Η αποκυνίνη Βελτιώνει τη βλάβη των όρχεων που προκαλείται από γλουταμινικό μονονάτριο από μειωμένο φραγμό αίματος στους όρχεις και παραμέτρους οξειδωτικού στρεςⅠ

Αφηρημένη:

Ιστορικό: Αυτή η μελέτη στόχευε στη διερεύνηση των επιδράσεων της αποκυνίνης (APO) στα επίπεδα ορμονών, στον φραγμό του αίματος-όρχει και στους οξειδωτικούς βιοδείκτες στον εκφυλισμό των όρχεων που προκαλείται από γλουταμινικό νάτριο (MSG). Μέθοδοι: Αρσενικοί αρουραίοι Sprague Dawley (150-200 g, n=32) κατανεμήθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες: έλεγχος, APO, MSG και MSG συν APO. Στις ομάδες MSG και MSG συν APO χορηγήθηκε MSG (120 mg/kg) για 28 ημέρες.

Κάντε κλικ στο cistanche herba για τεστοστερόνη

Επιπλέον, οι ομάδες APO και MSG συν APO έλαβαν APO (25 mg/kg) κατά τις τελευταίες πέντε ημέρες του πειράματος. Όλες οι χορηγήσεις έγιναν μέσω καθετήρα από το στόμα. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές αναλύσεις με βάση τον προσδιορισμό της τεστοστερόνης, της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH), της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH), της μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), της γλουταθειόνης (GSH) και της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), καθώς και του φωτός και της μετάδοσης Αξιολογήθηκαν οι ηλεκτρονικές μικροσκοπικές εξετάσεις, η αξιολόγηση των παραμέτρων του σπέρματος, η ανοσοϊστοχημεία ZO-1, ocludin, NOX-2 και TUNEL.

Αποτελέσματα: Το MSG αύξησε τόσο το επίπεδο οξειδωτικού στρες όσο και την απόπτωση, μείωσε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και προκάλεσε εκφυλισμό στη μορφολογία των όρχεων συμπεριλαμβανομένου του φραγμού αίματος-όρχεως. Η χορήγηση αποκυνίνης ανέστρεψε όλες τις επιδεινούμενες μορφολογικές και βιοχημικές παραμέτρους στην ομάδα MSG συν APO. Συμπεράσματα: Η αποκυνίνη θεωρείται ότι προλαμβάνει τον εκφυλισμό των όρχεων διατηρώντας την ακεραιότητα του φραγμού αίματος-όρχεως με ισορροπημένα επίπεδα ορμονών και οξειδωτικών/αντιοξειδωτικών.

Λέξεις-κλειδιά: γλουταμινικό νάτριο; αποκυνίνη; NOX-2; φραγμός αίματος-όρχη? υπερδομή

1. Εισαγωγή

Το ευρέως χρησιμοποιούμενο L-γλουταμινικό οξύ, ως πρόσθετο, εμφανίζεται φυσικά σε μια ποικιλία τροφίμων και είναι η πηγή του ενισχυτικού γεύσης, του γλουταμινικού μονονάτριου (MSG) [1]. Πολλά επεξεργασμένα τρόφιμα περιέχουν MSG ως πρόσθετο, με μέση ημερήσια πρόσληψη στα ευρωπαϊκά βιομηχανικά έθνη από 0,3 έως 1.0 g. [2]. Παρόλο που η κατανάλωση MSG θεωρείται ασφαλής από τους οργανισμούς ασφάλειας τροφίμων, εξακολουθεί να αμφισβητείται σε αρκετές προκλινικές και κλινικές μελέτες, ειδικά η μακροχρόνια έκθεσή του. Μεταξύ των φυσιολογικών λειτουργιών του γλουταμικού είναι η νευροδιαβιβαστής του ιδιότητα στο κεντρικό νευρικό σύστημα, ως πρόδρομος μεταβολιτών όπως η γλουταθειόνη [1].

