Χαρακτηρίζοντας τον κίνδυνο απόρριψης νεφρού πριν από τη μεταμόσχευση και μετά τη μεταμόσχευση από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου Β κυττάρων

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Η μελέτη του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου στο πλαίσιο της μεταμόσχευσης οργάνων παρέχει σημαντικές πληροφορίες για το πώς η προσαρμοστική ανοσία μπορεί να συμβάλει και να ρυθμίσει την απόρριψη μοσχεύματος. Εδώ χαρακτηρίζουμε το ανοσοποιητικό ρεπερτόριο του περιφερικού αίματος των ατόμων πριν και μετάνεφρόμεταμόσχευση με χρήση αλληλουχίας υποδοχέων Β κυττάρων σε μια διαχρονική κλινική μελέτη. Τα άτομα που αναπτύσσουν απόρριψη μετά τη μεταμόσχευση έχουν ένα πιο ποικίλο ανοσοποιητικό ρεπερτόριο πριν από τη μεταμόσχευση, υποδηλώνοντας μια προδιάθεση για κίνδυνο απόρριψης μετά τη μεταμόσχευση. Επιπλέον, μετά από 2 χρόνια παρακολούθησης, οι ασθενείς που αναπτύσσουν απόρριψη επιδεικνύουν ένα συγκεκριμένο σύνολο διευρυμένων κλώνων που επιμένουν μετά την απόρριψη. Ενώ υπάρχει συνολική μείωση της ποικιλομορφίας των περιφερειακών Β κυττάρων, πιθανόν λόγω αυξημένης γενικής έκθεσης σε ανοσοκαταστολή σε αυτήν την κοόρτη, η ανίχνευση της χρήσης ειδικού γονιδίου IGHV σε όλους τους ασθενείς που απορρίπτονται υποστηρίζει ότι μια κοινή δεξαμενή ανοσογόνων αντιγόνων μπορεί να οδηγήσει σε απόρριψη μετά τη μεταμόσχευση. Τα ευρήματά μας μπορεί να έχουν κλινικές επιπτώσεις για την πρόβλεψη και την κλινική διαχείριση της απόρριψης μοσχεύματος νεφρού.

ΝεφρόΗ μεταμόσχευση είναι η προτιμώμενη θεραπεία της νεφρικής νόσου τελικού σταδίου (ESRD) και της χρόνιαςνεφρόνόσος. Παρόλο που έχουν σημειωθεί σημαντικές βελτιώσεις στις τεχνολογίες και την αντιστοίχιση ιστών με βάση τις δοκιμές ιστοσυμβατότητας για ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα δότη/λήπτη (HLA), η πρόβλεψη της έκβασης του μοσχεύματος εξακολουθεί να είναι ένα άλυτο πρόβλημα. Η μετρημένη αναντιστοιχία ιστού σε άλλες δευτερεύουσες, μη-HLA τόπους23 μπορεί επίσης να οδηγήσει σε αλλοάνοσο τραυματισμό με οξεία και χρόνια απόρριψη, με αποτέλεσμα φτωχά μακροπρόθεσμα αποτελέσματα μοσχεύματος4. Επιπλέον, περίπου το 50 τοις εκατό τωννεφρόΤα αλλομοσχεύματα, χωρίς σημαντικές αναντιστοιχίες HLA, εξακολουθούν να χάνονται εντός 10 ετών από τη μεταμόσχευση². Έχουμε υποθέσει προηγουμένως ότι οι μη HLA τόποι, μπορεί να επηρεάσουν την ανοσολογική απόκριση του λήπτη έναντι τουνεφρόdonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 διαφορετικά αντισώματα0, που τους επιτρέπει να αναγνωρίζουν μια τεράστια σειρά ξένων αντιγόνων. Τα ανθρώπινα BCR ή Ig αποτελούνται από δύο πανομοιότυπες βαριές αλυσίδες (Ι) που σχηματίζονται από πέντε ισότυπους: IgM, IgD, IgA, IgE και IgG, και δύο ελαφριές αλυσίδες. Το άθικτο αντίσωμα περιέχει μια μεταβλητή και μια σταθερή περιοχή. Η δέσμευση αντιγόνου λαμβάνει χώρα στη μεταβλητή περιοχή, η οποία δημιουργείται από τον ανασυνδυασμό ενός συνόλου τμημάτων γονιδίων μεταβλητής (V), ποικιλομορφίας (D) και συνένωσης (J) που σχηματίζουν το ανοσοποιητικό ρεπερτόριο των Β-κυττάρων και η ποικιλομορφία του συγκεντρώνεται κυρίως στο συμπληρωματική προσδιοριστική περιοχή 3 (CDR3). Κατά τη διαδικασία της ωρίμανσης της συγγένειας, εμφανίζεται σωματική υπερμετάλλαξη (SHM) στη μεταβλητή περιοχή. Μια ισχυρή προσαρμοστική ανοσοαπόκριση εξαρτάται από την επέκταση κλώνων Β-κυττάρων και μια διαδικασία που ονομάζεται ωρίμανση συγγένειας, κατά την οποία εισάγονται σωματικές μεταλλάξεις στις αναδιατάξεις του γονιδίου Ig και επιλέγονται Β κύτταρα με υψηλότερη συγγένεια για ένα δεδομένο αντιγόνο.

Η μελέτη του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου στη μεταμόσχευση οργάνων είναι ζωτικής σημασίας για να κατανοήσουμε τι πυροδοτεί και συντηρεί τη διαδικασία απόρριψης και πώς μπορεί τελικά να επιταχύνει την πορεία προς την αποτυχία του μοσχεύματος. Με την πρόοδο της αλληλουχίας επόμενης γενιάς και τις ισχυρές υπολογιστικές προσεγγίσεις, μπορούμε να μελετήσουμε την περιοχή VDJ με λεπτομέρεια,12. Μέχρι σήμερα, η ανάλυση του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου Τ-κυττάρων σενεφρόμεταμόσχευση έχει πραγματοποιηθεί σε πολύ περιορισμένο αριθμό ασθενών3-15, και παρόλο που το BCRSeq έχει εφαρμοστεί σε άλλες ασθένειες και ανθρώπινες ανοσολογικές αποκρίσεις, όπως η πολλαπλή σκλήρυνση6, το εμβόλιο γρίπης7 ή οι διαταραχές ανοσοανεπάρκειας8, υπάρχει έλλειψη μελετών στη μεταμόσχευση απόρριψη. Σε ένανεφρόμεταμόσχευση, το BCRSeq έχει πραγματοποιηθεί μόνο στο πλαίσιο της ανοχής, ευαισθητοποιημένο σε HLAνεφρόυποψήφιες για μεταμόσχευση που υποβάλλονται σε θεραπεία απευαισθητοποίησης20 και διήθηση Β-κυττάρων συγκρίνοντας την κλωνική επέκταση στο αίμα και το μόσχευμα2l. Μια άλλη εφαρμογή για το BCRSeq στη μεταμόσχευση είχε δημοσιευθεί προηγουμένως σε μια μικρή ομάδα 12 ληπτών μοσχευμάτων καρδιάς.

Αναγνωρίζοντας τη σημασία του χυμικού σκέλους της ανοσοαπόκρισης στην όψιμη απόρριψη μοσχεύματος και τη χρόνια αποτυχία αλλομοσχεύματος, χαρακτηρίζουμε το ανοσοποιητικό ρεπερτόριο του περιφερικού αίματος χρησιμοποιώντας το BCRSeq σε μια προοπτική, διαχρονική μελέτη. Διαπιστώνουμε ότι η ποικιλομορφία του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου πριν από τη μεταμόσχευση είναι υψηλότερη σε εκείνα τα άτομα που το απορρίπτουννεφρόδείχνει επίσης την επέκταση ορισμένων κλώνων και γονιδίων IGHV κατά τη διάρκεια των 24 μηνών παρακολούθησης. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να βοηθήσουν στην πρόβλεψη του κινδύνου απόρριψης πριν από την εμφύτευση και μπορεί να έχουν κλινικές επιπτώσεις στην ανίχνευση συγκεκριμένων αντιγόνων που οδηγούν στην απόρριψη.

Το Cistanche είναι καλό για τη λειτουργία των νεφρών

Αποτελέσματα

Θέματα μελέτης. Πραγματοποιήσαμε BCRSeq σε 83 δείγματα περιφερικού αίματος από 27 μοναδικούς ασθενείς και εκτελέσαμε τον αναλυτικό αγωγό που φαίνεται στο Σχ.1. Σε αυτή τη μελέτη λήφθηκαν υπόψη τρεις ομάδες κλινικού φαινοτύπου, οι οποίες ορίστηκαν από τυφλές αναγνώσεις κεντρικής παθολογίας σειριακών βιοψιών αλλομοσχεύματος που βαθμολογήθηκαν με κριτήρια Banff23,24 και τη βαθμολογία του δείκτη χρόνιας βλάβης αλλομοσχεύματος (CADI): Μη προοδευτικοί (NP; n=10) είχαν χαμηλή μη αυξητική βαθμολογία CADI χωρίς οξεία απόρριψη, προοδευτικά άτομα χωρίς απόρριψη (PNR;n=10) ​​είχαν αυξητική βαθμολογία CADI για 2 χρόνια χωρίς απόρριψη και προοδευτικά άτομα με απόρριψη(PR; n=7) είχαν αυξητικές υψηλές βαθμολογίες CADI για 2 χρόνια με επεισόδια απόρριψης. Δημογραφικά στοιχεία, αιτίεςνεφρόΗ αποτυχία και η χρήση ανοσοκαταστολής παρέχεται στον Πίνακα 1. Είναι σημαντικό να επισημανθούν ορισμένα χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών. Η μητρική μελέτη στην οποία εγγράφηκαν αυτοί οι ασθενείς είχε ένα συνολικό χαμηλό ποσοστό (17 τοις εκατό ) επιβεβαιωμένης με βιοψία οξείας απόρριψης (μέσος{min, max}=12 {6,24}μήνες χρόνος απόρριψης). Αυτοί οι ασθενείς διέτρεχαν όλοι χαμηλό ανοσολογικό κίνδυνο απόρριψης (κατάσταση ευαισθητοποίησης αντισωμάτων σε αντιδραστική ομάδα κορυφής<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Αλληλουχία ανοσολογικού ρεπερτορίου Β-κυττάρων. Το BCRSeq έγινε σε δείγματα γονιδιωματικού DNA(gDNA) που εξήχθησαν από θρόμβους αίματος σε 81 δείγματα από 27νεφρόλήπτες μεταμοσχεύσεων σε τρία σημεία (0,6,24 μήνες). Η αλληλουχία έλαβε συνολικό αριθμό 327.703 αναγνώσεων (μέσος όρος 4045/δείγμα) μετά από ποιοτικό έλεγχο (βλ. ενότητα μεθόδων). Για επικύρωση των αποτελεσμάτων και περαιτέρω αξιολόγηση κάθε ισοτύπου, εξάγαμε επιπλέον RNA από ταιριαστά PBMC που ήταν διαθέσιμα για 55 δείγματα, συλλέχθηκαν ταυτόχρονα με τον θρόμβο αίματος και πραγματοποιήσαμε συμπληρωματική αλληλουχία DNA(cDNA) σε μεγαλύτερο βάθος λαμβάνοντας 1.773.330 αναγνώσεις για IgD (μέσος όρος 31,667/δείγμα), 1,708,227 αναγνώσεις για IgM (μέσος όρος 30,504/δείγμα), 973,444 αναγνώσεις για IgA (μέσος όρος 17,383/δείγμα), 139,7345 αναγνώσεις για IgG (μέσος όρος 53/29, 53/29), }} διαβάζει για IgE (μέσος όρος 5178/δείγμα) (Συμπληρωματικό Σχ. 1). Οι βιβλιοθήκες για κάθε ισότυπο ενισχύθηκαν χωριστά και στη συνέχεια συγκεντρώθηκαν για αλληλούχιση. Ως εκ τούτου, η συγκριτική διασταυρούμενη ανάλυση ισοτύπων δεν είναι εφικτή.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 1β, ορίσαμε έναν κλώνο ως μια ομάδα κυττάρων που προέρχονται από ένα κοινό πρόγονο μόριο που έχει το ίδιο τμήμα IGHV και IGHJ, ίδιο μήκος CDR3 και 90 τοις εκατό ταυτότητα νουκλεοτιδίων μεταξύ των CDR3, όπως ορίστηκε προηγουμένως σε μελέτες προσαρμοστικού Β. -Αποκρίσεις κυττάρων'8. Αυτός ο ορισμός επιτρέπει τη μελέτη της ποικιλομορφίας, των κοινών ή κοινών κώνων και της κλωνικής επέκτασης στο πλαίσιο της αλλοανοσίας σενεφρόμεταμοσχεύσεις. Ο αριθμός των μοναδικών κώνων ανά άτομο σε κάθε χρονική στιγμή εμφανίζεται ως barplot στο συμπληρωματικό υλικό (Συμπληρωματικό Σχ. 1). Για αυστηρότητα της ανάλυσης δεδομένων, προεξοφλήσαμε τα δείγματα με<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">νεφρόμεταμόσχευση, που χαρακτηρίζεται από πολλαπλασιασμό του Epstein Barr

Εικ. 1Συνολικός αγωγός μελέτης.α Σχηματική αναπαράσταση της δομής αντισωμάτων και της διαδικασίας ανασυνδυασμού VDJ που είναι υπεύθυνος για την ποικιλομορφία που παράγεται στο ανοσοποιητικό ρεπερτόριο.β Κλώνος Β-κυττάρων που ορίζεται ως κύτταρα από έναν κοινό πρόγονο και γ αναλυτική γραμμή της μελέτης: Β-κύτταρο προσδιορισμός αλληλουχίας για gDNA και cDNA, ανάλυση ποικιλομορφίας λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των κλώνων (πλούτος) και τη συχνότητα κάθε κλώνου (εντροπία Shannon), ανάλυση δικτύου και ανάλυση κλωνικών και γονιδίων IGHV

μολυσμένα από τον ιό (EBV) κύτταρα Β. Παρατηρήσαμε αυξημένο αριθμό κλώνων τη στιγμή 6 σε αυτόν τον ασθενή, με χαμηλότερη κλωνική ποικιλομορφία πριννεφρόμεταμόσχευση και στους 24 μήνες μετά τη μεταμόσχευση νεφρού. Δεδομένου ότι οι βιβλιοθήκες ενισχύθηκαν από μια αμετάβλητη ποσότητα εκμαγείου, ένα υψηλότερο κλάσμα Β κυττάρων στο αίμα μπορεί να είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερο αριθμό κλωνοτύπων που αντιπροσωπεύονται στα προϊόντα αλληλουχίας. Λόγω της ξεχωριστής και μοναδικής παθολογικής διαδικασίας σε αυτόν τον ασθενή, αυτό το δείγμα εξαιρέθηκε από μελλοντική ανάλυση.

Η ποικιλομορφία των Β-κυττάρων πριν από τη μεταμόσχευση σχετίζεται με την απόρριψη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1γ, εξετάσαμε την ποικιλομορφία του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου Β-κυττάρων λαμβάνοντας υπόψη τον πλούτο των ειδών (αριθμός μοναδικών κλώνων) και την εντροπία Shannon (εξίσωση (1) από μεθόδους) σε χρονικά σημεία και κλινικά αποτελέσματα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των κλώνων ή της εντροπίας ως εξαρτημένη μεταβλητή και της κλινικής έκβασης ή της SHM ως ανεξάρτητης μεταβλητής παράγοντα. Το ρεπερτόριο πριννεφρόΗ μεταμόσχευση στο PR ήταν σημαντικά πιο ποικιλόμορφη από ό,τι στο NP (πλούτος: P-value=0.005, εντροπία: P-value=0.01) με την ίδια τάση να παραμένει στους 6 μήνες μετάνεφρόμεταμόσχευση (πλούτος: P-value=0.02, εντροπία: P-value=0.02) και χωρίς διακριτές διαφορές ομάδας στα 2 χρόνια μετά τη μεταμόσχευση (Εικ. 2α και Συμπληρωματικό Σχ. 2). Τα δεδομένα αλληλουχίας cDNA μετά τη μεταμόσχευση έδειξαν την ίδια τάση σε μεγαλύτερη ποικιλομορφία ρεπερτορίου 6 μήνες μετά τη μεταμόσχευση, κυρίως για τους ισότυπους IgD (πλούτος: P-value=0.02, εντροπία: P-value=0). 03) (Εικ. 2β και Συμπληρωματικό Σχ. 2). Δεν υπήρξε σύγχυση στα δεδομένα από διάφορες δημογραφικές και κλινικές μεταβλητές, όπως ηλικία λήπτη, φύλο, φυλή, πηγή δότη, τύπος ανοσοκαταστολής, αναντιστοιχία HLA και αιτία νεφρικής ανεπάρκειας. Δεδομένου ότι η απόκριση των Β-κυττάρων ενός παιδιού 1- ετών (η ελάχιστη ηλικία στα δεδομένα) και 19- ετών (η μέγιστη ηλικία στα δεδομένα) μπορεί να είναι πολύ διαφορετική, πραγματοποιήσαμε μια ευαισθησία ανάλυση εξαιρουμένων αυτών των δύο ασθενών και τα αποτελέσματα παρέμειναν σημαντικά (NP έναντι PR τη χρονική στιγμή 0: πλούτος: P-value=0.01, εντροπία: P-value=0.03). Σε μια άλλη μέτρηση της ποικιλομορφίας του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου, αξιολογήσαμε το SHM, που ορίστηκε ως η συχνότητα των μεταλλάξεων σε κάθε τμήμα γονιδίου V, και βρήκαμε μια τάση για υψηλότερο αριθμό SHM για PR πριν από τη μεταμόσχευση και μια τάση για υψηλότερο SHM στον ισότυπο IgD σε PR στους 6 μήνες μετά τη μεταμόσχευση (P-value=0.06).

Η ποικιλομορφία των Β κυττάρων αλλάζει με την πάροδο του χρόνου ανάλογα με την κλινική έκβαση. Για να βρούμε εάν η ποικιλομορφία του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου αλλάζει με την πάροδο του χρόνου ανάλογα με το κλινικό αποτέλεσμα, μοντελοποιήσαμε τα διαχρονικά δεδομένα χρησιμοποιώντας γραμμικά μοντέλα μικτού αποτελέσματος λαμβάνοντας υπόψη την αλληλεπίδραση μεταξύ κλινικής έκβασης και χρόνου. Διαπιστώσαμε ότι η NP και η PR συμπεριφέρθηκαν διαφορετικά με την πάροδο του χρόνου μετά τη μεταμόσχευση, δείχνοντας αύξηση της ποικιλομορφίας της NP και μείωση της ποικιλομορφίας στην PR, ενώ για την PNR η ποικιλομορφία παρέμεινε αμετάβλητη με την πάροδο του χρόνου. Αυτό παρατηρήθηκε για το gDNA (πλούτος: P-value=0.007, εντροπία: P-value=0.001, Fig. 3a) και όλους τους ισότυπους για το cDNA, με τις πιο σημαντικές διαφορές στην εντροπία να είναι για ισότυπους IgM και IgD (IgA: P-τιμή=0.07, IgD: P-value=0.02, IgG: P-value=0.05, IgM: P-value=0.04, Εικ. 3β). Τα διαγράμματα για τον πλούτο με τις αντίστοιχες τιμές P φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 3. Όπως παρατηρήθηκε στις γραφικές παραστάσεις, ένα άτομο έχει ένα επιπλέον δείγμα σε χρόνο 32 μηνών, το οποίο μπορεί να παραμορφώσει τα αποτελέσματα, επομένως πραγματοποιήθηκε ανάλυση ευαισθησίας εξαιρουμένου αυτού του δείγματος από η ανάλυση και η παρατήρηση παρόμοιων αποτελεσμάτων εκτός από τους ισοτύπους IgG και IgM όπου χάνεται η σημασία (gDNA-εντροπία: P-value=0.004. cDNA-εντροπία: IgA: P-value=0.1 , IgD: P-value=0.05, IgG: P-value=0.08, IgM: P-value=0.1).

Τα μέτρα ποικιλομορφίας ενδέχεται να επηρεαστούν από τη βιολογική και τεχνική δειγματοληψία. Η ποικιλομορφία ενός δείγματος μπορεί να διαφέρει σημαντικά από τη συνολική ποικιλομορφία σε ένα ρεπερτόριο, καθώς αντιπροσωπεύεται μόνο ένα κλάσμα δισεκατομμυρίων κυττάρων, το οποίο είναι γνωστό ως το πρόβλημα των ελλειπόντων ειδών. Μπορεί να υπάρχει τεχνική δειγματοληψία επειδή κάθε δείγμα μπορεί να διαφέρει ως προς το βάθος αλληλουχίας και σε κάποιο βαθμό πειραματικών σφαλμάτων. Για να αντιμετωπίσουμε το πρόβλημα των ειδών που λείπουν, χρησιμοποιήσαμε το εργαλείο Recon (ανακατασκευή εκτιμώμενων κλώνων από παρατηρούμενους αριθμούς)29, το οποίο εκτιμά τη συνολική κατανομή μεγέθους κλώνων. Η Recon εξάγει ακριβείς και ισχυρές εκτιμήσεις ενός συνόλου μέτρων διαφορετικότητας, συμπεριλαμβανομένου του πλούτου και της εντροπίας, επιτρέποντας αξιόπιστες συγκρίσεις της διαφορετικότητας μεταξύ ατόμων. Για την αντιμετώπιση του βάθους αλληλουχίας και κάποιου βαθμού πειραματικών σφαλμάτων, εκτελέσαμε μια στρατηγική μείωσης δειγματοληψίας. μια πολύ καλά χρησιμοποιούμενη στρατηγική στην ανάλυση ανοσολογικού ρεπερτορίου11,17,30. Στην ανάλυση Recon (Συμπληρωματικό Σχήμα S4: A–E), τόσο ο πλούτος όσο και η ποικιλομορφία αντιγράφηκαν για τα δεδομένα gDNA. Στα δεδομένα cDNA, ο ισότυπος IgD χρόνου 6 δείχνει την τάση, αλλά δεν έφθασε σε σημαντικό βαθμό, αν και τα διαχρονικά αποτελέσματα για τους ισότυπους IgA, IgD και IgG επαναλήφθηκαν. Στην ανάλυση μειούμενης δειγματοληψίας (Συμπληρωματικό Σχήμα S4: F–J), τα πάντα αναπαράγονται αλλά ο χρόνος είναι 0 για τα δεδομένα gDNA. Αυτό μπορεί να είναι συνέπεια του περιορισμού της μείωσης του δείγματος

Εικ. 2 Διαγράμματα βιολιού που δείχνουν τον αριθμό των κλώνων (πλούτο) στα τρία κλινικά αποτελέσματα. έναν αριθμό κλώνων κατά περιόδους 0, 6 και 24 από δείγματα gDNA. β Αριθμός κλώνων τη στιγμή 6 για τον ισότυπο IgD από δείγματα cDNA. Οι τιμές P λαμβάνονται από την προσαρμογή ενός μοντέλου γραμμικής παλινδρόμησης λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των κλώνων ως εξαρτημένη μεταβλητή και την κλινική έκβαση ως ανεξάρτητη μεταβλητή παράγοντα (n=27 δείγματα). Τα διαγράμματα βιολιού αντιπροσωπεύουν την πυκνότητα πιθανότητας των δεδομένων σε κάθε τιμή. Ο δείκτης κουκκίδας αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή με το διατεταρτημόριο. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης

Εικ. 3 Διαμήκη δεδομένα που απεικονίζονται με την προσαρμοσμένη γραμμή για κάθε κλινικό αποτέλεσμα. μια Ποικιλομορφία που μετράται με την εντροπία Shannon που αντιπροσωπεύεται σε χρονικά σημεία από τα τρία κλινικά αποτελέσματα (NP, PNR, PR) στο gDNA. β Η ποικιλομορφία που μετρήθηκε με την εντροπία Shannon αντιπροσωπεύεται σε χρονικά σημεία από τα τρία κλινικά αποτελέσματα (NP, PNR, PR) από ισότυπους στο cDNA. Οι τιμές P αντιστοιχούν στον όρο αλληλεπίδρασης που ορίζεται από το χρόνο × κλινική έκβαση προσαρμόζοντας ένα γραμμικό μοντέλο μικτού αποτελέσματος (n=27 δείγματα). Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει την εντροπία ανά δείγμα κατά τη διάρκεια του χρόνου με την προσαρμοσμένη γραμμή και το διάστημα εμπιστοσύνης. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης

συνεπαγόμενες στρατηγικές, ειδικά στα δεδομένα gDNA όπου ο αριθμός των αλληλουχιών είναι πολύ μικρότερος από ό,τι για τα δεδομένα cDNA. Στο gDNA, περιορίσαμε την ανάλυση σε άτομα με τουλάχιστον 1000 κλώνους για να διατηρήσουμε αρκετές αλληλουχίες. Έγινε δειγματοληψία προς τα κάτω σε τουλάχιστον 1062 κλώνους σε σύγκριση με 62.173 κλώνους στο cDNA. Παρά αυτόν τον περιορισμό, παρατηρήσαμε την τάση για το χρόνο 0, διατηρήσαμε τη σημασία για τη διαχρονική ανάλυση στο gDNA και αντιγράψαμε όλες τις συσχετίσεις στο cDNA. Και στις δύο αναλύσεις (recon και downsampling), επαναλάβαμε τα αποτελέσματα, παρά τους ορισμένους περιορισμούς που επισημαίνονται εδώ, δείχνοντας την εγκυρότητα των αποτελεσμάτων που αναφέρθηκαν προηγουμένως.

Τα δίκτυα Β-κυττάρων παρουσιάζουν διαφορές στην κλωνική επέκταση. Το ρεπερτόριο των Β-κυττάρων μπορεί φυσικά να αναπαρασταθεί ως ένα δίκτυο που βασίζεται στην ποικιλομορφία ακολουθιών31. Στα δεδομένα μας, αναπτύξαμε ένα οπτικό δίκτυο για κάθε δείγμα (Εικ. 4 και Συμπληρωματικά Σχ. 5-7) όπου κάθε κορυφή αντιπροσώπευε ένα μοναδικό BCR και ο αριθμός των πανομοιότυπων BCR με βάση τις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων τους καθόριζε το μέγεθος της κορυφής. Υπάρχει μια ακμή μεταξύ των κορυφών όταν ανήκουν στον ίδιο κλώνο, επομένως οι ομάδες Β κυττάρων μπορούν να παρουσιαστούν ως ομάδες διασυνδεδεμένων κορυφών που σχηματίζουν έναν κλώνο. Για να ποσοτικοποιήσουμε το δίκτυο, χρησιμοποιήσαμε τον δείκτη Gini, ο οποίος είναι ένα μέτρο ανομοιομορφίας που εφαρμόστηκε στις κατανομές κορυφής και συμπλέγματος. Όταν εφαρμόζεται στο μέγεθος κορυφής, Gini(V), αντιπροσωπεύεται η συνολική κλωνική φύση. Εάν το Gini(V) είναι πιο κοντά στο 1, οι κορυφές είναι άνισες που δείχνουν την επέκταση ορισμένων από αυτές και πιο κοντά στο 0 διαφορετικά. Όταν εφαρμόζεται στο μέγεθος συστάδας, Gini(C), αντιπροσωπεύεται η κλωνική κυριαρχία. Εάν είναι πιο κοντά στο 1, τα συμπλέγματα είναι άνισα και επομένως αντιπροσωπεύουν κυρίαρχους κλώνους, αν είναι πιο κοντά στο 0, όλα τα συμπλέγματα είναι ίσου μεγέθους.

Στο Σχ. 4 δείχνουμε ένα παράδειγμα των αξιοσημείωτων οπτικών και ποσοτικών διαφορών μεταξύ αντιπροσωπευτικών ρεπερτορίων Β-κυττάρων από καθεμία από τις τρεις ομάδες κλινικής έκβασης, στα τρία διαφορετικά χρονικά σημεία (προ της μεταμόσχευσης και μετά τη μεταμόσχευση 6 και 24 μήνες) . Στο ρεπερτόριο PR, υπάρχει μια αφθονία αλληλουχιών Β-κυττάρων που σχηματίζουν περισσότερες και μεγαλύτερες ομάδες κλώνων σε σύγκριση με το NP ενώ το PNR βρίσκεται ενδιάμεσα. Με την πάροδο του χρόνου, η ομάδα PR εμφανίζει μείωση στον αριθμό των BCR και μοναδικών κλώνων σε σύγκριση με το NP. Τα λεπτομερή δίκτυα Β-κυττάρων κάθε ατόμου στη μελέτη παρέχονται στα Συμπληρωματικά Σχ. 5–7. Είναι ενδιαφέρον να παρατηρήσουμε το πολύ διαφορετικό μοτίβο του δικτύου Β-κυττάρων στο άτομο που ανέπτυξε PTLD στην ομάδα NP (Συμπληρωματικό Σχ. 5), χωρίς επέκταση των Β-κυττάρων πριν από τη μεταμόσχευση, ακολουθούμενη από αύξηση των Β κυττάρων μετά από 6 μήνες και μια σαφής κλωνική επέκταση που συνοδεύεται από μείωση της ποικιλομορφίας στους 24 μήνες μετά τη μεταμόσχευση.

Σε περαιτέρω αξιολόγηση της μέτρησης του δείκτη Gini (Εικ. 5), η ομάδα PR παρουσίαζε σταθερά σημαντικά υψηλότερα μέτρα τόσο για την κορυφή όσο και για τη συστάδα σε σχέση με την ομάδα NP, υποδηλώνοντας ότι οι ασθενείς της ομάδας PR είχαν υψηλότερη κλωνική επέκταση κατά την έναρξη.

Εικ. 4 Δίκτυα ρεπερτορίου Β-κυττάρων από τρία άτομα που αντιπροσωπεύουν τα τρία κλινικά αποτελέσματα σε χρονικά σημεία. Κάθε κορυφή αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό BCR που είναι το μέγεθος κορυφής που ορίζεται από τον αριθμό των πανομοιότυπων BCR λαμβάνοντας υπόψη τις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων. Υπάρχει μια ακμή μεταξύ των κορυφών όταν ανήκουν στον ίδιο κλώνο όπως ορίστηκε προηγουμένως, έτσι τα συμπλέγματα είναι ομάδες διασυνδεδεμένων κορυφών που σχηματίζουν έναν κλώνο. Κάθε δείγμα δείχνει τον δείκτη gini που λήφθηκε για το μέγεθος κορυφής (Gini(V)) και το μέγεθος συμπλέγματος (Gini(C)). Το BCR αντανακλά τους συνολικούς υποδοχείς Β-κυττάρων για αυτό το συγκεκριμένο δείγμα και οι κλώνοι αντανακλούν τον συνολικό αριθμό των μοναδικών κλώνων. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης

και περαιτέρω επέκταση μετά τη μεταμόσχευση ενός υποσυνόλου κυρίαρχων κλώνων (τιμή P [γραμμική παλινδρόμηση] < 0.05,="" εικ.="" 5).="" η="" ομάδα="" pnr="" εμπίπτει="" μεταξύ="" np="" και="" pr="" όπως="" φαίνεται="" προηγουμένως,="" αν="" και="" αυτός="" ο="" χρόνος="" είναι="" σημαντικά="" διαφορετικός="" από="" την="" ομάδα="" np="" τη="" χρονική="" στιγμή="" 24="" (p-value="" [γραμμική="" παλινδρόμηση]="">< 0,05).="" αν="" και="" τα="" δεδομένα="" για="" το="" σχ.="" 5="" δημιουργήθηκαν="" από="" τα="" δεδομένα="" gdna,="" ο="" ισότυπος="" igm="" για="" το="" cdna="" έδειξε="" τις="" ίδιες="" διαφορές="" (τιμή="" p="" [γραμμική="" παλινδρόμηση]="0.05)" (συμπληρωματικό="" σχήμα="">

Ορισμένοι κλώνοι και γονίδια IGHV εμπλέκονται στην απόρριψη.

Αν και η κύρια εστίασή μας ήταν να χαρακτηρίσουμε το ρεπερτόριο των Β-κυττάρων ανά ομάδες κλινικής έκβασης, παρέχοντας μια συνολική εικόνα της ανοσοαπόκρισης πριν και μετά τη μεταμόσχευση, τα δεδομένα μας επέτρεψαν επίσης να πραγματοποιήσουμε ειδική ανάλυση για την ακολουθία Ig στον κλώνο και στον IGHV επίπεδο γονιδίου.

Για κλωνική ανάλυση, αξιολογήσαμε τη συσχέτιση της παρουσίας ή της απουσίας κάθε συγκεκριμένου κλώνου (118.223 συνολικά κλώνοι) με το κλινικό αποτέλεσμα (PR, PNR, NR) σε κάθε χρονικό σημείο. Εφαρμόζοντας την ακριβή δοκιμή του Fisher, βρήκαμε 8, 4 και 21 κλώνους ονομαστικά συσχετισμένους με κλινικά αποτελέσματα σε καθένα από τους 0, 6 και 24 μήνες, αντίστοιχα (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Ενώ κανένας δεν πέρασε τη διόρθωση πολλαπλών δοκιμών, κυρίως λόγω έλλειψης ισχύος, καθώς έχουμε περιορισμένο μέγεθος δείγματος στην ανάλυση με χιλιάδες παραμέτρους (κλώνοι), μπορούσαμε να παρατηρήσουμε ότι οι λίγοι κλώνοι που πλησίασαν τη σημασία (P-value < {{="" 11}}.05)="" μοιράστηκαν="" μεταξύ="" των="" ασθενών="" μόνο="" στην="" ομάδα="" pr="" και="" εμπλουτίστηκαν="" 24="" μήνες="" μετά="" τη="">

Εξετάσαμε επίσης εάν ορισμένοι κλώνοι παρέμειναν κατά τη διάρκεια του χρόνου δειγματοληψίας, περισσότερο από άλλους, σε κάθε κλινικό αποτέλεσμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 9). Λαμβάνουμε υπόψη δύο διαφορετικά μέτρα: (1) τον αριθμό των επίμονων κλώνων και (2) την κλωνική επέκταση. Παρατηρήσαμε ότι οι κλώνοι που ήταν επίμονοι στο PR ήταν σημαντικά πιο διευρυμένοι (P-value [γραμμική παλινδρόμηση]=0.01, PR έναντι NP) και έδειξαν μια τάση υψηλότερου αριθμού επίμονων κλώνων (P- τιμή [γραμμική παλινδρόμηση]=0.09). Εξετάσαμε περαιτέρω εάν αυτοί οι επίμονοι κλώνοι μοιράστηκαν επίσης σε διαφορετικά άτομα σε κάθε κλινική έκβαση. Από τους 263 επίμονους κλώνους που εντοπίστηκαν, οι 23 μοιράστηκαν μεταξύ ατόμων. Πέντε μοιράστηκαν εντός του ίδιου PNR και έξι εντός της ομάδας PR και δεν μοιράστηκαν κλώνοι μεταξύ της ομάδας NP. Συνολικά, 12 κοινόχρηστοι κλώνοι ήταν κοινοί και στις δύο ομάδες ασθενών με προοδευτική χρόνια μεταμόσχευση τραυματισμού και ίνωση με την πάροδο του χρόνου (PR και PNR). Ο κατάλογος των κλώνων που μοιράζονται μεμονωμένα άτομα παρέχεται στο συμπληρωματικό υλικό (Συμπληρωματικός Πίνακας 2).

Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε ανάλυση γονιδίου IGHV, εξετάζοντας τη χρήση του γονιδίου IGHV ανά δείγμα, που ορίστηκε ως ο αριθμός των φορών που έχει χρησιμοποιηθεί κάθε γονίδιο IGHV, κανονικοποιημένος από τον αριθμό των κλώνων (για να αποφευχθεί η δειγματοληψία μεροληψίας ορισμένων γονιδίων IGHV), φιλτράροντας τα χαμηλά εκφραζόμενα

Εικ. 5 Ο δείκτης Gini κορυφής σχεδιάστηκε με τον δείκτη Gini Cluster. Η γραφική παράσταση διασποράς αντιπροσωπεύει κάθε δείγμα σε περιόδους 0, 6 και 24. Τα τετραγωνίδια δείχνουν τις διαφορές Gini(V) και Gini(C) τη χρονική στιγμή 24. Οι τιμές P λαμβάνονται από την προσαρμογή ενός μοντέλου γραμμικής παλινδρόμησης θεωρώντας τα Gini(V) και Gini(C) ως εξαρτημένη μεταβλητή και το κλινικό αποτέλεσμα ως ανεξάρτητη μεταβλητή παράγοντα για κάθε χρονικό σημείο (n=27 δείγματα). Στο πλαίσιο εμφανίζεται μόνο ο χρόνος 24, αλλά ο χρόνος 0 και 6 είναι επίσης σημαντικός για NP έναντι PR: χρόνος 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; χρόνος 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; χρόνος 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Η ζώνη μέσα στο πλαίσιο αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, το πλαίσιο ορίζει το διατεταρτημόριο εύρος (IQR) και τα μουστάκια ορίζουν το πρώτο και το τρίτο τεταρτημόριο ± 1,5 × IQR. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης

γονίδια (χρήση γονιδίου IGHV > {{0}}.05 σε τουλάχιστον 10 τοις εκατό των δειγμάτων) και εφαρμογή ενός μοντέλου γραμμικής παλινδρόμησης για την εύρεση των γονιδίων που συσχετίστηκαν με κάθε κλινικό αποτέλεσμα, σε κάθε χρονικό σημείο. Από τα 27 γονίδια IGHV που πέρασαν το φίλτρο χαμηλής έκφρασης, βρήκαμε σημαντικά γονίδια μεταξύ της ομάδας PR και NP (P-value < 0.05)="" με="" τρία="" γονίδια="" τη="" χρονική="" στιγμή="" 0,="" 7="" τη="" στιγμή="" 6="" και="" 16="" στο="" ώρα="" 24="" (εικ.="" 6a–c).="" από="" αυτά="" τα="" γονίδια,="" 1="" (ighv3-11)="" τη="" φορά="" 0,="" 5="" γονίδια="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv{3-23,="" ighv{="" {22}})="" στο="" χρόνο="" 6="" και="" 16="" γονίδια="" (ighv1-8,="" ighv{1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv{5-51)="" τη="" χρονική="" στιγμή="" 24="" πέρασε="" τη="" διόρθωση="" πολλαπλών="" δοκιμών="" με="" false="" discovery="" rate="" (fdr).="" είναι="" ενδιαφέρον="" ότι="" βρήκαμε="" ότι="" το="" ighv3-23="" ήταν="" το="" πιο="" σημαντικό="" και="" άφθονο="" γονίδιο="" και="" στα="" τρία="" χρονικά="" σημεία="" στη="" σύγκριση="" np="" έναντι="" pr="" (χρόνος="" 0:="" p-value="0.04," χρόνος="" 6:="" p-="" τιμή="0.003," χρόνος="" 24:="" p-value="0.02)" (εικ.="" 6δ).="" επιπλέον,="" αξιολογήσαμε="" εάν="" οι="" αλληλουχίες="" ighv{3-23="" υπερεκπροσωπούνταν="" μεταξύ="" των="" κοινών="" αλληλουχιών="" από="" την="" προηγούμενη="" κλωνική="" ανάλυση.="" βρήκαμε,="" χρησιμοποιώντας="" μια="" ανάλυση="" εμπλουτισμού="" με="" την="" ακριβή="" δοκιμή="" του="" fisher,="" ότι="" οι="" αλληλουχίες="" ighv3-23="" υπερεκπροσωπούνταν="" σημαντικά="" και="" στους="" δύο,="" τους="" επίμονους="" κλώνους="" που="" μοιράζονταν="" μεταξύ="" των="" ατόμων="" (συμπληρωματικός="" πίνακας="" 2)="" (p-value="">< 2,2="" ×="" 10="" -="" 16="" ),="" και="" τους="" κλώνους="" που="" σχετίζονται="" με="" την="" κλινική="" έκβαση="" στο="" χρόνο="" 24="" (συμπληρωματικός="" πίνακας="" 1)="" (p-value="">< 2,2="" ×="" 10−="" 16).="" παρατηρήσαμε="" ότι="" τα="" άτομα="" 9="" στην="" ομάδα="" nr,="" που="" είχαν="" βρεθεί="" ότι="" μοιράζονται="" ορισμένους="" επίμονους="" κλώνους="" με="" τους="" προοδευτικούς="" παράγοντες="" στις="" προηγούμενες="" αναλύσεις,="" ταξινομήθηκαν="" στην="" ομάδα="" pr="" ανά="" πάσα="" στιγμή.="" δεν="" υπήρξε="" σύγχυση="" στα="" δεδομένα="" από="" διάφορες="" δημογραφικές="" και="" κλινικές="" μεταβλητές,="" όπως="" ηλικία="" λήπτη,="" φύλο,="" φυλή,="" πηγή="" δότη,="" τύπος="" ανοσοκαταστολής,="" αναντιστοιχία="" hla="" και="" αιτία="" νεφρικής="" ανεπάρκειας.="" επιπλέον,="" αυτό="" το="" γονίδιο="" βρέθηκε="" επίσης="" να="" είναι="" σημαντικό="" και="" στους="" δύο="" ισότυπους="" igm="" (p-value="" [γραμμική="" παλινδρόμηση]="0.008)" και="" igd="" (p-value="" [γραμμική="" παλινδρόμηση]="0.05)." με="" βάση="" το="" cdna="" στους="" 24="" μήνες="" μετά="" τη="" μεταμόσχευση,="" σύμφωνα="" με="" τα="" προηγούμενα="" αποτελέσματα="" που="" δείχνουν="" συνέπεια="" με="" αυτούς="" τους="" δύο="" ισότυπους="" να="" είναι="" περισσότερο="" εμπλουτισμένοι="" στην="" ομάδα="" pr.="" μόνο="" τρία="" άλλα="" γονίδια="" βρέθηκαν="" σημαντικά="" στην="" ανάλυση="" cdna="" και="" όλα="" ήταν="" 24="" μήνες="" μετά="" τη="" μεταμόσχευση="" σε="" ισότυπους="" igd="" και="" igm="" (ighv3-15="" και="" ighv{4-="" 61="" σε="" igd="" και="" ighv4-39="" σε="">

Συζήτηση

Η ποικιλομορφία είναι ένα ουσιαστικό χαρακτηριστικό του ανοσοποιητικού συστήματος και στους υγιείς ανθρώπους είναι κρίσιμης σημασίας έναντι των παθογόνων για την αντιμετώπιση ασθενειών. Στη μεταμόσχευση οργάνων, ο σκόπιμος θεραπευτικός χειρισμός εγκαθίσταται κλινικά για να επιτρέψει στο ξένο όργανο να αγνοηθεί ενεργά ή να γίνει αποδεκτό από το ανοσοποιητικό σύστημα του ίδιου του ασθενούς για να μην δημιουργήσει αλλοάνοση απόκριση, οδηγώντας σε απόρριψη. Τα Β-κύτταρα είναι ένα σημαντικό συστατικό αυτής της διαδικασίας και έχει αποδειχθεί από την ομάδα μας και άλλους, ότι είναι καθοριστικά τόσο στην παρουσίαση αντιγόνου32,33 όσο και στην παραγωγή αλλοαντισώματος34,35. Σε αυτή την εργασία, χρησιμοποιήσαμε αλληλουχία Β-κυττάρων υψηλής απόδοσης για να κατανοήσουμε καλύτερα την ποικιλομορφία και την κλωνικότητα των Β κυττάρων στονεφρόκυκλοφορία του λήπτη μοσχεύματος, τόσο πριν από τη μεταμόσχευση όσο και μετά από 24 μήνες παρακολούθησης, με διαχρονική αξιολόγηση του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου των Β-κυττάρων. Συνολικά, η ανάλυσή μας δείχνει υψηλότερη ποικιλομορφία Β-κυττάρων πριν από τη μεταμόσχευση, διαφορές κατά μήκος με μείωση της ποικιλομορφίας που συνοδεύεται από κλωνική επέκταση και αύξηση στη χρήση ορισμένων γονιδίων IGHV μεταξύ εκείνων που συνεχίζουν να απορρίπτουν τα μοσχεύματα.

Μια βασική ανικανοποίητη κλινική ανάγκη για μεταμόσχευση οργάνου είναι η έλλειψη μη επεμβατικής, ευαίσθητης και ακριβούς πρόβλεψης του τραυματισμού της μεταμόσχευσης και των κακών αποτελεσμάτων. Αυτό το έργο περιπλέκεται από το γεγονός ότι υπάρχουν διάφοροι παράγοντες που επηρεάζουν την επιβίωση του μοσχεύματος36. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τα σταθερά άτομα είχαν μειωμένη ποικιλομορφία του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου Β-κυττάρων πριν από τη μεταμόσχευση σε σύγκριση με εκείνα που απέρριψαν το όργανο. Το επόμενο βήμα θα πρέπει να είναι η επίδειξη της προγνωστικής αξίας της ποικιλομορφίας του ρεπερτορίου Β-κυττάρων, παρέχοντας πιθανούς καλύτερους βιοδείκτες για την πρόβλεψη της απόρριψης πριν από την εμφύτευση και τη δυνατότητα εφαρμογής στην κλινική φροντίδα και επιλογές ανοσοκαταστολής πριν και μετά.νεφρόμεταμόσχευση. Εάν αυτό το χαρακτηριστικό είναι το αποτέλεσμα οποιουδήποτε παράγοντα που συμβάλλει στη μείωση της διαφορετικότητας σε σταθερά άτομα, όπως περιβαλλοντικοί ή γενετικοί παράγοντες, θα μπορούσαμε όχι μόνο να προβλέψουμε την απόρριψη αλλά και να την αποτρέψουμε. Πράγματι, πολύ πρόσφατα ευρήματα έδειξαν ότι η διακύμανση του ανοσοποιητικού συστήματος καθοδηγείται από περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες37,38. Στη μελέτη μας, δεν μπορέσαμε να βρούμε καμία συσχέτιση με οποιαδήποτε δημογραφικά και άλλα κλινικά χαρακτηριστικά ασθενών (ηλικία, φύλο, φυλή, ανοσοκαταστολή, πηγή οργάνων, αναντιστοιχίες HLA και ESRD). Από αυτή την άποψη, χρειαζόμαστε μια νέα ανάλυση για να επιβεβαιώσουμε εάν συγκεκριμένοι παράγοντες επηρεάζουν την ποικιλομορφία του ρεπερτορίου των Β-κυττάρων και τα αποτελέσματα των μεταμοσχεύσεων.

Ένα άλλο ενδιαφέρον εύρημα στη μελέτη μας δείχνει ότι το ανοσοποιητικό ρεπερτόριο συμπεριφέρεται διαφορετικά διαχρονικά ανάλογα με την ομάδα κλινικής έκβασης. Για εκείνους που εμφανίζουν απόρριψη του οργάνου μετά τη μεταμόσχευση, η ποικιλομορφία των Β-κυττάρων είναι αρχικά υψηλότερη και στη συνέχεια μειώνεται με την πάροδο του χρόνου, ενώ η τάση αντίστροφης ποικιλομορφίας παρατηρείται σε ασθενείς που δεν αναπτύσσουν απόρριψη ή χρόνιο τραυματισμό του μοσχεύματος. Παρόλο που όλα τα άτομα έλαβαν το ίδιο φορτίο ανοσοκαταστολής μετά τη μεταμόσχευση, κάποια πιθανή εξήγηση για τη μειωμένη ποικιλομορφία στους ασθενείς που αναπτύσσουν απόρριψη μπορεί να σχετίζεται με το γεγονός ότι αυτοί οι ασθενείς λαμβάνουν ένα προσωρινά πολύ αυξημένο φορτίο ανοσοκαταστολής για τη θεραπεία της απόρριψης και στη συνέχεια διατηρούνται στην υψηλότερη γραμμή βάσης. Αν και αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει τη μείωση της ποικιλότητας των Β-κυττάρων με την πάροδο του χρόνου και να εξηγήσει τη διαφορά στους 24 μήνες μετά τη μεταμόσχευση, αυτό είναι απίθανο να είναι η αιτία, καθώς η μειωμένη ποικιλομορφία στην ομάδα PR είναι

Εικ. 6 Heatmap και boxplot για την ανάλυση χρήσης γονιδίων IGHV. Χάρτης θερμότητας που δείχνει τα γονίδια IGHV που επιλέχθηκαν ως ονομαστικά σημαντικά (P-value < 0.05)="" τη="" χρονική="" στιγμή="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" και="" 24="" (c)="" για="" το="" np="" έναντι="" pr.="" η="" κόκκινη="" χρωματική="" κλίμακα="" αντιπροσωπεύει="" την="" έκφραση="" κάθε="" γονιδίου="" στα="" δείγματα.="" οι="" ζώνες="" στην="" κορυφή="" δείχνουν="" την="" κλινική="" έκβαση="" και="" την="" αιτία="" της="" esrd.="" πλαισίου="" που="" δείχνει="" έκφραση="" ighv3-23="" σε="" χρονικά="" σημεία="" για="" np="" έναντι="" pr="" (χρόνος="" 0:="" p-value="0.04," χρόνος="" 6:="" p-value="0.003," χρόνος="" 24:="" p="" -τιμή="0.02)" (δ).="" η="" ζώνη="" μέσα="" στο="" πλαίσιο="" αντιπροσωπεύει="" τη="" διάμεση="" τιμή,="" το="" πλαίσιο="" ορίζει="" το="" διατεταρτημόριο="" εύρος="" (iqr)="" και="" τα="" μουστάκια="" ορίζουν="" το="" πρώτο="" και="" το="" τρίτο="" τεταρτημόριο="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" οι="" τιμές="" p="" λαμβάνονται="" από="" την="" προσαρμογή="" ενός="" μοντέλου="" γραμμικής="" παλινδρόμησης="" που="" θεωρεί="" τα="" γονίδια="" v="" ως="" εξαρτημένη="" μεταβλητή="" και="" το="" κλινικό="" αποτέλεσμα="" ως="" ανεξάρτητη="" μεταβλητή.="" (n="12" δείγματα).="" τα="" δεδομένα="" προέλευσης="" παρέχονται="" ως="" αρχείο="" δεδομένων="">

παρατηρείται επίσης 6 μήνες μετά τη μεταμόσχευση, σε μια περίοδο που οι ασθενείς δεν έχουν ακόμη αναπτύξει απόρριψη, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι πιθανό να εμπλέκονται και άλλες ενεργές διεργασίες. Η παρατήρηση επιλεκτικής κλωνικής επέκτασης με επικρατέστερους κλώνους μόνο σε ασθενείς που αναπτύσσουν τόσο απόρριψη όσο και/ή προοδευτική χρόνιανεφρότραυματισμός μεταμόσχευσης, υποδηλώνει μια βιολογικά σχετική επιλογή, επιμονή και επέκταση ορισμένων κλώνων με βάση το αλλοαντιγόνο με την πάροδο του χρόνου, γεγονός που ευθύνεται για τη συνολική μείωση της χρονικής ποικιλότητας. Παρόλο που μπορούμε να υποθέσουμε ότι η επέκταση αυτών των κλώνων συνδέεται πιθανώς με αλλοάνοσο τραυματισμό του μοσχεύματος, η άμεση απόδειξη ότι η επέκταση αυτών των κλώνων είναι αλλοάνοση απαιτεί πρόσθετες in vitro μελέτες και μελέτες σε ζώα.

Η οξεία απόρριψη παραμένει ο ισχυρότερος αρνητικός παράγοντας για τη μακροχρόνια επιβίωση του μοσχεύματος παρά τις γρήγορες βελτιώσεις στις θεραπείες ανοσοκαταστολής39,40. Αυτή η μελέτη βρίσκει επίσης μια συσχέτιση της χρήσης ορισμένων γονιδίων IGHV με την απόρριψη, αν και η αιτιολογική σύνδεση θα πρέπει να διερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες. Το IGHV3-23 είναι το πιο ενδιαφέρον γονίδιο στην ανάλυση του gDNA, καθώς είναι σημαντικά υψηλότερο και χρησιμοποιείται σε ασθενείς που αναπτύσσουν απόρριψη σε όλα τα μετρημένα χρονικά σημεία και υπερεκπροσωπείται στους επίμονους κλώνους που μοιράζονται μεταξύ των ατόμων και στους κλώνους που εμπλουτίζονται μεταξύ τους. απορριφθέντες ασθενείς 24 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Αυτό το γονίδιο επικυρώνεται επίσης 24 μήνες μετά τη μεταμόσχευση και στους δύο ισότυπους IgD και IgM στην ανάλυση cDNA. Ο IGHV3-23 έχει συσχετιστεί εκτενώς με κακή πρόγνωση στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία41 και έχει αποδειχθεί ότι η συντριπτική πλειονότητα των αλληλουχιών IGHV3-23 διατήρησαν την ικανότητα να μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις υπεραντιγόνων42. Τα υπεραντιγόνα Β-κυττάρων παράγονται από ιούς και βακτήρια, που είναι γνωστό ότι συνδέονται με ανοσοσφαιρίνες εκτός των συμβατικών θέσεων δέσμευσης αντιγόνου43. Οι συναντήσεις των Β κυττάρων με ένα υπεραντιγόνο έχει αποδειχθεί ότι προκαλούν πολλαπλασιασμό, ενεργοποίηση, μετανάστευση και διαγραφή44. Στο μεταμοσχευμένονεφρό, υπάρχει η πιθανότητα συνεχούς έκθεσης στον ιό και στα βακτηριακά αντιγόνα, που σχετίζονται είτε με μια αιτιολογία πρωτοπαθούς κυστεοουρητηρικής παλινδρόμησης ως αιτία ESRD ή δευτερογενούς παλινδρόμησης μετά την επανεμφύτευση του ουρητήρα μεταμόσχευσης, είτε με παλινδρόμηση μετά από λοίμωξη του ουροποιητικού συστήματος. η οποία αυξάνεται με την έκθεση σε χρόνια ανοσοκαταστολή μετά τη μεταμόσχευση. Προσαρμόσαμε τα αποτελέσματα των αναλύσεων για την αιτία της νεφρικής ανεπάρκειας, μεταξύ άλλων κλινικών και δημογραφικών παραγόντων. Τα αποτελέσματα που συζητήθηκαν προηγουμένως παραμένουν σημαντικά, αν και συνειδητοποιήσαμε ότι ο ασθενής που είχε ταξινομηθεί εσφαλμένα στην ανάλυση (Εικ. 6) είχε παλινδρόμηση. Οι Cheng et al. έχουν επίσης διαπιστώσει προηγουμένως ότι οι κλώνοι σε ιστό βιοψίας ληπτών μοσχευμάτων νεφρού που διηθήθηκαν από Β κύτταρα είχαν υπεροχή του γονιδίου IGHV3-23 μεταξύ άλλων45. Οι Grover et al.46 απέδειξαν ότι τα αντισώματα για αυτό το συγκεκριμένο γονίδιο δεν αναγνώριζαν τα αντιγόνα HLA του δότη αλλά μάλλον ήταν ειδικά για το E. coli και οι Modena et al.47 έδειξαν ότι η επιβάρυνση του αριθμού των βακτηρίων στα ούρα ήταν πολύ μεγαλύτερη σε ασθενείς με διάμεση ίνωση και σωληναριακή ατροφία από εκείνα με μοσχεύματα που λειτουργούσαν καλά. Επεκτείνουμε αυτά τα ευρήματα που αποδεικνύουν ότι η χρήση του γονιδίου IGHV3-23 είναι σημαντικά υψηλότερη σε πολλαπλούς ασθενείς που απορρίπτονται στο περιφερικό αίμα και μπορεί να εμπλέκουν συγκεκριμένα κοινά αντιγόνα στην απόρριψη. Στο μέλλον, η έκφραση του IGHV3-23 θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της ανοσολογικής απόκρισης προς το μεταμοσχευμένονεφρό.

Επεκτείνοντας τη μελέτη μας χρησιμοποιώντας αλληλουχία cDNA, θα μπορούσαμε να αναπαράγουμε την πλειοψηφία των αποτελεσμάτων μας σε δύο από τους ισότυπους (IgM και IgD), δείχνοντας χαμηλότερη ποικιλομορφία προμεταμόσχευσης στο NP, όντας τα δύο πιο σημαντικά στη διαμήκη ανάλυση με μεγαλύτερη επέκταση και κυρίαρχη κλώνοι στην ανάλυση δικτύου και επίσης αντιγραφή του γονιδίου IGHV3-23. Τα πρώτα αντισώματα που παράγονται σε μια χυμική ανοσολογική απόκριση είναι πάντα τα IgM και προχωρούν γρήγορα στην παραγωγή όλων των διαφορετικών ισοτύπων, IgD, IgA, IgG και IgE, αλλά ιδιαίτερο ενδιαφέρον απαιτεί τον ισότυπο IgD48. Η IgD εκφράζεται ταυτόχρονα με την IgM και η εκκρινόμενη IgD υπάρχει και έχει μια λειτουργία στο αίμα, τις βλεννογονικές εκκρίσεις και στην επιφάνεια των έμφυτων ανοσοενεργών κυττάρων όπως τα βασεόφιλα49. Τα βασεόφιλα είναι λευκά αιμοσφαίρια που καταπολεμούν ιούς, βακτήρια, παράσιτα και μύκητες και εμπλέκονται σε νεφρικές παθήσεις και απόρριψη μοσχεύματος50. Έτσι, ένα άλλο στοιχείο που συσχετίζει τις αποκρίσεις των Β-κυττάρων με τη διαδικασία απόρριψης με ιούς και βακτήρια.

Απαιτούνται μελλοντικές μελέτες για να αποδειχθεί ότι αυτή η ενεργοποίηση οφείλεται σε διαφορές στο μικροβίωμα του αποδέκτη με επιπτώσεις στη διάγνωση και τη θεραπεία.

Αυτή η μελέτη μας επέτρεψε να προσδιορίσουμε τη συνάφεια ορισμένων από αυτούς τους κλώνους BCR, να αναγνωρίσουμε τους κλώνους BCR κλινικής σημασίας με την απόρριψη αλλομοσχεύματος και να δείξουμε ότι υπάρχει μια πιθανή σχέση αυτών των κλώνων με ετερόλογη ανοσία, δεδομένου του εμπλουτισμού αυτών των κλώνων σε ασθενείς με αποικισμένων ουροφόρων οδών πριν από τη μεταμόσχευση και η βιολογική τους σχέση με τις αποκρίσεις των παθογόνων. Καλύτερη κατανόηση της συμπεριφοράς του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου σενεφρόοι μεταμοσχεύσεις δεν θα ήταν δυνατές χωρίς την εφαρμογή του BCRSeq σε συνδυασμό με μια ισχυρή εφαρμογή υπολογιστικών και στατιστικών αγωγών. Ωστόσο, υπάρχουν αρκετοί περιορισμοί της προσέγγισής μας που πρέπει να αναγνωριστούν: Πρώτον, το μέγεθος του δείγματός μας είναι εξαιρετικά επιλεγμένο και σχετικά μικρό σε ένα σύνολο παιδιατρικών ασθενών και παρόλο που φτάσαμε σε στατιστική σημασία στην ανάλυσή μας και επικυρώθηκε σε δύο διαφορετικές πηγές δεδομένων. θα χρειαστεί περαιτέρω ανάλυση για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματά μας. Δεύτερον, τα αποτελέσματά μας δεν εξαιρούνται από την επιρροή που μπορεί να έχει η βιολογική και τεχνική δειγματοληψία στην ανάλυσή μας. Τα μέτρα ποικιλομορφίας εξαρτώνται από πολλά ζητήματα: το γεγονός ότι μόνο ένα κλάσμα δισεκατομμυρίων κυττάρων σε ένα ρεπερτόριο αντιπροσωπεύεται σε ένα δείγμα, διαφορές στο βάθος αλληλουχίας και πιθανά πειραματικά σφάλματα. Έχουμε ελέγξει εκτενώς για όλα αυτά τα ζητήματα, πρώτα στο εργαστήριο, τρέχοντας την ίδια ποσότητα αίματος για κάθε δείγμα στην ίδια παρτίδα και δεύτερον, υπολογιστικά και στατιστικά, εφαρμόζοντας το εργαλείο recon για την εκτίμηση του συνολικού ρεπερτορίου και πραγματοποιώντας μείωση δειγματοληψίας για έλεγχο βάθους αλληλουχίας και πειραματικά λάθη. Τρίτον, πραγματοποιήσαμε BCRSeq χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές πηγές, το gDNA και το cDNA. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας του gDNA διευκολύνει την εκτίμηση της κλωνικότητας μιας δεδομένης αλληλουχίας Ig αφού ο αριθμός των αναγνώσεων αλληλουχίας θα είναι ανάλογος με τον αριθμό των μορίων gDNA. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας cDNA παρέχει μια εκτίμηση του σχετικού επιπέδου έκφρασης διαφόρων αλληλουχιών Ig στο ρεπερτόριο. Έχει αποδειχθεί ότι για τους υποδοχείς Τ-κυττάρων, ο χαρακτηρισμός κλωνοτύπου που εκτελείται στο cDNA δεν είναι τόσο καλός όσο στο gDNA δείχνοντας ότι η σχετική αναλογία μεμονωμένων κλώνων διέφερε πολύ15 ή ότι η παρακολούθηση των ειδικών για τον HIV κλώνων είναι επιτυχής μόνο με το gDNA, αλλά όχι mRNA51. Τέταρτον, η επίδραση της ανοσοκαταστολής μπορεί να είναι ένας παράγοντας σύγχυσης σε αυτόν τον τύπο ανάλυσης. Σε αυτή τη μελέτη, όλα τα δείγματα προέρχονται από μια κλινική δοκιμή όπου όλοι οι ασθενείς έλαβαν το ίδιο φορτίο ανοσοκαταστολής μετά τη μεταμόσχευση. Ωστόσο, ελέγχαμε από τους δύο τύπους βασισμένων σε στεροειδή και χωρίς στεροειδή για να βεβαιωθούμε ότι αυτό δεν ήταν πρόβλημα, χωρίς να παρατηρήσουμε διαφορές στα αποτελέσματα. Τέλος, η κοόρτη που παρουσιάζουμε εδώ είναι αυτή των παιδιατρικών μεταμοσχεύσεων. Η πλειοψηφία των μεταμοσχευμένων κλινικών πτυχών είναι παρόμοια σε παιδιά και ενήλικες. Η ανοσοκαταστολή και τα σχήματα που χρησιμοποιούνται είναι παρόμοια, η κρεατινίνη είναι ο κύριος βιοδείκτης ορού, η οξεία απόρριψη προσδιορίζεται κυρίως μέσω βιοψίας με τη χρήση των κριτηρίων Banff και οι μηχανισμοί απόρριψης τουνεφρόΤο μόσχευμα είναι γενικά παρόμοιο52, επομένως η πλειοψηφία της έρευνας που έγινε σε ενήλικες ή παιδιά μπορεί να ισχύει και για τα δύο. Ωστόσο, άλλες πτυχές όπως η μη συμμόρφωση/μη τήρηση της ανοσοκαταστολής, οι ανοσολογικές πτυχές, οι πρωτογενείς νεφρικές ασθένειες, που οδηγούν σε νεφρική ανεπάρκεια, που συχνά συνδέονται με ουρολογικά προβλήματα, και οι ανοσοποιήσεις που απαιτούνται πριν από τη μεταμόσχευση μπορεί να διαφέρουν, επομένως περαιτέρω ανάλυση σε ένας ενήλικος πληθυσμός θα είναι απαραίτητος για τη γενίκευση αυτών των ευρημάτων.

Παρά αυτούς τους περιορισμούς, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι παρατηρείται μεγαλύτερη ποικιλομορφία πριν από τη μεταμόσχευση σε άτομα που συνεχίζουν να απορρίπτουν το όργανο, υποδηλώνοντας προδιάθεση απόρριψης, η οποία μπορεί να έχει μελλοντικές επιπτώσεις στην πρόβλεψη του κινδύνου απόρριψης πριν από την εμφύτευση, τις επιλογές ανοσοκαταστολής και την κλινική φροντίδα πρακτικές. Μετά από 24 μήνες παρακολούθησης, παρατηρείται συνολική μείωση της ποικιλομορφίας με την πάροδο του χρόνου που συνοδεύεται από επιμονή και επέκταση ορισμένων κλώνων και μεγαλύτερη χρήση αρκετών γονιδίων IGHV στην ομάδα απόρριψης, γεγονός που μπορεί να εμπλέκει συγκεκριμένα κοινά αντιγόνα στην οδήγηση απόρριψης. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρατηρείται για την αυξημένη χρήση του γονιδίου IGHV3-23 στους ασθενείς με απόρριψη, καθώς είχε προηγουμένως συσχετιστεί μενεφρόμεταμόσχευση και θα μπορούσε να αποτελέσει βασικό συστατικό για την προώθηση της διαδικασίας απόρριψης. Αυτή η εργασία παρουσιάζει μια διαχρονική ανάλυση του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου Β-κυττάρων σε μεταμοσχεύσεις οργάνων, προάγοντας περισσότερες μελέτες για την επιβεβαίωση αυτών των ευρημάτων, καθώς μπορεί να έχουν κλινικές επιπτώσεις στην πρόβλεψη, τον έλεγχο, την παρακολούθηση και τη θεραπείανεφρόαπόρριψη.

Μέθοδοι

Σχεδιασμός μελέτης. Μελετήσαμε 81 δείγματα για gDNA και 56 ταιριαστά δείγματα για cDNA διαμήκως σε περιόδους 0, 6 και 24 μήνες από έναν συνολικό αριθμό 27 παιδιατρικών ληπτών που έλαβαν πρωτογενήνεφρόμεταμόσχευση. Τα άτομα σε αυτή τη μελέτη προέρχονται από μια κλινική δοκιμή (πολυκεντρική μελέτη SNSO1) όπου τα άτομα τυχαιοποιήθηκαν (1:1) σε ένα παραδοσιακό σχήμα ανοσοκαταστολής βασισμένο σε στεροειδή χαμηλής δόσης (στεροειδή, τυπική επαγωγή daclizumab μέχρι τον δεύτερο μήνα μετά τη μεταμόσχευση, και ανοσοκαταστολή συντήρησης με τακρόλιμους (Prograf, Astellas Pharma) και MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) ή ένα σχήμα ανοσοκαταστολής χωρίς στεροειδή (παρατεταμένη επαγωγή daclizumab μέχρι τον έκτο μήνα μετά τη μεταμόσχευση, τακρόλιμους και MMF). εγγράφηκαν μετά από έγκριση IRB και είχαν ενημερωμένη συναίνεση.Σε αυτή τη μελέτη, 14 ασθενείς έλαβαν σχήμα αποφυγής στεροειδών, ενώ 13 έλαβαν ανοσοκατασταλτικό σχήμα βασισμένο σε στεροειδή53 και κανένας από αυτούς τους ασθενείς δεν έλαβε ανοσοκαταστολή πριν από τη μεταμόσχευση καθώς αυτό ήταν ένα κριτήριο αποκλεισμού. Θεραπεία για απόρριψη αποτελούνταν από τρεις παλμούς ενδοφλέβιας χορήγησης κορτικοστεροειδών (10 mg/kg) και εντατικοποίηση της βασικής ανοσοκαταστολής.

Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη είχαν μια συσχετισμένη σειριακή βιοψία αλλομοσχεύματος, η οποία διαβάστηκε από έναν κεντρικό παθολόγο, χρησιμοποιώντας ημιποσοτικές ιστολογικές βαθμολογίες. Η κλινική οξεία απόρριψη ορίστηκε ως ένα επεισόδιο οξείας απόρριψης, που σχετίζεται με δυσλειτουργία του μοσχεύματος, με βάση μεγαλύτερη από 10 τοις εκατό αύξηση της κρεατινίνης ορού από τις βασικές τιμές και επιβεβαιώθηκε μέσω μιας κεντρικής παθολογικής ανάγνωσης των βιοψιών σύμφωνα με την ενημερωμένη ταξινόμηση Banff224. Ο χρόνιος τραυματισμός αλλομοσχεύματος ορίστηκε χρησιμοποιώντας τη βαθμολογία του δείκτη χρόνιας βλάβης αλλομοσχεύματος (CADI). Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε τρία κλινικά αποτελέσματα που ορίστηκαν από τη βαθμολογία CADI και τα επεισόδια απόρριψης Οι μη προοδευτικοί (NP) είχαν χαμηλή μη αυξητική βαθμολογία CADI σε τρεις σειριακές βιοψίες σε διάστημα 2 ετών, χωρίς οξεία απόρριψη, οι προοδευτικοί ασθενείς χωρίς απόρριψη (PNR) είχαν υψηλότερο CADI βαθμολογία στις σειριακές βιοψίες τους για 2 χρόνια και σταδιακά σε όλα τα χρονικά σημεία χωρίς απόρριψη και οι προοδευτικοί με απόρριψη (PR) είχαν αυξητικές υψηλές βαθμολογίες CADI στις σειριακές βιοψίες τους για 2 χρόνια με επεισόδια απόρριψης. Αυτοί οι ασθενείς επιλέχθηκαν πολύ προσεκτικά από μια μεγαλύτερη κοόρτη 120 ασθενών, που ταιριάζουν με τις δημογραφικές μεταβλητές και για όλους τους NP και PNR να μην έχουν ενδείξεις φλεγμονής στη βιοψία ή υποκλινικό τραυματισμό, όπως μετρήθηκε από την έλλειψη ειδικών αντισωμάτων για τον δότη. Κανένας δεν είχε HLA ή απλοομοιότυπο μόσχευμα καθώς αυτό ήταν κριτήριο αποκλεισμού για εγγραφή54. Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν από 12 διαφορετικά προγράμματα παιδιατρικής μεταμόσχευσης των ΗΠΑ μεταξύ 2004 και 2006, σύμφωνα με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από το IRB. Η μελέτη εγκρίθηκε επίσης από το Πρόγραμμα Προστασίας της Ανθρώπινης Έρευνας (HRPP) του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, του Σαν Φρανσίσκο και του Πανεπιστημίου του Στάνφορντ για να επιτραπεί η ανάλυση δειγμάτων βιοτραπεζών. Όλοι οι ασθενείς/κηδεμόνες παρείχαν ενημερωμένη συγκατάθεση για συμμετοχή στην έρευνα, με πλήρη συμμόρφωση με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Οι κλινικές και ερευνητικές δραστηριότητες που αναφέρονται είναι συνεπείς με τις Αρχές της Διακήρυξης της Κωνσταντινούπολης, όπως περιγράφονται στη Διακήρυξη της Κωνσταντινούπολης για την εμπορία οργάνων και τον τουρισμό μεταμοσχεύσεων.

Απομόνωση gDNA και RNA. Δείγματα αίματος (4,5 ml) συλλέχθηκαν σε έναν κόκκινο κορυφαίο σωλήνα 5 ml και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά μέχρι να σχηματιστεί ο θρόμβος. Το δείγμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 2000 × g για 5 λεπτά χρησιμοποιώντας έναν περιστρεφόμενο ρότορα κάδου. Το ανώτερο στρώμα του ορού στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε άλλο κρυοσωλήνα και ο θρόμβος αποθηκεύτηκε στον ίδιο σωλήνα στους -80 βαθμούς μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Το γονιδιωματικό DNA από θρόμβους πλήρους αίματος εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Clotspin Baskets και το Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Για εξαγωγή RNA απόνεφρόβιοψία με βελόνα (Qiagen, Valencia, CA) και αποθήκευση στους -80 βαθμούς. ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κύριο μίγμα 790 μΐ ΤΡΙζόλης και 10 μΙ γλυκογόνου. Τα δείγματα ιστών ομογενοποιήθηκαν, επωάστηκαν στους 15 έως 25 βαθμούς για 5 λεπτά και προστέθηκαν 160 μΐ χλωροφορμίου για διαχωρισμό φάσεων. Το μίγμα επωάστηκε ξανά στους 25 βαθμούς για 2 λεπτά ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση στους 4 βαθμούς και χρησιμοποιήθηκε για εκχύλιση RNA χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Micro (Qiagen Catalog αρ. 4004). Η ποσότητα και η ακεραιότητα του RNA προσδιορίστηκαν με το Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 φασματοφωτόμετρο UV–Vis και το Agilent Bioanalyzer, αντίστοιχα.

Αλληλουχία Β-κυττάρων. Παρασκευάστηκαν αντιδράσεις PCR με μήτρα γονιδιωματικού DNA

από 100 ng κλάσματα gDNA για τη δημιουργία έξι ανεξάρτητων βιβλιοθηκών με γραμμωτό κώδικα ανά δείγμα. Χρησιμοποιήθηκαν πολυπλεγμένοι εκκινητές στις περιοχές πλαισίου IgH J ή FR1 ή FR2 ανά σχέδιο BIOMED-255. Οι «αλληλουχίες γραμμωτού κώδικα» δέκα νουκλεοτιδίων στους εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για να υποδείξουν την ταυτότητα του δείγματος και την ταυτότητα της βιβλιοθήκης αντιγραφής για κάθε αντίδραση PCR. Η PCR πραγματοποιήθηκε με πολυμεράση AmpliTaq Gold (Roche) με το ακόλουθο πρόγραμμα: 94 βαθμούς για 5 λεπτά. 35 κύκλοι (94 μοίρες για 30 δευτερόλεπτα, 60 μοίρες για 45 δευτερόλεπτα, 72 μοίρες για 90 δευτερόλεπτα). και τελική επέκταση στους 72 βαθμούς για 10 λεπτά. Διεξήχθη μια δεύτερη αντίδραση PCR για να διασφαλιστεί ότι οι βιβλιοθήκες δεν ενισχύθηκαν σε κορεσμό πριν από τον καθαρισμό γέλης και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας. Συνολικά, 0,4 ul από κάθε πρώτο προϊόν PCR διαμορφώθηκε ως πρότυπο για τη δεύτερη αντίδραση PCR χρησιμοποιώντας εξωτερικούς εκκινητές ειδικούς για τις 454 αλληλουχίες συνδετήρων. Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα: 94 μοίρες για 15 λεπτά, 12 κύκλοι (94 μοίρες για 30 δευτερόλεπτα, 60 μοίρες για 45 δευτερόλεπτα, 72 μοίρες για 90 δευτερόλεπτα) και τελική επέκταση στις 72 μοίρες για 10 λεπτά. Το ποσοστό σφάλματος του AmpliTaq Gold θα πρέπει να έχει ελάχιστη επίδραση στον εντοπισμό κλωνικά σχετικών αλληλουχιών ή στην εκτίμηση των ρυθμών σωματικής μετάλλαξης σε αλληλουχίες όπως συζητήθηκε κάπου αλλού56. Το cDNA συντέθηκε από ένα σύνολο 300 ng RNA με εκκίνηση με τυχαία εξαμερή. Τα πρότυπα ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές Biomed IGHV στο πλαίσιο 1 (FR1) και ειδικούς για ισότυπο εκκινητές που βρίσκονται στο πρώτο εξόνιο των σταθερών περιοχών. Αυτοί οι εκκινητές18,57 κωδικοποίησαν επίσης περίπου τις μισές από τις αλληλουχίες συνδέτη Illumina που απαιτούνται για τη δημιουργία συστάδων και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας στο όργανο MiSeq. Η ταυτότητα του δείγματος κωδικοποιήθηκε από γραμμωτούς κώδικες αναγνώρισης πολυπλεξίας οκτώ νουκλεοτιδίων σε κάθε εκκινητή. Για την αναγνώριση συστάδων Illumina, τέσσερα τυχαιοποιημένα νουκλεοτίδια κωδικοποιήθηκαν στους εκκινητές αμέσως μετά την αλληλουχία συνδέτη Illumina στους εκκινητές σταθερής περιοχής. Κάθε ισότυπος αντισώματος για κάθε δείγμα ενισχύθηκε σε ξεχωριστή αντίδραση PCR, για να αποτραπεί ο σχηματισμός χιμαιρικών προϊόντων PCR σταυρωτού ισοτύπου. Η PCR πραγματοποιήθηκε με AmpliTaq Gold (Roche) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή και χρησιμοποίησε ένα πρόγραμμα 94 μοιρών για 7 λεπτά, 35 κύκλους (94 μοίρες για 30 δευτερόλεπτα, 58 μοίρες για 45 δευτερόλεπτα, 72 μοίρες για 120 δευτερόλεπτα) και τελικό επέκταση στους 72 βαθμούς για 10 λεπτά. Ένα δεύτερο βήμα PCR χρησιμοποιήθηκε για την προσθήκη του υπόλοιπου τμήματος των συνδετήρων Illumina στα αμπλικόνια και πραγματοποιήθηκε με το κιτ Qiagen Multiplex PCR (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας 0,4 μικρολίτρα του πρώτου προϊόντος PCR ως πρότυπο σε Αντίδραση 30 μικρολίτρων. Το πρόγραμμα PCR για το δεύτερο βήμα PCR ήταν 94 μοίρες για 15 λεπτά, 12 κύκλοι (94 μοίρες για 30 δευτερόλεπτα, 60 μοίρες για 45 δευτερόλεπτα, 72 μοίρες για 90 δευτερόλεπτα) και τελική επέκταση στους 72 βαθμούς για 10 λεπτά. Τα προϊόντα κάθε αντίδρασης PCR συνενώθηκαν σε εκτιμώμενες ισομοριακές ποσότητες, ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης και εκχυλίστηκαν γέλη με κιτ QIAquick (Qiagen). Ο προσδιορισμός αλληλουχίας υψηλής απόδοσης βιβλιοθηκών μορφοποιημένων γονιδιωματικού DNA πραγματοποιήθηκε στην πλατφόρμα 454 (Roche) χρησιμοποιώντας χημεία τιτανίου. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας βιβλιοθήκης cDNA πραγματοποιήθηκε σε ένα όργανο Illumina MiSeq χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού αλληλουχίας 600-κύκλου. Ένας πλήρης κατάλογος των εκκινητών που χρησιμοποιούνται με το MiSeq (M154 και M155) και το 454 Titanium (T7) περιλαμβάνεται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 1.

Οι αναγνώσεις αλληλουχίας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως εξής: οι αναγνώσεις ζευγαριού άκρου συγχωνεύτηκαν χρησιμοποιώντας FLASH58 όπου μετά οι αλληλουχίες αποπολυπλέκτησαν και περικόπηκαν από γραμμικούς κώδικες και αλληλουχίες εκκινητών IGHV. Οι περιοχές V, D και J και οι διασταυρώσεις V–D (N1), D–J (N2) αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ευθυγράμμισης IgBLAST59. Οι αλληλουχίες φιλτραρίστηκαν για να αφαιρεθούν τεχνουργήματα μη-IGH, αλληλουχίες με εισαγωγή ή διαγραφές γονιδίου V, χιμαιρικές αλληλουχίες και μη λειτουργικές αλληλουχίες. Σε επίπεδο δείγματος, εξαιρέσαμε εκείνα με<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Ανάλυση ποικιλομορφίας. Η ποικιλότητα μετράται με βάση τον πλούτο των ειδών λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των κλώνων ανά δείγμα. Αυτό το μέτρο δεν λαμβάνει υπόψη τη συχνότητα κάθε είδους, επομένως χρησιμοποιήσαμε επίσης την εντροπία Shannon (H) για τη μέτρηση της ποικιλότητας παρέχοντας

πληροφορίες σχετικά με την κατανομή μεγέθους των ειδών στον πληθυσμό. Το H ορίζεται ως:

όπου N είναι ο αριθμός των μοναδικών κλώνων και pi είναι η συχνότητα του κλώνου i. Το H κυμαίνεται από 0 (δείγμα με μόνο έναν κλώνο) έως Hmax ¼ log2N (δείγμα με ομοιόμορφη κατανομή κλώνων).

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε ένα γενικό γραμμικό μοντέλο για να βρούμε τη σχέση μεταξύ πλούτου και εντροπίας με το κλινικό αποτέλεσμα σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Προσαρμόσαμε αυτό το μοντέλο με όλες τις διαθέσιμες κλινικές μεταβλητές που φαίνονται στον Πίνακα 1 για να είμαστε σίγουροι ότι οποιοδήποτε από τα χαρακτηριστικά του ασθενούς ήταν παράγοντας σύγχυσης

Για να μοντελοποιήσουμε τη διαμήκη συνιστώσα των δεδομένων, εφαρμόσαμε ένα γραμμικό μοντέλο μικτού αποτελέσματος λαμβάνοντας υπόψη ένα υπό όρους μοντέλο ανάπτυξης όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 10. Για να εφαρμόσουμε αυτό το μοντέλο, χρησιμοποιήσαμε το πακέτο lme4 στο R λαμβάνοντας υπόψη την αλληλεπίδραση μεταξύ κλινικής έκβασης και χρόνου Βρείτε συσχέτιση με τον πλούτο και την ποικιλομορφία με το χρόνο να είναι ένα τυχαίο αποτέλεσμα.

Για να αντιμετωπίσουμε το γεγονός ότι τα μέτρα ποικιλομορφίας μπορεί να επηρεαστούν από το πρόβλημα των ειδών που λείπουν (αντιπροσωπεύεται μόνο ένα κλάσμα δισεκατομμυρίων κυττάρων σε ένα ρεπερτόριο) και τα σφάλματα αλληλουχίας και πειραμάτων, εκτελέσαμε δύο στρατηγικές επιπλέον της πλήρους ανάλυσης δεδομένων. Αρχικά, χρησιμοποιήσαμε το εργαλείο Recon (ανακατασκευή εκτιμώμενων κλώνων από παρατηρούμενους αριθμούς)29 για να αντιμετωπίσουμε το πρόβλημα των ειδών που λείπουν. Το Recon είναι μια τροποποιημένη μέθοδος μέγιστης πιθανότητας που εξάγει τη συνολική ποικιλομορφία ενός ρεπερτορίου από μετρήσεις σε ένα δείγμα. Η Recon εξάγει ακριβείς και ισχυρές εκτιμήσεις ενός συνόλου μέτρων διαφορετικότητας, συμπεριλαμβανομένου του πλούτου και της εντροπίας, επιτρέποντας αξιόπιστες συγκρίσεις της διαφορετικότητας μεταξύ ατόμων. Δεύτερον, πραγματοποιήσαμε μια στρατηγική μείωσης δειγματοληψίας λαμβάνοντας ένα τυχαίο υποσύνολο αναγνώσεων για κάθε δείγμα ίσο με το μικρότερο μέγεθος αλληλουχίας, ακολουθούμενο από τον εκ νέου υπολογισμό των κλώνων των Β-κυττάρων για προσαρμογή βάσει του βάθους αλληλουχίας και αντιμετώπιση πιθανών πειραματικών σφαλμάτων. Για το gDNA, υπάρχουν δείγματα με πολύ χαμηλές αναγνώσεις (< 1000)="" και="" για="" να="" αποφευχθεί="" η="" απώλεια="" πολλών="" ακολουθιών="" και="" η="" πραγματικότητα="" των="" δεδομένων,="" αποκλείσαμε="" συνολικά="" εννέα="" δείγματα="" που=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Ανάλυση δικτύου. Ο αλγόριθμος δημιουργίας δικτύου είναι πολύ παρόμοιος με αυτόν που ορίστηκε πριν31. Εν συντομία, κάθε κορυφή αντιπροσωπεύει μια ακολουθία Β-κυττάρων όπου το μέγεθος ορίζεται από όλες τις πανομοιότυπες ακολουθίες. Οι ακμές υπολογίζονται χρησιμοποιώντας τον ορισμό του κλώνου (ίδια τμήματα V και J, ίδιο μήκος CDR3 και 90 τοις εκατό ταυτότητα νουκλεοτιδίου μεταξύ των CDR3) και οι συστάδες αντιπροσωπεύουν κάθε κλώνο στο ρεπερτόριο. Η ανάλυση έγινε με τη χρήση του πακέτου γραφήματος στο R χρησιμοποιώντας την επιλογή διάταξης_με_graphopt για τη δημιουργία της γραφικής παράστασης.

Για να ποσοτικοποιήσουμε το δίκτυο, υπολογίσαμε τον δείκτη Gini για το μέγεθος κορυφής και το μέγεθος συμπλέγματος. Ο δείκτης Gini είναι ένα μέτρο ανομοιομορφίας που χρησιμοποιείται ευρέως για τη μέτρηση της κατανομής του πλούτου. Μετρά την ανισότητα μεταξύ των τιμών κατανομής συχνότητας. Χρησιμοποιήσαμε τη συνάρτηση Gini από ένα πακέτο στο R για να υπολογίσουμε τον συντελεστή Gini για το μέγεθος κορυφής και την κατανομή μεγέθους συμπλέγματος. Ένας συντελεστής Gini μηδέν εκφράζει την τέλεια ισότητα και ένας συντελεστής Gini 1 εκφράζεται μέγιστη ανισότητα.

Κλωνική ανάλυση. Για να μελετήσουμε τους συγκεκριμένους κλώνους που σχετίζονται με κλινικά αποτελέσματα, κατασκευάσαμε μια μήτρα με όλους τους κλώνους που υπάρχουν σε περισσότερα από ένα δείγματα (συνολικός αριθμός=118,223) από όλα τα δείγματα σε κάθε χρονικό σημείο. Στη συνέχεια μελετήσαμε τη συσχέτιση με την κλινική έκβαση κάθε συγκεκριμένου κλώνου, ορίζοντας μία μεταβλητή ανά κλώνο ως παρούσα/δεν υπάρχει. Τέλος, εφαρμόσαμε την ακριβή δοκιμή του Fisher για να λάβουμε υπόψη τη σημασία στους πίνακες 2 × 3 για κάθε κλώνο σε κάθε χρονικό σημείο. Μελετήσαμε επίσης τους κλώνους επιμονής που ορίζονται από εκείνους τους κλώνους που βρίσκονται σε περισσότερα από ένα χρονικά σημεία σε κάθε άτομο. Στη συνέχεια, για να υπολογίσουμε τις διαφορές από το κλινικό αποτέλεσμα, εφαρμόσαμε ένα γραμμικό μοντέλο που ορίζει ως εξαρτημένη μεταβλητή τον αριθμό των κλώνων (για τη μέτρηση των διαφορών στην επιμονή) και τον αριθμό των μετρήσεων κάθε κλώνου (για τη μέτρηση της κλωνικής επέκτασης) και το κλινικό αποτέλεσμα ως ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας.

Ανάλυση χρήσης γονιδίου IGHV. Για τη μελέτη των γονιδίων IGHV, αξιολογήσαμε τη χρήση του γονιδίου IGHV ανά δείγμα καθώς ο αριθμός των φορών που χρησιμοποιείται κάθε γονίδιο κανονικοποιήθηκε με τον αριθμό των κλώνων για να αποφευχθεί η υπερεκπροσώπηση ορισμένων γονιδίων IGHV. Για στατιστική ανάλυση, φιλτράραμε εκείνα τα γονίδια με πολύ χαμηλή έκφραση (χρησιμοποίηση IGHV/κλώνοι < {{0}}.05)="" τουλάχιστον="" στο="" 10="" τοις="" εκατό="" των="" δειγμάτων.="" συνολικά,="" αναλύσαμε="" 27="" γονίδια="" ighv="" που="" αντιστοιχούν="" σε="" 63="" δείγματα.="" στη="" συνέχεια,="" εφαρμόσαμε="" ένα="" γραμμικό="" μοντέλο="" για="" να="" βρούμε="" εκείνα="" τα="" γονίδια="" που="" συσχετίστηκαν="" με="" την="" κλινική="" έκβαση="" σε="" κάθε="" χρονικό="" σημείο="" και="" διορθώσαμε="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" με="" πολλαπλές="" δοκιμές="" χρησιμοποιώντας="" benjamini="" και="" hochberg="" fdr=""><0,05. προσαρμόσαμε="" αυτό="" το="" μοντέλο="" με="" όλες="" τις="" διαθέσιμες="" κλινικές="" μεταβλητές="" που="" φαίνονται="" στον="" πίνακα="" 1="" για="" να="" είμαστε="" σίγουροι="" ότι="" οποιοδήποτε="" από="" τα="" χαρακτηριστικά="" του="" ασθενούς="" ήταν="" παράγοντας="">

Περίληψη αναφοράς. Περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τον σχεδιασμό της έρευνας είναι διαθέσιμες στη Σύνοψη Αναφορών Έρευνας Φύσης που συνδέεται με αυτό το άρθρο.

βιβλιογραφικές αναφορές

1.Cai,J.& Terasaki,PI Παρακολούθηση αντισωμάτων μετά τη μεταμόσχευση και HLA 1.(αναγνώριση επιτόπου αντισώματος. Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008).

2. Sigdel, TKet al. Τα αντισώματα Non-HLA σε ανοσογονικούς επιτόπους προβλέπουν την εξέλιξη της χρόνιας βλάβης νεφρικού αλλομοσχεύματος. Είμαι. Soc. Nephrol.23,750-763 (2012).

3. Li, L.et αϊ. Διαμερισματική εντόπιση και κλινική σημασία των αντισωμάτων MICA μετά από μεταμόσχευση νεφρού. Transplantation 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S.& Meier-Kriesche, H.-U. Μακροχρόνια επιβίωση νεφρικού αλλομοσχεύματος στις Ηνωμένες Πολιτείες: Μια κριτική επανεκτίμηση. Am.J. Μεταμόσχευση. 11, 450-462(2011).

5. Το Επιστημονικό Μητρώο Παραληπτών Μεταμοσχεύσεων.Διαθέσιμο στο: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Πρόσβαση: 24 Μαΐου 2018) Pineda, S. et al. Νέες παραλλαγές αντιγόνου μη ιστοσυμβατότητας που δεν ταιριάζουν

6. Βελτιώστε την ικανότητα πρόβλεψης του κινδύνου απόρριψης που προκαλείται από αντισώματα σε μεταμοσχεύσεις νεφρού. Εμπρός. Immunol. 8,1687 (2017).

7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM& Fairchild, RL Πρόσφατη πρόοδος και νέες προοπτικές στη μελέτη των αποκρίσεων των Τ κυττάρων σε αλλομοσχεύματα. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G.& Sarwal, MM Το yin και yang των Β κυττάρων σε απόρριψη και ανοχή μοσχεύματος. Μεταμόσχευση. Rev.24,67-78(2010).

9. Γεωργίου, G.et al. Η υπόσχεση και η πρόκληση της αλληλουχίας υψηλής απόδοσης του ρεπερτορίου συν αντισωμάτων. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).

10. Schroeder, HW Ομοιότητα και απόκλιση στην ανάπτυξη και έκφραση του ρεπερτορίου αντισωμάτων ποντικού και ανθρώπου. Dev. Comp. Immunol. 30,119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Πρακτικές οδηγίες για ανάλυση αλληλουχίας ρεπερτορίου υποδοχέων Β-κυττάρων. Genome Med.7,121 (2015).

12. Shugay, Μ. et αϊ. VDJtools: Ενοποιητική μετα-ανάλυση των ρεπερτορίων υποδοχέων Τ κυττάρων. PLOS Comput. Βιολ.11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H.et al. Quantitative χαρακτηρισμός του ρεπερτορίου των Τ-κυττάρων και των βιοδεικτών στην απόρριψη μοσχεύματος νεφρού. BMC Nephrol.17,181 (2016). 14. Morris, Η. et αϊ. Παρακολούθηση Τ-λεμφοκυττάρων που αντιδρούν σε δότη: Στοιχεία για κλωνική διαγραφή σε ανεκτικούς ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού. Sci. Μετάφρ. Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, Μ. et αϊ. Η ανάλυση ρεπερτορίου TCR με αλληλούχιση επόμενης γενιάς επιτρέπει πολύπλοκη διαφορική διάγνωση της παθολογίας που σχετίζεται με τα Τ κύτταρα. Είμαι. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A.et al. Τα κύτταρα Β με μεταγωγή κατηγορίας ανοσοσφαιρίνης σχηματίζουν έναν ενεργό ανοσοάξονα μεταξύ του ΚΝΣ και της περιφέρειας στη σκλήρυνση κατά πλάκας. Sci. Μετάφρ. Med.6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB& Hernandez, RDSstatistical inference of a convergent antibody repertoire response to influenza vaccine. Genome Med. 8,60 (2016).

18. Roskin, KM et αϊ. Οι αλληλουχίες IgH σε κοινή μεταβλητή ανοσοανεπάρκεια αποκαλύπτουν αλλοιωμένη ανάπτυξη και επιλογή Β κυττάρων. Sci. Μετάφρ. Med.7,302ra135 (2015).

19. Massart, A.,Ghisdal,L.,Abramowicz, M.& Abramowicz,D.Επιχειρητική ανοχή στη μεταμόσχευση νεφρού και σχετικοί βιοδείκτες. Clin. Exp. Immunol.189,138-157(2017).

20. Ρεπερτόρια κυττάρων Beausang, JFet al.B σε υποψηφίους μεταμόσχευσης νεφρού ευαισθητοποιημένους με HLA που υποβάλλονται σε θεραπεία απευαισθητοποίησης. J. Μετάφρ. Med.15, 9 (2017).

21. Ferdman, J. et αϊ. Επέκταση και σωματική υπερμετάλλαξη κλώνων Β-κυττάρων σε απορριφθέντα ανθρώπινα νεφρικά μοσχεύματα. Transplantation 98,766-772(2014).

22. Vollmers, C. et αϊ. Παρακολούθηση φαρμακολογικά επαγόμενης ανοσοκαταστολής με αλληλούχιση ανοσολογικού ρεπερτορίου για την ανίχνευση οξείας απόρριψης αλλομοσχεύματος σε ασθενείς με μεταμόσχευση καρδιάς: Μελέτη διαγνωστικής ακρίβειας απόδειξης της ιδέας.PLOS Med. 12,e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al.Banff'05 Meeting Report: Διαφορική διάγνωση χρόνιου τραυματισμού αλλομοσχεύματος και εξάλειψη χρόνιας νεφροπάθειας αλλομοσχεύματος (CAN). Είμαι. J. Transplant.7,518-526(2007). ανοσοκαταστολή στη μεταμόσχευση νεφρού: είναι καιρός να τη θεωρήσουμε ως τυπική θεραπεία; Kidney Int.76,825-830(2009).

28. Legendre, C. et al. Τριετή αποτελέσματα σε ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού που τυχαιοποιήθηκαν σε ανοσοκαταστολή χωρίς στεροειδή ή απόσυρση στεροειδών, με εντερική επικάλυψη μυκοφαινολικό νάτριο και κυκλοσπορίνη: η μελέτη άπειρου. J. Transplant.2014,1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Ισχυρές εκτιμήσεις της συνολικής ποικιλομορφίας του ανοσοποιητικού ρεπερτορίου από μετρήσεις υψηλής απόδοσης σε δείγματα. Nat. Commun.7, 11881(2016).

30. Stern, JNHet al. Τα Β κύτταρα που κατοικούν στον εγκέφαλο της σκλήρυνσης κατά πλάκας ωριμάζουν στους τραχηλικούς λεμφαδένες που παροχετεύουν. Sci. Μετάφρ. Med.6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet al. Οι ιδιότητες δικτύου που προκύπτουν από τη βαθιά αλληλουχία των ρεπερτορίων υποδοχέων ανθρώπινων Β-κυττάρων οριοθετούν πληθυσμούς Β-κυττάρων. Genome Res.23,1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met al. Μοριακή ετερογένεια στην οξεία απόρριψη νεφρικού αλλομοσχεύματος

αναγνωρίζεται με προφίλ μικροσυστοιχίας DNA. N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33.Zarkhin, V.,Lovelace, PA,Li, L.,Hsieh,S.-C.& Sarwal, MMPhenotypic Evaluation of b-cell subsets after rituximab για τη θεραπεία της οξείας απόρριψης νεφρικού αλλομοσχεύματος σε παιδιατρικούς λήπτες. Transplantation 91,1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR& Targeting, Β. Κύτταρα και αντισώματα στη μεταμόσχευση. J. Transplant.11,1359-1367 (2011).

35. Dijke,EIet al.Bcells in transplantation.J. Heart Lung Transplant.35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ& Kuypers, DRDiagnosis and prevention of χρόνιας απώλειας αλλομοσχεύματος νεφρού. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. Η φυσική παραλλαγή στις παραμέτρους του έμφυτου ανοσοκυττάρου καθοδηγείται κατά προτίμηση από γενετικούς παράγοντες. Nat.Immunol.19,302-314(2018). 38. Liston, A.& Goris,A. Η προέλευση της διαφορετικότητας στην ανθρώπινη ανοσία. Immunol. 19,209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Έλλειψη βελτίωσης στην επιβίωση του νεφρικού αλλομοσχεύματος παρά την αξιοσημείωτη μείωση στα ποσοστά οξείας απόρριψης κατά την πιο πρόσφατη εποχή.Am.J. Transplant.4,378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranic, G.& Nishio-Lucar, A. Η λειτουργία του μοσχεύματος και τα ενδιάμεσα αποτελέσματα των μεταμοσχεύσεων νεφρού βελτιώθηκαν την τελευταία δεκαετία: Ανάλυση της βάσης δεδομένων για τη μεταμόσχευση νεφρού των Ηνωμένων Πολιτειών. Μεταμόσχευση. απευθείας 3,el66 (2017).

41. Bomben, R. et αϊ. Η έκφραση μεταλλαγμένων γονιδίων IGHV3-23 στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία προσδιορίζει ένα υποσύνολο ασθενειών με ιδιόμορφα κλινικά και βιολογικά χαρακτηριστικά. Clin. Cancer Res. 16, 620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y.& Wheatley, L. B-cell superantigens: ορισμός και πιθανή επίδραση στην ανοσοαπόκριση.J. Clin.Immunol.15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ& Goodyear, CSA model B-Cell superantigen and the immunobiology of B lymphocytes. Clin.Immunol.102,117-134(2002).

44. Silverman, GJ& Goodyear, CSConfounding B-cell Defenses: μαθήματα από ένα σταφυλοκοκκικό υπεραντιγόνο. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J. et al. Οι εκτοπικές ομάδες Β-κυττάρων που διεισδύουν στους μεταμοσχευμένους ανθρώπινους νεφρούς είναι κλωνικές. Proc. Natl Acad. Sci. 108, 5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RKet al. Το συνδιεγερτικό ανοσογόνο LPS επάγει τους κλώνους Β-Κυττάρων που διεισδύουν στους μεταμοσχευμένους ανθρώπινους νεφρούς. Proc. Natl Acad. Sci. ΗΠΑ 109, 6036-6041(2012).

47, Μόντενα, BDet al. Οι αλλαγές στους πληθυσμούς του μικροβιώματος των ούρων συσχετίζονται σε μεταμοσχεύσεις νεφρού με διάμεση ίνωση και σωληναριακή ατροφία που τεκμηριώνεται σε βιοψίες πρώιμης επιτήρησης. Είμαι. J. Transpl.17,712-723 (2017).

48. Chen, Κ. & Cerutti, Α. Νέες ιδέες στο αίνιγμα της ανοσοσφαιρίνης D. Immunol. Rev. 237,160-179 (2010).

49. Chen, Κ. et αϊ. Η ανοσοσφαιρίνη D ενισχύει την ανοσολογική επιτήρηση ενεργοποιώντας αντιμικροβιακά, προφλεγμονώδη και προγράμματα διέγερσης των Β κυττάρων στα βασεόφιλα. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Basophils and mast κύτταρα σε νεφρική βλάβη.KidneyInt.76,1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet al. Μοριακή παρακολούθηση ιού ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας

Ο ειδικός nef κυτταροτοξικός κλώνος Τ-κυττάρων δείχνει επιμονή του DNA του υποδοχέα Τ-κυττάρων ειδικού για κλώνους αλλά όχι του mRNA μετά από πρώιμη συνδυαστική αντιρετροϊκή θεραπεία. Immunol. Lett.66,219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina,P.& Harmon, WEKidney transplantation in children.N.Engl. J. Med. 371,549-558(2014).

53. Sarwal, MMet al. Η πλήρης αποφυγή στεροειδών είναι αποτελεσματική και ασφαλής σε παιδιά με μεταμοσχεύσεις νεφρού: Μια πολυκεντρική τυχαιοποιημένη δοκιμή με τριετή παρακολούθηση. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al.Banff 07 ταξινόμηση της παθολογίας του νεφρικού αλλομοσχεύματος: ενημερώσεις και μελλοντικές κατευθύνσεις. Am.J.Transplant.8,753-760 (2008).

54. Li, L et αϊ. Ανοσοκαταστολή χωρίς στεροειδή από το 1999:129 παιδιατρικές μεταμοσχεύσεις νεφρού με παρατεταμένα οφέλη μοσχεύματος και ασθενών. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A.et al. Η κλινική επίδραση της χυμικής ανοσίας στην παιδιατρική μεταμόσχευση νεφρού.J. Είμαι. Soc.Nephrol.24,655-664 (2013).