Η απώλεια του καταβολισμού BCAA που προκαλείται από τον Παράγοντα 6 που μοιάζει με Krüppel συμβάλλει στον τραυματισμό των νεφρών σε ποντίκια και ανθρώπους

edmund.chen@wecistanche.com

Αλλοιωμένος κυτταρικός μεταβολισμός σενεφρόΤα εγγύς σωληνάρια (PT) διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην οξείανεφρική βλάβη (ΑΚΙ). Ο μεταγραφικός παράγοντας Krüppel-όπως παράγοντας 6 (KLF6) επάγεται γρήγορα και ισχυρά νωρίς στο PT μετά από AKI. Βρήκαμε ότι το knockdown Klf6 ειδικό για PT (Klf6PTKD) είναι προστατευτικό έναντι του AKI καινεφρόίνωση σε ποντίκια. Η συνδυασμένη ανάλυση αλληλουχίας RNA και ανοσοκαταβύθισης χρωματίνης έδειξε ότι η έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν καταβολικά ένζυμα αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (BCAA) διατηρήθηκε σε ποντικούς Klf6PTKD, με το KLF6 να καταλαμβάνει την περιοχή προαγωγέα αυτών των γονιδίων. Αντίθετα, η επαγόμενη υπερέκφραση του KLF6 κατέστειλε την έκφραση των γονιδίων BCAA και επιδείνωσενεφρική βλάβηκαι ίνωση σε ποντίκια. In vitro, τα τραυματισμένα κύτταρα που υπερεκφράζουν το KLF6 είχαν παρόμοιες μειώσεις στην έκφραση του καταβολικού γονιδίου BCAA και ήταν λιγότερο ικανά να χρησιμοποιήσουν το BCAA. Επιπλέον, η καταστροφή του BCKDHB, η οποία κωδικοποιεί μία υπομονάδα του ενζύμου περιορισμού του ρυθμού στον καταβολισμό BCAA, είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη παραγωγή ATP, ενώ η θεραπεία με ενισχυτή καταβολισμού BCAA BT2 αύξησε το μεταβολισμό. Ανάλυση τουνεφρική λειτουργία, KLF6, και γονιδιακή έκφραση BCAA σε ανθρώπινη χρόνιαΝεφρική ΝόσοςΟι ασθενείς εμφάνισαν σημαντικές αντίστροφες συσχετίσεις μεταξύ του KLF6 και των δύονεφρική λειτουργία και έκφραση BCAA. Έτσι, η στόχευση της καταστολής του καταβολισμού BCAA με τη μεσολάβηση KLF6-μπορεί να χρησιμεύσει ως βασικός θεραπευτικός στόχος σε ΑΚΙ καινεφρόίνωση.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

ΧρόνιοςΝεφρική Νόσος(ΧΝΝ) προκαλεί σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα και έχει επιπολασμό στον ενήλικο πληθυσμό των ΗΠΑ περίπου 15 τοις εκατό. Η ΧΝΝ μπορεί να προκύψει από επαναλαμβανόμενες κρίσεις οξείας νόσουνεφρική βλάβη(AKI) που αποδίδονται σε περιβαλλοντικές ή τοξικές προσβολές ή είναι δευτερογενείς σε άλλες ασθένειες ή στη θεραπεία τους. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, το εγγύς σωληνάριο (PT) είναι μια κύρια θέση βλάβης στο AKI, καθώς η υψηλή μεταβολική δραστηριότητα των PT κυττάρων τα καθιστά επιρρεπή σε ισχαιμική βλάβη και ο ρόλος τους στην απέκκριση φαρμάκων και τοξινών απαιτεί ροή δυνητικά επιβλαβών παράγοντες μέσω των κυττάρων ΡΤ (1). Μια τέτοια κατηγορία παραγόντων είναι τα χημειοθεραπευτικά που βλάπτουν το DNA, τα οποία συσσωρεύονται στα κύτταρα ΡΤ, προκαλώντας απώλεια ΑΚΙ και νεφρώνων. Μετά από τραυματισμό, τα PT κύτταρα αποδιαφοροποιούνται και εκκρίνουν διαλυτούς παράγοντες όπως τα μέλη της οικογένειας Wnt και Hedgehog και οι κυτοκίνες (1-4). Τα επιζώντα αποδιαφοροποιημένα PT κύτταρα μπορούν να εισέλθουν ξανά στον κυτταρικό κύκλο και να πολλαπλασιαστούν για να επιδιορθώσουν το τραυματισμένο PT, ακολουθούμενο από επαναδιαφοροποίηση σε πλήρως λειτουργικά PT κύτταρα (2). Ωστόσο, κύτταρα που αντ 'αυτού υποβάλλονται σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο σημείο ελέγχου G2/M μπορεί να μην ανακάμψουν, οδηγώντας σε ατροφία και ρύθμιση προς τα πάνω της προφιβρωτικής σηματοδότησης (5), προκαλώντας ίνωση διεγείροντας τη διαφοροποίηση των εγκατεστημένων ινοβλαστών σε μυοϊνοβλάστες που εκκρίνουν πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας και στρατολόγηση ανοσοκυττάρων όπως τα μακροφάγα και τα Τ κύτταρα (1).

Λέξεις-κλειδιά:νεφρό; οξεία νεφρική βλάβη? εγγύς σωληνάριο? συντελεστής μεταγραφής; αμινοξέα διακλαδισμένης αλυσίδας

Εκτός από την επαγωγή παθογόνων οδών σηματοδότησης, τα τραυματισμένα ΡΤ κύτταρα επιδεικνύουν επίσης δραστικά αλλοιωμένο κυτταρικό μεταβολισμό. Τα μη τραυματισμένα κύτταρα ΡΤ βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στην οξείδωση των μιτοχονδριακών λιπαρών οξέων, στον κύκλο τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA) και στην οξειδωτική φωσφορυλίωση για την παραγωγή ΑΤΡ. Ωστόσο, στο πλαίσιο του τραυματισμού, η οξείδωση των λιπαρών οξέων καταστέλλεται, με μόνο μια μέτρια αντισταθμιστική προς τα πάνω ρύθμιση της γλυκόλυσης, έτσι ώστε τα συνολικά επίπεδα ATP να μειώνονται σε τραυματισμένο PT (6). Επιπλέον, η αναστολή της οξείδωσης των λιπαρών οξέων in vitro προκάλεσε αποδιαφοροποίηση και απόπτωση των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και in vivo επιδεινώθηκενεφρική βλάβημετά από θεραπεία με φολικό οξύ (6). Είναι ενδιαφέρον ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της οξείδωσης των μιτοχονδριακών λιπαρών οξέων ή της οξείδωσης των υπεροξισωμικών λιπαρών οξέων (FAO) μπορεί να προστατεύσει απόνεφρική βλάβη(6, 7), υποδηλώνοντας ότι η διατήρηση του κυτταρικού μεταβολισμού μπορεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος στην ΑΚΙ. Μεταγραφικές μελέτες σε βιοψίες νεφρού με ανθρώπινη ΧΝΝ καθώς και μετά από τραυματισμό επαναιμάτωσης ισχαιμίας (IRI) σε ποντίκια καταδεικνύουν δυσρυθμισμένο μεταβολισμό λιπαρών οξέων καθώς και μεταβολισμό αμινοξέων (6, 8). Αν και ο ρόλος της οξείδωσης των λιπαρών οξέων PT έχει περιγραφεί προηγουμένως στο AKI, ο ρόλος του μεταβολισμού των αμινοξέων PT στο AKI μένει να διερευνηθεί. Επιπλέον, οι μηχανισμοί τραυματισμού της PT που περιγράφονται μέχρι σήμερα έχουν διερευνηθεί σε μεγάλο βαθμό χρησιμοποιώντας μοντέλα ποντικιών με νοκ-άουτ και υπερέκφραση μεμονωμένων μορίων σηματοδότησης, αλλά μηχανισμούς με τους οποίους παγκόσμιες οδούς, τόσο ινωτικές/φλεγμονώδεις όσο και μεταβολικές, και η εναλλαγή μεταξύ φυσιολογικής ανάκαμψης και ατροφίας ρυθμίζονται σε ΑΚΙ δεν χαρακτηρίζονται καλά.

Οι παράγοντες μεταγραφής λειτουργούν ως κύριοι ρυθμιστές θεμελιωδών βιολογικών διεργασιών, λόγω της ικανότητάς τους να ρυθμίζουν την έκφραση πολλαπλών κατάντη στόχων και να σχηματίζουν βρόχους ανάδρασης. Στο AKI, οι καλά μελετημένοι παράγοντες μεταγραφής, όπως τα μέλη της οικογένειας FOS και JUN, ρυθμίζονται σε υψηλό βαθμό. Πρόσφατες μελέτες μοριακών αποκρίσεων σε IRI σε ανθρώπινα δείγματα και μεταφραστικό προφίλ PT μετά από μονόπλευρη απόφραξη ουρητήρα (UUO) σε ποντίκια ταυτοποίησαν επίσης τον παράγοντα μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου παράγοντα 6 (KLF6) ως παρόμοιο γονίδιο απόκρισης πρώιμης βλάβης (9, 10). ). Τα KLFs περιλαμβάνουν μια οικογένεια παραγόντων μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου με εξαιρετικά διατηρημένους C-τερματικούς τομείς δέσμευσης DNA και μεταβλητά άκρα Ν που εκφράζονται ευρέως, συμπεριλαμβανομένης τηςνεφρό(11). Το KLF6 έχει ρόλους σε πολλαπλές διεργασίες όπως ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των κυττάρων, η απόπτωση, οι αποκρίσεις βλάβης του DNA και η μιτοχονδριακή λειτουργία (12) και έχει αναγνωριστεί ότι παίζει ρόλους στην ηπατική, την καρδιακή και την καρδιακή λειτουργία.νεφρόίνωση, με επιδράσεις που εξαρτώνται από το πλαίσιο (13, 14). Μέσα στονεφρό, το KLF6 εκφράζεται σε σπειραματικά ποδοκύτταρα και είναι ένας ουσιαστικός ρυθμιστής της μιτοχονδριακής λειτουργίας στο πλαίσιο της εστιακής τμηματικής σπειραματοσκλήρωσης (FSGS) (15). Εκτός από την έκφρασή του στα σπειραματικά ποδοκύτταρα, το KLF6 εκφράζεται επίσης ποικίλα στο PT, αλλά ο ρόλος του στα κύτταρα ΡΤ, είτε σε φυσιολογική λειτουργία είτε μετά από τραυματισμό, δεν είναι κατανοητός. Η υπερέκφραση του KLF6 σε κύτταρα HK-2 οδήγησε σε έναν αποδιαφοροποιημένο φαινότυπο με μειωμένη Ε-καντερίνη και αυξημένη έκφραση βιμεντίνης και επίσης οδήγησε σε αυξημένη έκφραση της φλεγμονώδους πρωτεΐνης των μακροφάγων-3 (16). Επιπλέον, η έκφραση του KLF6 αυξήθηκε ως απόκριση στην υψηλή γλυκόζη και αυτό το αποτέλεσμα μπλοκαρίστηκε με την καταστροφή του TGFB1 ή τη θεραπεία με εξουδετερωτικό αντίσωμα TGF- 1. Η άμεση θεραπεία με TGF- 1 προκάλεσε επίσης έκφραση KLF6, υποδεικνύοντας έναν πιθανό βρόχο θετικής ανάδρασης σε κύτταρα HK-2 (16). Το KLF6 έχει επίσης αποδειχθεί ότι επάγεται σε καρκινικά κύτταρα in vitro από υποαποπτωτικές δόσεις του βλαβερού για το DNA χημειοθεραπευτικού φαρμάκου σισπλατίνη (17). Προκειμένου να προσδιοριστεί ο ρόλος του PT KLF6 σε απόκριση στη βλάβη του DNA, χρησιμοποιήσαμε τη φυσική τοξίνη αριστολοχικό οξύ I (AAI). Η σχετιζόμενη με το AAI νεφροπάθεια είναι κλινικά σχετική (18) και η τοξικότητα του AAI είναι ιδιαίτερα ειδική για το PT, επιτρέποντας έτσι τη μελέτη του ρόλου του PT KLF6 ειδικά ως απόκριση στον τραυματισμό του PT. Επιπλέον, το AAI προκαλεί αξιόπιστα τόσο AKI όσο και μετάβαση σε ίνωση σε ποντίκια, σε αντίθεση με τα περισσότερα σχήματα σισπλατίνης (19). Το AAI εισέρχεται στα PT κύτταρα μέσω βασικών πλευρικών μεταφορέων οργανικών ανιόντων (OATs) 1 έως 3 και έχει τόσο γονοτοξικές επιδράσεις, μέσω σχηματισμού προσαγωγών αριστολακτάμης (AL)-DNA, όσο και κυτταροτοξικές επιδράσεις, προκαλώντας μιτοχονδριακή βλάβη, η οποία δημιουργεί αντιδραστικά είδη οξυγόνου και συγκεκριμένα αναστέλλοντας το φυσιολογικό Λειτουργίες PT όπως η ενδοκυττάρωση που προκαλείται από υποδοχείς (18-20). Εδώ, αποδεικνύουμε μέσω της διαμόρφωσης της έκφρασης του KLF6 ειδικά στο PT μέσω μελετών κέρδους-λειτουργίας και απώλειας-λειτουργίας σε ποντίκια ότι η καταστολή του καταβολισμού αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (BCAA) με τη μεσολάβηση του KLF6-συμβάλλει στο AKI και επακόλουθονεφρόίνωση.

Αποτελέσματα

Η θεραπεία με AAI Αυξάνει την Έκφραση του νεφρικού PT Klf6. Δεδομένου ότι αρκετά μέλη της οικογένειας KLF εκφράζονται στα επιθηλιακά κύτταρα στονεφρό(21), αρχικά αναλάβαμε qRT-PCR για αυτά τα επιθηλιακά Klfs σενεφρόο φλοιός συλλέχτηκε 24 ώρες μετά από μια απλή δόση ΡΤ-ειδικής τοξίνης, AAI, έναντι φορέα (διμεθυλοσουλφοξείδιο [DMSO]) σε ποντικούς C57BL/6. Τα Klf4, Klf5 και Klf6 ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω, ενώ το Klf15 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα κάτω (Εικ. 1Α) και αυτές οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση συνέβησαν πριν από μια σημαντική αύξηση της κρεατινίνης ορού (Εικ. 1Β). Για να προσδιορίσουμε εάν η ανοδική ρύθμιση του Klf6 είναι παροδική ή παρατεταμένη, χορηγήσαμε AAI σε πολλαπλές ενέσεις 3 μακροχρόνια είτε για δύο ενέσεις είτε για 3 εβδομάδες (ενεργή φάση) ή για 3 εβδομάδες ακολουθούμενες από 3 εβδομάδες χωρίς AAI (φάση αναδιαμόρφωσης) (Εικ. 1C) . Η ΡΤ παρέμεινε ανέπαφη 24 ώρες μετά από μία ένεση, αλλά μετά από δύο ενέσεις, τα κύτταρα ΡΤ υπέστησαν κυτταρικό θάνατο και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με πολλαπλές δόσεις AAI παρουσίασαν απώλεια ΡΤ, φλεγμονώδεις διηθήσεις, πρωτεΐνη

γύψοι και ίνωση στο τέλος της φάσης αναδιαμόρφωσης (Εικ. 1D). Η έκφραση του Klf6 παρέμεινε σημαντικά αυξημένη στις φάσεις ενεργού και αναδιαμόρφωσης του τραυματισμού (Εικ. 1Ε), υποδηλώνοντας έναν ρόλο για το KLF6 σε όλη την οξεία και ινωτική φάση του τραυματισμού. Το KLF6 εκφράζεται σε σπειραματικά, σωληναριακά και φλεγμονώδη κύτταρα και για να προσδιορίσουμε τη συμβολή της ειδικής για PT έκφρασης Klf6 στην παρατηρούμενη αύξηση της έκφρασης Klf6 του νεφρικού φλοιού, πραγματοποιήσαμε αλληλούχιση RNA (RNA-seq) σε μικροδιατομή S2/S3 PT τμήματα 24 h μετά από μία ένεση AAI, πριν την απώλεια κυττάρων ΡΤ. Το Klf6 ρυθμίστηκε σε υψηλό βαθμό σε επίπεδο συγκρίσιμο με τους γνωστούς μεταγραφικούς παράγοντες πρώιμης απόκρισης Fos και Jun, υποδεικνύοντας ότι η πρώιμη επαγωγή της έκφρασης αγγελιοφόρου RNA Klf6 (mRNA) στονεφρόκαθοδηγείται από την έκφρασή του σε κύτταρα ΡΤ (Εικ. 1 ΣΤ). Αυτά τα ευρήματα συμφωνούν με πρόσφατα δημοσιευμένα δεδομένα μονοκυττάρου/πυρηνικού RNA-seq που δείχνουν αύξηση της ρύθμισης του Klf6 σε κύτταρα PT σε τραυματισμένο ποντικό και άνθρωπονεφρά(22, 23). Τέλος, η εξόρυξη δεδομένων συστοιχιών έκφρασης από προηγούμενες μελέτες χρονικής πορείας IRI (8) επιβεβαίωσε την πρώιμη επαγωγή στην έκφραση KLF6, εντός 2 ωρών από το AKI, παρόμοια με τα Fos και Jun (Εικ. 1G). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το Klf6 είναι ένα γονίδιο απόκρισης πρώιμης επαγώγιμης βλάβης μετά από θεραπεία με την ειδική για PT τοξίνη AAI και μετά από IRI και παραμένει αυξημένο παρά τη διακοπή της AAI.

Η ειδική απώλεια του KLF6 για το PT εξασθενεί τον τραυματισμό των νεφρών στις φάσεις ενεργού και αναδιαμόρφωσης μετά τη θεραπεία με AAI.Για να προσδιορίσουμε τη συμβολή του ειδικού για PT KLF6 στον τραυματισμό που προκαλείται από το AAI, δημιουργήσαμε ποντίκια με ειδική για PT αναστολή του Klf6 (Klf6PTKD) διασταυρώνοντας ποντίκια Klf6fl/fl (24) με ποντίκια Pepck-Cre (25). Τα ποντίκια Klf6PTKD ήταν βιώσιμα και γόνιμα, με σημαντική μείωση της ειδικής για PT έκφραση πρωτεΐνης KLF6 αλλά καμία αλλαγή στην έκφραση mRNA του Klf6 στο ήπαρ, σε σύγκριση με τα ποντίκια Klf6fl/fl (Παράρτημα SI, Σχήμα S1 A-C). Δεν υπήρχαν εμφανείς διαφορέςνεφρόιστολογία ή λειτουργία μεταξύ ποντικών Klf6fl/fl και Klf6PTKD σε ηλικία 24 εβδομάδων (Παράρτημα SI, Εικ. S1 D και E) και επίπεδα έκφρασης των OATs 1 έως 3 (Slc22a6, Slc22a7 και Slc22a8), οδός εισόδου AAI PT, δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές (Παράρτημα SI, Σχήμα S1F).

Τα ποντίκια ελέγχου (Klf6fl/fl) και Klf6PTKD υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα (DMSO) ή 3 mg/kg AAI ενδοπεριτοναϊκά κάθε 3 ημέρες για 3 εβδομάδες και υποβλήθηκαν σε ευθανασία 3 ημέρες μετά την τελευταία ένεση AAI για την αξιολόγηση της ενεργού φάσης του τραυματισμού ή 3 εβδομάδες μετά την τελευταία ένεση AAI για την αξιολόγηση της φάσης αναδιαμόρφωσης του τραυματισμού (Εικ. 1C). Τα ποντίκια Klf6fl/fl και Klf6PTKD είχαν παρόμοιες ποσότητες προϊόντων προσθήκης AL-DNA τόσο μετά από μία ένεση όσο και στο τέλος της ενεργού φάσης και της φάσης αναδιαμόρφωσης (Παράρτημα SI, Εικ. S1 G και H), υποδηλώνοντας παρόμοια πρόσληψη PT του AAI και επιδιόρθωση της AL -Προαγωγές DNA σε ποντικούς Klf6fl/fl και Klf6PTKD. Ενώ υποβάλλονταν σε ενέσεις, τα ποντίκια που έλαβαν AAI έχασαν βάρος σε σχέση με εκείνα που έλαβαν DMSO, με παρόμοια μείωση ~18 τοις εκατό από την αρχική τιμή σε ποντίκια Klf6fl/fl και Klf6PTKD στην τελική ένεση AAI, ακολουθούμενη από ανάκτηση παρόμοιων ποσοτήτων σωματικού βάρους ( SI Παράρτημα, Εικ. S2A).ΝεφρόΤα βάρη σε σχέση με το αρχικό σωματικό βάρος (ημέρα 0) ήταν παρόμοια μεταξύ των ποντικών Klf6fl/fl και Klf6PTKD που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO και AAI στο τέλος της ενεργής φάσης (Παράρτημα SI, Εικ. S2B). Στη φάση της αναδιαμόρφωσης,νεφράαπό ποντίκια Klf6fl/fl που έλαβαν θεραπεία με AAI ζύγιζαν σημαντικά λιγότερο από αυτά από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με DMSO, αλλά σε ποντίκια Klf6PTKD που έλαβαν θεραπεία με AAI,νεφρόδιατηρήθηκαν τα βάρη (Παράρτημα SI, Εικ. S2B).Λειτουργία των νεφρώναξιολογήθηκε με μέτρηση των συγκεντρώσεων κρεατινίνης ορού (Εικ. 2Α) και αζώτου ουρίας (Εικ. 2Β). Τόσο οι συγκεντρώσεις κρεατινίνης ορού όσο και αζώτου ουρίας ήταν σημαντικά αυξημένες σε ποντικούς που έλαβαν AAI έναντι DMSO. Ωστόσο, οι αυξήσεις ήταν σημαντικά μικρότερες στα ποντίκια Klf6PTKD σε σύγκριση με τα ποντίκια Klf6fl/fl (Εικ. 2 Α και Β). Η ιστολογική ανάλυση χρησιμοποιώντας χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης και περιοδικού οξέος Schiff έδειξε ότι τόσο τα ποντίκια Klf6fl/fl όσο και τα ποντίκια Klf6PTKD που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AAI είχαν αποβολή σωληναρίων με υπολειπόμενες βασικές μεμβράνες, φλεγμονώδεις διηθήσεις που εντοπίζονταν κυρίως στο

εξωτερικό φλοιό και πολλαπλές πρωτεϊνικές ρίψεις τόσο στον φλοιό όσο και στο μυελό (Εικ. 2 Γ και Δ). Ωστόσο, αυτά τα χαρακτηριστικά ήταν λιγότερο σοβαρά στα ποντίκια Klf6PTKD σε σύγκριση με τα ποντίκια Klf6fl/fl, με διατήρηση σωληναρίων και μικρότερες φλεγμονώδεις διηθήσεις. Η ανάλυση της περιοχής PT πραγματοποιήθηκε με χρήση χρώσης φθορίζουσας λεκτίνης Lotus για τον εντοπισμό ανέπαφων ορίων βούρτσας PT σε πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα ΡΤ και ανοσοφθορισμό για κυτοκερατίνη-20 (KRT-20) για την αναγνώριση τραυματισμένων PT (8). Σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν DMSO, τόσο τα ποντίκια Klf6fl/fl όσο και τα ποντίκια Klf6PTKD που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AAI είχαν σημαντική απώλεια ώριμης PT, όπως φαίνεται από την απώλεια χρώσης με λεκτίνη Lotus και την επαγωγή έκφρασης KRT-20, υποδεικνύοντας βλάβη της PT και στις δύο ενεργές φάσεις και φάσεις αναδιαμόρφωσης (Εικ. 2Ε και Παράρτημα SI, Εικ. S2C). Τα ποντίκια Klf6PTKD που έλαβαν θεραπεία με AAI είχαν σημαντική διατήρηση του ώριμου PT σε σύγκριση με τα ποντίκια Klf6fl/fl, συνοδευόμενα από παρόμοια επίπεδα επαγωγής KRT{13}} τόσο στην ενεργό όσο και στη φάση αναδιαμόρφωσης. Τριχρωμική χρώση φάσης αναδιαμόρφωσηςνεφράέδειξε εκτεταμένη εναπόθεση ινώδους υλικού σε ποντικούς Klf6fl/fl, με σημαντικά λιγότερη ίνωση σε ποντικούς Klf6PTKD (Εικ. 2F, μπλε χρώση, SI Παράρτημα, Πίνακας S1). Η εναπόθεση του κολλαγόνου Ι του συστατικού της ινωτικής μήτρας, που ανιχνεύθηκε με χρήση ανοσοφθορισμού (Εικ. 2G και Παράρτημα SI, Σχήμα S2D), έδειξε ότι το κολλαγόνο Ι αυξήθηκε σημαντικά σε ποντικούς Klf6fl/fl με AAI αλλά όχι σε ποντικούς Klf6PTKD με AAI σε σύγκριση με DMSO στο την ενεργό φάση. Στη φάση αναδιαμόρφωσης, το κολλαγόνο Ι αυξήθηκε σημαντικά σε ποντίκια Klf6fl/fl και Klf6PTKD με AAI, με σημαντικά χαμηλότερη ποσοστιαία περιοχή στα ποντίκια Klf6PTKD με AAI σε σύγκριση με τα ποντίκια Klf6fl/fl με AAI. Διάμεση φλεγμονώδη κύτταρα που αποτελούνταν από CD68 συν μακροφάγα και GR-1 συν μυελοειδή μονοκύτταρα ήταν παρόντα στο Klf6fl/fl

και ποντίκια Klf6PTKD που έλαβαν θεραπεία με ΑΑΙ αλλά ήταν σημαντικά λιγότερο άφθονα σε ποντίκια Klf6PTKD τόσο στην ενεργό όσο και στη φάση αναδιαμόρφωσης (Εικ. 2Η). Έτσι, η απώλεια του ειδικού για PT KLF6 προστατεύει από τραυματισμό ΡΤ, ίνωση και φλεγμονή που προκαλείται από ΑΑΙ, παρά την παρουσία παρόμοιων ποσοτήτων προϊόντων προσθήκης AL-DNA σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με ΑΑΙ. Η ειδική απώλεια του KLF6 για το PT μειώνει τη φλεγμονώδη σηματοδότηση και διατηρεί τον κυτταρικό μεταβολισμό μετά από θεραπεία με AAI. Επιδιώξαμε να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς με τους οποίους η απώλεια του PT KLF6 προστατεύει από τραυματισμό, και ως εκ τούτου αναλάβαμε το RNA-seq τουνεφρόcortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- ή<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

Για να προσδιορίσουμε μονοπάτια που δυνητικά ρυθμίζονται άμεσα και έμμεσα από το KLF6, αναλύσαμε περαιτέρω τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ταξινομώντας τα με βάση την παρουσία και τη θέση των θέσεων δέσμευσης KLF6, χρησιμοποιώντας δεδομένα αλληλουχίας ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης KLF6 (ChIP-Seq) από το έργο Encyclopedia of DNA Elements . Τα γονίδια κατηγορίας 2 ορίστηκαν ως έχοντα τουλάχιστον 1 θέση δέσμευσης KLF6 εντός ±1 kb από τη θέση έναρξης μεταγραφής (TSS), γονίδια κατηγορίας 1 ως έχοντα τουλάχιστον 1 θέση δέσμευσης KLF6 μεταξύ ±1 και 1{0 kb του Τα γονίδια TSS και κατηγορίας 0 δεν έχουν θέση δέσμευσης KLF6 εντός ±10 kb από το TSS. Υπήρχαν 538 γονίδια που είχαν ρυθμιστεί προς τα πάνω σε ποντικούς Klf6fl/fl και σημαντικά μειωμένα σε ποντίκια Klf6PTKD έναντι ποντικών Klf6fl/fl στην ενεργή φάση. Η ανάλυση εμπλουτισμού μονοπατιού αυτών των 538 γονιδίων έδειξε ότι τα μονοπάτια που σχετίζονται με το έμφυτο ανοσοποιητικό (π.χ. TYROBP, φαγόσωμα και μακροφάγο) και με κυτταρική προσκόλληση (π.χ. ιντεγκρίνη, εστιακή προσκόλληση) εμπλουτίστηκαν σημαντικά (Εικ. 3Α). Η ταξινόμηση των γονιδίων σύμφωνα με τις θέσεις δέσμευσης KLF6 έδειξε ότι η πλειοψηφία των DEGs (428/538) δεν είχε θέσεις δέσμευσης KLF6 (κατηγορία 0) και ανάλυση εμπλουτισμού των γονιδίων κατηγορίας 2 (72) και γονιδίων κατηγορίας 0 χωριστά έδειξε ότι η σημασία αυτών των μονοπατιών καθοδηγείται έντονα από τα γονίδια κατηγορίας 0, υποδεικνύοντας ότι η χαμηλότερη έκφραση αυτών των γονιδίων σε ποντικούς Klf6PTKD ήταν πιθανώς μια έμμεση επίδραση μικρότερου τραυματισμού ΡΤ ως αποτέλεσμα της ειδικής PT Klf6 knockdown (Εικ. 3Α).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

Υπήρχαν 388 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε ποντικούς Klf6fl/fl και διατηρήθηκαν σημαντικά (ρυθμισμένα προς τα πάνω) σε Klf6PTKD έναντι Klf6fl/fl ποντικών. Η ανάλυση εμπλουτισμού οδού έδειξε ότι αυτά τα γονίδια αντιπροσώπευαν μεταβολικές οδούς, με τον μεταβολισμό των αμινοξέων και τον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων να είναι εξέχοντες (Εικ. 3Β και Παράρτημα SI, Εικ. S4). Η ανάλυση εμπλουτισμού των γονιδίων κατηγορίας 2 (1{{10}}3) και γονιδίων κατηγορίας 0 (246) έδειξε ότι παρά μόνο το ~25 τοις εκατό των γονιδίων έχουν θέσεις δέσμευσης KLF6 εντός ±1 kb από το TSS ( κατηγορίας 2), αυτό το υποσύνολο γονιδίων ήταν ο οδηγός για τις πολύ σημαντικές τιμές P αυτών των μονοπατιών. Εντυπωσιακά, οι μεταβολικές οδοί ειδικών αμινοξέων (Val, Leu και Ile [BCAA] και Gly, Ser, και Thr) ήταν εξίσου σημαντικές όταν αναλύθηκαν μόνο γονίδια κατηγορίας 2, υποδηλώνοντας πιθανή άμεση ρύθμιση αυτών των οδών από το KLF6 (Εικ. 3Β) . Αντίθετα, η υψηλή σημασία των μεταβολικών οδών λιπαρών οξέων και της οδού σηματοδότησης PPAR καθοδηγούνταν σε μεγάλο βαθμό από γονίδια κατηγορίας 0, υποδηλώνοντας έμμεση διατήρηση αυτών των μονοπατιών ως αποτέλεσμα της ειδικής για την PT καταστροφή του Klf6. Ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων για συγκεκριμένες μεταβολικές οδούς της Εγκυκλοπαίδειας Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG) (αποδόμηση λιπαρών οξέων, μεταβολισμός αμινοξέων, κύκλος TCA και γλυκόλυση) χρησιμοποιώντας όλα τα διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια επιβεβαίωσε ότι αυτά ρυθμίζονται σημαντικά προς τα πάνω (διατηρούνται) σε Klf6PTKD έναντι ποντικών Klf6fl/fl (Εικ. 3C).

Επαγωγή KLF6 ΕπιδεινώνειΚάκωση νεφρούκαι καταστέλλει τα καταβολικά γονίδια BCAA μετά τη θεραπεία με AAI. Για να προσδιορίσουμε εάν η υπερβολική έκφραση του KLF6 θα είχε τα αντίθετα αποτελέσματα, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα "tet-on" για να δημιουργήσουμε ένα μοντέλο ποντικού με επαγώγιμη από τη δοξυκυκλίνη (DOX) έκφραση του ανθρώπινου KLF6 (hKLF6OE; διπλό διαγονιδιακό CAG-rtTA, TRE-hKLF6 ποντίκια) (Παράρτημα SI, Εικ. S5A). Τα ποντίκια hKLF6OE είχαν ισχυρή επαγωγή της έκφρασης του hKLF6 μετά τη συμπλήρωση της δίαιτας με DOX για 7 ημέρες χωρίς σημαντικές διαφορές στην έκφραση Klf6 ποντικού (Παράρτημα SI, Εικ. S5B) καινεφράδεν εμφάνισε εμφανή ιστολογική βλάβη ή απώλεια τουνεφρική λειτουργίαμετά από συνεχή θεραπεία με DOX για 15 εβδομάδες (Παράρτημα SI, Εικ. S5 C και D) σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου (TRE-hKLF6 με θεραπεία με DOX). Ωστόσο, για να διευκρινιστεί εάν η επαγωγή του hKLF6 σε PT επιδείνωσε το AKI καινεφρόίνωση, hKLF6OE και ποντίκια ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χαμηλότερη δόση 1 mg/kg AAI ή DMSO κάθε 3 ημέρες για 2 εβδομάδες ακολουθούμενη από ευθανασία μετά από 3 ακόμη ημέρες (ενεργή φάση) ή 2 περαιτέρω εβδομάδες (φάση αναδιαμόρφωσης) (Παράρτημα SI, Σχήμα S6A). Τα ποντίκια ελέγχου και hKLF6OE που έλαβαν AAI έχασαν παρόμοιες ποσότητες σωματικού βάρους (Παράρτημα SI, Εικ. S6B) καινεφρότα βάρη ήταν παρόμοια μεταξύ όλων των ομάδων (Παράρτημα SI, Εικ. S6C). Τα ποντίκια hKLF6OE είχαν σημαντικά αυξημένη κρεατινίνη ορού και άζωτο ουρίας σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου μετά από θεραπεία με ΑΑΙ στην ενεργό φάση (Εικ. 4 Α και Β). Αυτό συνοδευόταν από απώλεια ώριμης PT με υψηλότερη αναλογία KRT-20-θετικής PT, η οποία επιδεινώθηκε σε ποντικούς hKLF6OE και στα δύο χρονικά σημεία (Εικ. 4 C–E και SI Παράρτημα, Εικ. S6D) και αυξήθηκε ίνωση και στις δύο φάσεις (Εικ. 4F και Παράρτημα SI, Εικ. S6E). Η ανάλυση qRT-PCR των γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα στη μεταβολική οδό BCAA έδειξε καταστολή των γονιδίων BCAA μετά από θεραπεία με AAI σε ποντίκια ελέγχου και hKLF6OE, με περαιτέρω καταστολή σε ποντίκια hKLF6OE σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου (Εικ. 4G). Επιπλέον, η έκφραση αρκετών από τα γονίδια BCAA είτε μειώθηκε σημαντικά (Hibch) είτε έδειξε μια τάση προς χαμηλότερη έκφραση σε ποντίκια hKLF6OE σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου ακόμη και χωρίς θεραπεία με AAI (με αγωγή με DMSO) (Εικ. 4G). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η επαγωγή του hKLF6 σε ενήλικα ποντίκια καθιστά τονεφρόπιο επιρρεπείς σε ΑΚΙ και τελικά ίνωση με σημαντική απορρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν τον καταβολισμό BCAA.

Η επαγωγή του KLF6 καταστέλλει τον καταβολισμό BCAA, ο οποίος είναι σημαντικό υπόστρωμα για την παραγωγή ATP in vitro.Ο ταβολισμός του μιτοχονδριακού BCAA ca μπορεί να συμβάλει στην οξειδωτική φωσφορυλίωση με την παραγωγή ακετυλο-CoA και ηλεκτρυλο-CoA (Παράρτημα SI, Εικ. S4B). Για να διερευνήσουμε εάν το KLF6 ρυθμίζει το BCAA και τον κυτταρικό μεταβολισμό in vitro, αξιολογήσαμε πρώτα την έκφραση των μεταβολικών γονιδίων BCAA σε κύτταρα HK-2 με υπερέκφραση του KLF6 (KLF6-OE), με ή χωρίς θεραπεία με AAI. Όπως και στα ποντίκια hKLF6OE, η υπερέκφραση του KLF6 μόνο στα HK-2 κύτταρα οδήγησε σε μια τάση προς την καταστολή αρκετών γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα BCAA, ιδίως BCKDHB. Η θεραπεία των κυττάρων ελέγχου KLF{10}}Con με 25 μM AAI για 6 ώρες κατέστειλε σημαντικά την έκφραση αρκετών ενζύμων και αυτά κατέστειλαν περαιτέρω σε κύτταρα KLF6-ΟΕ που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AAI (Εικ. 5Α). Προς την

Εικ. 3. Η απώλεια του KLF6 καταστέλλει τις προϊβρωτικές οδούς και διατηρεί τις μεταβολικές οδούς μετά από θεραπεία με AAI. (Α) Ταξινόμηση και ανάλυση εμπλουτισμού οδού των γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω σε ποντικούς Klf6fl/fl μετά από AAI αλλά σημαντικά λιγότερο ρυθμισμένα σε ποντίκια Klf6PTKD μετά από AAI σύμφωνα με την κατηγορία θέσης δέσμευσης: κατηγορία 2 με μεγαλύτερη ή ίση με 1 θέση δέσμευσης KLF6 εντός ±1 kb TSS; κλάση 1 με μεγαλύτερη ή ίση με 1 θέση δέσμευσης KLF6 στα ±1 έως 10 kb από TSS. και κλάση 0 χωρίς θέση δέσμευσης KLF6 εντός ± 10 kb από το TSS. (Β) Ταξινόμηση και ανάλυση εμπλουτισμού οδού των γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα κάτω σε ποντικούς Klf6fl/fl μετά από AAI αλλά σημαντικά λιγότερο ρυθμισμένα (δηλ. διατηρούνται) σε ποντίκια Klf6PTKD μετά από AAI σύμφωνα με την κατηγορία θέσης δέσμευσης: κατηγορία 2 με μεγαλύτερη ή ίση με 1 θέση δέσμευσης KLF6 εντός ±1 kb TSS. κλάση 1 με μεγαλύτερη ή ίση με 1 θέση δέσμευσης KLF6 στα ±1 έως 10 kb από TSS. και κλάση 0 χωρίς θέση δέσμευσης KLF6 εντός ±10 kb από το TSS. (Γ) Διαγράμματα ανάλυσης εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων χρησιμοποιώντας όλα τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια, για την αποικοδόμηση λιπαρών οξέων KEGG (FA DEGRAD), το μεταβολισμό των αμινοξέων (AA METAB) και τον κύκλο TCA (KEGG_TCA).

προσδιορίσαμε εάν αυτή η καταστολή στην έκφραση του γονιδίου BCAA παρουσία AAI οδήγησε σε αλλαγές στον καταβολισμό BCAA, μετρήσαμε τις ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις BCAA. Μετά από θεραπεία με AAI, τα κύτταρα KLF6- Con εμφάνισαν μείωση του BCAA, σύμφωνα με αυξημένο καταβολισμό του BCAA, πιθανώς ως αντιστάθμιση για την απώλεια οξείδωσης FA (Εικ. 5Β). Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα χάθηκε στα κύτταρα KLF6-OE, τα οποία δεν είχαν μείωση στο ενδοκυτταρικό BCAA μετά από θεραπεία με AAI, σύμφωνα με μειωμένη ικανότητα καταβολισμού BCAA (Εικ. 5Β) και αυτό συσχετίστηκε με μειωμένη παραγωγή μιτοχονδριακού ATP σε σύγκριση με κύτταρα KLF6-Con που έχουν υποστεί αγωγή με AAI (Εικ. 5C).

Τα τυπικά μέσα που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της παραγωγής ATP περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης (10 mM γλυκόζη, 1 mM γλουταμίνη και 2 mM πυροσταφυλικό) και για να προσδιορίσουμε εάν το KLF6 από μόνο του υπερέκφρασης θα μπορούσε να αλλάξει τη χρήση διαφορετικών πηγών ενέργειας, αντ' αυτού πραγματοποιήσαμε δοκιμές Ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) σε μέσα ενεργειακά περιορισμένης ενέργειας (μέσα χωρίς ορό με 1 mM γλυκόζη, χωρίς γλουταμίνη και χωρίς πυροσταφυλικό). Τα κύτταρα KLF6-ΟΕ είχαν μειωμένη μιτοχονδριακή OCR (ορίζεται ως αρχική OCR μείον μη μιτοχονδριακή OCR που προσδιορίστηκε μετά τη χορήγηση ροτενόνης/αντιμυκίνης Α) αλλά είχαν παρόμοια αντιστάθμιση μετά τον αποκλεισμό της γλυκόλυσης με 2-δεοξυγλυκόζη (2- DG) και παρόμοιο FAO (μείωση της OCR μετά τον αποκλεισμό του FAO με etomoxir) (Εικ. 5 D και E). Δεδομένου ότι η μιτοχονδριακή απόκριση στην απώλεια γλυκόλυσης και η OCR που προκύπτει από την οξείδωση FA δεν άλλαξαν στα κύτταρα KLF6-ΟΕ, αυτό υποδηλώνει ότι η συνολική μιτοχονδριακή λειτουργία δεν επηρεάστηκε, αλλά μάλλον η αδυναμία χρήσης BCAA ως πηγής ευθύνονται για τη βασική μείωση του μιτοχονδριακού OCR σε αυτές τις συνθήκες περιορισμένης ενέργειας. Για να προσδιορίσουμε εάν η απώλεια του καταβολισμού BCAA θα οδηγούσε σε μειωμένη παραγωγή μιτοχονδριακού ATP, δημιουργήσαμε κύτταρα HK-2 με εξουδετέρωση του BCKDHB (Παράρτημα SI, Εικ. S7). Τα BCKDHA και BCKDHB κωδικοποιούν δύο από τις υπομονάδες του συμπλέγματος μεγάλων πρωτεϊνών αφυδρογονάσης κετοξέος διακλαδισμένης αλυσίδας (BCKDH), η οποία καταλύει το πρώτο μη αναστρέψιμο και περιοριστικό ρυθμό στον καταβολισμό BCAA και αναστέλλεται από τη φωσφορυλίωση από την κινάση BCKDH (BCKDK) (BCKDK). Για να μετατοπιστεί ο έλεγχος BCKDHB-SCR και να μειωθούν τα κύτταρα BCKDHB-sh προς την παραγωγή μιτοχονδριακού ATP, αυτά προεπωάστηκαν σε 2-DG για να αποκλειστεί η γλυκόλυση για 1 ώρα πριν από την εκτέλεση της ανάλυσης ATP Production Rate. Η καταστροφή του BCKDHB οδήγησε σε σημαντική μείωση στην παραγωγή ATP, δείχνοντας ότι τα BCAA χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ATP στον άνθρωπονεφρόκύτταρα (Εικ. 5F). Αντίθετα, να

Εικ. 4. Τα ποντίκια hKLF6OE έχουν επιδεινωθείνεφρική βλάβημε καταστολή των γονιδίων BCAA. (Α και Β) Συγκεντρώσεις κρεατινίνης ορού (Α) και αζώτου ουρίας (Β) σε ποντίκια ελέγχου και hKLF6OE που έλαβαν αγωγή με DMSO ή AAI στην ενεργό φάση. n=4 έως 9 ανά ομάδα. $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{23}}{101}="" {26}}1="" έναντι="" του="" ίδιου="" γονότυπου="" με="" dmso.="" **p="">< 0.01="" έναντι="" ελέγχου="" με="" aai.="" μονόδρομη="" anova="" με="" διόρθωση="" sidak="" για="" πολλαπλές="" δοκιμές.="" (c="" και="" d)="" αντιπροσωπευτικές="" ιστολογικές="" εικόνες="" που="" χρωματίστηκαν="" χρησιμοποιώντας="" κηλίδες="" αιματοξυλίνης="" και="" ηωσίνης="" (c)="" και="" περιοδικού="" οξέος="" schiff="" (d).="" κίτρινα="" βέλη:="" σωλήνες="" αποβολής.="" μαύρα="" βέλη:="" υπολείμματα="" βασικών="" μεμβρανών.="" κίτρινες="" αιχμές="" βελών:="" εκμαγεία="" πρωτεΐνης.="" και="" μαύρες="" αιχμές="" βελών:="" φλεγμονώδεις="" διηθήσεις.="" (ράβδοι="" κλίμακας,="" 100="" μm.)="" (ε)="" ανοσοφθορισμού="" χρώση="" για="" κυτοκερατίνη-20="" (krt-20)="" ως="" δείκτης="" τραυματισμένης="" pt="" (κόκκινο)="" με="" συνχρωματισμό="" με="" λεκτίνη="" lotus="" (ll="" )="" ως="" δείκτης="" μη="" τραυματισμένου="" pt="" (πράσινο).="" (λάβες="" κλίμακας,="" 250="" μm.)="" (f)="" ανοσοφθορίζουσα="" χρώση="" για="" -sma="" (πράσινο)="" με="" κοστολόγηση="" για="" edu="" (ματζέντα).="" (ράβδοι="" κλίμακας,="" 100="" μm.)="" (g)="" έκφραση="" mrna="" των="" γονιδίων="" bcaa="" σε="" ποντίκια="" ελέγχου="" και="" hklf6oe="" που="" έλαβαν="" θεραπεία="" με="" dmso="" ή="" aai="" στην="" ενεργό="" φάση.="" n="5" έως="" 9="" ανά="" ομάδα.="" $p="">< 0,01,="" $$p="">< 0,001="" έναντι="" ελέγχου="" με="" dmso.="" όλα="" τα="" hklf6oe="" με="" aai="" είναι="" p="">< 0,001="" έναντι="" hklf6oe="" με="" dmso.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001 έναντι="" ελέγχου="" με="" την="" ίδια="" θεραπεία.="" πολλαπλές="" δοκιμές="" t="" με="" διόρθωση="" του="" ρυθμού="" ψευδούς="" ανακάλυψης="" χρησιμοποιώντας="" το="" μοντέλο="" δύο="" σταδίων="" βήμα-up="" των="" benjamini,="" kreiger="" και="" yekutieli.="" τα="" δεδομένα="" είναι="" μέσος="" όρος="" ±="" sem="" με="" n="" που="" υποδεικνύει="" τον="" αριθμό="" των="" βιολογικών="">

ενίσχυση του καταβολισμού BCAA, αντιμετωπίσαμε τα κύτταρα HK-2 με BT2, το οποίο αναστέλλει το BCKDK, εμποδίζοντας έτσι την ανασταλτική φωσφορυλίωση του BCKDH. Υπό συνθήκες περιορισμένης ενέργειας, η θεραπεία με BT2 αύξησε την OCR σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO, η οποία διατηρήθηκε μετά την αναστολή της γλυκόλυσης και όχι λόγω αλλοίωσης του FAO ή της μη μιτοχονδριακής OCR (Εικ. 5 G και H). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η καταστολή του καταβολισμού BCAA με τη μεσολάβηση KLF6-μειώνει την παραγωγή του μιτοχονδριακού ΑΤΡ, η οποία πιθανότατα θα επιδείνωσε τη βλάβη της ΡΤ στο πλαίσιο του κυτταρικού στρες, στο οποίο υπάρχουν παρόμοιες συνθήκες περιορισμένης ενέργειας λόγω του φαινομένου του FAO σε κίνδυνο.

Η έκφραση γονιδίου BCAA μειώνεται σε διαφορετικά ποντίκια και ανθρώπουςΚακώσεις νεφρών. Για να προσδιορίσουμε εάν η απώλεια της έκφρασης του γονιδίου BCAA συμβαίνει πριν από την απώλεια PT και αυξημένα επίπεδα κρεατινίνης σε τραυματισμό που προκαλείται από AAI, κάναμε qRT-PCR σε ποντίκια C57BL/6 που έλαβαν θεραπεία με μία δόση AAI και υπέστησαν ευθανασία μετά από 24 ώρες. Τα Bckdhb, Hibch και Mccc2 είχαν ήδη ρυθμιστεί σημαντικά προς τα κάτω σε αυτό το χρονικό σημείο, με άλλα γονίδια (π.χ. Acadm) να δείχνουν μια ισχυρή τάση προς τα κάτω ρύθμιση (Εικ. 6Α). Για τη μελέτη της έκφρασης του γονιδίου BCAA σε άλλα ποντίκιανεφρική βλάβημοντέλα, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη (Εικ. 6Β) ή υποβλήθηκαν σε UUO (Εικ. 6C). Και στα δύο μοντέλα, η έκφραση Klf6 ήταν πολύ ρυθμισμένη προς τα πάνω σε σχέση με το όχημα/ τους ελέγχους. Σε ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη, αρκετά από τα γονίδια BCAA που δοκιμάστηκαν ήταν σημαντικά προς τα κάτω, με τάσεις προς τα κάτω ρύθμισης των άλλων γονιδίων (Εικ. 6Β). Σε ποντίκια που υπόκεινται σε UUO, όλα τα γονίδια που δοκιμάστηκαν ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα κάτω τόσο στις 3 όσο και στις 7 ημέρες μετά την UUO (Εικ. 6C), υποδηλώνοντας ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων BCAA συμβαίνει νωρίς μετά τον τραυματισμό.

Εικ. 5. Η υπερέκφραση KLF6 καταστέλλει την έκφραση γονιδίου BCAA, την παραγωγή ATP και τη χρήση BCAA in vitro. (Α) Έκφραση των μεταβολικών γονιδίων KLF6 και BCAA σε κύτταρα HK{3}} που εκφράζουν σταθερά πλασμίδια ελέγχου (Con) ή υπερέκφρασης KLF6 (OE), που έχουν υποστεί επεξεργασία με DMSO ή AAI. n=4 ανά ομάδα; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" έναντι="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0,001="" έναντι="" της="" ίδιας="" κυτταρικής="" γραμμής="" με="" dmso;="" αμφίδρομη="" anova="" με="" διόρθωση="" tukey="" για="" πολλαπλές="" δοκιμές.="" (β)="" ποσοτικοποίηση="" του="" συνολικού="" bcaa="" σε="" κύτταρα="" con="" και="" oe="" που="" έχουν="" υποστεί="" επεξεργασία="" με="" dmso="" ή="" aai.="" n="6" ανά="" ομάδα.="" $p="">< 0,05="" έναντι="" con="" dmso;="" μονόδρομη="" anova="" με="" διόρθωση="" sidak="" για="" πολλαπλές="" δοκιμές.="" (γ)="" ποσοστιαία="" αλλαγή="" στον="" ρυθμό="" παραγωγής="" μιτοχονδριακού="" ατρ="" σε="" κύτταρα="" con="" και="" oe="" που="" υποβλήθηκαν="" σε="" αγωγή="" με="" aai="" έναντι="" dmso.="" n="27" έως="" 30="" ανά="" ομάδα.="" *p="">< 0,05,="" ***p="">< 0,001="" έναντι="" dmso,="" $p="">< 0,05="" έναντι="" con="" aai;="" μονόδρομη="" anova="" με="" διόρθωση="" sidak="" για="" πολλαπλές="" δοκιμές.="" (δ)="" μετρήσεις="" ocr="" για="" κύτταρα="" con="" και="" oe="" σε="" περιορισμένα="" μέσα.="" όπου="" υποδεικνύεται,="" προστέθηκαν="" 2-dg,="" etomoxir="" (eto)="" και="" ένας="" συνδυασμός="" ροτενόνης/αντιμυκίνης="" α="" (rot).="" n="16" ανά="" ομάδα.="" (ε)="" ποσοτικοποιήσεις="" βασικής="" μιτοχονδριακής="" ocr="" (αρχική="" ocr="" μείον="" ocr="" μετά="" τη="" σήψη),="" μη="" μιτοχονδριακή="" ocr="" (ocr="" μετά="" τη="" σήψη)="" και="" αλλαγές="" στο="" ocr="" μετά="" την="" προσθήκη="" 2-dg="" (μιτοχονδριακή="" αντιστάθμιση="" μετά="" από="" 2-dg)="" και="" etomoxir="" (fao).="" n="16" ανά="" ομάδα;="" **p=""><0,01 έναντι="" con;="" αμφίδρομη="" anova="" με="" διόρθωση="" tukey="" για="" πολλαπλές="" δοκιμές.="" (στ)="" ρυθμός="" παραγωγής="" μιτοχονδριακού="" ατρ="" σε="" κύτταρα="" bckdhb-scr="" και="" bckdhb-sh.="" n="14" ανά="" ομάδα;="" **p="">< 0,05,="" μη="" ζευγαρωμένη="" δοκιμή="" t.="" (ζ)="" μετρήσεις="" ocr="" σε="" κύτταρα="" hk-2="" σε="" περιορισμένα="" μέσα="" απουσία="" ή="" παρουσία="" bt2.="" όπου="" υποδεικνύεται,="" προστέθηκαν="" 2-dg,="" eto="" και="" rot.="" (η)="" ποσοτικοποιήσεις="" βασικής="" μιτοχονδριακής="" ocr,="" μη="" μιτοχονδριακής="" ocr="" και="" μεταβολών="" στην="" ocr="" μετά="" την="" προσθήκη="" 2-dg="" και="" etomoxir="" σε="" κύτταρα="" hk-2="" απουσία="" ή="" παρουσία="" bt2.="" n="8" ανά="" ομάδα;="" *p="">< 0,05="" έναντι="" μη="" bt2.="" αμφίδρομη="" anova="" με="" διόρθωση="" tukey="" για="" πολλαπλές="" δοκιμές.="" τα="" δεδομένα="" είναι="" μέσος="" όρος="" ±="" sem="" με="" n="" που="" υποδεικνύει="" τον="" αριθμό="" των="" βιολογικών="">

Παρομοίως, η εξόρυξη δεδομένων μιας συστοιχίας έκφρασης που είχε αναφερθεί προηγουμένως από το σωληναριακό διάμεσο διαμέρισμα 36 ανθρώπινων ασθενών με ΧΝΝ (υπερτασικούς και διαβητικούςνεφρικές παθήσεις) σε σύγκριση με ασθενείς ελέγχου (6) έδειξαν ότι αρκετά γονίδια BCAA ρυθμίζονται προς τα κάτω με παρόμοιο τρόπο με τα ποντίκια που έλαβαν AAI (Εικ. 6D). Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η σχέση μεταξύνεφρική λειτουργία, την έκφραση KLF6 και την έκφραση των γονιδίων BCAA στην ανθρώπινη ΧΝΝ, χρησιμοποιήσαμε μια δημοσιευμένη συστοιχία έκφρασης από το διάμεσο τμήμα του σωληνίσκου μιας σειράς 164 ασθενών με διάφορεςνεφρικές παθήσεις (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 mL/min/1,73m2) (P < 0,001="" για="" όλα="" τα="" γονίδια),="" αποδεικνύοντας="" ότι="" αυτές="" οι="" αλλαγές="" στη="" γονιδιακή="" έκφραση="" μπορεί="" να="" συμβούν="" νωρίς="" σε="" σχέση="" με="" λειτουργικές="" αλλαγές.="" συλλογικά,="" αυτά="" τα="" δεδομένα="" υποδηλώνουν="" ότι="" η="" μεσολαβούμενη="" από="" το="" klf6-="" καταστολή="" γονιδίων="" που="" είναι="" κρίσιμα="" για="" τον="" καταβολισμό="" bcaa="" μπορεί="" να="" διαδραματίσει="" κρίσιμο="" ρόλο="" στην="">νεφρική βλάβησε ποντικίσια μοντέλα τουνεφρόίνωση καθώς και στην ανθρώπινη ΧΝΝ.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, καταδεικνύουμε τον in vivo ρόλο του ειδικού για PT KLF6 στη ρύθμιση τουνεφρική βλάβη.Το KLF6 ρυθμίζεται έντονα και με συνέπεια νωρίς στο PT ως απόκρισηνεφρική βλάβη, αλλά αυτή είναι μια δυσπροσαρμοστική απόκριση, όπως καταδεικνύεται από την προστατευτική επίδραση της απώλειας του PT Klf6 μετά από θεραπεία με την κλινικά σχετική και εξαιρετικά ειδική για PT τοξίνη AAI. Επιπλέον, καταδεικνύουμε τη δυνητική σημασία του απορρυθμισμένου μεταβολισμού BCAA σε τραυματισμένο PT ως πιθανή συνεισφορά στην ΑΚΙ και την επακόλουθη ίνωση. Η απώλεια του Klf6 οδήγησε στη διατήρηση της έκφρασης του καταβολικού ενζύμου BCAA, με πολλά από τα γονίδια που κωδικοποιούν αυτά τα ένζυμα να έχουν θέσεις δέσμευσης KLF6 σε κοντινή απόσταση από τα TSS τους, υποδηλώνοντας ότι το KLF6 μπορεί να είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας του καταβολισμού BCAA. Αν και άλλο μέλος της οικογένειας KLF, το KLF15, έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι ρυθμίζει την έκφραση της αμινοτρανσφεράσης 2 (Bcat2) διακλαδισμένης αλυσίδας των σκελετικών μυών (30), η ρύθμιση άλλων ενζύμων BCAA δεν αναφέρθηκε. Υποθέτουμε ότι το KLF6 δρα για να καταστέλλει την έκφραση πολλαπλών γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα BCAA.

Σε μη τραυματισμένο ΡΤ, η έκφραση Klf6 είναι χαμηλή και εκφράζεται μεταβλητά σε ορισμένα κύτταρα ΡΤ και όχι σε άλλα. Η ταχεία και ισχυρή ανοδική ρύθμιση που συμβαίνει μετά από πολλαπλούς τύπους τραυματισμών υποδηλώνει έναν φυσιολογικά σημαντικό ρόλο για το KLF6. Στους ινοβλάστες, το KLF6 αποδείχθηκε πρόσφατα ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω ως απόκριση τόσο στο ογκογόνο όσο και στο οξειδωτικό στρες, οδηγώντας σε κυτταρική γήρανση, ενώ η σίγαση του KLF6 οδήγησε σε συσσώρευση δεικτών βλάβης του DNA και γονιδιωματική αστάθεια (31). Έτσι, ο φυσιολογικός ρόλος του KLF6 στον τραυματισμό μπορεί να είναι η πρόκληση κυτταρικής γήρανσης, επιτρέποντας την αποκατάσταση της βλάβης του DNA που μπορεί να προκύψει από τοξικές ή οξειδωτικές/ισχαιμικές προσβολές. Ωστόσο, σε τραυματισμένα PT κύτταρα, μια δεύτερη συνέπεια της ανοδικής ρύθμισης του Klf6 φαίνεται να είναι η καταστολή του καταβολισμού BCAA, ο οποίος ιδιαίτερα στα κύτταρα ΡΤ είναι πιθανώς επιζήμιος. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρά τη μερική καταστροφή του ειδικού για PT Klf6 κατά την έναρξη σε ποντικούς Klf6PTKD, αυτό ήταν ακόμα σε θέση να προσφέρει ένα σαφές προστατευτικό αποτέλεσμα μετά τον τραυματισμό. Αυτό έχει σημαντικές θεραπευτικές επιπτώσεις, καθώς υποδηλώνει ότι μόνο ένας μικρός χειρισμός στα επίπεδα ή τη δραστηριότητα του KLF6 (π.χ. μέσω της χρήσης ενός μικρού μορίου αναστολέα) θα μπορούσε να δείξει θεραπευτική αποτελεσματικότητα. Πράγματι, οι παράγοντες μεταγραφής είναι πιο πιθανοί από άλλες οικογένειες γονιδίων

στο ανθρώπινο γονιδίωμα να έχει ευαισθησία στη δόση (32). Ομοίως, ένας περιορισμός του επαγώγιμου μοντέλου ποντικού υπερέκφρασης KLF6 είναι ότι δεν είναι περιορισμένα PT κύτταρα και ως εκ τούτου, οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να επικεντρωθούν στη χρήση ενός μοντέλου που προκαλείται από συγκεκριμένο κύτταρο για να διευκρινιστεί ο ρόλος του KLF6 που εξαρτάται από το κυτταρικό πλαίσιο.

Προηγουμένως αποδείξαμε ότι η απώλεια του Klf6 στα σπειραματικά ποδοκύτταρα ήταν επιζήμια στη ρύθμιση του FSGS λόγω του ρόλου του στη μεταγραφική ενεργοποίηση της σύνθεσης της οξειδάσης του κυτοχρώματος c 2 (Sco2). Η απώλεια του Klf6 στο FSGS οδήγησε σε χειρότερη ίνωση, με αυξημένη ενεργοποίηση της ενδογενούς αποπτωτικής οδού (15). Η ανάκριση των διαθέσιμων συνόλων δεδομένων RNA-seq ενός κυττάρου δείχνει ότι σε υγιή ποντίκινεφρά,Το Klf6 εκφράζεται σε πολύ μεγαλύτερη αναλογία podo κυττάρων από τα κύτταρα ΡΤ και σε πολύ υψηλότερο επίπεδο (αναφ. 33, https:// susztaklab.com/). Επομένως, το KLF6 πιθανότατα παίζει πιο σημαντικό φυσιολογικό ρόλο στα φυσιολογικά ποδοκύτταρα από τα PT κύτταρα, ενώ άλλοι γνωστοί κύριοι ρυθμιστές μιτοχονδρίων (π.χ. Ppara) εκφράζονται πολύ πιο έντονα στα PT κύτταρα από τα ποδοκύτταρα. Επομένως, η απώλεια του Klf6 στα ποδοκύτταρα είναι πιθανό να έχει πιο επιζήμια επίδραση από ότι στα κύτταρα ΡΤ. Οι αντιθετικοί ρόλοι του KLF6 σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων εντός τουνεφρόπαραλληλίζεται με προηγούμενα ευρήματα κυτταροειδικών επιδράσεων στην καρδιά και το ήπαρ. Έτσι, η καταστροφή του Klf6 σε καρδιακά μυοκύτταρα σε ποντίκια εξασθένησε την καρδιακή ίνωση μετά από υπερφόρτωση αγγειοτενσίνης II, υποδηλώνοντας έναν ρόλο για το KLF6 στη διάδοση της ίνωσης, αλλά η καταστροφή του Klf6 στους καρδιακούς μυοϊνοβλάστες δεν είχε καμία επίδραση στην ίνωση (14). Αντίθετα, στο ήπαρ, η μείωση του Klf6 στα ηπατοκύτταρα ποντικού δεν είχε καμία επίδραση στην ηπατική ίνωση μετά από χρόνια χορήγηση CCl4, αλλά η υπερέκφραση του KLF6 σε ηπατικά αστερικά κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη ίνωση, υποδηλώνοντας ότι το KLF6 είναι προστατευτικό (13).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Απώλεια του FAO κατά τη διάρκειανεφρική βλάβηείναι πλέον γνωστό ότι είναι ένα σημαντικό γεγονός στην παθολογία τουνεφρική βλάβηκαι πράγματι μπορεί να συμβάλει άμεσα στην ίνωση. Ελλείψει του FAO, που είναι η κύρια πηγή ενέργειας για μη τραυματισμένους PT, άλλες πιθανές πηγές ενέργειας ενδέχεται να αποκτήσουν μεγαλύτερη σημασία. Τα BCAA συμβάλλουν στον κύκλο TCA μέσω της παραγωγής ακετυλο-CoA και ηλεκτρυλο-CoA. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι όχι μόνο τα επισημασμένα με 13C BCAA συμβάλλουν στα ενδιάμεσα του κύκλου TCA στονεφρόαλλά τονεφρόείχε την τέταρτη υψηλότερη ενσωμάτωση του 13C στα ενδιάμεσα του κύκλου TCA των οργάνων που δοκιμάστηκαν, μετά το πάγκρεας, τους μυς και τον λευκό λιπώδη ιστό (34), υποδηλώνοντας ότι τα BCAA είναι δυνητικά σημαντικός συνεισφέρων στον κύκλο TCA. Ωστόσο, η σημασία του καταβολισμού BCAA στη συμβολή στον κύκλο TCA, είτε σε φυσιολογικό είτε σε τραυματισμένονεφρά, δεν έχει διερευνηθεί προηγουμένως. Για παράδειγμα, δεν είναι γνωστό εάν η απώλεια του καταβολισμού PT BCAA από μόνη της θα προκαλούσε αλλαγές στην ομοιόσταση και/ή την επιδιόρθωση της PT, και αυτές οι μελέτες θα απαιτήσουν τη δημιουργία νέων μοντέλων ποντικιών, όπως τα ειδικά για PT ποντίκια Bckdhb knockdown. Στο σκηνικό τουνεφρότραυματισμού, όταν ο FAO καταστέλλεται σοβαρά, επιπλέον καταστολή του

γονίδια που κωδικοποιούν τα μεταβολικά ένζυμα BCAA μπορεί να στερήσουν τα σωληναριακά κύτταρα από μια σημαντική εναλλακτική δυνητική πηγή ενέργειας. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η έκφραση του γονιδίου BCAA είχε ήδη μειωθεί προς τα κάτω 24 ώρες μετά από μία μόνο ένεση, πριν από οποιεσδήποτε αλλαγές στην κρεατινίνη ορού ή απώλεια PT, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι καθοδικές ρυθμίσεις ήταν ειδική συνέπεια του τραυματισμού PT και δεν συνδέονταν με μειωμένη ζήτηση ενέργειας PT. από μειωμένο GFR και κατά συνέπεια μειωμένη απαίτηση για πρόσληψη διαλυμένης ουσίας. Αυτές οι οδοί διατηρήθηκαν σε ποντικούς Klf6PTKD που προστατεύτηκαν από τραυματισμό και περαιτέρω κατεστάλησαν σε ποντίκια hKLF6OE που είχαν χειρότερο τραυματισμό. Επιπλέον, τα κύτταρα KLF6-ΟΕ είχαν μειωμένη παραγωγή μιτοχονδριακού ATP μετά από θεραπεία με AAI σε σύγκριση με τα κύτταρα KLF6-Con, και ενώ τα ενδοκυτταρικά BCAA μειώθηκαν στα κύτταρα KLF6-Con, σύμφωνα με τον καταβολισμό τους , αυτή η μείωση δεν εντοπίστηκε σε κύτταρα KLF6-ΟΕ. Επιπλέον, η καταστροφή του BCKDHB σε κύτταρα HK-2 είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη παραγωγή μιτοχονδριακού ΑΤΡ. Έτσι, η διατηρημένη έκφραση των γονιδίων BCAA σε ποντικούς Klf6PTKD μπορεί να παρέχει προστασία έναντι τραυματισμού παρέχοντας ζωτικά ενδιάμεσα του κύκλου TCA σε συνθήκες σοβαρά μειωμένης οξείδωσης FA. Μελλοντικές μελέτες που θα χρησιμοποιούν ποντίκια με γενετικούς χειρισμούς του καταβολισμού BCAA και/ή θεραπεία με BT2 θα μας επιτρέψουν να διερευνήσουμε τη δυναμική μεταξύ του καταβολισμού BCAA και του FAO στονεφρική βλάβη.

Έχουμε δείξει ότι η απώλεια έκφρασης των γονιδίων BCAA οδηγεί σε μειωμένη μιτοχονδριακή αναπνοή και παραγωγή ATP, και αυτό αντιπροσωπεύει έναν μηχανισμό με τον οποίο η απώλεια του καταβολισμού BCAA μπορεί να συμβάλει στηννεφρική βλάβη. Ένας εναλλακτικός μηχανισμός θα μπορούσε να είναι η συσσώρευση BCAA, η οποία μπορεί να έχει τοξική επίδραση. Πράγματι, αυτό έχει αποδειχθεί στο πλαίσιο της καρδιακής IRI. Η συσσώρευση BCAA λόγω απώλειας καταβολισμού αποδείχθηκε ότι αναστέλλει τη χρήση του μιτοχονδριακού πυροσταφυλικού άλατος απενεργοποιώντας μετα-μεταφραστικά την πυροσταφυλική αφυδρογονάση, αφαιρώντας έτσι μια περαιτέρω κυτταρική πηγή ενέργειας και επιδεινώνοντας τον τραυματισμό (35). Αυτό αντιστράφηκε είτε αυξάνοντας τον καταβολισμό BCAA με θεραπεία των ποντικών με BT2 είτε αυξάνοντας τον μεταβολισμό της γλυκόζης με υπερέκφραση της GLUT1. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε επίσης επιδείνωση της καρδιακής IRI με απώλεια του καταβολισμού BCAA σε διαβητικά ποντίκια. Αυτό συνοδεύτηκε από αυξημένο οξειδωτικό στρες και πάλι αντιστράφηκε με επανενεργοποίηση του καταβολισμού BCAA (36). Το BCAA και ιδιαίτερα η λευκίνη είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν τον στόχο σηματοδότησης του συμπλόκου 1 της ραπαμυκίνης (mTOR) των θηλαστικών (mTORC1). Σε ένα μοντέλο ποντικιού πολυκυστικούΝεφρική Νόσος,στα οποία κύτταρα που περιβάλλουν τις κύστεις έχουν ενεργοποίηση του mTOR

η σηματοδότηση, η συμπλήρωση με BCAA ενεργοποίησε περαιτέρω τη σηματοδότηση mTORC1, οδηγώντας σε αυξημένο πολλαπλασιασμό (37). Το μεταγραφικό προφίλ των ηπατοκυτταρικών καρκινωμάτων αποκάλυψε μειωμένη έκφραση γονιδίου BCAA, οδηγώντας σε συσσώρευση BCAA στον ιστό όγκου. Αυτό συσχετίστηκε με αυξημένη σηματοδότηση και πολλαπλασιασμό mTORC1, ο οποίος μειώθηκε με τον περιορισμό των BCAA ή τη θεραπεία με BT2, και επιδεινώθηκε σε ποντίκια που τρέφονταν με δίαιτα με υψηλή περιεκτικότητα σε BCAA (38). Απαιτείται σηματοδότηση mTORC1 για τη λειτουργία PT και μελέτες που χρησιμοποιούν αναστολείς mTORνεφρική βλάβηέχουν δείξει αντικρουόμενα αποτελέσματα, πιθανόν λόγω διαφορετικών δοσολογικών σχημάτων, χρονισμού των θεραπειών και μοντέλων τραυματισμών (39-42). Η σηματοδότηση mTORC1 οδηγεί σε ένα πλήθος κυτταρικών αποκρίσεων, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού, σύνθεσης λιπιδίων, μιτοχονδριακής σύνθεσης και καταστολής της αυτοφαγίας (43). Είναι πιθανό ότι είτε η υπο- είτε η υπερενεργοποίηση της σηματοδότησης mTORC1 θα μπορούσε να είναι επιζήμια και ότι απαιτείται ισορροπία για τη σωστή κυτταρική λειτουργία. Για παράδειγμα, η υπερενεργοποίηση της σηματοδότησης mTORC1 σε τραυματισμό PT μπορεί να οδηγήσει σε επιζήμια καταστολή της αυτοφαγίας, η οποία απαιτείται για την αφαίρεση κατεστραμμένων μιτοχονδρίων και έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντική για την ανάρρωση μετά από PTτραυματισμός (39, 42, 44, 45). Έτσι, η συσσώρευση λευκίνης μπορεί να έχει επιζήμιο ρόλονεφρική βλάβημε υπερενεργοποίηση της σηματοδότησης mTORC1 και καταστολή της αυτοφαγίας. Συμπερασματικά, δείξαμε ότι η ισχυρή ανοδική ρύθμιση του Klf6 που συμβαίνει στονεφρική βλάβηείναι επιζήμιο, στο οποίο η απώλεια του ειδικού για PT Klf6 διατήρησε την έκφραση του γονιδίου BCAA και εξασθενούσε το AKI και την τελική ίνωση. Αντίθετα, η επαγωγή του KLF6 σε ποντίκια κατέστειλε την έκφραση του γονιδίου BCAA και κατέστησε τηννεφρόευπαθή σενεφρική βλάβη.Επιπλέον, γονίδια που κωδικοποιούν πολλαπλά ένζυμα BCAA έχουν θέσεις δέσμευσης KLF6, υποδηλώνοντας ότι το KLF6 μπορεί να είναι ένας μεταγραφικός ρυθμιστής του καταβολισμού BCAA. Πτώση της ρύθμισης του καταβολισμού BCAA in vitro με υπερέκφραση του KLF6 και θεραπεία με AAI ή με εξουδετέρωση του BCKDHB.σε μειωμένη παραγωγή μιτοχονδριακού ΑΤΡ. Συλλογικά, ταδεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπευτική στόχευση της διατήρησης τουΟ καταβολισμός BCAA μπορεί να παρέχει μια εναλλακτική μιτοχονδριακήπηγή ενέργειας στο πλαίσιο τηςνεφρική βλάβηστην οποία ο FAOείναι μειωμένο.