαμο που περιείχε 5 τοις εκατό CO2 και 95 τοις εκατό Ν2 στους 37 βαθμούς για 4 ώρες και στη συνέχεια αφέθηκαν να υποστούν εκ νέου οξυγόνωση. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, ο ίδιος όγκος μέσου καλλιέργειας προστέθηκε στα κύτταρα. Μετά την επαναοξυγόνωση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κανονικό επωαστήρα για 24 ώρες.

2.2. Χορήγηση φαρμάκου

CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)αγοράστηκε από την Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Κίνα (C23J7Y18405, > 98 τοις εκατό καθαρότητας). Η νιμοδιπίνη, ένα φάρμακο πρώτης γραμμής για το ισχαιμικό εγκεφαλικό, χρησιμοποιήθηκε ως θετική ένωση ελέγχου [17-19]. Η ένεση νιμοδιπίνης προήλθε από την Bayer Company. Τα κύτταρα χωρίστηκαν τυχαία σε έξι ομάδες, συγκεκριμένα, το μάρτυρα, ve hicle (OGD/RP), Nimo (5 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)(0.05 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)(0.5 ug/ml) και CDP (5 ug/ml). Νιμοδιπίνη και CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)προστέθηκαν πριν από την επαναιμάτωση. Η ομάδα ελέγχου καλλιεργήθηκε σε ένα κανονικό μέσο και επωάστηκε υπό μια νορμοξική κατάσταση.

2.3. Βιωσιμότητα κυττάρων: Αναλύσεις MTT και NRU

Κύτταρα PC12 (6 χ 103 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96-πλάκα καλλιέργειας φρεατίου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τις απαιτήσεις κάθε ομάδας. ΜΤΤ (Solarbio, Κίνα) προστέθηκε στα κύτταρα σε συγκέντρωση 5 mg/ml και επωάστηκε για 4 ώρες στους 37 βαθμούς. Η φορμαζάνη είναι το αναγωγικό προϊόν της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης σε ζωντανά κύτταρα [20]. Προστέθηκε DMSO για τη διάλυση της παραγόμενης μπλε φορμαζάνης. Η απορρόφηση σε μήκος κύματος 490 nm ανιχνεύθηκε με Microplate Reader (Thermo, USA) αφού τα κύτταρα ανακινήθηκαν για 10 λεπτά στους 25 βαθμούς. Τα αποτελέσματα της κυτταρικής βιωσιμότητας εκδηλώθηκαν ως ποσοστό της ομάδας ελέγχου [21].

Η δοκιμασία ουδέτερης πρόσληψης ερυθρού (NRU) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο [22]. Όταν ολοκληρώθηκαν οι περίοδοι επαναιμάτωσης, προστέθηκε ουδέτερο κόκκινο (Solarbio, Κίνα) στα κύτταρα σε συγκέντρωση 50 ug/ml. Το μίγμα επωάστηκε για 3 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν ταχέως με ένα διάλυμα που περιείχε 0,5 τοις εκατό φορμαλδεΰδη και 1 τοις εκατό χλωριούχο ασβέστιο. Τα κύτταρα στη συνέχεια προστέθηκαν σε ένα μίγμα που περιείχε 1 τοις εκατό αιθυλικό οξύ και 50 τοις εκατό άνυδρο αιθανόλη. Οι πλάκες διαβάστηκαν σε απορρόφηση 540 nm αφού τα κύτταρα ανακινήθηκαν για 20 λεπτά στους 37 βαθμούς. Τα αποτελέσματα της κυτταρικής βιωσιμότητας εκδηλώθηκαν ως ποσοστό της ομάδας ελέγχου.

Πολυσακχαρίτες Cistanche deserticolaέχω έναΝευροπροστατευτικό αποτέλεσμα

2.4. Εκτίμηση κυτταροτοξικότητας

Η LDH είναι ένα κυτταροπλασματικό ένζυμο που καταλύει την οξείδωση του γαλακτικού τοπυροσταφυλικού. Η LDH απελευθερώνεται γρήγορα στο εξωκυττάριο υγρό όταν η κυτταρική μεμβράνη είναι κατεστραμμένη. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση LDH πραγματοποιείται συνήθως για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας. [23]. Η πειραματική διαδικασία ακολούθησε τις οδηγίες του εμπορικού κιτ που παρέχονται από το κιτ δοκιμασίας LDH (Jiancheng, Κίνα). Η απορρόφηση κάθε δείγματος ανιχνεύθηκε στα 440 nm με συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Το ποσοστό του κυτταρικού θανάτου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Βιωσιμότητα ( ποσοστό )=(Θεραπεία OD − Κενό ODTreatment)/(Δραστηριότητα OD Max LDH − Κενό OD Max Activity LDH) × 100 τοις εκατό .

2.5. Ανίχνευση ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης Ca2 συν

Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση Ca2 plus μετρήθηκε με Fluo-3/AM [15]. Τα κύτταρα PC12 πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και στη συνέχεια επωάστηκαν με 2 μM Fluo-3/AM (Beyotime, Κίνα) για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές για τον καθαρισμό της εξωκυτταρικής χρωστικής. Η ένταση φθορισμού του Fluo-3/AM προσδιορίστηκε σε ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (Olympus, Ιαπωνία). Πακέτο λογισμικού Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer και ImageJχρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό τιμών κλίμακας του γκρι

2.6. Μέτρηση MMP

Το JC-1 (5,5',6,6'-τετραχλωρο-1,1',3,3'-τετρααιθυλο-ιμιδακαρβοκυανίνη; Beyotime, Κίνα) είναι ένας βολικός ευαίσθητος στην τάση ανιχνευτής που χρησιμοποιείται γενικά για χρώση κύτταρα και αξιολόγηση MMP [24]. Τα κύτταρα PC12 πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα μίγμα που περιείχε 50 τοις εκατό μέσο και 50 τοις εκατό υγρό εργασίας για 15 λεπτά στους 37 βαθμούς στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, το μίγμα απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε από ένα φρέσκο ​​μέσο. Οι κόκκινες και οι πράσινες εικόνες φθορισμού καταγράφηκαν μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης λέιζερ. Η σχετική αναλογία των κόκκινων και πράσινων σημάτων φθορισμού χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση MMP [25]. Το πακέτο λογισμικούOlympus FV10-ASW 4.1 Viewer και ImageJ χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό των τιμών κλίμακας του γκρι.

