Σύντομη εισπνοή σεβοφλουρανίου μπορεί να μειώσει τον σχηματισμό γλοιακής ουλής μετά από υποξικό-ισχαιμικό τραυματισμό του εγκεφάλου σε νεογνικούς αρουραίους Μέρος 1

Αφηρημένη

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η μεταρρύθμιση του σεβοφλουρανίου μπορεί να προσφέρει νευροπροστασία μετά από υποξικό-ισχαιμικό τραυματισμό και να βελτιώσει τη λειτουργία μάθησης και μνήμης σε αναπτυσσόμενους εγκεφάλους τρωκτικών.

Η υποξική-ισχαιμική βλάβη αναφέρεται σε μια παθολογική κατάσταση που προκαλείται από εγκεφαλική ισχαιμία, υποξία, μεταβολική διαταραχή και βλάβη των νευρικών κυττάρων λόγω διαταραχών του καρδιαγγειακού και του εγκεφαλοαγγειακού συστήματος. Με την κοινωνική πρόοδο και τις αλλαγές στον τρόπο ζωής, ο υποξικός-ισχαιμικός τραυματισμός γίνεται όλο και πιο συχνός. Αυτή η κατάσταση μπορεί να προκαλέσει πολλές βλάβες στην ανθρώπινη υγεία, συμπεριλαμβανομένης της νοημοσύνης και της μνήμης κάποιου.

Αν και η υποξία και η ισχαιμία μπορεί να προκαλέσουν μείωση της εγκεφαλικής λειτουργίας, αυτό δεν σημαίνει ότι η μνήμη θα επηρεαστεί αρνητικά. Αντίθετα, μπορούμε να βελτιώσουμε τη μνήμη και να αυξήσουμε την αποτελεσματικότητα του εγκεφάλου με τις σωστές μεθόδους. Ακολουθούν μερικοί τρόποι για να βελτιώσετε τη μνήμη σας:

1. Υγιεινή διατροφή: Η επίδραση της διατροφής στη μνήμη είναι πολύ σημαντική. Τροφές πλούσιες σε πρωτεΐνες, βιταμίνες και μέταλλα μπορούν να βοηθήσουν στη διατήρηση ενός υγιούς νευρικού συστήματος και της λειτουργίας της σκέψης.

2. Ασκηθείτε περισσότερο: Η σωματική άσκηση μπορεί να προωθήσει την κυκλοφορία του αίματος, να αυξήσει τη ροή οξυγόνου, να ενισχύσει την ανοσία του σώματος και να μειώσει τον κίνδυνο ασθενειών. Μέσω της άσκησης, μπορείτε να βελτιώσετε την ικανότητα μνήμης σας.

3. Ενισχύστε την αυτοπεποίθηση: Η αυτοπεποίθηση είναι σημαντικός παράγοντας στη μνήμη ενός ατόμου. Εάν πιστεύετε ότι μπορείτε να ολοκληρώσετε μια συγκεκριμένη εργασία, θα επιτύχετε εύκολα τα αποτελέσματα που θέλετε και μπορείτε επίσης να βελτιώσετε αποτελεσματικά τη μνήμη σας.

Μπορεί να φανεί ότι η υποξική-ισχαιμική βλάβη δεν είναι μια κατάσταση που θα βλάψει αναπόφευκτα την ανθρώπινη μνήμη. Εφόσον κυριαρχούμε στις σωστές μεθόδους και φροντίζουμε καλά τον εγκέφαλό μας, μπορούμε να αγκαλιάσουμε ένα υγιές μέλλον με θετική στάση. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό που έχει πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του Cistanche deserticola προέρχεται από τα πολλαπλά ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου μέσω ποικίλων οδών.

Κάντε κλικ στο Μάθετε 10 τρόπους για να βελτιώσετε τη μνήμη

Το κλασικό μοντέλο Rice-Vannucci χρησιμοποιήθηκε για την πρόκληση υποξικού-ισχαιμικού τραυματισμού και οι νεογέννητοι (μεταγεννητική ημέρα 7) αρουραίοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,4% σεβοφλουράνιο για 30 λεπτά μετά από υποξικό-ισχαιμικό τραυματισμό.

