Αντιοξειδωτικές και αντιγηραντικές δραστηριότητες παραγόμενων προϊόντων κολλαγόνου από χοιρινό μέρος 2

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

2.2. Επίδραση υπερδιήθησης στις ιδιότητες υδρόλυσης κολλαγόνου

Μια διαδικασία υπερδιήθησης μπορεί να είναι μια χρήσιμη, βιομηχανικά πλεονεκτική μέθοδος για την παραγωγή μικρών πεπτιδικών κλασμάτων με επιθυμητό μοριακό μέγεθος και υψηλή βιοδραστικότητα, ανάλογα με τη σύνθεση του αρχικού υδρόλυσης και τη δραστηριότητα που μελετάται [19]. Η διαλυτότητα, η περιεκτικότητα σε ελεύθερη αμινομάδα και η απόδοση των CHs μετά τη λυοφιλοποίηση παρουσιάζονται (Πίνακας 1). Η διαλυτότητα και η περιεκτικότητα σε ελεύθερη αμινομάδα του ελέγχου ήταν 11,95 τοις εκατό και 0,79 τοις εκατό, αντίστοιχα. Μετά από ενζυματική υδρόλυση και υπερδιήθηση με αποκοπή μοριακού βάρους 3 kDa, η υψηλότερη διαλυτότητα (21,17 τοις εκατό) και η περιεκτικότητα σε ελεύθερη αμινομάδα (14,17 τοις εκατό) παρατηρήθηκαν στην CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Το μέσο μοριακό βάρος των πρωτεϊνικών υδρολυμάτων είναι ένας σημαντικός παράγοντας που καθορίζει τις βιολογικές τους ιδιότητες [19]. Γενικά, ένα μέσο κλάσμα με MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>Τα 300 kDa αντιπροσωπεύουν το κολλαγόνο [20,21]. Η σχετική κατανομή μοριακού βάρους του μάρτυρα (δείγμα προεπεξεργασίας), CH-Alcalase και CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Η σύνθεση αμινοξέων στα CHs φαίνεται (Πίνακας 2). Τα CHS από διαφορετικές πρωτεάσες είχαν διαφορετικές συνθέσεις αμινοξέων και αντιοξειδωτικές ιδιότητες [23]. Η σύνθεση αμινοξέων του κολλαγόνου ήταν πλούσια σε γλυκίνη (Gly), προλίνη (Pro) και γλουταμικό οξύ (Glu). Η περιεκτικότητα σε αμινοξέα των CHs (CH-αλκαλάση και CH-αλκαλάση<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">στέλεχος κιστάνιΑυτά τα αμινοξέα έχει αναφερθεί ότι ενισχύουν την αντιοξειδωτική δράση λόγω της αυξημένης διαλυτότητάς τους στα λιπίδια ή μέσω των αντιδράσεων ελεύθερων ριζών [1,24].

2.3. Αντιοξειδωτικές και Αντιγηραντικές Δραστηριότητες Υδρολύσεων Κολλαγόνου

Οι αντιοξειδωτικές δραστηριότητες των CHs μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας 2,2'-και-δις-(3-αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ)(ABTS) προσδιορισμό δραστηριότητας δέσμευσης ριζών και προσδιορισμό αναγωγικής ισχύος. Η δράση δέσμευσης ριζών ABTS του ελέγχου (εναιώρημα κολλαγόνου), της CH-Alcalase και της CH-Alcalase<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">εκχύλισμα σάλσας cistancheΓενικά, η αντιοξειδωτική δράση των πεπτιδίων μπορεί να επηρεαστεί από τις αλληλουχίες αμινοξέων τους, τον αριθμό των ελεύθερων αμινοξέων που υπάρχουν, τον βαθμό υδρόλυσης και το μοριακό βάρος των πεπτιδίων [26,27]. Συγκεκριμένα, τα προϊόντα υδρόλυσης χαμηλού μοριακού βάρους είχαν ισχυρότερες αντιοξειδωτικές ιδιότητες σε σύγκριση με τα υδρολύματα υψηλού μοριακού βάρους [2,26].