2.7. Δοκιμασία ανίχνευσης απόπτωσης, Hoechest33342 και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Το Hoechst33342, μια χρωστική που δεσμεύει το DNA, χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση της κυτταρικής απόπτωσης [26]. Μετά την επαναιμάτωση, τα κύτταρα PC12 πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και επωάστηκαν με Hoechst33342 (Beyotime, China) σε συγκέντρωση 5 μg/ml για 15 λεπτά στους 37 βαθμούς στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ. Τα θεαποπτωτικά κύτταρα εμφάνισαν έντονο μπλε φθορισμό και συμπύκνωση πυρήνα. Για κάθε πείραμα χρώσης, συλλήφθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν τρία τυχαία πεδία. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer και ImageJχρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό τιμών κλίμακας του γκρι. Τα ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκαν μέσω του ακόλουθου τύπου: αποπτωτική ποσότητα/συνολική ποσότητα × 100 τοις εκατό [27].

2.8. Μέτρηση παραγωγής ROS

Ο φθορίζων ανιχνευτής 2',7'-διχλωροφθοροσκεΐνη-διοξεική (DCFH-DA; Jiancheng, Κίνα) μπορεί να διεισδύσει στις κυτταρικές μεμβράνες και μπορεί να υδρολυθεί σε μη φθορίζον DCFH. Το DCFH οξειδώνεται από ενδοκυτταρικό ROS σε φθορίζον DCF [29]. Μετά την επαναιμάτωση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με DCFH-DA σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ για 45 λεπτά στους 37 βαθμούς στο σκοτάδι. Ο φθορισμός παρατηρήθηκε με φασματοφωτόμετρο φθορισμού με μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 535 nm.

Πολυσακχαρίτες Cistanche deserticolaέχω έναΝευροπροστατευτικό αποτέλεσμα

2.9. Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες: επίπεδα CAT, GSH-Px και T-AOC

Τα κύτταρα ξύστηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Τα ληφθέντα κυτταρικά εναιωρήματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους 45 φορές σε πάγο και φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 r/min για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς. Τα υπερκείμενα διατηρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για ανίχνευση [24]. Η συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του υπερκειμένου του κυττάρου μετρήθηκε με ένα κιτ αντιδραστηρίου προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (KeyGEN, China). Οι δραστηριότητες των επιπέδων CAT, GSH-Px και T-AOC μετρήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών (Jiancheng, Κίνα). Η απορρόφηση κάθε δείγματος ανιχνεύθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.

2.10. Μέτρηση εξωκυτταρικής συγκέντρωσης DJ-1

Κύτταρα PC12 (6 × 103 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96-πλάκες καλλιέργειας φρεατίων. Μετά από επαναιμάτωση, το υπερκείμενο κυτταρικό υγρό συλλέχθηκε και αναλύθηκε με κιτ ELISA DJ-1/PARK{-7 (Raybio, ΗΠΑ ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [9]. Η απορρόφηση κάθε δείγματος ανιχνεύθηκε με Microplate Reader σε διπλό μήκος κύματος 450 nm ή 540 nm.

2.11. Ανάλυση Western blot

Οι κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό λύσης σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών (KeyGEN, Κίνα). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κιτ αντιδραστηρίου δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA. Ίσες ποσότητες προϊόντων λύσης πρωτεΐνης (20 μg) από κάθε ομάδα διαχωρίστηκαν σε ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου 12 τοις εκατό και ακολούθως μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη επωάστηκε με PBS που περιείχε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια διερευνήθηκε με αντισώματα αντι-PARK7/DJ-1 (ab76008, Abcam; αραίωση 1:1000) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Στη συνέχεια, η μεμβράνη πλύθηκε τρεις φορές με PBST και επωάστηκε με δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (SA{14}}, Proteintech Group, αραίωση 1:5000) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Το αντίσωμα αντι- -Tubulin (10759-1-AP, Proteintech Group; αραίωση 1:1000) θεωρήθηκε ως ο έλεγχος. Οι πρωτεϊνικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν με αντιδραστήρια αντίδρασης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Οι πυκνότητες ζώνης μετρήθηκαν με το λογισμικό QuantityOne Analysis v.4.6.9.

2.12. Ανάλυση ανοσοκυτταροχημείας

Τα κύτταρα PC12 σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου μετά την επεξεργασία επαναιμάτωσης [9]. Αφού αφαιρέθηκε η υπερβολική παραφορμαλδεΰδη, τα κύτταρα επωάστηκαν σε PBS που περιείχε 0,3 τοις εκατό Triton X-100 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές προτού επωαστούν με 5 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με μονοκλωνική αλυσίδα συνθάσης αντι-ATP ποντικού κουνελιού (MABS1304, EMD Millipore, αραίωση 1:200) για τη χρώση των μιτοχονδρίων και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-PARK7/DJ-1 (αραίωση 1: 100) για την ανίχνευση πρωτεΐνης DJ-1. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με IgG-Alexa 488 αντι-κουνελιού κατσίκας (πράσινο, Α11034, Invitrogen, αραίωση 1:1000) και IgG-Alexa 594 αντι-ποντικού κατσίκας (κόκκινο, Α11032, Invitrogen, αραίωση 1:1900) ελάχ. Τελικά, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες με ένα μέσο στερέωσης που περιέχει DAPI. Οι εικόνες ανοσοφθορισμού οπτικοποιήθηκαν με χρήση ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης με λέιζερ.

Πολυσακχαρίτες Cistanche deserticolaέχω έναΝευροπροστατευτικό αποτέλεσμα

2.13. Δεδομένα/στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές εμφανίστηκαν ως μέσος όρος ± SD. Η σημασία προσδιορίστηκε με ανάλυση διακύμανσης μονής κατεύθυνσης (ANOVA), ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Dunnett. p < .05="" θεωρήθηκε="" ως="" στατιστική="" σημαντικότητα.="" τα="" πειραματικά="" δεδομένα="" αναλύθηκαν="" με="" τη="" χρήση="" στατιστικού="" λογισμικού="" spss="">

3. Αποτελέσματα

3.1. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ανέστειλε την επαγόμενη από OGD/RP κυτταρική βλάβη

Τα κύτταρα PC12 που εκτέθηκαν σε OGD/RP εμφάνισαν σημαντική μείωση σε αριθμό. Το σχήμα του κυττάρου άλλαξε και η κυτταρική μεμβράνη έσπασε. Στην ανάλυση MTT, οι βιωσιμότητα των κυττάρων στο CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)οι ομάδες ({0}},05, 0,5 και 5 ug/ml) ήταν 58,91 τοις εκατό ± 5,40 τοις εκατό , 61,13 τοις εκατό ± 3,81 τοις εκατό και 68,57 τοις εκατό ± 3,24 τοις εκατό αντίστοιχα, p < .05="" (εικ.="" 1α)="" ,="" και="" αυτό="" με="" όχημα="" είχε="" 51,68="" τοις="" εκατό="" ±="" 3,89="" τοις="" εκατό="" .="" αυτές="" οι="" τιμές="" έδειξαν="" ότι="" το="">(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)προστάτευσε τα κύτταρα από τραυματισμό OGD/RP και μείωσε τον κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, η κυτταρική βιωσιμότητα στην ομάδα Nimo ήταν 77,02 τοις εκατό ± 5,22 τοις εκατό, το οποίο είναι σχεδόν ίσο με αυτό στο 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδα θεραπείας.

Στον προσδιορισμό NRU, οι βιωσιμότητα των κυττάρων στο CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)οι ομάδες ({0}},05, 0,5 και 5 ug/ml) ήταν 52,03 τοις εκατό ± 4,72 τοις εκατό , 58,49 τοις εκατό ± 2,50 τοις εκατό και 69,17 τοις εκατό ± 3,91 τοις εκατό, αντίστοιχα, (Εικ. 1Β) και ότι με όχημα είχε 47,14 τοις εκατό ± 2,88 τοις εκατό. Οι τιμές έδειξαν την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση προστατευτική επίδραση του CDP.

Σε αντίθεση με ένα όχημα (44,73 τοις εκατό ± 3,30 τοις εκατό), η απελευθέρωση LDH μειώθηκε σημαντικά στο CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδες. Στο CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδες ({0}}.05, 0,5 και 5 ug/ml), τα ποσοστά διαρροής LDH ήταν 32,41 τοις εκατό ± 3,70 τοις εκατό , 27,13 ± 2,79 τοις εκατό και 23,13 τοις εκατό ± 4,59 τοις εκατό αντίστοιχα, p < .01="" (εικ.="" .="" 1c).="" επιπλέον,="" τα="" ποσοστά="" διαρροής="" ldh="" στην="" ομάδα="" nimo="" ήταν="" 21,99="" τοις="" εκατό="" ±="" 4,02="" τοις="" εκατό,="" το="" οποίο="" ήταν="" σχεδόν="" ίσο="" με="" εκείνο="" στην="" ομάδα="" που="" έλαβε="" αγωγή="" με="" 5="" ug/ml="">

3.2. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)εξασθενημένη αύξηση που προκαλείται από OGD/RP του [Ca2 συν]i

Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα Ca2 plus στα κύτταρα PC12 αυξήθηκαν σε 4146,60 ± 195,97 μετά από τραυματισμό OGD/RP σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου (373,62 ± 75,69). Το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδες ({0}}.05, 0,5 και 5 μg/ml) θα μπορούσαν ανάλογα με τη δόση να μειώσουν το ενδοκυτταρικό επίπεδο Ca2 συν σε 2921,25 ± 222,19, 2015,85 ± 230,53 και 1768,43 ± 426,12, αντίστοιχα (Εικ. ). Επιπλέον, το επίπεδο Ca2 plus στην ομάδα που έλαβε αγωγή με 5 μg/ml CDP μειώθηκε σε επίπεδο συγκρίσιμο με εκείνο στην ομάδα Nimo (1591,19 ± 213,21).

3.3. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)εξασθενημένη διάχυση της MMP που προκαλείται από OGD/RP

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (1.67 ± 0.89), η ομάδα οχημάτων (0.48 ± 0.10) εμφάνισε περισσότερο πράσινο φθορισμό FL από ό,τι κόκκινο FL φθορισμού (Εικ. 2Β και Δ). Οι αναλογίες μεταξύ κόκκινου και πράσινου φθορισμού FL μειώθηκαν σε 1,11 ± 0,26 και 1,18 ± 0,16 στα 0,5 και 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδες που έλαβαν θεραπεία αντίστοιχα, p < 0,01.="" ο="" φθορισμός="" πράσινου="" fl="" μειώθηκε="">

3.4. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)εμπόδισε την επαγόμενη από OGD/RP απόπτωση των κυττάρων

Κύτταρα που εμφάνιζαν συμπυκνωμένες χρωματίνες ή κατακερματισμένους πυρήνες βαθμολογήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα [30]. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Hoechst33342 αποκάλυψαν την εμφάνιση συμπυκνωμένων πυρήνων μετά από OGD/RP (Εικ. 3Α και Γ). Παρατηρήθηκε υψηλή ένταση φθορισμού FL στους πυρήνες της ομάδας οχήματος. Η ένταση φθορισμού FL των πυρήνων αποδυναμώθηκε στα 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδα θεραπείας. Αναλύσαμε τον αποπτωτικό ρυθμό στα κύτταρα PC12 με συναδέλφους κυτταρομετρία χρησιμοποιώντας διπλή χρώση FITC-Annexin V/PI (Εικ. 3Β και D). Η ομάδα ελέγχου είχε 4,16 τοις εκατό ± 0,24 τοις εκατό ποσοστό απόπτωσης κυττάρων, ενώ η ομάδα φορέα είχε 22,98 τοις εκατό ± 0,66 τοις εκατό. Στην ομάδα που έλαβε 5 ug/ml CDP, το ποσοστό απόπτωσης κυττάρων ήταν 7,{14}} τοις εκατό ± 1,16 τοις εκατό .

3.5. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)εξασθενημένη ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS που προκαλείται από OGD/RP και διατηρημένη κατάσταση οξειδοαναγωγής

Οι επιπτώσεις του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)σχετικά με το οξειδωτικό στρες αποδείχθηκαν με βάση τη δημιουργία ROS, GSH-Px, δραστηριότητες CAT και επίπεδα T-AOC. Τα επίπεδα ROS στα κύτταρα PC12 που έχουν τραυματιστεί με OGD/RP αυξήθηκαν και έγιναν σημαντικά υψηλότερα από αυτά στην ομάδα ελέγχου (p < 0,01).="" εν="" τω="" μεταξύ,="" τα="" επίπεδα="" ros="" στο="">(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδες ({0}}.05, 0,5 και 5 ug/ml) μειώθηκαν κατά τρόπο δοσοεξαρτώμενο (ρ < 0,01;="" εικ.="" 4α).="" περαιτέρω,="" το="" cdp="" αύξησε="" επίσης="" σημαντικά="" τα="" επίπεδα="" t-aoc="" (p="">< 0,05;="" εικ.="" 4β),="" cat="" (p="">< 0,05;="" σχ.="" 4c)="" και="" gsh-px="" (p="">< 0,05;="" εικ.="" 4d)="" σε="" σύγκριση="" με="" το="" όχημα="" ομάδα.="" οι="" δραστηριότητες="" των="" ενδογενών="" αντιοξειδωτικών="" στο="">(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)ομάδες αυξήθηκαν.

3.6. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)διέγειρε την έκκριση του DJ-1 και ενίσχυσε την έκφραση του DJ-1

Οι αλλαγές συγκέντρωσης του DJ-1 στο υπερκείμενο του κυττάρου εντοπίστηκαν και αποκάλυψαν την πιθανή σχέση μεταξύ του DJ-1 και του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες). Παρατηρήθηκε απελευθέρωση DJ-1 από τα κύτταρα PC12 που έχουν τραυματιστεί από OGD/RP (Εικ. 5). Ο DJ-1 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω στο 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)-ομάδα που έλαβε αγωγή (38,66 ± 8,44 pg/ml) και αυξήθηκε σημαντικά από εκείνη στην ομάδα φορέα (18,33 ± 3,80 pg/ml, p < 0,01) και την ομάδα ελέγχου (9,67 ± 3,96 pg/ml, p < 0,01) .

Για τη διερεύνηση των επιπτώσεων του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)στην ενδοκυτταρική έκφραση του DJ-1, μετρήσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης DJ-1 με Western blotting. Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης DJ-1 αυξήθηκαν σημαντικά 24 ώρες μετά την επαναιμάτωση. Αντίθετα, η 5 ug/ml CDP μετά τη θεραπεία ενίσχυσε σημαντικά την υπερέκφραση του DJ-1 σε σύγκριση με την ομάδα οχημάτων (p < .01,="" εικ.="">

3.7. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)βελτιωμένη μετατόπιση του DJ-1 στα μιτοχόνδρια

Τα κύτταρα PC12 χρωματίστηκαν με αντισώματα αντι-PARK7/DJ-1 και αντι-ΑΤΡ αλυσίδας συνθάσης (Εικ. 7 και 8). Οι δεσμοί αντισώματος αντι-ΑΤΡ συνθάσης - αλυσίδας με το μιτοχονδριακό σύμπλεγμα Ι και το δεσμευτικό αντιγόνο εντοπίστηκαν στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ο DJ-1 μετατοπίστηκε στη μιτοχονδριακή εσωτερική μεμβράνη μετά από προσβολή OGD/RP (Εικ. 8). Εν τω μεταξύ, τα αποτελέσματα διπλής χρώσης DJ{-1 και μιτοχονδρίων αποκάλυψαν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)διευκόλυνε τη μετατόπιση και συνεντοπισμό του μιτοχονδριακού DJ- 1 (Εικ. 8). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ του DJ-1 και τουνευροπροστατευτικόεπίδραση του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)(Εικ. 9).

4. Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, αναφέραμε από πρώτο χέρι ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)μειώνει αποτελεσματικά τη βλάβη των κυττάρων PC12 που προκαλείται από OGD/RP μέσω της ανοδικής ρύθμισης της πρωτεΐνης DJ-1. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)βελτιωμένη κυτταρική βιωσιμότητα, μειωμένη βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης, διατήρηση ενδοκυτταρικού Ca2 συν ομοιόσταση, αποτροπή απώλειας MMP, μειωμένη απόπτωση κυττάρων, καταστολή οξειδωτικού στρες, προώθηση της έκφρασης του DJ-1 και ενισχυμένη μετατόπιση DJ-1 στα μιτοχόνδρια. Ο DJ-1 έχει εμπλακεί πρόσφατα στη ρύθμιση τουνευροπροστατευτικόεπίδραση και μιτοχονδριακή ακεραιότητα. Αυτά τα αποτελέσματα παρείχαν πειστικές αποδείξεις για τονευροπροστατευτικόεπιπτώσεις του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)κατά της ισχαιμίας. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση μεταξύ CDP και DJ-1 παίζει ανευροπροστατευτικόρόλο στη βλάβη των κυττάρων PC12 που προκαλείται από OGD/RP. Τα παραπάνω αποτελέσματα μπορεί να αναπτύξουν την κατανόησή μας για την ευεργετική επίδραση του CDP και μπορεί να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τη θεραπεία του εγκεφαλικού στο μέλλον.

Το ισχαιμικό εγκεφαλικό έχει αποδοθεί σε μια σύνθετη σειρά βιοχημικών και μοριακών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της διεγερτικής τοξικότητας, της υπερφόρτωσης ασβεστίου και του οξειδωτικού στρες [31]. Το OGD/RP χρησιμοποιείται ευρέως ως in vitro μοντέλο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης και χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση νευρολογικών και βιοχημικών αλλαγών. Η κυτταρική σειρά PC12 είναι ευαίσθητη σε τραυματισμό OGD/RP [2]. Παρουσιάζει έναν αριθμό ιδιοτήτων και χαρακτηριστικών των συμπαθητικών νευρώνων [32] και επομένως χρησιμοποιούνται ευρέως νευρωνικές κυτταρικές σειρές για έρευνα που σχετίζεται με τους μηχανισμούς νευρολογικής βλάβης λόγω εγκεφαλικού [33,34]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι το οξειδωτικό στρες παίζει ζωτικό ρόλο στο εγκεφαλικό επεισόδιο και τη βλάβη της ισχαιμίας του εγκεφάλου [35-37]. Η πρωτεΐνη DJ που σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον-1 μπορεί να αναστείλει τον ισχαιμικό νευροεκφυλισμό και τη συμπεριφορική δυσλειτουργία μειώνοντας τη νευρωνική βλάβη που προκαλείται από ROS [7]. Επομένως, χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο κυττάρων PC12 με τραυματισμό OGD/RP για να διερευνήσουμε τονευροπροστατευτικόεπίδραση του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες).

Ο βαθμός βλάβης σε κύτταρα PC12 που προκλήθηκε από OGD/RP αξιολογήθηκε με προσδιορισμούς απελευθέρωσης MTT, NRU και LDH. Διαχείριση CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)({{0}}.05, 0,5 και 5 ug/ml) βελτίωσε την κυτταρική επιβίωση και μείωσε την απελευθέρωση LDH. Τα ευεργετικά αποτελέσματα της θεραπείας με CDP περιελάμβαναν επίσης τη μείωση της ενδοκυτταρικής υπερφόρτωσης ασβεστίου και τη διατήρηση της MMP. Οι ανωμαλίες της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης Ca2 συν, ιδιαίτερα η υπερφόρτωση μιτοχονδριακού ασβεστίου, έχουν συνδεθεί με νευρωνική απόπτωση και θάνατο που προκαλείται από ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο [38]. Η MMP μπορεί να αντανακλά την αποτελεσματικότητα της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και έχει υποδειχθεί ως δείκτης παθολογικής διαταραχής αυτού του συστήματος [39]. Και οι δύο αυξήσεις του ενδοκυτταρικού Ca2 συν συγκέντρωση και η απώλεια MMP μπορεί να οδηγήσουν σε αποσταθεροποίηση της δομής του νευρώνα και τελικά να οδηγήσουν σε κυτταρική βλάβη ή κυτταρικό θάνατο [21,40]. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CDP ανέστειλε σημαντικά το ενδοκυτταρικό Ca2 συν υπερφόρτωση και αύξησε τα επίπεδα MMP σε κύτταρα PC12 με τραυματισμό OGD/RP. Η απόπτωση παίζει ζωτικό ρόλο στη σύνθετη παθοφυσιολογία της εγκεφαλικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Τα αυξανόμενα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η απόπτωση έχει εμπλακεί σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. η διάχυση της ΜΜΡ είναι ένα πρώιμο γεγονός που οδηγεί σε απόπτωση των κυττάρων [8,39]. Η απόπτωση είναι μια διαδικασία εξαρτώμενου από την ενέργεια προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου για την απόρριψη περιττών κυττάρων. Πολλοί νευρώνες στο ισχαιμικό εγκεφαλικό θα υποστούν απόπτωση [41]. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε χρώση Hoechst33342 και Annexin V-FITC/PI για να εξετάσουμε την επίδραση της CDP στην απόπτωση [23,28]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CDP διατηρεί την ακεραιότητα του πυρήνα και μειώνει το ρυθμό κυτταρικής απόπτωσης. Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αντι-αποπτωτική δράση του CDP συνέβαλε στην ευεργετική επίδραση στη νευρωνική βλάβη στα κύτταρα PC12.

Κύτταρα που υφίστανται βλάβη ισχαιμίας που προκαλείται από υπερβολική συσσώρευση ROS, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε υπεροξείδωση λιπιδίων, βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης, υπερφόρτωση ασβεστίου και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, καταλήγοντας τελικά σε απόπτωση και θάνατο των κυττάρων [42]. Η κατανάλωση ενδογενών αντιοξειδωτικών, όπως SOD, CAT και GSH-Px, έδειξε επίσης την εμφάνιση Εικ. 9. Πιθανοί μηχανισμοί για τις προστατευτικές επιδράσεις του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)έναντι βλάβης των κυττάρων PC12 που προκαλείται από OGD/RP. Η θεραπεία του CDP καταστέλλει το οξειδωτικό στρες, σταθεροποιεί τη συγκέντρωση Ca2 συν και MMP, ενισχύει την έκφραση του DJ-1 και τον εντοπισμό στα μιτοχόνδρια. Y. Liu et αϊ. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 678του οξειδωτικού στρες κατά την ισχαιμία-επαναδιάχυση. Σε αυτή τη μελέτη, η ομάδα OGD/RP έδειξε σημαντική αύξηση στο ROS και μείωση στα CAT, GSH-Px και T-AOC σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε 5 ug/ml CDP. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ουσιαστικές μειώσεις στα ποσοστά παραγωγής ROS και κατανάλωσης ενδογενών αντιοξειδωτικών (CAT, GSH-Px και T-AOC) στις ομάδες CDP. Τα ευεργετικά αποτελέσματα στην ομάδα CDP των 5 ug/ml ήταν κοντά σε αυτά της ομάδας Nimo. Τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το CDP αναστέλλει τη δημιουργία ROS και αποκαθιστά την ενζυμική αντιοξειδωτική άμυνα.

Ο DJ-1 είναι ένα βασικό οξειδοαναγωγικό αντιδραστικόνευροπροστατευτικόπρωτεΐνη που εμπλέκεται στη ρύθμιση του οξειδωτικού στρες στο εγκεφαλικό. Τα ευεργετικά αποτελέσματα της υπερέκφρασης του DJ-1 περιλαμβάνουν την κυτταρική επιβίωση από ισχαιμία-επαναιμάτωση και τη διατήρηση της μιτοχονδριακής λειτουργίας και μορφολογίας, όπως η καθίζηση του ανοίγματος μεταβατικού πόρου της διαπερατότητας των μιτοχονδρίων [39,43]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η προστατευτική δράση του DJ-1 σε κύτταρα που εκτίθενται σε OGD/RP σχετίζεται με τις αντιοξειδωτικές του ιδιότητες και τη μετατόπιση των μιτοχονδρίων [43-45]. Ο DJ-1 εκτελεί αποτελεσματική ενδογενή νευροπροστασία στον μετριασμό των μιτοχονδριακών ελαττωμάτων μέσω μετατόπισης [46]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η μετατόπιση του DJ{10}} μπορεί να έχει επίδραση στην κίνηση των μιτοχονδρίων, να ενισχύει την αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου και να προάγει άλλες διαδικασίες για την επιβίωση των κυττάρων.

Ο DJ-1 επηρεάζει διάφορες διαδικασίες, όπως η κυτταρική μετανάστευση και προσκόλληση, η χημειοταξία, ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση, τόσο σε μοντέλα in vitro όσο και in vivo [6,9,47,48]. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο εγκεφαλικού επεισοδίου τραυματισμένων κυττάρων PC12 OGD/RP, διερευνήσαμε μια πιθανή σχέση μεταξύ του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)και DJ-1. Η υπερέκφραση του DJ- 1 εντοπίστηκε με ELISA και Western blotting. Μαζί με αυτή τη συνάρτηση, ένα σημαντικό εύρημα στα πειράματα έδειξε ότι η σημαντική υπερέκφραση του DJ-1 συνέβη όταν το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)(5 μg/ml) χορηγήθηκε πριν από την επαναιμάτωση. Αυτό πρότεινε ένα δυνατόνευροπροστατευτικόεπίδραση στη σχέση CDP και DJ-1. Επιπλέον, έχουμε παρατηρήσει ότι ο DJ-1 που βρίσκεται στα μιτοχόνδρια υπό συνθήκες OGD/RP και άφθονη έκφραση του DJ-1 μείωσε την κυτταρική ευαισθησία στο ROS και ανέστειλε το οξειδωτικό στρες [45]. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CDP ρυθμίζει και ενισχύει το DJ-1, το οποίο δρα ως μοριακός σύνδεσμος μεταξύ της δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων και του οξειδωτικού στρες και παρέχει μια εξέλιξη του δευτερογενούς κυτταρικού θανάτου που είναι εγγενής στο εγκεφαλικό επεισόδιο [5,47,49-51]. Παράλληλα με τη σταθεροποίηση του DJ-1 στα μιτοχόνδρια, CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)Η θεραπεία αύξησε την κυτταρική επιβίωση, σταθεροποίησε την ομοιόσταση του Ca2 συν, βελτίωσε τη διάχυση της MMP και αποτρέπει την απόπτωση που σχετίζεται με τα μιτοχόνδρια [43]. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το CDP ασκεί ένα νέονευροπροστατευτικόμηχανισμός στη θεραπεία του ισχαιμικού εγκεφαλικού.

5. Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)προστατεύει τα κύτταρα PC12 από τραυματισμό που προκαλείται από OGD/RP μέσω των αντιοξειδωτικών του επιδράσεων, οι οποίες εν μέρει αποδίδονται στη διαμεσολαβούμενη από τον DJ-1 οδό. Αυτές οι επιδράσεις περιλαμβάνουν μείωση του ρυθμού βλάβης της κυτταρικής μεμβράνης, διατήρηση της ομοιόστασης [Ca2 συν] I, βελτίωση της διάχυσης MMP, αναστολή της κυτταρικής απόπτωσης, εξασθένηση του ενδοκυτταρικού ROS και ρύθμιση των επιπέδων DJ-1. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ CDP και DJ-1 ενισχύουν τη νευροπροστασία και διατηρούν τη μιτοχονδριακή ακεραιότητα. Ως εκ τούτου, οι ευάλωτοι νευρώνες μπορούν να προστατευθούν από το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτες)μέσω της ενίσχυσης της έκφρασης του DJ-1 κατά το ισχαιμικό εγκεφαλικό.

Ευχαριστίες

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (επιχορήγηση 81360649), το Εθνικό Βασικό Πρόγραμμα Επιστήμης και Τεχνολογίας (επιχορήγηση 2015BAK45B01) και το Πρόγραμμα Υποστήριξης Επιστήμης και Τεχνολογίας της Αυτόνομης Περιφέρειας Ningxia Hui (επιχορήγηση 2016BZ07).

Πολυσακχαρίτες Cistanche deserticolaέχω ένα Νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα

βιβλιογραφικές αναφορές

[1] HD Tsai, JS Wu, MH Kao, JJ Chen, GY Sun, WY Ong, TN Lin, Clinacanthus nutans προστατεύουν τους νευρώνες του φλοιού από την τοξικότητα που προκαλείται από την υποξία μειώνοντας την HDAC1/6, τη Neuromol. Med. 18 (2016) 274–282.

[2] J. Zhao, R. Liu, Stroke 1-2-0: πρόγραμμα ταχείας απόκρισης για εγκεφαλικό στην Κίνα, Lancet Neurol. 16 (2017) 27–28.

[3] PM George, GK Steinberg, Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its effect on κλινικές θεραπείες, Neuron 87 (2015) 297–309.

[4] H. Yao, T. Ago, T. Kitazono, T. Nabika, NADPH oxidase-related pathophysiology in experimental models of stroke, Int. J. ΜοΙ. Sci. (2017) 18.

[5] J. Cao, M. Ying, N. Xie, G. Lin, R. Dong, J. Zhang, H. Yan, X. Yang, Q. He, B. Yang, The oxidation states of DJ{{ 1}} υπαγορεύουν τη μοίρα των κυττάρων ως απόκριση στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από 4-hpr: αυτοφαγία ή απόπτωση; Σημάδι οξειδοαναγωγής. 21 (2014) 1443–1459.

[6] Y. Kaneko, H. Shojo, J. Burns, M. Staples, N. Tajiri, CV Borlongan, DJ-1 βελτιώνει τον ισχαιμικό κυτταρικό θάνατο in vitro πιθανώς μέσω της μιτοχονδριακής οδού, Neurobiol, Dis. 62 (2014) 56–61.

[7] D. Yanagisawa, Y. Kitamura, M. Indian, K. Takata, T. Taniguchi, S. Morikawa, M. Morita, T. Inubushi, I. Tooyama, T. Taira, et al., DJ{{ 1}} προστατεύει από τον νευροεκφυλισμό που προκαλείται από εστιακή εγκεφαλική ισχαιμία και επαναιμάτωση σε αρουραίους, J. Cereb. Ροή του αίματος. Συνάντησε. 28 (2008) 563–578.

[8] Y. Kaneko, N. Tajiri, H. Shojo, CV Borlongan, Πρωτεύοντα νευρικά κύτταρα αρουραίου χωρίς οξυγόνο γλυκόζης παρουσιάζουν μετατόπιση DJ-1 σε υγιή μιτοχόνδρια: ένας ισχυρός θεραπευτικός στόχος εγκεφαλικού επεισοδίου, νευροειδείς νευρώσεις του ΚΝΣ. Εκεί. 20 (2014) 275–281.

[9] N. Tajiri, CV Borlongan, Y. Kaneko, Η θεραπεία με κυκλοσπορίνη Α καταργεί τον επαγόμενο από ισχαιμία θάνατο νευρωνικών κυττάρων διατηρώντας την ακεραιότητα των μιτοχονδρίων μέσω της ανοδικής ρύθμισης της πρωτεΐνης DJ-1 που σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον, CNS Neurosci. Εκεί. 22 (2016) 602–610.

[10] RX Yang, J. Lei, BD Wang, DY Feng, L. Huang, YQ Li, T. Li, G. Zhu, C. Li, FF Lu, et al., Pretreatment with sodium Phenylbutyrate Aleviates ceebral ischemia/ τραυματισμός επαναιμάτωσης από αυξημένη ρύθμιση της πρωτεΐνης DJ-1, εμπρός. Neurol. 8 (2017) 256.

[11] C. Gu, X. Yang, L. Huang, Cistanches Herba. Μια νευροφαρμακολογική ανασκόπηση, Εμπρός. Pharmacol. 7 (2016) 289.

[12] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Ένα από τα καλύτερα φαρμακευτικά δώρα της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής, Front. Pharmacol. 7 (2016) 41.

[13] Q. Liu, J. Li, J. Wang, J. Li, JS Janicki, D. Fan, Effects and mechanisms of Chinese Herbal medicine in meliorating myocardial ischemia-reperfusion τραυματισμός, Evid.- Based Compl. Alt. (2013) (2013) 925625.

[14] Το HS Wong, KM Ko, Herba Cistanches διεγείρει τον κυτταρικό κύκλο οξειδοαναγωγής της γλουταθειόνης από αντιδραστικά είδη οξυγόνου που παράγονται από μιτοχονδριακή αναπνοή σε καρδιομυοκύτταρα H9c2, Pharm. Biol. 51 (2013) 64–73.

[15] T. Wang, X. Zhang, W. Xie,Cistanchedeserticola YC Ma, "Desert ginseng": μια κριτική, Am. J. Chin. Med. 40 (2012) 1123–1141.

[16] L. Gu, WT Xiong, C. Wang, HX Sun, GF Li, X. Liu,CistanchedeserticolaΤο αφέψημα ανακουφίζει την τοξικότητα των όρχεων που προκαλείται από την υδροξυουρία σε αρσενικά ποντίκια, Asian J. Androl. 15 (2013) 838–840.

[17] E. Herzfeld, C. Strauss, S. Simmermacher, K. Bork, R. Horstkorte, F. Dehghani, C. Scheller, Investigation of theνευροπροστατευτικόεπίδραση της νιμοδιπίνης στα κύτταρα Neuro2a μέσω ενός μοντέλου στρες που μοιάζει με χειρουργείο, Int. J. ΜοΙ. Sci. 15 (2014) 18453–18465.

[18] G. Vahabzadeh, N. Rahbar-Roshandel, SA Ebrahimi, M. Mahmoudian,Νευροπροστατευτικόεπίδραση της νοσκαπίνης στον εγκεφαλικό τραυματισμό στέρησης οξυγόνου-γλυκόζης, Pharmacol. Rep. 67 (2015) 281–288.

[19] CP Wang, LZ Zhang, GC Li, YW Shi, JL Li, XC Zhang, ZW Wang, F. Ding, XM Liang, Mulberroside A προστατεύουν από την ισχαιμική βλάβη στην πρωτογενή καλλιέργεια νευρώνων του φλοιού αρουραίου μετά από στέρηση οξυγόνου-γλυκόζης με επαναιμάτωση, J. Neurosci. Res. 92 (2014) 944–954.

[20] X. Qi, R. Zhou, Y. Liu, J. Wang, WN Zhang, HR Tan, Y. Niu, T. Sun, YX Li, JQ Yu, Trans-cinnamaldehyde προστατευμένα κύτταρα PC12 έναντι της στέρησης οξυγόνου και γλυκόζης Τραυματισμός που προκαλείται από /επαναιμάτωση (OGD/R) μέσω αντι-απόπτωσης και αντιοξειδωτικού στρες, ΜοΙ. Cell Biochem. 421 (2016) 67–74.

[21] R. Chang, R. Zhou, X. Qi, J. Wang, F. Wu, W. Yang, W. Zhang, T. Sun, Y. Li, J. Yu, Protective effect of aloin on oxygen and Τραυματισμός που προκαλείται από στέρηση γλυκόζης σε κύτταρα PC12, Brain Res. Ταύρος. 121 (2016) 75–83.

[22] M. Agrawal, V. Kumar, AK Singh, MP Kashyap, VK Khanna, MA Siddiqui, AB Pant, Trans-resveratrol προστατεύει τα ισχαιμικά κύτταρα PC12 αναστέλλοντας τους μεταγραφικούς παράγοντες που σχετίζονται με την υποξία και αυξάνοντας τα επίπεδα των αντιοξειδωτικών αμυντικών ενζύμων, ACS Chem. Neurosci. 4 (2013) 285–294.

[23] KW Zeng, LX Liao, MB Zhao, FJ Song, Q. Yu, Y. Jiang, PF Tu, Protosappanin B προστατεύει τα κύτταρα PC12 έναντι του νευρωνικού θανάτου που προκαλείται από στέρηση οξυγόνου-γλυκόζης διατηρώντας τη μιτοχονδριακή ομοιόσταση μέσω επαγωγής εξαρτώμενης από την ουβικουιτίνη αποικοδόμηση πρωτεΐνης p53, Eur. J. Pharmacol. 751 (2015) 13–23.

[24] NT Ma, R. Zhou, RY Chang, YJ Hao, L. Ma, SJ Jin, J. Du, J. Zheng, CJ Zhao, Y. Niu, et al., Protective Effffects of aloperine on neonatal rat πρωτογενές καλλιεργημένοι νευρώνες ιππόκαμπου τραυματισμένοι από στέρηση οξυγόνου-γλυκόζης και επαναιμάτωση, J. Nat. Med. 69 (2015) 575–583.

[25] Y. Wang, W. Ma, A. Jia, Q. Guo, Parecoxib προστατεύει τους νευρώνες του φλοιού ποντικιού έναντι της επαγόμενης από OGD/R νευροτοξικότητας ρυθμίζοντας προς τα πάνω το Bcl-2, Neurochem. Res. 40 (2015) 1294–1302.

[26] MP Ponnusamy, P. Seshacharyulu, A. Vaz, P. Dey, SK Batra, MUC4 σταθεροποιεί την έκφραση HER2 και διατηρεί τον πληθυσμό καρκινικών βλαστοκυττάρων σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, J. Ovarian Res. 4 (2011) 7.

[27] R. Wang, L. Peng, J. Zhao, L. Zhang, C. Guo, W. Zheng, H. Chen, A. Gardenamide, Protects RGC-5 κύτταρα από H(2)O( 2)-επαγόμενες προσβολές οξειδωτικού στρες ενεργοποιώντας το μονοπάτι σηματοδότησης PI3K/Akt/eNOS, Int. J. ΜοΙ. Sci. 16 (2015) 22350–22367.

[28] Τα εκχυλίσματα LP Sun, X. Xu, HH Hwang, X. Wang, KY Su, YL Chen, διχλωρομεθανίου προστατεύουν το κύτταρο από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από στέρηση οξυγόνου-γλυκόζης Y. Liu et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 679via reducing apoptosis, Food Nutr. Res. 60 (2016) 30081.

[29] L. Wang, Y. Zhang, T. Asakawa, W. Li, S. Han, Q. Li, B. Xiao, H. Namba, C. Lu, Q. Dong,Νευροπροστατευτικόεπίδραση της νευροσερπίνης σε αστροκύτταρα αρουραίου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με στέρηση οξυγόνου και επαναοξυγόνωση in vitro, PLoS One. 10 (2015) e0123932.

[30] Z. Zhiwen, W. Haitao, S. Fu, Z. Lihua, JL Peter, Q. Remi, Z. Wenhua, Τα ιόντα λιθίου εξασθενούν την απόπτωση που προκαλείται από στέρηση ορού στα κύτταρα PC12 μέσω της ρύθμισης της σηματοδότησης Akt/FoxO1 μονοπάτια, Psychopharmacology (Berl) 12 (2015) 625–633.

[31] EJB Dariush Mozaffffarian, S. Alan, et al., Εκτελεστική περίληψη στατιστικών στοιχείων για τις καρδιακές παθήσεις και το εγκεφαλικό επεισόδιο 2016. Μια αναφορά από την American Heart Association, Circulation 133 (2016) 447–454.

[32] JE Jumblatt, TA, Ρύθμιση θέσεων σύνδεσης μουσκαρινικού συνδέτη από τον αυξητικό παράγοντα νεύρου σε κύτταρα φαιοχρωμοκυτώματος PC12, Nature 297 (1982) 152-154.

[33] S. Afrazi, S. Esmaeili-Mahani, V. Sheibani, M. Abbasnejad, Το Neurosteroid allopregnanolone εξασθενεί την απόπτωση που προκαλείται από υψηλή γλυκόζη και αποτρέπει τον πειραματικό διαβητικό νευροπαθητικό πόνο: in vitro και in vivo μελέτες, J. Steroid Biochem. ΜοΙ. Biol. 139 (2014) 98–103.

[34] X. Liu, X. Zhu, M. Chen, Q. Ge, Y. Shen, S. Pan, Resveratrol προστατεύει τα κύτταρα PC12 από την απόπτωση που προκαλείται από OGD/R μέσω της οδού σηματοδότησης με τη μεσολάβηση των μιτοχονδρίων, Acta Biochem Biophys Sin . 48 (2016) 342–353.

[35] PW Kleikers, K. Wingler, JJ Hermans, I. Diebold, S. Altenhofer, KA Radermacher, B. Janssen, A. Gorlach, HH Schmidt, οξειδάσες NADPH ως πηγή οξειδωτικού στρες και μοριακός στόχος στην ισχαιμία/επαναδιάχυση τραυματισμός, J. ΜοΙ. Med. (Berl) 90 (2012) 1391–1406.

[36] FC Liu, HI Tsai, HP Yu, Οργανοπροστατευτικές επιδράσεις του εκχυλίσματος κόκκινου κρασιού, ρεσβερατρόλη, σε τραυματισμό επαναιμάτωσης που προκαλείται από οξειδωτικό στρες, Οξείδιο. Med. Cell Longev. (2015) 568634.

[37] LK Seidlmayer, VV Juettner, S. Kettlewell, EV Pavlov, LA Blatter, EN Dedkova, Διακεκριμένοι μηχανισμοί ενεργοποίησης mPTP στην ισχαιμία-επαναδιάχυση: συνεισφορές Ca2 plus, ROS, pH και ανόργανο πολυφωσφορικό, Cardiovasc. Res. 106 (2015) 237–248.

[38] F. Su, AC Guo, WW Li, YL Zhao, ZY Qu, YJ Wang, Q. Wang, YL Zhu, Η προετοιμασία χαμηλής δόσης αιθανόλης προστατεύει από τη στέρηση οξυγόνου-γλυκόζης/ τον νευρωνικό τραυματισμό που προκαλείται από την επανοξυγόνωση ενεργοποιώντας τη μεγάλη αγωγιμότητα , Ca2 συν συν -ενεργοποιημένο Κ συν συν Κανάλια In Vitro, Neurosci. Ταύρος. 33 (2017) 28–40.

[39] Y. Li, M. Wang, S. Wang, Επίδραση της αναστολής της μιτοχονδριακής σχάσης στον ενεργειακό μεταβολισμό σε νευρώνες ιππόκαμπου αρουραίου κατά τη διάρκεια τραυματισμού ισχαιμίας/επαναιμάτωσης, Neurol. Res. (2016) 1–8.

[40] C. Rui, L. Yuxiang, H. Yinju, Z. Qingluan, W. Yang, Z. Qipeng, W. Hao, M. Lin, L. Juan, Z. Chengjun, et al., Protective Effffects of Πολυσακχαρίτης Lycium barbarum σε πρωτογενείς καλλιεργημένους νευρώνες ιππόκαμπου νεογνού αρουραίου που τραυματίστηκαν από στέρηση οξυγόνου-γλυκόζης και επαναιμάτωση, J. ΜοΙ. Histol. 43 (2012) 535–542.

[41] BR Broughton, DC Reutens, CG Sobey, Αποπτωτικοί μηχανισμοί μετά από εγκεφαλική ισχαιμία, Stroke 40 (2009) e331-339.

[42] Jordan M. Willcox, AJS Summerlee, Relaxin προστατεύει τα αστροκύτταρα από την υποξία in vitro, PLoS One. 9 (3) (2014) e90864.

[43] X. Zhang, D. Yuan, Q. Sun, L. Xu, E. Lee, AJ Lewis, BS Zuckerbraun, MR Rosengart, εξαρτώμενη από ασβέστιο/καλμοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση ρυθμίζει το PINK1/Parkin και τον DJ{{3} } μονοπάτια μιτοφαγίας κατά τη σήψη, FASEB J. 31 (2017) 4382–4395.

[44] S. Vasseur, S. Afzal, J. Tardivel-Lacombe, DS Park, JL Iovanna, TW Mak, DJ-1/ PARK7 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής των κυτταρικών αποκρίσεων που προκαλούνται από υποξία, Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 106 (2009) 1111–1116.

[45] Z. Xianghong, Y. Du, S. Qian, X. Li, L. Emma, ​​J. Anthony, Brian Lewis, S. Zuckerbraun, Matthew R. Rosengart, Η πρωτεϊνική κινάση που εξαρτάται από ασβέστιο/καλμοδουλίνη ρυθμίζει το PINK1/ Parkin και DJ-1 μονοπάτια μιτοφαγίας κατά τη σήψη, FASEB J. (2017). [

46] MS Choi, T. Nakamura, SJ Cho, X. Han, EA Holland, J. Qu, GA Petsko, JR Yates 3rd, RC Liddington, SA Lipton, Transnitrosylation από DJ-1 σε PTEN εξασθενεί τον θάνατο των νευρωνικών κυττάρων σε μοντέλα νόσου Πάρκινσον, J. Neurosci. 34 (2014) 15123–15131.

[47] RK Dongworth, UA Mukherjee, AR Hall, R. Astin, SB Ong, Z. Yao, A. Dyson, G. Szabadkai, SM Davidson, DM Yellon, DJ Hausenloy, DJ-1 προστατεύει από τον κυτταρικό θάνατο μετά από οξεία βλάβη καρδιακής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, Cell Death Dis. 5 (2014) e1082.

[48] ​​A. Di Cello, M. Di Sanzo, FM Perrone, G. Santamaria, E. Rania, E. Angotti, R. Venturella, S. Mancuso, F. Zullo, G. Cuda, F. Costanzo, DJ{ Το {1}} είναι ένας αξιόπιστος βιοδείκτης ορού για τη διάκριση του καρκίνου του ενδομητρίου υψηλού κινδύνου, Tumor Biol. 39 (2017) 1010428317705746.

[49] H. Aleyasin, MW Rousseaux, PC Marcogliese, SJ Hewitt, I. Irrcher, AP Joselin, M. Parsanejad, RH Kim, P. Rizzo, SM Callaghan, et al., DJ-1 προστατεύει τη μέλαινα ραβδιά άξονα από τη νευροτοξίνη MPTP με διαμόρφωση της οδού ΑΚΤ, Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 107 (2010) 3186–3191.

[50] RM Canet-Aviles, MA Wilson, DW Miller, R. Ahmad, C. McLendon, S. Bandyopadhyay, MJ Baptista, D. Ringe, GA Petsko, MR Cookson, Ο DJ πρωτεΐνης της νόσου του Πάρκινσον-1 είναινευροπροστατευτικόλόγω του μιτοχονδριακού εντοπισμού που καθοδηγείται από κυστεΐνη-σουλφινικό οξύ, Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 101 (2004) 9103–9108.

[51] M. Liu, B. Zhou, ZY Xia, B. Zhao, SQ Lei, QJ Yang, R. Xue, Y. Leng, JJ Xu, Z. Xia, Υπεργλυκαιμία-επαγόμενη αναστολή του DJ-1 Η έκφραση έθετε σε κίνδυνο την αποτελεσματικότητα της ισχαιμικής καρδιοπροστασίας μετά την προετοιμασία σε αρουραίους, Oxid. Med. Cell Longev. (2013) (2013) 564902.