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η μετεγκατάσταση σεβοφλουρανίου βελτίωσε σημαντικά τη λειτουργία μάθησης και μνήμης των αρουραίων, μείωσε την αστρογλοίωση και τον σχηματισμό γλοιακής ουλής, αύξησε τον αριθμό των δενδριτικών σπονδυλικών οστών και προστάτευσε την ιστομορφολογία του ιππόκαμπου. Μηχανιστικά, η sevofluranepconditioning μείωσε την έκφραση του von Hippel-Lindau του επαγόμενου από υποξία παράγοντα-1 και αύξησε την έκφραση του DJ-1.

Η έγχυση 1,52 ug του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα-1 αναστολέα YC-1 (Lificiguat) στην αριστερή πλάγια κοιλία 30 λεπτά πριν από τον υποξικό-ισχαιμικό τραυματισμό ανέστρεψε τη νευροπροστασία που προκλήθηκε από το σεβοφλουράνιο. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι το σεβοφλουράνιο μπορεί να ανακουφίσει αποτελεσματικά την αστρογλοίωση στον ιππόκαμπο και να μειώσει τις βλάβες μάθησης και μνήμης που προκαλούνται από το σχηματισμό γλοιακής ουλής μετά από υποξικό-ισχαιμικό τραυματισμό.

Ο υποκείμενος μηχανισμός μπορεί να σχετίζεται με τη ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση του DJ-1, τη μειωμένη ουβικουϊτινίωση του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα-1 και τη σταθεροποιημένη έκφραση του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα-1. Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Εργαστηριακής Φροντίδας Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Κίνας (αριθμός έγκρισης 2016PS337K) στις 9 Νοεμβρίου 2016.

Λέξεις κλειδιά: εγκεφαλική βλάβη; εγκέφαλος; κεντρικό νευρικό σύστημα; in vivo; βλάβη; μοντέλο; πλαστικότητα; αρουραίος; ανάκτηση; αναγέννηση; επισκευή Κινεζική Βιβλιοθήκη Αρ. ταξινόμησης R453; R741; R614.2+1.

Εισαγωγή

Η νεογνική υποξική-ισχαιμική εγκεφαλοπάθεια (HIE) είναι μια συχνή επιπλοκή στη νεογνική περίοδο που προκαλείται από πολλούς παράγοντες, όπως η νεογνική ασφυξία, η ενδομήτρια δυσφορία και η νόσος της υαλινομεμβράνης (Douglas-Escobar and Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

Το HIE είναι η κύρια αιτία βρεφικών θανάτων και η κύρια πηγή νευρολογικών επακόλουθων (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). Το ενενήντα τοις εκατό των επιζώντων από HIE έχουν μακροχρόνια νευρολογική δυσλειτουργία, όπως μαθησιακές, γνωστικές και κινητικές δυσλειτουργίες, και επιληψία (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Η τρέχουσα θεραπεία του HIE επικεντρώνεται κυρίως στη συμπτωματική θεραπεία, συμπεριλαμβανομένου του μηχανικού αερισμού, της διόρθωσης της υπότασης, της συμπλήρωσης γλυκόζης και του περιορισμού της πρόσληψης υγρών, όπως ενδείκνυται.

Ωστόσο, απαιτείται μια αποτελεσματική θεραπεία ικανή να αναστρέψει ή να μειώσει τη μακροχρόνια εγκεφαλική βλάβη (Stankowski and Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Ως βασικό μέρος της μάθησης και της αναγνώρισης, ο ιππόκαμπος, συμπεριλαμβανομένης της οδοντωτής έλικας (DG) , περιοχές CA1 και CA3, συμμετέχει στον μετασχηματισμό και την ενσωμάτωση περιφερειακών πληροφοριών σε νευρικά κέντρα (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Ο ιππόκαμπος είναι υπερευαίσθητος στην υποξική-ισχαιμική (HI) βλάβη, η οποία μπορεί να προκαλέσει απόπτωση των ιπποκαμπαλνευρώνων, να διεγείρει την υπερβολική αντιδραστική γλοίωση και να οδηγήσει σε σχηματισμό γλοιακής ουλής (Hopkins and Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Ο πολλαπλασιασμός των αστροκυττάρων είναι ζωτικής σημασίας για τη σφράγιση της θέσης του εμφράγματος, την αναδιαμόρφωση της δομής του ιππόκαμπου και τον προσωρινό έλεγχο των τοπικών ανοσολογικών αποκρίσεων κατά την οξεία φάση (Rolls et al., 2009).

Ωστόσο, ο σχηματισμός υπερτροφίας και γλοιακής ουλής συμβάλλει στην ανώμαλη νευρογένεση, εμποδίζει την ανάπτυξη της δενδριτικής σπονδυλικής στήλης και παρεμποδίζει το σχήμα των συνάψεων, μειώνοντας περαιτέρω τις λειτουργίες μάθησης και αναγνώρισης (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda and Sofroniew, 2014; , 2014, Shi et al., 2017).

Η γλοιακή ινιδιακή όξινη πρωτεΐνη (GFAP) και οι πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης, όπως η νευροκάνη, είναι παθολογικοί δείκτες της αστρογλοίωσης και της γλοιακής ουλής των οποίων η έκφραση μπορεί να ρυθμιστεί προς τα πάνω από πολύ ενεργοποιημένα αστροκύτταρα (Pekny and Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 201). Έτσι, η αναστολή της αστρογλοίωσης και της γλοιακής ουλής μπορεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος για το HIE και τα μακροπρόθεσμα νευρολογικά του επακόλουθα.

Η εφαρμογή του σεβοφλουρανίου έχει αποδειχθεί ότι μετριάζει τον τραυματισμό του HI σε τρωκτικά. Μελέτες που διερευνούν τη σημασία του σεβοφλουρανίου μετά την προετοιμασία (SPC) για την ανακούφιση της βλάβης του HI μέσω της αύξησης της ρύθμισης του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) σε ενήλικα τρωκτικά και νεογνούς αρουραίους έχουν εντοπίσει αρκετούς πιθανούς μηχανισμούς (Wang et al., 2019b; Yanget al., 2019, Du et al., 2020, Liu and Gong, 2020).

Ως βασικός φυσιολογικός αισθητήρας της υποξίας, ο HIF-1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας με εκατοντάδες κατάντη μόρια που εμπλέκονται σε μηχανισμούς ισχαιμικής ανοχής, όπως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας και η ερυθροποιητίνη (Na et al., 2015). Η υποξική μετά την προετοιμασία έχει επαληθευτεί ότι μειώνει την ενεργοποίηση αστροκυττάρων και μικρογλοίων μετά από HI σε εγκεφάλους νεογνών αρουραίων (Teo et al., 2015).

Επομένως, υποθέσαμε ότι το HIF-1 μπορεί να συμβάλλει στην εξασθένιση του σχηματισμού γλοιακών ουλών και αστρογλοίωσης. Το HIF-1 μπορεί να υπάρχει συστατικά σε νευρώνες, με αποτέλεσμα να αυξάνεται γρήγορα η έκφραση και να συσσωρεύεται υπό συνθήκες υποξίας. Ωστόσο, όταν το οξυγόνο επανέρχεται στο φυσιολογικό, η έκφραση του HIF1 δεν μπορεί να διατηρηθεί σε αρκετά υψηλό επίπεδο ώστε να ασκεί συνεχώς νευροπροστατευτική δράση λόγω της οξυγονοεξαρτώμενης αποικοδόμησης από τις πρωτεΐνες προλυλ-υδροξυλάσης και την επακόλουθη ουβικιυλίωση από τις πρωτεΐνες von Hippel-Lindau (VHL) (Berra et al., 2003; Zhang et al., 2018).

Η DJ-1 (κωδικοποιημένη από το Park7) αναφέρεται ότι είναι μια νευροπροστατευτική πρωτεΐνη, ειδικά υπό οξειδωτικές συνθήκες (Aleyasin et al., 2007, 2010). Η πρωτεΐνη VHL αλληλεπιδρά φυσικά με τον DJ-1, όπως προσδιορίζεται από μια αμερόληπτη οθόνη φασματομετρίας μάζας και επιβεβαιώθηκε στο μοντέλο της νόσου του Πάρκινσον (PD). Επιπλέον, οι Parsanejad et al. (2014) έδειξαν ότι ο DJ-1 αναστέλλει την εξαρτώμενη από το VHL ubiquitylation και σταθεροποιεί την έκφραση HIF-1.

Έτσι, υποθέσαμε ότι το σεβοφλουράνιο σταθεροποιεί την πρωτεΐνη HIF-1 στον ιππόκαμπο ρυθμίζοντας προς τα πάνω τον DJ-1 για να αναστέλλει την ουβικιυλίωση του HIF-1, βελτιώνοντας έτσι τη μακροπρόθεσμη μάθηση και τη λειτουργία της μνήμης.

Για να διερευνήσουμε τον ρόλο του HIF-1 στη σχέση μεταξύ σεβοφλουρανίου και αστρογλοίωσης, χρησιμοποιήσαμε το YC-1 (Lificiguat), τον επιλεκτικό ανταγωνιστή του HIF-1, για να αναστείλουμε πλήρως την έκφραση του HIF-1 σε το μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον ρόλο του HIF-1a στη νευροπροστασία νεογνών αρουραίων HIE που έλαβαν SPC.

Υλικά και μέθοδοι

Των ζώων
Πραγματοποιήθηκε έρευνα σε ζώα στο συναπτικό στάδιο της ανάπτυξης αρουραίων, το οποίο ξεκινά την 7η μεταγεννητική ημέρα (P7), που αντιστοιχεί στην περίοδο ανάπτυξης των ανθρώπινων βρεφών από την ύστερη εγκυμοσύνη έως τα 3 χρόνια μετά τη γέννηση (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Επιλέχθηκαν επίμυες Sprague-Dawley ηλικίας επτά ημερών με βάρος 12–16 g από 20 έγκυους αρουραίους (αγορασμένοι από το Laboratory of Shengjing Hospital, China Medical University, Κίνα, αναλογία αρσενικών/θηλυκών, 1:1).

Όλοι οι αρουραίοι μπόρεσαν να έχουν πρόσβαση στο νερό και την τροφή ελεύθερα και διατηρήθηκαν σε τυπική υγρασία και θερμοκρασία στο εργαστήριο, με κύκλους 12-ώρας φωτός/σκότους (8 π.μ./8 μ.μ.). Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (Bethesda, MD, ΗΠΑ).

Η Επιτροπή Εργαστηριακής Φροντίδας Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Κίνας ενέκρινε επίσημα τα πειράματα που περιγράφηκαν (Shenyang, Κίνα; Αρ. έγκρισης 2016PS337K) στις 9 Νοεμβρίου 2016.

Από 25 έγκυους αρουραίους, επιλέχθηκαν 249 αρουραίοι P7 και χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες με βάση έναν πίνακα τυχαίων αριθμών (Wang etal., 2019a). Η τελική μας ανάλυση περιελάμβανε συνολικά 201 νεογνά. το ποσοστό θνησιμότητας μετά από θεραπεία με ΗΙ ήταν 19%.

Αυτοί οι 201 νεογέννητοι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες: εικονικό (n=54), HI (n=54), HI + σεβοφλουράνιο (HIS) (n=54) και HIS+ YC{{ 6}} (n=39) ομάδες. Σε κάθε ομάδα, 24 αρουραίοι χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασία forwestern blot, 5 χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία και χρώση Golgi και 10 χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμές συμπεριφοράς. Οι υπόλοιποι 45 αρουραίοι σε ομάδες εικονικής, HI και HIS χρησιμοποιήθηκαν για αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT- PCR).

Πειραματικός σχεδιασμός και έκθεση σε αναισθητικό

Το χρησιμοποιούμενο μοντέλο HIE περιγράφηκε προηγουμένως (Zhao etal., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Με βάση την απόσταση μεταξύ του πρωκτού και των αναπαραγωγικών οργάνων, ολοκληρώθηκε ο προσδιορισμός φύλου των μεταγεννητικών αρουραίων. Για να καθιερωθεί το μοντέλο HIE, το κεφάλι κάθε αρουραίου P7 τοποθετήθηκε σε έναν διαφανή πλαστικό σωλήνα, ο οποίος σφραγίστηκε με βαμβάκι πριν απελευθερωθεί το sevoflurane (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Η αριστερή κοινή καρωτιδική αρτηρία κάθε αρουραίου απολινώθηκε μόνιμα και μεταξύ των δύο απολινώσεων, η αρτηρία κόπηκε. κάθε χειρουργική επέμβαση ολοκληρώθηκε μέσα σε 5 λεπτά. Στη συνέχεια, οι αρουραίοι ξύπνησαν ανεπηρέαστοι από αναισθησία και τοποθετήθηκαν ξανά στα κλουβιά των μητέρων τους για 2 ώρες. Για τη χορήγηση της SPC, οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ένα διαφανές θάλαμο (Lingzhi Company, Hangzhou, Κίνα) συνδεδεμένο με ατμοποιητή ασεβοφλουράνης. Ο ένας αγωγός βοηθούσε στον αερισμό, ενώ ο άλλος μετέφερε το δείγμα αερίου έξω από το θάλαμο στην οθόνη.

Ο θάλαμος αερίστηκε με 30% Ο2 και 70% Ν2 για 2 ώρες για την εικονική ομάδα, ενώ 8% Ο2 και 92% Ν2 χορηγήθηκαν για 2 ώρες στην ομάδα ΗΙ. Η SPC ορίστηκε αμέσως μετά το HI: 2,4% σεβοφλουράνιο (1 ελάχιστη κυψελιδική συγκέντρωση) εισπνέεται από αρουραίους στον θάλαμο με αναατμόσφαιρα 30% O2 και 70% N2 και ρυθμό ροής αέρα 2 L/min για 30 λεπτά. Η θερμαντική πισίνα σταθεροποίησε τη θερμοκρασία στο εσωτερικό του θαλάμου στους 37 βαθμούς.

Χορήγηση φαρμάκου

Ακριβώς 30 λεπτά πριν από το HI, 1,52 ug αναστολέα HIF-1 (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) εγχύθηκαν στην αριστερή πλάγια κοιλία (Paxinos and Franklin, 2013) χρησιμοποιώντας μια 5-σύριγγα μLHamilton (Yingweida Technology, Πεκίνο, Κίνα). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, το YC-1 διαλύθηκε σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό σε συγκέντρωση 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Ανάλυση Western blot

Οι αρουραίοι Ρ7 αναισθητοποιήθηκαν με 2% σεβοφλουράνιο και οι ιστοί του ιππόκαμπου εξήχθησαν από νεογνά στις 12, 24 και 48 ώρες και 28 ημέρες μετά την επέμβαση. Μετά την εκχύλιση, οι ιστοί τοποθετήθηκαν αμέσως σε πάγο.

Οι ολικές υπερκείμενες πρωτεΐνες απομονώθηκαν με την προσθήκη ενός αναλυτή ραδιο-ανοσοκαθίζησης (Beyotime, Haimen, China). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ένα κιτ One BCA (Beyotime).

Στη συνέχεια, τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε γέλες δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου 12,5% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (Sigma-Aldrich) στους 4 βαθμούς, η μεμβράνη επωάστηκε με τα κατάλληλα πρωτογενή αντισώματα, συμπεριλαμβανομένης της αντι-γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; Technology CellSignal , Danvers, MA, ΗΠΑ), anti-DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), anti-VHL (1:5000;polyclonal; Cat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900; πολυκλωνικό; Cat# ab2185; Abcam), αντινευροκανικό (1:200; μονοκλωνικό; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Ντάλας, Τέξας, ΗΠΑ) , πρωτεΐνη αντι-μετασυναπτικής πυκνότητας 95 (PSD95; 1:1000; monoclonal; Cat. No 3409S; Cell Signaling Technology), σχετιζόμενη με την ανάπτυξη πρωτεΐνη 43 (GAP43; 1:2000; polyclonal; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Bichnology , Σικάγο, IL, ΗΠΑ) και αντι-GFAP (1:5000, πολυκλωνικό, Cat# ab53554; Abcam).

Στη συνέχεια, οι κηλίδες επωάστηκαν με IgG αντι-κουνελιού (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Πεκίνο, Κίνα) πορτοκαλί IgG ποντικού (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου.

Οι κηλίδες πρωτεΐνης εμφανίστηκαν με αντιδραστήρια ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA). Οι ζώνες πρωτεϊνών ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό ImageJ (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας). Για ανάλυση των κηλίδων western, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε GAPDH.

Ανοσοϊστοχημεία

Είκοσι οκτώ ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση, στους αρουραίους χορηγήθηκε αναισθητικό χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε παραπάνω, εγχύθηκε με 4% φορμαλίνη και οι εγκέφαλοί τους αφαιρέθηκαν για χρώση ανοσοφθορισμού.

Οι εγκέφαλοι βυθίστηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη στους 4 βαθμούς για 48 ώρες, στη συνέχεια αφυδατώθηκαν σε μια σειρά διαβαθμισμένης αιθανόλης και τελικά ενσωματωμένη παραφίνη. Στη συνέχεια, οι ιστοί ενσωματωμένοι σε παραφίνη κόπηκαν σε τμήματα πάχους 2.5-μm με δονητή και τα προκύπτοντα τμήματα αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου.

Κάθε εγκέφαλος τεμαχίστηκε συνεχώς και επιλέχθηκαν τρεις ασυνεχείς εγκεφαλικές τομές για χρώση NeuN (δείκτης νευρώνων), GFAP (δείκτης αστροκυττάρων) και νευροκάνιο (δείκτης γλοιακής ουλής). GFAP(1:250; πολυκλωνικό; Cat# ab53554; Abcam), αντιγόνα κουνελιού (1:100; Cat# 12943; Τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης) και/ή αντινευροκανικό ποντικού (1:200; μονοκλωνικό; Cat# sc{{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) στους 4 βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας σε έναν υγροποιημένο θάλαμο.

Στη συνέχεια, οι τομές πλύθηκαν με 0.1 αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά και επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένου IgG κατά κουνελιού συζευγμένο με Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη, Η.Π.Α.), IgG αντι-ποντικιού συζευγμένο με Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies) και IgG αντι-κατσίκας συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (1:200; Life Technologies).

Η αντιχρώση των κυτταρικών πυρήνων πραγματοποιήθηκε με 4′,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (Beyotime) για 5 λεπτά.

Ένα μικροσκόπιο Olympus BX51 (OlympusCorporation, Τόκιο, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση των χρωματισμένων τομών. Τρία οπτικά πεδία του αριστερού ιππόκαμπου επιλέχθηκαν τυχαία από κάθε τομή για φωτογράφιση. Το λογισμικό ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του ποσοτικού εντοπισμού και, επομένως, για τον υπολογισμό του συντελεστή επικάλυψης του Manders.

For more information:1950477648nn@gmail.com