Ο πολυσακχαρίτης Cistanche Deserticola αναστέλλει την οστική απώλεια που προκαλείται από OVX σε ποντίκια και την οστεοκλαστογένεση που προκαλείται από το RANKL

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Η οστεοπόρωση είναι μια σοβαρή ασθένεια των οστών που επηρεάζει τη γήρανση του πληθυσμού. Το Cistanche deserticola (CD), μια τονωτική και φαρμακευτική τροφή που χρησιμοποιείται ευρέως στην Κίνα, έχει αποδειχθεί ότι παρέχει αποτελεσματική θεραπεία για την οστεοπόρωση. Ο πολυσακχαρίτης Cistanche deserticola (CDP), που εξάγεται από CD, έχει διάφορες φαρμακολογικές ιδιότητες, αλλά ο ρόλος του στηνοστεοκλαστικόςο σχηματισμός και η λειτουργία, καθώς και η οστεοπόρωση, παραμένουν άγνωστες. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η εξαγωγή και ο καθαρισμός του CDP για την περαιτέρω διερεύνηση του πιθανού μηχανισμού δράσης του στην οστεοπόρωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με CDP απέτρεψε την επαγόμενη από OVX οστεοπόρωση και βελτίωσε την οστική απώλεια καταστέλλοντας τη δραστηριότητα και τη λειτουργία των οστεοκλαστών. Επιπλέον, η θεραπεία με CDP ανέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από RANKL οστεοκλαστογένεση, την απορρόφηση των οστών και την ειδική για οστεοκλάστες έκφραση γονιδίου. Μηχανιστικά, το CDP ανέστειλε την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών NF-κB και MAPKs και κατά συνέπεια επηρέασε την ενεργοποίηση του NFATc1 κατάντη. Τα ευρήματα αυτής της μελέτης υποδηλώνουν ότι το CDP είναι ένα δυνητικά ασφαλές φάρμακο για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης. (10 οφέλη που μπορεί να δώσει το Cistanche)

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Εισαγωγή

Η οστεοπόρωση—μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από μειωμένη οστική μάζα, μη φυσιολογική μικροδομή οστού ιστού, αυξημένη ευθραυστότητα των οστών και κάταγμα (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006)— επηρεάζει σήμερα περισσότερους από 200 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως και παρουσιάζει σημαντική ιατρική και κοινωνικοοικονομική επιβάρυνση στη σύγχρονη κοινωνία (Strom et al., 2011). Η κλινική θεραπεία της οστεοπόρωσης επικεντρώνεται κυρίως στην ορμονική υποκατάσταση,διφωσφονικόή θεραπεία με denosumab. Αυτές οι μέθοδοι είναι αποτελεσματικές αλλά δημιουργούν μακροπρόθεσμες παρενέργειες όπως ο πιθανός κίνδυνος καρκίνου του μαστού και άτυπων καταγμάτων του μηριαίου οστού (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof Bauer, 2011). Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να διερευνηθούν φάρμακα που όχι μόνο μπορούν να αναστείλουν την οστεοπόρωση αλλά έχουν και λιγότερες ανεπιθύμητες παρενέργειες. Το Cistanche deserticola (CD), ένα τονωτικό και φαρμακευτικό τρόφιμο που χρησιμοποιείται ευρέως στην Κίνα, γνωστό ως "τζίνσενγκ της ερήμου", είναι το αποξηραμένο χυμώδες στέλεχος με λέπια φύλλου C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) και έχει ποικιλία και αποτελεσματικές φαρμακολογικές δραστηριότητες, όπως η ανοσολογική ρύθμιση,αντιοξείδωσηκαι ιδιότητες κατά της οστεοπόρωσης (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Προηγούμενες μελέτες σχετικά με τις δραστικές ουσίες του CD στη θεραπεία της οστεοπόρωσης επικεντρώθηκαν κυρίως σε φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). Ωστόσο, το CD περιέχει επίσης άλλα αποτελεσματικά συστατικά όπως ιριδοειδή, λιγνάνες, πολυσακχαρίτες (Wang, Zhang, & Xie, 2012). Η κλινική εφαρμογή της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής (TCM) είναι κυρίως το αφέψημα με νερό. Οι πολυσακχαρίτες είναι υδατοδιαλυτά συστατικά και είναι πολύ πιθανό να είναι τα κύρια φαρμακοδυναμικά συστατικά του TCM. Οι πολυσακχαρίτες που εξάγονται από το TCM αναφέρθηκε ότι έχουν δράση κατά της οστεοπόρωσης και μερικές ανεπιθύμητες παρενέργειες, οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί γενικά σε κλινικές (π.χ. πολυσακχαρίτες που εξάγονται απόEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bintata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) και Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Επομένως, υποθέσαμε ότιΠολυσακχαρίτης Cistanche deserticolaΤο (CDP) που εξάγεται από το CD μπορεί να είναι ένα δυνητικά ασφαλές φάρμακο για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης. Τυπικά, η οστική απορρόφηση και ο σχηματισμός οστών διατηρούν μια δυναμική ισορροπία κατά την αναδιαμόρφωση των οστών σε συντονισμό με διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των οστεοκλαστών,οστεοβλάστες, κύτταρα επένδυσης οστών και οστεοκύτταρα (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Η διακοπή αυτής της ισορροπίας μπορεί να οδηγήσει σε μια ποικιλία μεταβολικών ασθενειών των οστών, όπως η οστεοπόρωση (Zhu et al., 2018) και η οστεοσκλήρωση (Ihde et al., 2011). Οι οστεοκλάστες, ως τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα που προέρχονται από τη γραμμή μονοπύρηνων/μακροφάγων, είναι τα μόνα κύτταρα με λειτουργία οστικής απορρόφησης (Teitelbaum, 20{{1{06}}0). Υπάρχουν δύο βασικές κυτοκίνες που συμμετέχουν στη διαφοροποίηση και ωρίμανση των οστεοκλαστών (Koga et al., 2004): ο παράγοντας διέγερσης αποικίας μακροφάγων (M-CSF) και ο ενεργοποιητής υποδοχέα του συνδέτη πυρηνικού παράγοντα κΒ (NF-κB) (RANKL). Το M-CSF μεσολαβεί στη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων σε προγονικούς οστεοκλάστες και προάγει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση του υποδοχέα RANK (Takayanagi, 2007). Η σύνδεση του RANKL και του