Η μακροχρόνια κατανάλωση MSG έχει αποδειχθεί ότι έχει αρνητικές επιπτώσεις στο ανδρικό αναπαραγωγικό σύστημα. Μελέτες έχουν δείξει ότι η μακροχρόνια κατανάλωση MSG μειώνει τον αριθμό των σπερματοζωαρίων στους άνδρες και επηρεάζει τη μορφολογική δομή του σπέρματος και των όρχεων [3]. Η πλειοψηφία της έρευνας που αναφέρθηκε προηγουμένως επικεντρώθηκε κυρίως στην τοξικότητα του MSG σε αρουραίους σε δόσεις 2000–8000 mg/kg σωματικού βάρους, κάτι που είναι εξαιρετικά απίθανο για τον άνθρωπο σε αυτό το επίπεδο [4].

Αλλομετρική μετατροπή από τους Shin et al. [5] έδειξε ότι αυτή η δόση είναι ισοδύναμη με 120 mg/kg σωματικού βάρους σε αρουραίους. Υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός υποδοχέων γλουταμικού στα αναπαραγωγικά όργανα και στο σπέρμα, γεγονός που τα καθιστά επιρρεπή σε βλάβη διέγερσης από την περίσσεια γλουταμικού στο σώμα. Αυτό καθιστά το αναπαραγωγικό σύστημα συχνό στόχο για βλάβες που προκαλούνται από το γλουταμικό. Επιπλέον, η τοξικότητα του γλουταμικού είναι γνωστό ότι βλάπτει άμεσα τον άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-γοναδικής μοίρας, οδηγώντας σε ομοιοστατική ανισορροπία στην αναπαραγωγή [6].

Το MSG έχει οδηγήσει σε οξειδωτική βλάβη (αυξημένη υπεροξείδωση λιπιδίων και μειωμένη δράση αντιοξειδωτικών ενζύμων) και σπερματογόνες αλλαγές που εκδηλώνονται με χαμηλό αριθμό σπερματοζωαρίων και μορφολογικές ανωμαλίες [3]. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε τις επιδράσεις της από του στόματος κατανάλωσης MSG σε αρουραίους όταν έλαβαν μια μέτρια δόση προεκτεινόμενη απευθείας από την ημερήσια πρόσληψη στους ανθρώπους. Αυτή η επίδραση δόσης MSG στη μορφολογία των όρχεων επίμυος παρατηρήθηκε επίσης σε πειραματικές μελέτες [3,7].

Η υπερπαραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) πυροδοτεί οξειδωτικό στρες και απόπτωση. Λόγω των αντιδραστικών δομών τους, οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τα λιπίδια, τα νουκλεϊκά οξέα και τις πρωτεΐνες και να έχουν επιβλαβείς επιπτώσεις στο σώμα [8]. Το οξειδωτικό στρες, που προκαλείται από το ROS, είναι γνωστό ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανδρική υπογονιμότητα [9]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η οξειδάση NADPH (NOX) είναι μία από τις κύριες πηγές ROS [10]. Το υπερβολικό ROS και το οξειδωτικό στρες στο ανδρικό αναπαραγωγικό σύστημα προκαλούν αρνητικές αλλαγές στη συγκέντρωση, την κινητικότητα και τη μορφολογία του σπέρματος. Το εκφυλισμένο σπέρμα και οι μειωμένες παραμέτρους του σπέρματος οδηγούν σε στειρότητα [11]. Το ROS προκαλεί ανδρική υπογονιμότητα λόγω βλάβης του DNA στο σπέρμα [12]. Το οξειδωτικό στρες θέτει σε κίνδυνο την ακεραιότητα της πλασματικής μεμβράνης του σπέρματος και προκαλεί πρώιμη χωρητικότητα.

Ως αποτέλεσμα, η ικανότητα γονιμοποίησης του σπέρματος μειώνεται και εμφανίζεται υπογονιμότητα [13]. Η αποκυνίνη (APO), που εξάγεται από τις ρίζες του φυτού Apocynum cannabinum, είναι γνωστό ότι είναι αποτελεσματική ως αναστολέας του NOX [14]. Η αντιφλεγμονώδης δράση του APO έχει αποδειχθεί σε πολλές πειραματικές μελέτες [15]. Η ενεργοποίηση των NOX λαμβάνει χώρα μέσω της μετανάστευσης των συστατικών του κυτοσολίου στην κυτταρική μεμβράνη [16,17]. Το APO δρα ως εκλεκτικός αναστολέας της παραγωγής ROS δρώντας στη δραστηριότητα NOX σε ενεργά ανθρώπινα ουδετερόφιλα.

Ωστόσο, η APO δεν επηρεάζει τη φαγοκυττάρωση ή άλλους μηχανισμούς ενδοκυτταρικού θανάτου [18,19]. Οι ισομορφές NOX εκφράζονται σε διάφορα κύτταρα και έχουν διαφορετικές φυσιολογικές λειτουργίες. Το NOX-2 είναι μια ισομορφή του NOX, η οποία υπάρχει στα ηωσινόφιλα, τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα [20]. Τα σπερματογόνα κύτταρα συνδέονται και τα κύτταρα Sertoli. Αυτή η δυναμική σχέση ρυθμίζεται από σφιχτές διασταυρώσεις και κόμβους κενού [21]. Οι στενές συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων Sertoli είναι σημαντικές για το σχηματισμό και τη λειτουργία του φραγμού αίματος-όρχεως (BTB).

Η δομή του BTB περιλαμβάνει σφιχτές συνδέσεις, δεσμοσώματα, βασικές εξωπλασματικές εξειδικεύσεις και κενούς συνδέσμους. Οι σφιχτές συνδέσεις επιθηλιακής προέλευσης είναι εξειδικεύσεις πολυμοριακών μεμβρανών που περιέχουν πολλαπλές ενσωματωμένες πρωτεΐνες μεμβράνης όπως η zonula occludens-1 (ZO-1) και η οκλουδίνη [21]. Οι οκλουδίνες είναι ένα από τα μόρια που συμβάλλουν στο σχηματισμό σφιχτών ενώσεων. Οι πρωτεΐνες Zonula occludens όπως η zonula occludens-1 (ZO-1), η ZO-2 και η ZO-3 είναι σημαντικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε αυτή τη δομή. Το Occludin, το ZO-1 και το ZO-3 αλληλεπιδρούν με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Η πρωτεΐνη ZO-3 σχετίζεται με τις κυτταροπλασματικές περιοχές του ZO-1 και της οκλουδίνης [22].

Το οξειδωτικό στρες εμφανίζεται όταν δεν υπάρχουν αρκετά αντιοξειδωτικά κατά των ελεύθερων ριζών. Η μείωση της δραστηριότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) και τα επίπεδα γλουταθειόνης (GSH) οδηγεί σε αύξηση της οξειδωτικής βλάβης [23]. Η μηλονοδιαλδεΰδη (MDA), μια παράμετρος της βλάβης της κυτταρικής μεμβράνης, υποδεικνύει την πυκνότητα της προσβολής των ριζών οξυγόνου σε αντιδραστικά κύτταρα και τον μεταβολισμό των ελεύθερων ριζών in vivo. Η μειωμένη SOD και η αυξημένη MDA πυροδοτούν το οξειδωτικό στρες και προκαλούν κυτταρική βλάβη, με αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο [24]. Μελέτες ανέφεραν το NOX-2 ως την πηγή του ROS [20,25]. Το APO, ένας ισχυρός αναστολέας NOX-2 [26], θα μπορούσε να είναι αποτελεσματικός στην αναστολή του NOX-2 για την πρόληψη της βλάβης των ιστών λόγω οξειδωτικού στρες.

Η χορήγηση APO θα μπορούσε να έχει θεραπευτική επίδραση στις παραμέτρους του οξειδωτικού στρες και στις ιστοπαθολογικές βλάβες. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να αξιολογήσει τις επιδράσεις του MSG στη βλάβη του ιστού των όρχεων, στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, στην απόπτωση και στο οξειδωτικό στρες που υποδεικνύονται από την έκφραση του NOX-2 και στον αιματογενή φραγμό. Επιπλέον, η μελέτη είχε στόχο να διερευνήσει εάν η αποκυνίνη μπορεί να βελτιώσει τις επιδράσεις σε όλες αυτές τις παραμέτρους.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Πειραματικό σχέδιο

Αυτή η πειραματική μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Πειραματικών Ζώων του Πανεπιστημίου Acibadem Mehmet Ali Aydinlar (ACU-HADYEK, Αριθμός έγκρισης: HDK2020/39). Σε αυτή τη μελέτη, 8-αρσενικοί αλμπίνο αρουραίοι Sprague Dawley εβδομάδων (n=32) κρατήθηκαν σε κλουβιά με θερμοκρασία 22 ± 2 ◦C και τυπικό φως/σκοτάδι (12:12 ώρες) κύκλος. Οι αρουραίοι τράφηκαν με τυπική ζωική τροφή κατά βούληση για 28 ημέρες της πειραματικής περιόδου. Αυτή η έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες και τους κανονισμούς του ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Σε αυτή τη μελέτη, αρσενικοί αρουραίοι Sprague Dawley (n=8 σε κάθε ομάδα) χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες ελέγχου, APO, MSG και MSG συν APO. Απεσταγμένο νερό (1 mL) δόθηκε στην ομάδα ελέγχου των αρουραίων με καθετήρα από το στόμα για 28 ημέρες. Στις ομάδες MSG και MSG συν APO χορηγήθηκαν 120 mg/kg MSG με καθετηριασμό από το στόμα για 28 διαδοχικές ημέρες [4]. Στις ομάδες APO και MSG συν APO χορηγήθηκαν 25 mg/kg APO με καθετηριασμό από το στόμα τις τελευταίες 5 ημέρες του πειράματος [27]. Τα βάρη των αρουραίων στις πειραματικές ομάδες αναλύονταν εβδομαδιαία. Μετά από αναισθησία με ισοφλουράνιο, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν. Δείγματα αίματος, καθώς και δείγματα ιστού όρχεων και επιδιδυμίδας, χρησιμοποιήθηκαν για βιοχημικές και μικροσκοπικές αξιολογήσεις.

2.2. Μέτρηση των συγκεντρώσεων τεστοστερόνης ορού, FSH και LH

Οι συγκεντρώσεις της τεστοστερόνης στον ορό, της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) και της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) μετρήθηκαν με χρήση κιτ ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμο (ELISA). Τεστοστερόνη αρουραίου (αριθ. καταλόγου: EA0023Ra, κιτ ELISA Bioassay Technology Laboratory), FSH αρουραίου (αριθ. καταλόγου: EA0015Ra, Bioassay Technology Laboratory, Σαγκάη, Κίνα) και Rat LH ELISA (Αριθμός καταλόγου: EA0013Ra. ανάλυση επιπέδων ορμονών σύμφωνα με τη διαδικασία του κιτ. Τα αποτελέσματα της τεστοστερόνης δόθηκαν ως nmol/L και η FSH και η LH δόθηκαν ως mIU/L

2.3. Μέτρηση των επιπέδων MDA, GSH και SOD των όρχεων

Τα επίπεδα MDA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (E-BC-K025-M, Elabscience, Houston, TX, USA). Το MDA, ένα από τα προϊόντα αποδόμησης της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, αντιδρά με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA) για να σχηματίσει ένα ροζ σύμπλοκο με μέγιστη απορρόφηση 532 nm. Τα επίπεδα MDA στον ιστό υπολογίστηκαν σε nmol/g. Η ανάλυση GSH στον ιστό των όρχεων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Beutler [28]. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στο γεγονός ότι η GSH στο σωλήνα ανάλυσης αντιδρά με 5,50 -διθειοδις-2-νιτροβενζοϊκό οξύ (DTNB) για να δώσει ένα κιτρινωπό χρώμα. Η ένταση φωτός αυτού του χρώματος διαβάστηκε στο φασματοφωτόμετρο σε μήκος κύματος 410 nm. Τα ομογενοποιήματα ιστού φυγοκεντρήθηκαν και ένα διάλυμα TCA 10 τοις εκατό προστέθηκε στο ληφθέν υπερκείμενο, αναμίχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν ξανά για να καταβυθιστούν οι πρωτεΐνες. Τα έντονα χρωματισμένα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση GSH. Η ένταση του χρώματος που σχηματίστηκε στα δείγματα που διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά διαβάστηκε στα 410 nm στο φασματοφωτόμετρο και τα επίπεδα GSH σε μmol/g στον ιστό προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την πρότυπη καμπύλη γλουταθειόνης. Η δραστηριότητα SOD προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ προσδιορισμού SOD Sigma (E-BC-K019-M, Elabscience, Houston, TX, USA). Οι τιμές απορρόφησης διαβάστηκαν στα 450 nm μετά την επώαση της δραστικότητας SOD με ένα διάλυμα που λειτουργεί με ένζυμο. Τα επίπεδα SOD στον ιστό υπολογίστηκαν σε IU/g

2.4. Αριθμός σπερματοζωαρίων, κινητικότητα και μορφολογία

Δείγματα επιδιδυμικού ιστού από αρουραίους τοποθετήθηκαν σε διάλυμα Earle's Balanced Salts με ρυθμιστικό διάλυμα Hepes και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση του αριθμού, της κινητικότητας και της μορφολογίας του σπέρματος με βάση μια προηγούμενη μελέτη [27]. Εν συντομία, δείγματα ιστού επιδιδυμίδας αρουραίων μεταφέρθηκαν σε διάλυμα Earle's Balanced Salts με ρυθμιστικό διάλυμα Hepes που προστέθηκε σε αυτά μετά την ανατομή. Για την αξιολόγηση των σπερματοζωαρίων χρησιμοποιήθηκε μια μέθοδος ρουτίνας διαβάθμισης πυκνότητας. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και το ίζημα αραιώθηκε με ένα μέσο πλύσης σπερματοζωαρίων (SAGE, Newcastle upon Tyne, UK) και φυγοκεντρήθηκε. Στη συνέχεια το ίζημα αραιώθηκε με ένα μέσο παρασκευής σπέρματος (SAGE, UK). Το σφαιρίδιο των 10 μm χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των σπερματοζωαρίων σε έναν θάλαμο μέτρησης Macler (Sefi cut out Medical Instruments, Χάιφα, Ισραήλ) με ένα φωτομικροσκόπιο για την μέτρησή τους. Για μορφολογική αξιολόγηση, παρασκευάστηκαν επιχρίσματα και στη συνέχεια χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Diff-Quick (Medion Diagnostics, Grafelfing, Μόναχο, Γερμανία). Σε κάθε διαφάνεια, 100 σπερματοζωάρια εξετάστηκαν σε μεγέθυνση 100× με ένα φωτομικροσκόπιο (Zeiss A1 Axio Scope, Oberkochen, Γερμανία) για την αξιολόγηση της μορφολογίας του σπέρματος.

2.5. Επεξεργασία Ιστών για Μικροσκοπία Φωτός

Οι ιστοί των όρχεων στερεώθηκαν με το διάλυμα Bouin για συνήθεις ιστολογικές εξετάσεις. Για ανοσοϊστοχημικές εξετάσεις, οι ιστοί των όρχεων στερεώθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης (PFA) 4 τοις εκατό. Μετά τη στερέωση, οι ιστοί υποβλήθηκαν σε διαδικασία ρουτίνας ενσωμάτωσης παραφίνης [29]. Η χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η&Ε) εφαρμόστηκε στις τομές για ιστολογική αξιολόγηση ρουτίνας. Μια αντίδραση περιοδικού οξέος-Schiff (PAS) εφαρμόστηκε για να αποκαλύψει τη δομή των βασικών μεμβρανών των σπερματοφόρων σωληναρίων. Τα σπερματοφόρα σωληνάρια σε τομές όρχεων βαμμένες με H&E βαθμολογήθηκαν με βάση τις τροποποιημένες ιστοπαθολογικές παραμέτρους βαθμολόγησης του Johnsen [30,31]. Επιπλέον, μετρήθηκαν τα επιθηλιακά πάχη 100 σπερματοφόρων σωληναρίων σε όλες τις τομές χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Image J (λογισμικό Image J, National Institutes of Health).