Σχήμα 5. Αντιοξειδωτικές δράσεις υδρολυμάτων κολλαγόνου (CH) σε 2,2'-και-δις-(3-αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ) (ABTS) δέσμευση ριζών (Α) και αναγωγική ισχύς (Β) αναλύσεις. Τα δεδομένα που δηλώνονται με διαφορετικά γράμματα (ac) δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάλογα με τις διαφορετικές θεραπείες (σελ<0.05).>Οφέλη και παρενέργειες του cistanche tubulosaΤα δεδομένα που δηλώνονται με διαφορετικά γράμματα (AD) δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάλογα με τη συγκέντρωση (p < 0.05).

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Οι αναγωγικές δυνάμεις του ελέγχου, CH-Alcalase και CH-Alcalase<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">εκχύλισμα cistanche tubulosaΠαρόμοιες παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι το ακατέργαστο προϊόν υδρόλυσης κολλαγόνου μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικό στη μείωση της ισχύος από τα υπερδιηθημένα πεπτίδια κολλαγόνου [30].

Η αναστολή της δραστηριότητας τυροσινάσης, κολλαγενάσης και ελαστάσης χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση των in vitro αντιγηραντικών επιδράσεών τους [20]. Τα αποτελέσματα της αναστολής της δραστηριότητας τυροσινάσης, κολλαγενάσης και ελαστάσης του ελέγχου, CH-Alcalase και CH-Alcalase<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>ελαστάση (χωρίς δραστηριότητα). CH-Αλκαλάση<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>ελαστάση (χωρίς δραστηριότητα). Παρόμοιες τάσεις που αναφέρθηκαν σε άλλη μελέτη έδειξαν ότι τα υδρολύματα κολλαγόνου έδειξαν τη δυνατότητα να δρουν ως αντιγηραντικοί παράγοντες και αναστολείς της κολλαγενάσης [20].

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Προεπεξεργασία δέρματος χοίρου

Το δέρμα χοίρου αγοράστηκε από έναν τοπικό προμηθευτή (Σεούλ, Κορέα) και όλο το ορατό λίπος και οι συνδετικοί ιστοί του δέρματος χοίρου αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας μια λεπίδα ξυραφιού. Το δέρμα χοίρου που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη ελήφθη από έναν χοίρειο προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η βιολογική διακύμανση. Το κομμένο δέρμα χοίρου πλύθηκε σε νερό στους 90 βαθμούς για 1 λεπτό τέσσερις φορές για να αφαιρεθεί το λίπος και τα υπολείμματα υλικών. Το δέρμα στη συνέχεια κόπηκε σε τετράγωνα τμήματα 1 cm και κονιοποιήθηκε σε απεσταγμένο νερό για 3 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα μπλέντερ με λεπίδες τεσσάρων πτερύγων (CNHR-26, Bosch, Χονγκ Κονγκ, Κίνα). Το κονιοποιημένο δέρμα χοίρου ομογενοποιήθηκε σε υψηλή ταχύτητα (25,000rpm) για 5 λεπτά χρησιμοποιώντας Ultra Turrax (T25, ΙΚΑ Labotechnik, Staufen, Γερμανία). Περίπου 100 g του μείγματος του δέρματος χοίρου (50 τοις εκατό τελικού στερεού περιεχομένου) συσκευάστηκε σε κενό και καταψύχθηκε σε -20 βαθμό και αποθηκεύτηκε για χρήση εντός 1 μηνός.

3.2. Εμπορικές Πρωτεάσες και Αντιδραστήρια

Οι αλκαλάση, Flavorzyme, Neutrase και Protamex αγοράστηκαν από τη Novozymes (Bagsvaerd, Δανία). Η Bromelain και η Papain αγοράστηκαν από την Daesong Sangsa (Σεούλ, Κορέα). Όλα τα χημικά για αντιοξειδωτικά και αντιγηραντικά τεστ αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Chemical Company (St.Louis, MS, ΗΠΑ). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια και διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας.