RANK στην επιφάνεια των οστεοκλαστών έχει ως αποτέλεσμα τα εξής: (1) στρατολόγηση μορίων προσαρμογέα σηματοδότησης όπως ο παράγοντας 6 που σχετίζεται με τον υποδοχέα TNF (TRAF6). (2) ενεργοποίηση πολλαπλών κατάντη στόχων, συμπεριλαμβανομένων των NF-κB και πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνο (MAPKs). και (3) ανοδική ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων, κυτταροπλασματικό 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Η ενεργοποίηση αυτών των οδών σηματοδότησης ρυθμίζει άμεσα την έκφραση των γονιδίων οστεοκλαστών, συμπεριλαμβανομένης της όξινης φωσφατάσης 5 (Acp5) [που κωδικοποιεί την ανθεκτική στην τρυγική όξινη φωσφατάση (TRAcP)], της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 9 (MMP9) και της καθεψίνης Κ (CTSK) (Boyle, Si , & Lacey, 2003). Επομένως, η αναστολή των οδών σηματοδότησης που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών που προκαλούνται από RANKL είναι μια πιθανή θεραπευτική μέθοδος για την οστεοπόρωση. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να προσδιορίσουμε τα αποτελέσματα της θεραπείας με CDP στο μοντέλο ποντικού με οστεοπόρωση που προκαλείται από ωοθηκεκτομή (OVX) in vivo και στη δραστηριότητα οστεοκλαστών που προκαλείται από RANKL in vitro, με εστίαση στην έκφραση των ειδικών για οστεοκλάστες γονιδίων και στην ενεργοποίηση του NFATc1 και των οδών σηματοδότησης NF-κB και MAPKs. Τα ευρήματά μας μπορεί να παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με τις δυνατότητες του CDP ως ασφαλούς και αποτελεσματικού φαρμάκου για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης. 2. Υλικά και μέθοδοι 2.1. Το CD συλλογής χημικών ουσιών και δειγμάτων (αρ. 180801) αγοράστηκε από την Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Κίνα) και αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Haibo Huang από τη Σχολή Φαρμακευτικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Κινέζικης Ιατρικής Guangzhou, Guangzhou, Κίνα . Τα δισκία βαλερικής οιστραδιόλης αγοράστηκαν από την Bayer (Λεβερκούζεν, Βόρεια Ρηνανία Βεστφαλία, Γερμανία). Το άλφα-τροποποιημένο ελάχιστο απαραίτητο μέσο (-MEM) και ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) ελήφθησαν από την Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη και το κιτ χρώσης TRAcP αποκτήθηκαν από τη Solarbio (Πεκίνο, Κίνα). Το ανασυνδυασμένο M-CSF ποντικού και το ανασυνδυασμένο ποντικό RANKL προμηθεύτηκαν από την R&D Systems (Minneapolis, ΜΝ, ΗΠΑ). Πλάκες επικαλυμμένες με υδροξυαπατίτη αγοράστηκαν από την Corning Life Sciences (St. Lowell, ΜΑ, ΗΠΑ). Τα κύρια αντισώματα για NFATc1 και CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK και P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); και -ακτίνη (CWBIO, Πεκίνο, Κίνα) ελήφθη επίσης. Τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας και το νερό καθαρίστηκε με το σύστημα καθαρισμού νερού Milli-Q (Millipore, Bedford, ΜΑ, ΗΠΑ). 2.2. Εκχύλιση CDP Το CD αλέθεται σε λεπτή σκόνη και αναμειγνύεται με πετρελαϊκό αιθέρα τρεις φορές για να εξουδετερωθεί. Το στερεό υπόλειμμα συλλέχθηκε με διήθηση και στη συνέχεια ξηράνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πολυσακχαρίτες εκχυλίστηκαν από τα προκατεργασμένα δείγματα τρεις φορές με νερό για 2 ώρες, συμπυκνώθηκαν, καταβυθίστηκαν με την προσθήκη άνυδρης αιθανόλης σε τελική συγκέντρωση 80 τοις εκατό (ο/ο) και αποθηκεύτηκαν στους 4°C για 24 ώρες. Τα ιζήματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 20 λεπτά, διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και καθαρίστηκαν (αφαίρεση ελεύθερων πρωτεϊνών) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Sevag (Zhao et al., 2019). Οι ανακτηθέντες πολυσακχαρίτες υποβλήθηκαν σε διαπίδυση, ξηράνθηκαν και αποθηκεύτηκαν μέχρι περαιτέρω χρήση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της χημικής σύνθεσης έδειξαν ότι η συνολική περιεκτικότητα σε ζάχαρη, ουρονικό οξύ, θειικό και πρωτεΐνη του CDP ήταν 67,63 ± 0,98 τοις εκατό, 21,05 ± 0,49 τοις εκατό, 1,90 ± 0,24 τοις εκατό και 8,81 ± 0,36 τοις εκατό. Η σύνθεση μονοσακχαρίτη και η ανάλυση υπερύθρων μετασχηματισμού Fourier του CDP παρουσιάστηκαν στα συμπληρωματικά Σχ. 1 και 2. 2.3. Μοντέλο ποντικού οστεοπόρωσης που προκαλείται από OVX Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής Guangzhou (εγκεκριμένο SYXK 2019-0202). Τριάντα 6-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια C57BL/6 προμηθεύτηκαν από το Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Πανεπιστημίου Κινέζικης Ιατρικής Guangzhou. Μετά από εγκλιματισμό για 1 εβδομάδα, σε μια ομάδα ποντικών υποβλήθηκε σε εικονική επέμβαση (ομάδα Sham), ενώ τα υπόλοιπα ποντίκια υποβλήθηκαν σε επέμβαση ωοθηκεκτομής (ομάδα OVX). Μετά την επέμβαση, τα ποντίκια αφέθηκαν να αναρρώσουν για 1-εβδομάδα. Στη συνέχεια, τα ποντίκια που μοντελοποιήθηκαν επιτυχώς χωρίστηκαν τυχαία σε 5 ομάδες, με 6 ποντίκια ανά ομάδα: (1) Sham ομάδα: έλαβαν θεραπεία με απεσταγμένο νερό, (2) ομάδα OVX: έλαβαν θεραπεία με απεσταγμένο νερό, (3) OVX συν ομάδα E2 (E2) : αγωγή με δισκία βαλερικής οιστραδιόλης 0,13 mg/kg, (4) ομάδα χαμηλής δόσης OVX συν CDP (CDP-L): αγωγή με 300 mg/kg CDP, (5) OVX συν CDP ομάδα υψηλής δόσης (CDP H): αγωγή με 600 mg/kg CDP. Απεσταγμένο νερό, Ε2 ή CDP χορηγήθηκε με καθετήρα μία φορά την ημέρα. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν μετά την περίοδο θεραπείας 12- εβδομάδας (Εικ. 1Α). Οι μήτρες συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν και οι αριστερές κνήμες συλλέχθηκαν για μετέπειτα εξετάσεις. Συλλέχθηκαν δείγματα ολικού αίματος και φυγοκεντρήθηκαν στις 5000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ◦C. Τα υπερκείμενα του ορού αναρροφήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C μέχρι περαιτέρω ανάλυση. 2.4. Ανάλυση μικροϋπολογιστικής τομογραφίας (micro-CT) και ιστομορφομετρία οστού Οι αριστερές κνήμες σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης για 48 ώρες και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε φυγοκεντρικούς σωλήνες που περιείχαν φυσιολογικό ορό. Τα σταθερά δείγματα σαρώθηκαν με το όργανο micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Βέλγιο) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες ρυθμίσεις: τάση, 80 kV; ρεύμα πηγής, 100 μA; Al, φίλτρο 0,5 mm; μέγεθος pixel, 9,76 μm; και βήμα περιστροφής, 0,6◦. Αρκετές παράμετροι του δοκιδωτού οστού, συμπεριλαμβανομένης της οστικής πυκνότητας (BMD), του κλάσματος οστικού όγκου (BV/TV), της επιφάνειας του οστού ανά συνολικό όγκο (BS/TV), του αριθμού των δοκιδωτών (Tb. N) και της απόστασης των δοκίδων (Tb.Sp ) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Δημιουργήθηκαν τρισδιάστατες εικόνες χρησιμοποιώντας λογισμικό CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Μετά από ανάλυση μικρο-CT, οι αριστερές κνήμες απασβεστώθηκαν σε διάλυμα EDTA 14 τοις εκατό και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη για τομή. Τα δείγματα κόπηκαν σε τομές 5 μm χρησιμοποιώντας μικροτόμο πριν από τα πειράματα χρώσης αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η&Ε) και TRAcP. Οι χρωματισμένες τομές εξετάστηκαν και τεκμηριώθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Τόκιο, Ιαπωνία). 2.5. Ανάλυση ορού Οι συγκεντρώσεις ασβεστίου (Ca) και φωσφόρου (Ρ) προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ που σχεδιάστηκαν από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Κίνα). Τα επίπεδα TRAcP-5b και RANKL στον ορό αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA TRAcP-5b (CUSABIO, Wuhan, Κίνα) και κιτ RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Κίνα), αντίστοιχα.

Το CD συλλογής χημικών ουσιών και δειγμάτων (αρ. 180801) αγοράστηκε από την Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Κίνα) και αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Haibo Huang από τη Σχολή Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Κίνα. Τα δισκία βαλερικής οιστραδιόλης αγοράστηκαν από την Bayer (Λεβερκούζεν, Βόρεια Ρηνανία Βεστφαλία, Γερμανία). Το άλφα-τροποποιημένο ελάχιστο απαραίτητο μέσο (-MEM) και ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) ελήφθησαν από την Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη και το κιτ χρώσης TRAcP αποκτήθηκαν από τη Solarbio (Πεκίνο, Κίνα). Το ανασυνδυασμένο M-CSF ποντικού και το ανασυνδυασμένο ποντικό RANKL προμηθεύτηκαν από την R&D Systems (Minneapolis, ΜΝ, ΗΠΑ). Πλάκες επικαλυμμένες με υδροξυαπατίτη αγοράστηκαν από την Corning Life Sciences (St. Lowell, ΜΑ, ΗΠΑ). Τα κύρια αντισώματα για NFATc1 και CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK και P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); και -ακτίνη (CWBIO, Πεκίνο, Κίνα) ελήφθη επίσης. Τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας και το νερό καθαρίστηκε με το σύστημα καθαρισμού νερού Milli-Q (Millipore, Bedford, ΜΑ, ΗΠΑ). 2.2. Εκχύλιση CDP Το CD αλέθεται σε λεπτή σκόνη και αναμειγνύεται με πετρελαϊκό αιθέρα τρεις φορές για να εξουδετερωθεί. Το στερεό υπόλειμμα συλλέχθηκε με διήθηση και στη συνέχεια ξηράνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πολυσακχαρίτες εκχυλίστηκαν από τα προκατεργασμένα δείγματα τρεις φορές με νερό για 2 ώρες, συμπυκνώθηκαν, καταβυθίστηκαν με την προσθήκη άνυδρης αιθανόλης σε τελική συγκέντρωση 80 τοις εκατό (v/v) και αποθηκεύτηκαν στους 4 ◦C για 24 ώρες. Τα ιζήματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 20 λεπτά, διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και καθαρίστηκαν (αφαίρεση ελεύθερων πρωτεϊνών) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Sevag (Zhao et al., 2019). Οι ανακτηθέντες πολυσακχαρίτες υποβλήθηκαν σε διαπίδυση, ξηράνθηκαν και αποθηκεύτηκαν μέχρι περαιτέρω χρήση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της χημικής σύνθεσης έδειξαν ότι η συνολική περιεκτικότητα σε ζάχαρη, ουρονικό οξύ, θειικό και πρωτεΐνη του CDP ήταν 67,63 ± 0,98 τοις εκατό, 21,05 ± 0,49 τοις εκατό, 1,90 ± 0,24 τοις εκατό και 8,81 ± 0,36 τοις εκατό. Η σύνθεση μονοσακχαρίτη και η ανάλυση υπερύθρων μετασχηματισμού Fourier του CDP παρουσιάστηκαν στα συμπληρωματικά Σχ. 1 και 2. 2.3. Μοντέλο ποντικού με οστεοπόρωση που προκαλείται από OVX Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής Guangzhou (εγκεκριμένο SYXK 2019-0202). Τριάντα 6-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια C57BL/6 προμηθεύτηκαν από το Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Πανεπιστημίου Κινέζικης Ιατρικής της Γκουανγκζού. Μετά από εγκλιματισμό για 1 εβδομάδα, σε μια ομάδα ποντικών υποβλήθηκε σε εικονική επέμβαση (ομάδα Sham), ενώ τα υπόλοιπα ποντίκια υποβλήθηκαν σε επέμβαση ωοθηκεκτομής (ομάδα OVX). Μετά την επέμβαση, τα ποντίκια αφέθηκαν να αναρρώσουν για 1-εβδομάδα. Στη συνέχεια, τα ποντίκια που μοντελοποιήθηκαν επιτυχώς χωρίστηκαν τυχαία σε 5 ομάδες, με 6 ποντίκια ανά ομάδα: (1) Sham ομάδα: έλαβαν θεραπεία με απεσταγμένο νερό, (2) ομάδα OVX: έλαβαν θεραπεία με απεσταγμένο νερό, (3) OVX συν ομάδα E2 (E2) : αγωγή με δισκία βαλερικής οιστραδιόλης 0,13 mg/kg, (4) ομάδα χαμηλής δόσης OVX συν CDP (CDP-L): αγωγή με 300 mg/kg CDP, (5) OVX συν CDP ομάδα υψηλής δόσης (CDP H): αγωγή με 600 mg/kg CDP. Απεσταγμένο νερό, Ε2 ή CDP χορηγήθηκε με καθετήρα μία φορά την ημέρα. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν μετά την περίοδο θεραπείας 12- εβδομάδων (Εικ. 1Α). Οι μήτρες συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν και οι αριστερές κνήμες συλλέχθηκαν για μετέπειτα εξετάσεις. Συλλέχθηκαν δείγματα ολικού αίματος και φυγοκεντρήθηκαν στις 5000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ◦C. Τα υπερκείμενα του ορού αναρροφήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C μέχρι περαιτέρω ανάλυση. 2.4. Ανάλυση μικροϋπολογιστικής τομογραφίας (micro-CT) και ιστομορφομετρία οστού Οι αριστερές κνήμες σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης για 48 ώρες και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε φυγοκεντρικούς σωλήνες που περιείχαν φυσιολογικό ορό. Τα σταθερά δείγματα σαρώθηκαν με το όργανο micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Βέλγιο) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες ρυθμίσεις: τάση, 80 kV; ρεύμα πηγής, 100 μA; Al, φίλτρο 0,5 mm; μέγεθος pixel, 9,76 μm; και βήμα περιστροφής, 0,6◦. Αρκετές παράμετροι του δοκιδωτού οστού, συμπεριλαμβανομένης της οστικής πυκνότητας (BMD), του κλάσματος οστικού όγκου (BV/TV), της επιφάνειας του οστού ανά συνολικό όγκο (BS/TV), του αριθμού των δοκιδωτών (Tb. N) και της απόστασης των δοκίδων (Tb. Sp ) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Δημιουργήθηκαν τρισδιάστατες εικόνες χρησιμοποιώντας λογισμικό CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Μετά από ανάλυση μικρο-CT, οι αριστερές κνήμες απασβεστώθηκαν σε διάλυμα EDTA 14 τοις εκατό και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη για τομή. Τα δείγματα κόπηκαν σε τομές 5 μm χρησιμοποιώντας μικροτόμο πριν από τα πειράματα χρώσης αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η&Ε) και TRAcP. Οι χρωματισμένες τομές εξετάστηκαν και τεκμηριώθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Τόκιο, Ιαπωνία). 2.5. Ανάλυση ορού Οι συγκεντρώσεις ασβεστίου (Ca) και φωσφόρου (P) προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ που σχεδιάστηκαν από το Nanjing

Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Κίνα). Τα επίπεδα TRAcP{{0}}b και RANKL στον ορό αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA TRAcP-5b (CUSABIO, Wuhan, Κίνα) και κιτ RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Κίνα) , αντίστοιχα. 2.6. Δοκιμασία οστεοκλαστογένεσης in vitro ΒΜΜ απομονώθηκαν από την κνήμη και το μηριαίο οστό θηλυκά ποντικών C57BL/6 6- εβδομάδων. Τα απομονωμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο -MEM που περιέχει 25 ng/mL M-CSF, 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη. Μόλις φτάσουν στη συρροή, τα BMM (1 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP παρουσία 50 ng/mL RANKL. Το μέσο και το CDP αντικαταστάθηκαν κάθε 2 ημέρες. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν για την παρουσία ίχνους. Ο αριθμός των οστεοκλαστών, που ορίζονται ως TRAcP θετικά κύτταρα με τρεις ή περισσότερους πυρήνες, μετρήθηκε και τεκμηριώθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός. 2.7. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων Τα ΒΜΜ (1 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και επωάστηκαν όλη τη νύχτα. Μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 και 40 μg/mL) για 48 ώρες. Η συρροή κυττάρων ανιχνεύτηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, ΗΠΑ), ένα μακροπρόθεσμο, δυναμικό σύστημα απεικόνισης ζωντανών κυττάρων σε πραγματικό χρόνο. 2.8. Δοκιμασία απορρόφησης υδροξυαπατίτη Τα ΒΜΜ (1 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε μια πλάκα επικαλυμμένη με υδροξυαπατίτη, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (0, 5 και 10 μg/mL) και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες -MEM που περιείχε 25 ng/ mL M-CSF και 50 ng/mL RANKL. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με διάλυμα λευκαντικού 10 τοις εκατό για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά συστατικά. Οι εικόνες των περιοχών απορρόφησης υδροξυαπατίτη καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας IncuCyte ZOOM® και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (NIH, Bethesda, MD, ΗΠΑ) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003). 2.9. Απομόνωση RNA και ανάλυση ποσοτικής PCR (RT-qPCR) αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο Τα BMM (1 × 105 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο φρεατίου και διεγέρθηκαν με RANKL και M-CSF παρουσία CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 5 και 10 μg/mL) για 5 ημέρες. Το ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα ή τον οστικό ιστό ποντικών χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΡΙζόλης (Sigma Aldrich). Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας κιτ ανάστροφης μεταγραφάσης (TransGen Biotech, Πεκίνο, Κίνα). Οι αντιδράσεις RT-qPCR παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) και ανιχνεύθηκαν από το σύστημα ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Οι παράμετροι κύκλου για την PCR ορίστηκαν ως εξής: 95 ◦C για 5 λεπτά, ακολουθούμενοι από 40 κύκλους των 95 ◦C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ◦C για 30 δευτερόλεπτα. Οι ειδικοί εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 1 και η ποσότητα κάθε γονιδίου στόχου κανονικοποιήθηκε σε GAPDH (εσωτερικός έλεγχος).