2.6. Ανοσοχημεία τερματικής δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

Η μέθοδος επισήμανσης του τερματικού δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης dUTP (TUNEL) εφαρμόστηκε σε τομές ιστού όρχεων σύμφωνα με το εγχειρίδιο οδηγιών του κιτ που δόθηκε από τον κατασκευαστή (ApopTag Plus, In Situ Apoptosis Detection Kit, S7101, Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία). Εν συντομία, μετά την αποπαραφίνη και την επανυδάτωση, οι τομές πλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια θερμάνθηκαν σε φούρνο μικροκυμάτων σε ρυθμιστικό κιτρικού. Μετά από ψύξη, πρωτεϊνάση Κ (20 μg/mL) στάλαξε πάνω στα τμήματα ιστού. Οι τομές πλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και εμποτίστηκαν σε διάλυμα παρασκευασμένο με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. Μετά από πλύση σε PBS, ένα σταθεροποιητικό ταμπόν 10 μL τοποθετήθηκε στις τομές για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, στάχθηκαν 10 μL ενζύμου Tdt και οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ◦C. Το ρυθμιστικό διάλυμα διακοπής πλύσης στάλαξε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, στάχθηκαν 13 μL αντιδιγοξιγενίνης στα τμήματα. Μετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, τα τμήματα πλύθηκαν 4 φορές για 2 λεπτά σε PBS. Στη συνέχεια, στάχθηκαν 13 μL διαλύματος 3,3'-διαμινοβενζιδίνης (DAB). Στη συνέχεια, τα τμήματα ανακινήθηκαν με απεσταγμένο νερό. Για χρώση με αντίθεση, οι τομές εμποτίστηκαν σε διάλυμα αιματοξυλίνης Mayer (JT Baker, Center Valley, PA, USA). Μετά το πλύσιμο σε απεσταγμένο νερό τα τμήματα τοποθετήθηκαν με ιταλικό. Οι τομές απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο φωτός (Zeiss A1 Axio Scope, Oberkochen, Γερμανία). Ο αποπτωτικός δείκτης υπολογίστηκε διαιρώντας τον συνολικό αριθμό των ορχικών σωληναρίων με τον αριθμό των σπερματοζωαρίων με 3 ή περισσότερα κύτταρα θετικά στο TUNEL [32].

2.7. Ανοσοϊστοχημεία πολλαπλασιαζόμενου πυρηνικού αντιγόνου κυττάρων (PCNA).

Οι τομές υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημεία PCNA για να προσδιοριστεί ο αριθμός των πολλαπλασιαστικών κυττάρων και ο δείκτης πολλαπλασιασμού. Μετά την αποπαραφίνη και την επανυδάτωση, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία PCNA όπως περιγράφεται σε προηγούμενη μελέτη [32]. Εν συντομία, οι τομές αποθηκεύτηκαν σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3 τοις εκατό (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) για 20 λεπτά. Οι τομές θερμάνθηκαν σε φούρνο μικροκυμάτων στα 200 W σε ρυθμιστικό διάλυμα αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA) (Sigma-Aldrich, ΗΠΑ) για 20 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS 3 φορές, οι τομές εμποτίστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού ορού κατσίκας 5 τοις εκατό (Invitrogen, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε το πρωτεύον αντίσωμα αντι-PCNA κουνελιού (Αριθμός καταλόγου: SY12-07, Novus Biologicals, Littleton, CO, ΗΠΑ) (1:50). Οι τομές διατηρήθηκαν σε έναν υγροποιημένο θάλαμο στους 4 ◦C όλη τη νύχτα και πλύθηκαν 3 φορές με PBS για 5 λεπτά κάθε φορά. Επισημασμένο με βιοτίνη δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας κατά κουνελιού (Αρ. Καταλόγου: Α16100, Invitrogen, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) (1:500) έπεσε στα τμήματα και διατηρήθηκε στους 37°C για 30 λεπτά. Η υπεροξειδάση της στρεπταβιδίνης (Invitrogen, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) ενστάλαξε στα τμήματα και αφέθηκε για 10 λεπτά. Μετά από πλύση 3 φορές με PBS, οι τομές εμποτίστηκαν σε 3,30 -διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρωμογόνο (1 mL υποστρώματος DAB συν 30 μL χρωμογόνου DAB) για 5 λεπτά. Μετά από πλύση με απεσταγμένο νερό, οι τομές χρωματίστηκαν με διάλυμα αιματοξυλίνης Mayer για χρώση με αντίθεση. Οι τομές στη συνέχεια συναρμολογήθηκαν με ζελατίνη γλυκερίνης Kaiser (Αρ. Καταλόγου: 1.09242, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Γερμανία). Οι τομές εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φωτός (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Γερμανία). Για να προσδιοριστεί ο δείκτης πολλαπλασιασμού, ο αριθμός των θετικών σε PCNA κυττάρων σε 20 σωληνάρια σε κάθε τμήμα διαιρέθηκε με τον συνολικό αριθμό των κυττάρων [32].

2.8. Ανοσοϊστοχημεία του ZO-1 και του Occludin

Οι 4 τοις εκατό τομές ιστού σταθεροποιημένες με PFA αποπαραφινώθηκαν και επανυδατώθηκαν με διαλύματα αλκοόλης. Οι τομές στη συνέχεια εμποτίστηκαν σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3 τοις εκατό (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) για 20 λεπτά για να αποκλειστούν τα ενδογενή ένζυμα. Μετά από πλύση με PBS, τα τμήματα θερμάνθηκαν σε φούρνο μικροκυμάτων στα 200 W σε ρυθμιστικό διάλυμα EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Οι τομές ψύχθηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αποθηκεύτηκαν 3 φορές για 5 λεπτά η καθεμία σε PBS ακολουθούμενα από 10 λεπτά σε 10 τοις εκατό ρυθμισμένο ορό κατσίκας (Invitrogen, USA). Οι τομές υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-ΖΟ κουνελιού-1 (αριθ. καταλόγου: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, ΗΠΑ) και αντι-ογκλουδίνη κουνελιού (1:100) (Αριθ. καταλόγου: {{18} }, Invitrogen, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) αντισώματα (κατά τη διάρκεια της νύχτας, στους συν 4 ◦C). Μετά από πλύση 3 φορές σε PBS για 5 λεπτά, ένα σημασμένο με βιοτίνη δευτερεύον αντίσωμα κατά του κουνελιού (Αρ. Καταλόγου: 65-6140, Invitrogen, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) (1:1000) έπεσε στα τμήματα. Μετά από εμποτισμό σε PBS 3 φορές και 5 λεπτά, εφαρμόστηκε στις τομές στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση (Invitrogen, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Μετά το πλύσιμο σε PBS, το AEC Single/Plus Chromogen (Abcam, Cambridge, UK) έπεσε πάνω και τα τμήματα ανακινήθηκαν με απεσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν με ζελατίνη γλυκερίνης Kaiser (Αρ. Καταλόγου: 1.09242, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Γερμανία). Οι τομές απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Γερμανία). Η ένταση της ανοσοαντιδραστικότητας τόσο του ZO-1 όσο και της αποκλειδίνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Image J (λογισμικό 1.44, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας).

2.9. Ανάλυση ανοσοφθορισμού ZO-1, Occludin and NOX-2

Οι τομές διατηρήθηκαν σε 3 τοις εκατό υπεροξείδιο του υδρογόνου και πλύθηκαν με PBS. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με αντι-ΖΟ κουνελιού-1(1:100) ZO-1(Αριθμός καταλόγου: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, ΗΠΑ), κουνέλι αντι-οκλουδίνη (1 :100) (Αριθμός καταλόγου: 71-1500, Invitrogen, Η.Π.Α.) και πρωτεύοντα αντισώματα αντι-NOX-2 κουνελιού (1:100) (Αριθμός καταλόγου: NBP2-41291, Novus, BioTechne, Μινεσότα, ΗΠΑ). Οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με AF 488 (Αρ. Καταλόγου: ab150077, Abcam, USA) σημασμένο δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας κατά κουνελιού (1:1000). Αφού τα τμήματα πλύθηκαν με PBS για τελευταία φορά, τοποθετήθηκαν με διάλυμα 406- διαμινο-2-φαινυλικό είδωλο (DAPI) (Αριθμός καταλόγου: ab104139, Abcam, Boston, MA, USA). Οι τομές απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού (μικροσκόπιο Zeiss Axio Scope.A1 με προσάρτημα φθορισμού Zeiss AxioCam MRc 5 κάμερα). Η ένταση φθορισμού στις φωτογραφημένες τομές υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Image J (λογισμικό Image J, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας).

2.10. Επεξεργασία Ιστών για Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Μετάδοσης

Τα δείγματα ιστού των όρχεων μονιμοποιήθηκαν με ρυθμισμένο διάλυμα γλουταραλδεΰδης 2,5 τοις εκατό (σε 0, 1 M PBS, pH 7,2) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για τη συνήθη μικροσκοπική παρασκευή ηλεκτρονίων μετάδοσης σύμφωνα με το προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο [32]. Οι τομές αναλύθηκαν κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TALOS L 120 C, Thermo Scientific Fisher, Eindhoven, Ολλανδία).

2.11. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA και πολλαπλές συγκρίσεις του Tukey με p < 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 8.0 (San Diego, CA, USA).

Πώς το Cistanche ενισχύει την τεστοστερόνη;

Το Cistanche είναι ένα βότανο που χρησιμοποιείται παραδοσιακά στην κινεζική ιατρική για να τονώσει την ενέργεια, τη λίμπιντο και τη συνολική ζωτικότητα. Πιστεύεται ότι το Cistanche μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα τεστοστερόνης αναστέλλοντας τη δραστηριότητα ενός ενζύμου που ονομάζεται αρωματάση, το οποίο μετατρέπει την τεστοστερόνη σε οιστρογόνο. Το Cistanche έχει επίσης βρεθεί ότι αυξάνει την παραγωγή της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) στο σώμα. Η LH παίζει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της παραγωγής τεστοστερόνης στους όρχεις. Αυξάνοντας τα επίπεδα LH, το Cistanche μπορεί να ενισχύσει έμμεσα την παραγωγή τεστοστερόνης. Επιπλέον, το Cistanche περιέχει επίσης πολλά φυτοχημικά όπως η εχινακοσίδη και η ακτεοσίδη, τα οποία διαθέτουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Αυτές οι ενώσεις μπορεί να βοηθήσουν στην προστασία των όρχεων και άλλων αναπαραγωγικών οργάνων από οξειδωτική βλάβη, βελτιώνοντας έτσι τη λειτουργία τους και αυξάνοντας την παραγωγή τεστοστερόνης. Συνολικά, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους το Cistanche αυξάνει τα επίπεδα τεστοστερόνης δεν είναι πλήρως κατανοητοί, αλλά είναι πιθανόν μια αλληλεπίδραση αναστολής της αρωματάσης, αύξησης της παραγωγής LH και παροχής αντιοξειδωτικής υποστήριξης στο αναπαραγωγικό σύστημα.

Συνεχίζεται...

Merve Acikel-Elmas 1,*, Salva Asma Algilani 1, Begum Sahin 1, Ozlem Bingol Ozakpinar 2, Mert Gecim 2, Kutay Koroglu 3 και Serap Arbak 1

1 Τμήμα Ιστολογίας και Εμβρυολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Acibadem Mehmet Ali Aydinlar, Icerenkoy Mah., Kayisdagi Cad. No. 32, Atasehir, Istanbul 34752, Turkey

2 Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Marmara University, Basibuyuk Yolu, 4/A, Basibuyuk, Istanbul 34854, Turkey

3 Τμήμα Ιστολογίας και Εμβρυολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Marmara, Basibuyuk Yolu No. 9 D:2, Maltepe, Istanbul 34854, Turkey