3.3. Ενζυμική Υδρόλυση

Η ενζυματική υδρόλυση αναπτύχθηκε για τα αντίστοιχα εμπορικά ένζυμα ποιότητας τροφίμων που χρησιμοποιούνται (με βάση τις συστάσεις του κατασκευαστή, Πίνακας 4). Το παρασκευασμένο μίγμα δέρματος χοίρου αραιώθηκε με απεσταγμένο νερό σε ένα τελικό στερεό περιεχόμενο 5 τοις εκατό. Αυτή η συγκέντρωση επιλέχθηκε για να διασφαλίσει τη συμπεριφορά ροής λόγω του χαμηλού ιξώδους της. Το 5 τοις εκατό μίγμα δέρματος χοίρου ονομάστηκε εναιώρημα κολλαγόνου (ή έλεγχος). Το εναιώρημα κολλαγόνου υδρολύθηκε σε αντιδραστήρες χρησιμοποιώντας έξι εμπορικά ένζυμα ποιότητας τροφίμων σε αναλογία ένζυμου: υποστρώματος 1:100. Δείγματα δειγμάτων (5 mL) ελήφθησαν σε 1, 3,6, 12 και 24 ώρες υδρόλυσης και θερμάνθηκαν αμέσως στους 100 βαθμούς για 10 λεπτά για να απενεργοποιηθεί το ένζυμο, ακολουθούμενο από ψύξη στους 0 βαθμούς χρησιμοποιώντας παγωμένο νερό. Κατά τη διάρκεια της δειγματοληψίας, το pH ελεγχόταν χρησιμοποιώντας 1 Μ NaOH ανάλογα με την περίπτωση. Μετά την ψύξη, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 4000xg για 15 λεπτά και το υπερκείμενο (υδρολύμα κολλαγόνου, CH) συλλέχθηκε. Το CH συμπυκνώθηκε περαιτέρω με υπερδιήθηση, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα AmiconStirred Cells (Κατάλογος Αρ. UFSC 20001, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, ΗΠΑ) με αποκοπή μοριακού βάρους 3 kDa (MWCO) (UltracelMembrane, EMD Millipore Corporation, MA, ΗΠΑ) στα 60 psi αέριο άζωτο, στους 20 βαθμούς.κριτικές cistanche tubulosaΤο παρασκευασμένο CH λυοφιλοποιήθηκε και διατηρήθηκε σε αεροστεγείς περιέκτες στους 20 βαθμούς μέχρι την ανάλυση.

3.4. Προσδιορισμός ρΗ, Ανάκτηση Πρωτεϊνών, Περιεκτικότητα Αμινοομάδας Χωρίς Διαλυτότητα και Απόδοση Παραγωγής Το ρΗ των δειγμάτων (μάρτυρας και CHs) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μετρητή ρΗ (Model S220, Mettler Toledo GmbH, Columbus, OH, USA). Η ανάκτηση ή η διαλυτότητα πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με εκτίμηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτεΐνης δικινχονικού οξέος (BCA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma-Aldrich, St. Louis, MS, USA) με αλβουμίνη ορού ως πρότυπο. Η περιεκτικότητα σε ελεύθερη αμινομάδα προσδιορίστηκε μέσω μιας δοκιμασίας 2,4,6-τρινιτροβενζολοσουλφονικού οξέος (TNBSA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) χρησιμοποιώντας L-λευκίνη ως πρότυπο. Μετρήθηκαν τόσο τα υγρά όσο και τα ξηρά βάρη για τον υπολογισμό του πεδίου παραγωγής.

3.5. Κατανομή μοριακού βάρους

3.5.1. Ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE)

Τα πρότυπα SDS-PAGE των δειγμάτων (μάρτυρας και CH) μετρήθηκαν σύμφωνα με μια μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως [10]. Τα δείγματα αραιώθηκαν με ουρία 8 Μ (τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης, 4 mg/mL). Κάθε δείγμα αναμίχθηκε με ένα μέρος ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος KTG 020 (10 τοις εκατό γλυκερόλη, 2 τοις εκατό SDS, 0,003 τοις εκατό μπλε βρωμοφαινόλης, 5 τοις εκατό -μερκαπτοαιθανόλη και 63 mM Tris-HCl, pH6,8) από την KOMA Biotech Inc ., (Σεούλ, Κορέα) και βράσαμε για 2 λεπτά. Το μίγμα του δείγματος (20 μL) φορτώθηκε σε ζελέ ακρυλαμιδίου EzWayTM PAG 6 τοις εκατό (KOMA Biotech Inc., Σεούλ, Κορέα). Μετά την ηλεκτροφόρηση, το πήκτωμα σταθεροποιήθηκε, χρωματίστηκε και αποχρωματίστηκε. Τα μοριακά βάρη προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπα μοριακού βάρους ευρείας κλίμακας μεταξύ 10 και 210 kDa.