2.10. Ανάλυση κηλίδας Western Τα BMM (5 × 105 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο 6-πηγαδιού. Για πειράματα σύντομου χρόνου, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με τις διαφορετικές συγκεντρώσεις CDP (0, 5 και 10 μg/mL) για 1 ώρα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5{{ 58}} ng/mL RANKL για 30 λεπτά. Για μεγάλο χρονικό διάστημα, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 50 ng/mL RANKL τις ημέρες 3, 5 και 7 παρουσία CDP (0, 5 και 10 μg/mL). Οι συνολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (CWBIO). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 10 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ◦C και στη συνέχεια με τα αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα για 1,5 ώρα. Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ECL (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ) και οι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα απεικόνισης χημειοφωταύγειας Tanon 5200 (Tanon Science and Technology, Shanghai, China). 2.11. Ανίχνευση μετατόπισης NFATc1 με χρήση δοκιμής ανοσοφθορισμού Τα BMM σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες 12-πηγαδιών, διεγέρθηκαν με RANKL και M-CSF και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μg/mL CDP για 5 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και διαπερατήθηκαν με 0,1 τοις εκατό Triton X-100 για 10 λεπτά. Τα κύτταρα αναμίχθηκαν με 10 τοις εκατό ορό κατσίκας (CWBIO) και επωάστηκαν για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με το πρωτεύον αντίσωμα όλη τη νύχτα στους 4°C και στη συνέχεια με δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας κατά ποντικού Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, ΜΑ, ΗΠΑ) στο σκοτάδι για 1 ώρα. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με PBS, τοποθετήθηκαν σε αντιδραστήριο Prolong Gold Antifade Reagent με 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar) και επιθεωρήθηκαν χρησιμοποιώντας Zeiss LSM 800 με ομοεστιακό μικροσκόπιο Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία). 2.12. Στατιστική ανάλυση Όλα τα πειραματικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στατιστικό λογισμικό SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Τα δεδομένα για μελέτες σε ζώα και κύτταρα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM και μέσοι όροι ± SD, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα χρησιμοποιούν μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ή Student's t-test. Τιμές p < 0,05="" θεωρήθηκαν="" στατιστικά="" σημαντικές.="" 3.="" αποτελέσματα="" 3.1.="" το="" cdp="" αποτρέπει="" την="" επαγόμενη="" από="" το="" ovx="" οστική="" απώλεια="" in="" vivo="" χρησιμοποιήσαμε="" ένα="" μοντέλο="" ποντικού="" οστεοπόρωσης="" που="" προκαλείται="" από="" ovx="" για="" να="" διερευνήσουμε="" τα="" αποτελέσματα="" της="" θεραπείας="" με="" cdp="" στην="" οστεοπόρωση="" in="" vivo.="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" sham,="" το="" σωματικό="" βάρος="" των="" ποντικών="" ovx="" αυξήθηκε="" σημαντικά="" ενώ="" ο="" δείκτης="" της="" μήτρας="" μειώθηκε,="" υποδεικνύοντας="" ότι="" το="" μοντέλο="" οστεοπόρωσης="" κατασκευάστηκε="" με="" επιτυχία="" (εικ.="" 1β="" και="" δ).="" η="" μικρο-ct="" ανάλυση="" των="" κνημών="" στην="" ομάδα="" ovx="" έδειξε="" εκτεταμένη="" οστική="" απώλεια.="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" ovx,="" ο="" αριθμός="" των="" δοκιδωτών="" οστών="" αυξήθηκε="" στην="" ομάδα="" cdp-l,="" ενώ="" η="" αύξηση="" στις="" ομάδες="" cdp-h="" και="" e2="" ήταν="" πιο="" σημαντική="" και="" οι="" δοκίδες="" στις="" δύο="" τελευταίες="" ομάδες="" έγιναν="" πιο="" τραχιές="" και="" το="" χάσμα="" έγινε="" μικρότερο="" (="" εικ.="" 1c).="" η="" ποσοτική="" ανάλυση="" επιβεβαίωσε="" ότι="" αρκετές="" οστικές="" ιστομορφομετρικές="" παράμετροι,="" συμπεριλαμβανομένων="" των="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" και="" tb.="" το="" ν="" είχε="" σημαντικά="" αυξημένες="" τιμές,="" ενώ="" το="" tb.="" το="" sp="" έδειξε="" μειωμένες="" τιμές="" στην="" ομάδα="" cdp-h="" (εικ.="" 1ε="" και="" στ).="" η="" παθολογική="" του="" εξέταση="" χρησιμοποιώντας="" χρώση="" h&e="" αποκάλυψε="" ότι="" ο="" αριθμός="" των="" οστικών="" δοκίδων="" στις="" ομάδες="" cdp-h="" και="" e2="" ήταν="" σημαντικά="" υψηλότερος="" από="" αυτόν="" στην="" ομάδα="" ovx="" ενώ="" δεν="" υπήρχε="" σημαντική="" βελτίωση="" στην="" ομάδα="" cdp-l="" (εικ.="" 1g).="" επιπρόσθετα,="" η="" χρώση="" tracp="" έδειξε="" ότι="" ο="" αριθμός="" των="" οστεοκλαστών="" αυξήθηκε="" σημαντικά="" στην="" ομάδα="" ovx="" αλλά="" μειώθηκε="" στις="" ομάδες="" cdp-h="" και="" e2="" (εικ.="" 1η).="" οι="" ομάδες="" cdp-l,="" cdp-h="" και="" ε2="" έδειξαν="" ότι="" ανέστειλαν="" την="" επαγόμενη="" από="" το="" ovx="" αύξηση="" της="" περιεκτικότητας="" σε="" p,="" αλλά="" αύξησαν="" την="" περιεκτικότητα="" σε="" ca="" στον="" ορό="" του="" αίματος.="" οι="" δείκτες="" οστικής="" απορρόφησης,="" rankl="" και="" tracp-5b="" έδειξαν="" πτωτική="" τάση="" στο="">

η ομάδα χωρίς στατιστική διαφορά, ενώ μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα CDP-H (Εικ. 1I). Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της CDP στην έκφραση των γονιδίων δεικτών οστεοκλαστών στους ιστούς των οστών με RT-qPCR. Τα επίπεδα mRNA των NFATc1, Acp5, Mmp9 και CTSK στην ομάδα OVX ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα της ομάδας Sham. Οι ομάδες CDP-H έδειξαν μείωση του επιπέδου mRNA των NFATc1, Acp5 και CTSK κατά 1.74-, 1.70- και 2.{14}}φορές, σε σύγκριση με την ομάδα OVX. (Εικ. 1J). 3.2. Το CDP καταστέλλει την επαγόμενη από το RANKL οστεοκλαστογένεση in vitro Παρακολουθήσαμε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των BMM που υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDP χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή δυναμικής απεικόνισης ζωντανών κυττάρων μακροπρόθεσμα σε πραγματικό χρόνο. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η κυτταρική συρροή στις ομάδες που έλαβαν CDP δεν άλλαξε σε μια δόση<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 μg/mL CDP έδειξε σημαντικά μειωμένο μέγεθος και αριθμό (Εικ. 2Β και Γ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η CDP ανέστειλε αποτελεσματικά την αναμενόμενη οστεοκλαστογένεση που προκαλείται από RANKL χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. 3.3. Το CDP αναστέλλει τη δραστηριότητα οστεοκλαστικής απορρόφησης που προκαλείται από το RANKL και την έκφραση γονιδίου ειδική για οστεοκλάστες Προσδιορίσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα της θεραπείας με CDP στη δραστηριότητα απορρόφησης οστού των οστεοκλαστών χρησιμοποιώντας πλακίδια επικαλυμμένα με υδροξυαπατίτη. Η οστική απορρόφηση είναι η κύρια λειτουργία και πρότυπο για τη μέτρηση της δραστηριότητας και της ικανότητας των οστεοκλαστών (Novack & Faccio, 2011). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η CDP μπορεί να μειώσει σημαντικά την περιοχή απορρόφησης των οστών των οστεοκλαστών με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι η CDP ανέστειλε τη δραστηριότητα απορρόφησης οστού που επάγεται από το RANKL (Εικ. 3Α και Β). Ειδικότερα, η οστεοκλαστική περιοχή απορρόφησης των οστών μειώθηκε σε περίπου 6,3 τοις εκατό μετά από θεραπεία με 10 μg/mL CDP. Για να καταλάβουμε καλύτερα την παρεμπόδιση της CDP στην οστεοκλαστογένεση, μετρήσαμε τα επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων που σχετίζονται με τους οστεοκλάστες. Χωρίς θεραπεία με CDP, η επαγωγή με RANKL προήγαγε την έκφραση των γονιδίων NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 και Mmp9. Αντίθετα, η ταυτόχρονη εφαρμογή CDP και RANKL μείωσε σημαντικά αυτά τα πέντε γονίδια (Εικ. 3C και D).

3.4. Το CDP αναστέλλει την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση NFATc1 Η χρώση TRAcP αποκάλυψε ότι η θεραπεία με CDP μείωσε σημαντικά την αναμενόμενη αύξηση στον αριθμό των ώριμων οστεοκλαστών μετά από διέγερση RANKL για 3-7 ημέρες (Εικ. 4Α και Β). Επιπλέον, διερευνήσαμε εάν η θεραπεία με CDP μπορεί να επηρεάσει αποτελεσματικά τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών αναστέλλοντας την έκφραση NFATc1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η NFATc1 εκφράστηκε σε μεγάλο βαθμό μετά από διέγερση RANKL για 5 ημέρες, η οποία αναστέλλεται σημαντικά μετά τη θεραπεία με CDP (Εικ. 4C και D). Επιπλέον, η θεραπεία με CDP κατέστειλε τα επίπεδα έκφρασης της CTSK, μιας πρωτεΐνης που απαιτείται για τον φυσιολογικό σχηματισμό και λειτουργία οστεοκλαστών (Bossard et al., 1996) (Εικ. 4Ε και ΣΤ). Επιλέξαμε μια αναπαράσταση σημείου-σε-χρόνου της διέγερσης RANKL για 5 ημέρες για να διερευνήσουμε περαιτέρω την επίδραση της θεραπείας με 10 μg/mL CDP στη μετατόπιση του NFATc1. Όπως αναμενόταν, η θεραπεία με CDP ανέστειλε σημαντικά την πυρηνική μετατόπιση NFATc1 που προκαλείται από RANKL (Εικ. 4G και Η).

Εικ. 4. Το CDP καταστέλλει την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση NFATc1. (Α) Τα BMM σπάρθηκαν σε 6-πλάκα φρεατίου και διεγέρθηκαν με RANKL και M-CSF παρουσία CDP (0, 5 και 10 μg/mL) για τις αναφερόμενες ημέρες. Αντιπροσωπευτικές εικόνες που δείχνουν TRAcP-θετικά πολυπύρηνα κύτταρα. Μεγέθυνση, ×100. Γραμμές κλίμακας {{10}} μm. (Β) Ποσοτικοποίηση πολυπύρηνων κυττάρων θετικών TRAcP (πυρήνες μεγαλύτεροι ή ίσοι με 3). (CF) Ανάλυση Western blot των εκφράσεων πρωτεΐνης NFATc1 και CTSK, σε BMMs, που διεγείρονται με M CSF και RANKL για 3-7 ημέρες παρουσία CDP. (Ζ) Τα BMM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ug/mL CDP και διεγέρθηκαν με M-CSF και RANKL για 5 ημέρες, στη συνέχεια ανοσοχρωματίστηκαν με NFATc1 (πράσινο) και DAPI (μπλε) και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο. Μεγέθυνση, ×200. Γραμμές κλίμακας=20 μm. (Η) Η ένταση φθορισμού αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" έναντι="" ομάδας="" ελέγχου.="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" έναντι="" ομάδας="" rankl.="" 3.5.="" το="" cdp="" αναστέλλει="" την="" επαγόμενη="" από="" το="" rankl="" ενεργοποίηση="" των="" μονοπατιών="" σηματοδότησης="" nf-κb="" και="" mapks="" για="" να="" διευκρινιστούν="" οι="" μηχανισμοί="" που="" εμπλέκονται="" στην="" επαγόμενη="" από="" cdp="" αναστολή="" της="" διαφοροποίησης="" των="" οστεοκλαστών,="" εξετάσαμε="" τον="" αντίκτυπο="" της="" θεραπείας="" με="" cdp="" στις="" οδούς="" nf-κb="" και="" mapks.="" τα="" αποτελέσματα="" αποκάλυψαν="" ότι="" η="" θεραπεία="" με="" cdp="" είχε="" κατασταλτικά="" αποτελέσματα="" στην="" αποικοδόμηση="" του="" iκb-="" και="" στη="" φωσφορυλίωση="" της="" ρ65="" με="" δοσοεξαρτώμενο="" τρόπο="" (εικ.="" 5α="" και="" β).="" η="" φωσφορυλίωση="" τριών="" μελών="" της="" οικογένειας="" mapks,="" ειδικά="" η="" εξωκυτταρική="" κινάση="" ρυθμιζόμενη="" με="" σήμα="" (erk),="" η="" n-τερματική="" κινάση="" c-jun="" (jnk)="" και="" η="" ρ38="" ρυθμίστηκαν="" προς="" τα="">

Συζήτηση

Η οστεοπόρωση είναι μια κοινή και εκφυλιστική ασθένεια των οστών. Επί του παρόντος, υπάρχουν πολλά φάρμακα χημικής σύνθεσης που χρησιμοποιούνται σε κλινικές θεραπείες για την οστεοπόρωση, όπως τα οιστρογόνα και τα διφωσφονικά. Ωστόσο, η μακροχρόνια χρήση αυτών των φαρμάκων θα αποδυναμώσει σταδιακά την κλινική αποτελεσματικότητα και θα προκαλέσει ακόμη και πολλές σοβαρές παρενέργειες, όπως αυξημένο κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών, του μαστού και του ενδομητρίου και οστεονέκρωση της γνάθου (Beral, 2003 Khan et al., 2009· Lacey et al., 2002). Ενώ σε αυτή τη μελέτη, επιλέξαμε το CDP, ένα αποτελεσματικό συστατικό που εκχυλίστηκε από το CD, ως θεραπευτικό παράγοντα και δείξαμε ότι το CDP είχε προστατευτική δράση έναντι της απώλειας οστού σε ποντικούς OVX και ανέστειλε το σχηματισμό και τη λειτουργία οστεοκλαστών που προκαλείται από RANKL. Εν τω μεταξύ, σύμφωνα με τη θεωρία της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής για το «νεφρό που διέπει τα οστά», η απώλεια οστικής μάζας αποδίδεται σε ανεπάρκεια των νεφρών. Ως ιατρική τροφή που τονώνει τα νεφρά, το CD έχει αποδειχθεί ότι παρέχει αποτελεσματική θεραπεία για την οστεοπόρωση (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li, & Zhang, 2016). Έτσι, το CDP που εξάγεται από αυτό το φυσικό βότανο είναι μια καλύτερη και ασφαλέστερη επιλογή φαρμάκου. Επί του παρόντος, το μοντέλο ποντικού OVX είναι ένα κλασικό μοντέλο μετεμμηνοπαυσιακής οστικής απώλειας σε γυναίκες, που διερευνά τα αίτια της οστικής απώλειας και πραγματοποιεί παρέμβαση (Wehrle et al., 2015). Αντίστοιχα, πραγματοποιήσαμε αμφοτερόπλευρη ωοθηκεκτομή σε θηλυκά ποντίκια C57BL/6J για να κατασκευάσουμε ένα μοντέλο οστεοπόρωσης. Σε προηγούμενες μελέτες, οι δόσεις CDP που χορηγήθηκαν στα ζώα ήταν 50–200 mg/kg (χαμηλή δόση) και 1800 mg/kg (υψηλή δόση) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Εδώ, η υψηλή δόση CDP στα ποντίκια ήταν 600 mg/kg, η οποία βασίστηκε στην υψηλή κλινική δόση των 30 g CD σε αφέψημα. Έτσι, είναι παρόμοια με την τρέχουσα κλινική πρακτική. Σε αυτή τη μελέτη, η θεραπεία με CDP ανέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από το OVX αύξηση σωματικού βάρους, το οποίο είναι ένα κοινό φαινόμενο που παρατηρείται σε ποντικούς OVX (Davis et al., 2019). Χρησιμοποιώντας μικρο-CT σάρωση και 3D ανακατασκευή, διαπιστώσαμε ότι το OVX οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση του BMD, BV/TV, BS/TV και Tb.N και αύξηση του Tb.Sp, ενώ η θεραπεία με CDP ανέστρεψε όλες αυτές τις αλλαγές . Συγκεκριμένα, σε σύγκριση με το θετικό φάρμακο, το CDP θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά την BMD των ποντικών OVX, η οποία είναι ένας σημαντικός δείκτης ποιότητας των οστών και χρησιμοποιείται για να αντικατοπτρίζει τον βαθμό της οστεοπόρωσης (Fuggle et al., 2019), υποδεικνύοντας ότι η CDP έχει ένα πλεονέκτημα πάνω από το θετικό φάρμακο για τη βελτίωση της BMD. Επιπλέον, τα ιστολογικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με CDP θα μπορούσε να μειώσει την αυξημένη ποσότητα θετικών σε TRAcP οστεοκλαστών που προκαλούνται από το OVX. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η χορήγηση CDP μετριάζει αποτελεσματικά την οστική απώλεια στην οστεοπόρωση που προκαλείται από OVX, πιθανώς με την αναστολή του σχηματισμού οστεοκλαστών. Σε συμφωνία με τα παραπάνω αποτελέσματα, βρήκαμε ότι η CDP αναστέλλει δοσοεξαρτώμενα τον σχηματισμό και τη λειτουργία οστεοκλαστικών που προκαλείται από RANKL, ενώ η CDP είχε μικρή επίδραση στον προκαλούμενο από M-CSF πολλαπλασιασμό πρόδρομων κυττάρων οστεοκλαστών στα in vitro πειράματά μας. Η δέσμευση των RANKL και RANK μπορεί να οδηγήσει στη στρατολόγηση του TRAF6 και στην επακόλουθη ενεργοποίηση αρκετών κατάντη οδών σηματοδότησης, όπως οι NF-κB και MAPKs (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). Η οδός σηματοδότησης NF-κB παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των οστεοκλαστών και η σίγαση των γονιδίων που κωδικοποιούν βασικές πρωτεΐνες σε αυτό το μονοπάτι μπορεί να οδηγήσει σε ανώμαλη ανάπτυξη των οστών (Leibrandt & Penninger, 2008). Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι ο NF-κΒ υπάρχει στο κυτταρόπλασμα των μη διεγερμένων κυττάρων σε ένα σύμπλεγμα με το IκB αλλά εισέρχεται γρήγορα στον πυρήνα μετά τη διέγερση του RANKL (Boyle et al., 2003). Το απελευθερωμένο IκB στη συνέχεια αποικοδομείται ταχέως, ενώ το NF-κB ενεργοποιεί ειδική γονιδιακή μεταγραφή, προάγοντας κατά συνέπεια τη διαφοροποίηση, την ωρίμανση και την απόπτωση των οστεοκλαστών (Abdelmagid et al., 2015). Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με CDP κατέστειλε την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης NF-κB, όπως αποδεικνύεται από την αναστολή της αποικοδόμησης του IκB και τη φωσφορυλίωση του p65 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, ο οποίος μπορεί να περιλαμβάνει την αντι-οστεοκλαστογόνο δράση του . Επιπλέον, η οδός σηματοδότησης MAPKs, συμπεριλαμβανομένων των ERK, JNK και p38, εμπλέκονται στενά στην επαγόμενη από το RANKL οστεοκλαστογένεση (Li et al., 2002). Επιπλέον, οι κυρίαρχοι αναστολείς του p38 και του JNK μπορούν να αποτρέψουν την επαγόμενη από το RANKL οστεοκλαστογένεση (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), ενώ το ERK παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των οστεοκλαστών (Miyazaki et al., 2000). Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το RANKL ενεργοποιεί το μονοπάτι σηματοδότησης MAPKs αυξάνοντας τη φωσφορυλίωση των ERK, JNK και p38 (Mizukami et al., 2002). Στη μελέτη μας, δείξαμε ότι το CDP κατέστειλε τη φωσφορυλίωση βασικών πρωτεϊνών που προκαλείται από το RANKL στο μονοπάτι σηματοδότησης MAPKs. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της ενεργοποίησης των μονοπατιών σηματοδότησης NF-κB και MAPKs συμβάλλει στην ανασταλτική δράση της CDP κατά της οστεοκλαστογένεσης. Η ενεργοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης NF-κB και MAPKs προάγει την έκφραση πολλών βασικών παραγόντων μεταγραφής, όπως το κυτταρικό ογκογονίδιο fos, η πρωτεΐνη ενεργοποιητή 1 και το NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). Το NFATc1, ένα σημαντικό μέλος της οικογένειας NFAT, εμπλέκεται στην τελική διαφοροποίηση των οστεοκλαστών ως κύριος μεταγραφικός ρυθμιστής (Asagiri et al., 2005). Έχει αναφερθεί ότι τα ελλιπή εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα NFATc1- δεν μπορούν να διαφοροποιηθούν σε οστεοκλάστες υπό τη διέγερση του RANKL και η έκτοπη έκφραση του NFATc1 προκαλεί διαφοροποίηση στα πρόδρομα κύτταρα παρακάμπτοντας τη σηματοδότηση RANKL, γεγονός που υποδηλώνει ότι το NFATc1 έχει κρίσιμο ρόλο στην διαφοροποίηση οστεοκλαστών (Takayanagi et al., 2002). Τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν την κατασταλτική επίδραση του CDP στην έκφραση του NFATc1 και την ακόλουθη πρωτεΐνη CTSK του. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε ότι το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης του NFATc1 αρχικά αυξήθηκε και στη συνέχεια μειώθηκε, φτάνοντας στο υψηλότερο επίπεδο την 5η ημέρα μετά τη διέγερση του RANKL. Αυτό ήταν συνεπές με τα αποτελέσματα των Baek et al. (2014), οι οποίοι παρατήρησαν την αποικοδόμηση του NFATc1 που προκάλεσε το M-CSF κατά τη διάρκεια της οστεοκλαστογένεσης όψιμου σταδίου μέσω της επαγόμενης από Cbl ουμπικουϊτινίωσης του NFATc1 με τρόπο που εξαρτάται από την κινάση Src. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ανοσοφθορισμού υποστήριζαν σταθερά την ανασταλτική επίδραση του CDP στη μεταγραφική ενεργοποίηση του NFATc1. Επιπλέον, τα ειδικά για οστεοκλάστες γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των CTSK, Acp5, Mmp9 και Atp6v0d2, όλα ρυθμίζονται απευθείας από το NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), καταστέλλονται από το CDP. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι το NFATc1 είναι στόχος της ανασταλτικής επίδρασης του CDP στα μονοπάτια σηματοδότησης NF-κB και MAPK.

συμπέρασμα

Συνοπτικά, εκχυλίσαμε και καθαρίσαμε τον ενεργό πολυσακχαρίτη από το CD και δείξαμε ότι το CDP επέδειξε προστατευτική επίδραση στην οστεοπόρωση που προκαλείται από OVX και βελτίωσε την οστική απώλεια καταστέλλοντας τη δραστηριότητα και τη λειτουργία των οστεοκλαστών. Επιπλέον, το CDP μπορεί να αναστείλει τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των οστεοκλαστών που προκαλείται από το RANKL παρεμβαίνοντας στα μονοπάτια σηματοδότησης NF-κB και MAPK και κατά συνέπεια επηρεάζοντας την ενεργοποίηση του NFATc1 κατάντη. Συμπερασματικά, τα ευρήματά μας παρέχουν τη βάση για την επέκταση και την εφαρμογή της CDP στη θεραπεία της οστεοπόρωσης.

Αυτό το άρθρο προέρχεται από τις λίστες περιεχομένων που είναι διαθέσιμες στην αρχική σελίδα του περιοδικού ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff