Σύντομη εισπνοή σεβοφλουρανίου μπορεί να μειώσει τον σχηματισμό γλοιακής ουλής μετά από υποξικό-ισχαιμικό τραυματισμό του εγκεφάλου σε νεογνικούς αρουραίους Μέρος 2

PCR σε πραγματικό χρόνο

Το ολικό RNA εξήχθη από τους ιστούς του ιππόκαμπου νεογνών στις 12, 24 και 48 ώρες μετά την επέμβαση χρησιμοποιώντας TRIzolreagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα προηγμένο κιτ Superscript II RT-PCR (Invitrogen).

Η υποξική-ισχαιμική βλάβη αναφέρεται σε μια παθολογική κατάσταση που προκαλείται από εγκεφαλική ισχαιμία, υποξία, μεταβολική διαταραχή και βλάβη των νευρικών κυττάρων λόγω διαταραχών του καρδιαγγειακού και του εγκεφαλοαγγειακού συστήματος. Με την κοινωνική πρόοδο και τις αλλαγές στον τρόπο ζωής, ο υποξικός-ισχαιμικός τραυματισμός γίνεται όλο και πιο συχνός. Αυτή η κατάσταση μπορεί να προκαλέσει πολλές βλάβες στην ανθρώπινη υγεία, συμπεριλαμβανομένης της νοημοσύνης και της μνήμης κάποιου.

Αν και η υποξία και η ισχαιμία μπορεί να προκαλέσουν μείωση της εγκεφαλικής λειτουργίας, αυτό δεν σημαίνει ότι η μνήμη θα επηρεαστεί αρνητικά. Αντίθετα, μπορούμε να βελτιώσουμε τη μνήμη και να αυξήσουμε την αποτελεσματικότητα του εγκεφάλου με τις σωστές μεθόδους. Ακολουθούν μερικοί τρόποι για να βελτιώσετε τη μνήμη σας:

1. Υγιεινή διατροφή: Η επίδραση της διατροφής στη μνήμη είναι πολύ σημαντική. Τροφές πλούσιες σε πρωτεΐνες, βιταμίνες και μέταλλα μπορούν να βοηθήσουν στη διατήρηση ενός υγιούς νευρικού συστήματος και της λειτουργίας της σκέψης.

2. Ασκηθείτε περισσότερο: Η σωματική άσκηση μπορεί να προωθήσει την κυκλοφορία του αίματος, να αυξήσει τη ροή οξυγόνου, να ενισχύσει την ανοσία του σώματος και να μειώσει τον κίνδυνο ασθενειών. Μέσω της άσκησης, μπορείτε να βελτιώσετε την ικανότητα μνήμης σας.

3. Ενισχύστε την αυτοπεποίθηση: Η αυτοπεποίθηση είναι σημαντικός παράγοντας στη μνήμη ενός ατόμου. Εάν πιστεύετε ότι μπορείτε να ολοκληρώσετε μια συγκεκριμένη εργασία, θα επιτύχετε εύκολα τα αποτελέσματα που θέλετε και μπορείτε επίσης να βελτιώσετε αποτελεσματικά τη μνήμη σας.

Μπορεί να φανεί ότι η υποξική-ισχαιμική βλάβη δεν είναι μια κατάσταση που θα βλάψει αναπόφευκτα την ανθρώπινη μνήμη. Εφόσον κυριαρχούμε στις σωστές μεθόδους και φροντίζουμε καλά τον εγκέφαλό μας, μπορούμε να αγκαλιάσουμε ένα υγιές μέλλον με θετική στάση. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola έχει αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και αντιγηραντικά αποτελέσματα, τα οποία μπορούν να βοηθήσουν στη μείωση της οξείδωσης και των φλεγμονωδών αντιδράσεων στον εγκέφαλο, προστατεύοντας έτσι τον υγεία του νευρικού συστήματος. Επιπλέον, το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να προωθήσει την ανάπτυξη και την επισκευή των νευρικών κυττάρων, ενισχύοντας έτσι τη συνδεσιμότητα και τη λειτουργία των νευρωνικών δικτύων. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να βοηθήσουν στη βελτίωση της μνήμης, της μάθησης και της ταχύτητας σκέψης και μπορεί επίσης να αποτρέψουν την ανάπτυξη γνωστικής δυσλειτουργίας και νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη λειτουργία του εγκεφάλου

Φθορίζουσα βαφή SYBR Green I (SYBR Green PCRMaster Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και 1 μL αντίστροφης μεταγραφής συμπληρωματικού DNA χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση σύνθεσης DNA με PCR σε πραγματικό χρόνο με ειδικούς εκκινητές HIF{2}.

Στο σύστημα ενίσχυσης DNA του γονιδίου ρότορα σε πραγματικό χρόνο (Corbett Research, Sydney, Αυστραλία), η PCR πραγματοποιήθηκε με τους ακόλουθους κύκλους: μετουσίωση στους 95 βαθμούς για 15 λεπτά, 40 κύκλοι 95 μοιρών (20 δευτερόλεπτα), ανόπτηση στους 58 βαθμούς για 25 δευτερόλεπτα. , και σύρετε προς τα κάτω στις 72 μοίρες για 35 δευτερόλεπτα. Η παρακολούθηση του φθορίζοντος προϊόντος πραγματοποιήθηκε για μεγάλο χρονικό διάστημα στους 72 βαθμούς.

Λογισμικό ανάλυσης γονιδίου ρότορα (Corbett Research) χρησιμοποιήθηκε για την τυποποίηση του γονιδίου νοικοκυριού GAPDH και την ποσοτικοποίηση της σχετικής γονιδιακής έκφρασης. Όλες οι αλληλουχίες εκκινητών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Χρώση Nissl
Οι εγκέφαλοι αρουραίου παρασκευάστηκαν σε φέτες 28 ημέρες μετά την επέμβαση όπως περιγράφεται παραπάνω για ανοσοϊστοχημεία. Κάθε εγκέφαλος τεμαχίστηκε διαδοχικά και επιλέχθηκαν τρία παρόμοια τμήματα του εγκεφάλου για χρώση Nissl.

Χρησιμοποιώντας μια κάμερα ψηφιακού μικροσκοπίου Nikon C1 (Nikon Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία), καταγράφηκαν τυπικές μικροφωτογραφίες του ιππόκαμπου CA1, CA3 και DGareas. Πολλά κελιά που μετρήθηκαν σε κάθε ένα από τα τρία τμήματα εκτελέστηκαν με τυφλό τρόπο χρησιμοποιώντας το λογισμικόImageJ.

Τεστ συμπεριφοράς

Οι αρουραίοι απογαλακτίστηκαν σε 3 εβδομάδες, χωρίστηκαν σε τρεις έως πέντε ομάδες και κρατήθηκαν σε κλουβιά σύμφωνα με την ανάθεση της ομάδας. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές συμπεριφοράς σε αρουραίους P28-P33 (δηλαδή 21-26 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση), όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Wang et al., 2019a ) αλλά με μια μικρή τροποποίηση. Για να αποκλειστεί η επίδραση του κύκλου του οίστρου στη συμπεριφορά των τρωκτικών, δοκιμάστηκαν μόνο αρσενικοί αρουραίοι.

Λαβύρινθος νερού Morris

Η δοκιμή λαβύρινθου νερού Morris χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των ικανοτήτων χωρικής μάθησης και μνήμης των αρουραίων P28-P33 (Wang et al., 2019a).

Οι δοκιμές αποτελούνταν από δύο φάσεις, συμπεριλαμβανομένου του τμήματος εκπαίδευσης και της δοκιμής χωρικής αναζήτησης. Για 5 συνεχόμενες ημέρες, υλοποιούνταν τμήματα τεσσάρων προπονήσεων καθημερινά με έναρξη στις 8:00π.μ. Για δοκιμές ανίχνευσης πλατφόρμας, 10 αρουραίοι από κάθε ομάδα τοποθετήθηκαν ξεχωριστά στο νερό σε διάφορες τοποθεσίες, στοχαστικά, απέναντι από τον τοίχο της πισίνας.

Εάν ένας αρουραίος ανίχνευε επιτυχώς την πλατφόρμα εντός 90 δευτερολέπτων, αναγκαζόταν να μείνει στην πλατφόρμα για 20 δευτερόλεπτα και ο χρόνος που χρειαζόταν για την ανίχνευση της πλατφόρμας καταγραφόταν ως λανθάνουσα κατάσταση διαφυγής. Κάθε γύρος δοκιμής ήταν 90 δευτερόλεπτα και η καθυστέρηση διαφυγής μετρήθηκε ως ο χρόνος από την τοποθέτηση του αρουραίου στο νερό μέχρι την επιτυχή επιβίβαση στην πλατφόρμα.

Εάν ο αρουραίος απέτυχε να βρει την πλατφόρμα εντός 90 δευτερολέπτων, η εγγραφή σταματούσε και πραγματοποιούνταν καθοδήγηση εκμάθησης και μνήμης (ο πειραματιστής χρησιμοποίησε μια μακριά ράβδο για να καθοδηγήσει τον αρουραίο στην πλατφόρμα και τους επέτρεψε να μείνουν στην πλατφόρμα για 20 δευτερόλεπτα για να μάθουν). Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, η καθυστέρηση διαφυγής των αρουραίων που δεν κατάφεραν να εισέλθουν στη σκηνή καταγράφηκε ως 90 δευτερόλεπτα.

Στη δοκιμή χωρικής ανίχνευσης που εφαρμόστηκε την έκτη ημέρα της δοκιμής, η πλατφόρμα αφαιρέθηκε και ο αρουραίος τοποθετήθηκε στο αντίθετο τεταρτημόριο και του επετράπη να κολυμπήσει για 90 δευτερόλεπτα. Η ταχύτητα της κολύμβησης, η καθυστέρηση διαφυγής και ο αριθμός των φορών που διέσχισαν το μέρος όπου βρισκόταν προηγουμένως η πλατφόρμα καταγράφηκαν από το σύστημα παρακολούθησης βίντεο (Shanghai MobileDatum Ltd., Σαγκάη, Κίνα).

Δοκιμή ανάρτησης

Η δοκιμή εναιώρησης πραγματοποιήθηκε σε αρουραίους P28–P32 για να αξιολογηθεί η κινητική τους λειτουργία, ξεκινώντας στις 3 μ.μ. κάθε μέρα. Το οριζόντιο πλαστικό σχοινί με διάμετρο 0,5 cm τοποθετήθηκε σε απόσταση 45 cm από το έδαφος και οι αρουραίοι οδηγήθηκαν να κρατήσουν το πλαστικό σχοινί και με τα δύο άνω άκρα, οπότε ο χρόνος μέχρι την πτώση του αρουραίου μετρήθηκε ως λανθάνουσα κατάσταση αναστολής. Η δοκιμή έληξε εάν: (i) ο αρουραίος έπεσε. (ii) η αναστολή ήταν μεγαλύτερη από 60 δευτερόλεπτα. ή (iii) το σχοινί πιάστηκε από πίσω άκρα.

Δοκιμή ανοιχτού πεδίου

Πραγματοποιήθηκε δοκιμή ανοιχτού πεδίου σε αρουραίους P28 χρησιμοποιώντας εξωτερικό εξοπλισμό που αποτελείται από ένα κουτί από πλεξιγκλάς (100 cm × 100 cm· Borj Sanat, Τεχεράνη, Ιράν) που περιβάλλεται από έναν τοίχο ύψους 45- cm, με ένα πάτωμα χωρισμένο σε 16 τετράγωνα. Η κεντρική περιοχή ήταν η περιοχή 50 cm × 50 cm στο κέντρο της αρένας. Κάθε αρουραίος τοποθετήθηκε ξεχωριστά στο κέντρο της αρένας και του επιτράπηκε να εξερευνήσει χωρίς περιορισμούς για 10 λεπτά.

Ένα σύστημα παρακολούθησης βίντεο (Borj Sanat) χρησιμοποιήθηκε για την καταγραφή και ανάλυση του συνολικού (ως δείκτης δραστηριότητας άσκησης) και του χρόνου που αφιερώθηκε στην κεντρική περιοχή (ως δείκτης της συμπεριφοράς άγχους) (Zhai etal., 2019).

Χρώση Golgi

Μετά την ολοκλήρωση της δοκιμής συμπεριφοράς (δηλαδή 26 ημέρες μετά την επέμβαση), πέντε αρουραίοι επιλέχθηκαν τυχαία από κάθε ομάδα. Η χρώση Golgi πραγματοποιήθηκε σε παγωμένες τομές εγκεφάλου πάχους 150-μm χρησιμοποιώντας κιτ χρώσης FD Rapid Golgi (FDNeuroTechnologies, Columbia, MD, ΗΠΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Το λογισμικό ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της πυκνότητας της σπονδυλικής στήλης (αριθμός σπονδυλικής στήλης ανά 10 μm) κάθε νευρώνα. Οι σπονδυλικές στήλες μετρήθηκαν σε δύο ή τρία τμήματα δευτερογενούς δενδρίτη.

Στατιστική ανάλυση

Το SPSS 17.0 για Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων, τα οποία εμφανίζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Το τεστ Shapiro-Wilk χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η υπόθεση της κανονικότητας μεταξύ όλων των συνεχών μεταβλητών. Επιπλέον, η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από πολλαπλές δοκιμές σύγκρισης Tukey'spost hoc προσεγγίστηκε σε astring πειραμάτων.

Εάν τα δεδομένα απέτυχαν να ικανοποιήσουν την υπόθεση της κανονικότητας, η δοκιμή Kruskal-Wallis H ή Mann-Whitney Utest ολοκληρώθηκε χωριστά. Η καθυστέρηση διαφυγής αναλύθηκε με βάση την αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης για επαναληπτικές μετρήσεις. Οι τιμές P < 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Η SPC βελτιώνει την απώλεια νευρωνικών κυττάρων του ιππόκαμπου

Ο ιππόκαμπος, συμπεριλαμβανομένων των τριών περιοχών που εξετάστηκαν, σχετίζεται με τη μάθηση και τη μνήμη (Jung et al., 2020). Μετά τη συμπεριφορά των δοκιμών, πραγματοποιήθηκε χρώση Nissl για να εξεταστεί η αρχιτεκτονική του ιππόκαμπου.

Στην ομάδα HI, η βιώσιμη νευρωνική πυκνότητα μειώθηκε σε σύγκριση με την εικονική ομάδα. Ωστόσο, ο αριθμός των νευρώνων αυξήθηκε σε ζώα που εκτέθηκαν σε SPC. αυτό το αποτέλεσμα αντιστράφηκε από το YC-1, το οποίο μείωσε την πυκνότητα των νευρώνων (Εικόνα 1Α). Αυτό το φαινόμενο παρατηρήθηκε στις περιοχές CA1, CA3 και DG του ιππόκαμπου (P< 0.05; Figure 1B–D).

Η SPC βελτιώνει και μειώνει την πυκνότητα της δενδριτικής σπονδυλικής στήλης στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου

Η χρώση Golgi χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πυραμιδικής νευρωναλδενδριτικής πυκνότητας της σπονδυλικής στήλης CA1 (Εικόνα 2Α). Επειδή τα μεγέθη των αγκάθων ποικίλλουν πολύ (π.χ. διακλαδισμένοι δενδρίτες, λεπτοί ή με μανιτάρια), προσδιορίσαμε μόνο ότι η πυκνότητα των δενδριτικών αγκάθων αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα HIS σε σύγκριση με την ομάδα ΗΙ (P < 0).{{6 }}5), ενώ η πυκνότητα των δενδριτικών σπονδύλων μειώθηκε στην ομάδα HIS + YC-1 σε σύγκριση με την ομάδα HIS (P < 0,01; Εικόνα 2Β).
Η SPC βελτιώνει την έκφραση PSD95 και GAP43 στον ιππόκαμπο

Αξιολογήσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών GAP43 και PSD95 που σχετίζονται με τη σύναψη για να προσδιορίσουμε εάν αναστέλλονταν από γλοιακές ουλές. Το HI μείωσε σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης PSD95 (P < 0.01) και GAP43 (P <0,05) σε σύγκριση με την ομάδα shamgroup (Εικόνα 2C–E). Σε σύγκριση με την ομάδα HIS, τα επίπεδα έκφρασης των PSD95 και GAP43 μειώθηκαν σημαντικά μετά την έγχυση YC-1.

Σχηματισμός αστρογλοίωσης και γλοιακών ουλών καταστρέφουν την αρχιτεκτονική του ιππόκαμπου μετά από HI

Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να επαληθεύσουμε εάν το σεβοφλουράνιο βελτίωσε τη λειτουργία μάθησης και μνήμης προστατεύοντας την αρχιτεκτονική του ιππόκαμπου και μετριάζοντας την αστρογλοίωση. Η νεογνική νευρωνική απόπτωση στον ιππόκαμπο που προκαλείται από HIE, καθώς και αντιδραστική αστρογλοίωση στην περιοχή του εμφράγματος που στη συνέχεια εξελίσσεται σε γλοιακή ουλή (Rolls et al., 2009).

Στην ομάδα HI, οι πυραμιδικές στιβάδες CA1 και CA3 και η περιοχή DG παρουσίασαν προφανείς μειώσεις στους νευρώνες (P < 0.01, P < 0.001; Εικόνες 3E και 4C), καθώς και αυξημένος αριθμός αστροκυττάρων με ευδιάκριτες μορφολογικές αλλαγές (P < 0,001; Σχήματα 3C και 4B). Αξιολογήσαμε την έκφραση του GFAP και του NeuN στις τρεις περιοχές του αριστερού ιππόκαμπου χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και ανάλυση Western blotting.

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε σύγκριση με την εικονική ομάδα, τα αστροκύτταρα ενεργοποιήθηκαν στην ομάδα HI, εισήχθησαν στο πυραμιδικό στρώμα CA1 (Εικόνα 4Α) και CA3 (Εικόνα 3Α) και περιέβαλαν νευρώνες στο DG (Εικόνα 3Β). Η υπερβολική αστρογλοίωση οδήγησε σε περαιτέρω επέκταση των νευρογλοιακών διεργασιών προς τις φυσιολογικές νευρωνικές δομές, σχηματίζοντας ένα ανώμαλο δίκτυο αστροκυττάρων που μοιάζει με τοίχωμα (Εικόνες 3Α, Β και 4Α).

Επιπλέον, η ανοσοαντιδραστικότητα GFAP (Εικόνες 3C, D και 4B, E) και τα επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκαν (P < 0.01; Εικόνα 4Ε), ενώ η ανοσοαντιδραστικότητα NeuN μειώθηκε (P < {{7} }.01 ή Ρ < 0.001. Σχήματα 3Ε, ΣΤ και 4Γ).

Τα αποτελέσματα του ανοσοφθορισμού διπλής επισήμανσης αποκάλυψαν αξιοσημείωτες διαφορές στην ένταση φθορισμού της ανοσοχρώσης neurocan+/GFAP+ μεταξύ HI και εικονικών ομάδων (P < 0.001, P < 0,05, P <0,01; Εικόνες 5G, H και 6D), σύμφωνα με τα αποτελέσματα western blot (P< 0.01; Figure 6F).

Η SPC εξασθενεί την αστρογλοίωση και τον σχηματισμό γλοιακών ουλών στον ιππόκαμπο

Στη συνέχεια, η μελέτη μας διερεύνησε εάν η SPC εξασθένησε τη γλοιακή ουλή. Σε σύγκριση με την ομάδα HI, η ανοσοαντιδραστικότητα του GFAP (Εικόνες 5C, D, και 6C) και των νευροκανών (Εικόνες 5E, F, και 6B) στην ομάδα HIS ήταν σημαντικά μειωμένη στον ιππόκαμπο (P < 0).{{6} }1 ή P < 0,001).

Αντίθετα, η έκφραση GFAP και neurocan στην ομάδα HIS + YC-1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με την ομάδα HIS και δεν διέφερε από τις ομάδες HIS + YC-1 και HI (P > 0.05; Εικόνα 6Ε και ΣΤ).

Επιπλέον, η ανοσοθετικότητα NeuN ρυθμίστηκε προς τα πάνω και οι δομές εμφανίστηκαν πιο τακτικές στην ομάδα HIS σε σύγκριση με την ομάδα HI, η οποία αντιστράφηκε από το YC-1 (Εικόνες 3E, F και 4C).

For more information:1950477648nn@gmail.com