3.5.2. Χρωματογραφία διείσδυσης γέλης (GPC)

Η κατανομή μοριακού βάρους των δειγμάτων προσδιορίστηκε σύμφωνα με μια προηγουμένως αναφερθείσα μέθοδο [3]. Η χρωματογραφία διείσδυσης γέλης (GPC) διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) YL9100 (YL9100, Youngling Instrument Co., Ltd, Gyeonggi-do, Κορέα) εξοπλισμένο με τρεις στήλες Ultrahydrogel TM 120( 7,8×3000 mm) από το Waters (Milford, MA, ΗΠΑ). Η κινητή φάση ήταν απεσταγμένο/απιονισμένο νερό με ρυθμό ροής 1,0 mL/min, και οι κατανομές μοριακού βάρους των πεπτιδίων κολλαγόνου παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή δείκτη διάθλασης YL 9100 στους 40 βαθμούς. Ως πρότυπο χρησιμοποιήθηκε ένα κιτ προτύπων μοριακού βάρους (106-67,500 Da, Polymer Standards Service, Mainz, Γερμανία).

3.6.Αμιν0 Σύνθεση οξέος

Η σύνθεση αμινοξέων των δειγμάτων αναλύθηκε μέσω παραγωγοποίησης με {{0}}φθορενυλαιθοξυκαρβονυλ (FMOC)-χλωρίδιο και ο-φθαλική διαλδεΰδη (OPA) σε ένα σύστημα Ultimate 3000 HPLC ( Dionex, Idstein, Γερμανία) εξοπλισμένο με δύο ανιχνευτές (έναν ανιχνευτή φθορισμού και έναν ανιχνευτή UV) και έναν VDSpher 100 C18-E (4,6 mm × 150 mm, μέγεθος σωματιδίων 3,5 μm, VDS Optilab, Βερολίνο, Γερμανία). Ο όγκος έγχυσης ήταν 1,0 L και η κινητή φάση αποτελούνταν από δύο διαλύματα έκλουσης: ένα 40 mM διβασικό φωσφορικό νάτριο (ρΗ 7) και ένα 45 τοις εκατό (ο/ο) ακετονιτρίλιο/45 τοις εκατό (ο/ο) διάλυμα μεθανόλης. Με τη σύνδεση ενός ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας και ανιχνευτή φθορισμού, ανιχνεύθηκαν υπεριώδεις ακτίνες στα 338 nm, παράγωγο OPA ανιχνεύθηκε στα 450 nm μήκους κύματος εκπομπής και 340 nm μήκους κύματος διέγερσης, παράγωγο FMOC ανιχνεύθηκε στα 305 nm μήκους κύματος e26 anth nm μήκους κύματος διέγερσης. Ένα μίγμα αμινοξέων (1,0 nmol mL-I για κάθε αμινοξύ) χρησιμοποιήθηκε για βαθμονόμηση.

όπου το ατοταλαμινο οξύ ήταν το περιεχόμενο μετά την υδρόλυση χρησιμοποιώντας 6 Μ HCl (στους 130 βαθμούς για 24 ώρες), και το αμινοξύ Afree ήταν το περιεχόμενο μετά τη διαλυτοποίηση σε απεσταγμένο νερό.

3.7. Αξιολόγηση Αντιοξειδωτικής Δραστηριότητας

3.7.1.2,2'-Αζινο-δις-(3-αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ) (ABTS) Δραστηριότητα καθαρισμού ριζών

Η δραστηριότητα δέσμευσης ριζών ABTS του CH μετρήθηκε σύμφωνα με μια μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως [20]. Το ριζικό κατιόν ABTS δημιουργήθηκε με ανάμιξη αποθεματικού διαλύματος ABTS (7,0 mM) με υπερθειικό κάλιο (2,45 mM) και επώαση του προκύπτοντος μίγματος στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύχτα. Το διάλυμα ρίζας ABTS αραιώθηκε σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό 5.{11}} mM (ρΗ 7.4) σε επίπεδο απορρόφησης 0.70±0.02 στα 734 nm. Ένα mL του αραιωμένου διαλύματος ρίζας ABTS αναμίχθηκε με 1 mL από κάθε δείγμα. Δέκα λεπτά αργότερα, οι απορροφήσεις δείγματος (Ένα δείγμα, με δείγμα) και ελέγχου (Ένας έλεγχος χωρίς δείγμα) μετρήθηκαν στα 734 nm. Η δραστηριότητα δέσμευσης ριζών ABTS ( ποσοστό ) υπολογίστηκε ως:

3.7.2.Μειωτική Ισχύς

Η αναγωγική ισχύς του CH μετρήθηκε σύμφωνα με μια μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως [20]. Ένα mL από κάθε δείγμα αναμείχθηκε με 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών 0,2 Μ (ρΗ6,6) και 1 mL σιδηροκυανιούχου καλίου 1 τοις εκατό. Το μίγμα επωάστηκε στους 50 βαθμούς για 20 λεπτά και στη συνέχεια προστέθηκε 1 mL τριχλωροξικού οξέος 10%. Ένα κλάσμα 2 mL από αυτό το μίγμα επώασης αναμίχθηκε με 2 ml απεσταγμένου νερού και 0,4 mL 0,1 τοις εκατό χλωριούχου σιδήρου. Μετά από 10 λεπτά, η απορρόφηση του προκύπτοντος διαλύματος μετρήθηκε στα 700 nm σε φασματοφωτόμετρο (OPTIZEN, Mecasys Co., Daejeon, Κορέα) Η αυξημένη απορρόφηση (στα 700 nm) του μίγματος αντίδρασης θεωρήθηκε ότι υποδεικνύει αυξημένη αναγωγική ισχύ.

3.8. Αξιολόγηση της αντιγηραντικής επίδρασης

3.8.1. Αναστολή της δραστηριότητας της τυροσινάσης

Η αναστολή της τυροσινάσης προσδιορίστηκε με μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Διάλυμα προμίγματος που περιέχει 70 μL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών 0,1 M (pH6,8), 30 uLof τυροσινάση μανιταριού (167 U/mL). Sigma-Aldrich, ΗΠΑ) και 20 L του δείγματος επωάστηκαν για 5 λεπτά στους 30 βαθμούς. Στη συνέχεια προστέθηκαν περίπου 100 μL 3,4-διυδροξυ φαινυλ-L-αλανίνης (L-DOPA) για να ξεκινήσει η ενζυματική αντίδραση. Η απορρόφηση στα 492 nm μετρήθηκε για 20 λεπτά για να παρακολουθηθεί ο σχηματισμός L-DOPA. Το ασκορβικό οξύ (1 mg/mL) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. Η αναλογία αναστολής υπολογίστηκε ως εξής:

όπου το Α ήταν ένα μείγμα με τυροσινάση χωρίς δείγμα. Το Β ήταν ένα μίγμα χωρίς δείγμα και τυροσινάση. Το C ήταν ένα μείγμα με δείγμα και τυροσινάση, και το D ήταν ένα μείγμα με ένα δείγμα αλλά χωρίς τυροσινάση.

3.8.2.Αναστολή της δραστηριότητας της κολλαγενάσης

Η αναστολή της κολλαγενάσης προσδιορίστηκε με μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, παρασκευάστηκε 50 mM ρυθμιστικό διάλυμα τρικίνης (ρΗ7,5) που περιέχει 10 mM χλωριούχο ασβέστιο και 400 mM χλωριούχο νάτριο. Στη συνέχεια, 50 mL διαλύματος N-[3-(2-φουρυλ) ακρυλοϋλ]-Leu-Gly-Pro-Ala 1,0 mM και 0,2 mg/ml κολλαγενάσης (από Clostridium histolyticum, Τύπος ΙΑ, 0. {19}} FALGPA U/mg στερεού· Sigma-Aldrich, ΗΠΑ) προστέθηκαν παρουσία και απουσία δειγμάτων. Η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη κιτρικού οξέος (6 τοις εκατό). Το μίγμα της αντίδρασης διαχωρίστηκε με προσθήκη οξικού αιθυλεστέρα. Η απορρόφηση του υπερκειμένου μετρήθηκε στα 345 nm. Το ασκορβικό οξύ (1 mg/mL) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος και χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. Το ποσοστό αναστολής υπολογίστηκε ως εξής:

όπου το Α ήταν ένα μείγμα με κολλαγενάση χωρίς δείγμα. Το Β ήταν ένα μίγμα χωρίς δείγμα και κολλαγενάση. Το C ήταν ένα μείγμα με δείγμα και κολλαγενάση, και το D ήταν ένα μείγμα με ένα δείγμα αλλά χωρίς κολλαγενάση.

3.8.3.Αναστολή της δραστηριότητας της ελαστάσης

Η αναστολή της ελαστάσης προσδιορίστηκε με μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ν-ηλεκτρυλο-Ala-Ala-Ala-p-νιτροανιλίδιο (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) χρησίμευσε ως υπόστρωμα και η απελευθέρωση της ρ-νιτροανιλίνης παρακολουθήθηκε για 2{{2{0}} min στους 25 βαθμούς. Ένα μέρος (1 ug) παγκρεατικής ελαστάσης χοίρου τύπου IV (PPE) διαλύθηκε σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0). Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 0,2 Μ ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl (ρΗ8,0), 1 ppm PPE, 0,8 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, το δείγμα και το προαναφερθέν υπόστρωμα. Μετρήθηκε η απορρόφηση στα 214 nm. Το ασκορβικό οξύ (1 mg/mL) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος που χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. Η αναλογία αναστολής υπολογίστηκε ως εξής:

όπου το Α ήταν ένα μείγμα με ελαστάση και χωρίς δείγμα. Το Β ήταν ένα μίγμα χωρίς δείγμα και ελαστάση. Το C ήταν ένα μείγμα με δείγμα και ελαστάση, και το D ήταν ένα μείγμα με ένα δείγμα αλλά χωρίς ελαστάση.

3.9.Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Η σημασία των διαφορών μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας πολλαπλές συγκρίσεις και ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από το τεστ ειλικρινούς σημαντικής διαφοράς Tukey (HSD). Οι διαφορές με τιμές p μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

4. Συμπεράσματα

Σε αυτή τη μελέτη, τα υδρολύματα κολλαγόνου, ένα λειτουργικό συστατικό τροφίμων, παρήχθησαν με επιτυχία μέσω ενζυματικής υδρόλυσης, ακολουθούμενης από υπερδιήθηση και καθαρισμό. Διάφορες εμπορικές πρωτεάσες δοκιμάστηκαν για την πιθανή χρησιμότητά τους στην παραγωγή κατάλληλων υδρολυμάτων κολλαγόνου. Το CHS που υδρολύθηκε από την Αλκαλάση ήταν το πιο αποτελεσματικά υδρολυμένο CH και η υπερδιήθηση ακολουθούμενη από καθαρισμό ήταν αποτελεσματική στη δημιουργία ενεργών πεπτιδίων με χαμηλά μοριακά βάρη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα CHs εμφάνισαν εξαιρετικές αντιοξειδωτικές και ανασταλτικές δραστηριότητες κολλαγενάσης. Ως εκ τούτου, τα CH που λαμβάνονται από αυτή τη μελέτη μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε βιομηχανίες τροφίμων, καλλυντικών ή φαρμακευτικών προϊόντων ως φυσικό πρόσθετο, με αντιοξειδωτικές και αντιγηραντικές ιδιότητες. Περαιτέρω μελέτες που περιλαμβάνουν μια in vivo αξιολόγηση των δραστηριοτήτων γήρανσης των ενεργών πεπτιδίων στο ανθρώπινο δέρμα μπορεί να αποδειχθούν χρήσιμες.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Molecules 2019, 24, 1104. doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules