Ένα εκχύλισμα κυτταρικών καλλιεργειών Oenothera Biennis προικισμένο με αντιγηραντική δράση του δέρματος βελτιώνει τις μηχανικές ιδιότητες των κυττάρων

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Η γήρανση του δέρματος είναι μια πολύ γνωστή διαδικασία που θέτει μια σταδιακή επιδείνωση των μηχανικών χαρακτηριστικών του δέρματος λόγω της μείωσης της παραγωγής του μηχανισμού εξωκυτταρικής μήτρας και μιας ταυτόχρονης αλλαγής στη διαδικασία συστολής. Για να επιβραδυνθεί αυτή η εξέλιξη, είναι σημαντικό να προκληθεί η έκφραση πολλών πρωτεϊνών ικανών να προάγουν το σχηματισμό ελαστικών ινών και την επιδιόρθωση των ιστών. Εδώ, το υδατικό εκχύλισμα κυτταροκαλλιέργειας Oenothera bi-Ennis έχει διερευνηθεί από χημική άποψη και στη συνέχεια δοκιμάστηκε in vitro, στα κύτταρα και σε ex vivo πειράματα ως ανοσοενισχυτικό για την αντιμετώπιση της γήρανσης του δέρματος. έδειξε ότι το εκχύλισμα Oenothera biennis ήταν σε θέση, αυξάνοντας την έκφραση του γονιδίου MYLK, να προάγει τη συστολή του κολλαγόνου μήτρας, τον πολυμερισμό της ακτίνης και την παραγωγή βασικών πρωτεϊνών ECM.

Λέξεις-κλειδιά:μεταβολομική; μοριακά δίκτυα; υδρόφιλο εκχύλισμα κυτταρικών καλλιεργειών Oenothera biennis. συστολή κολλαγόνου μήτρας; γήρανση του δέρματος

1. Εισαγωγή

Η γήρανση του δέρματος είναι μια πολύ γνωστή διαδικασία που προκαλείται από ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες. Κατά τη διάρκεια της γήρανσης, όλες οι δερματικές φυσιολογικές λειτουργίες εκφυλίζονται αδυσώπητα και αυτή η προοδευτική επιδείνωση βλάπτει το δέρμα [1]. Πράγματι, το δέρμα σταδιακά μειώνει τα μηχανικά του χαρακτηριστικά, λόγω τόσο της μείωσης της παραγωγής των πρωτεϊνών της εξωκυτταρικής μήτρας όσο και της ταυτόχρονης αλλαγής στη διαδικασία συστολής [2]. Τα πιο σημαντικά συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας του δέρματος είναι πρωτεΐνες όπως το κολλαγόνο Ι και IIl, η λαμινίνη, η περιστίνη, η τενασκίνη, η ελαστίνη, η φιμπρονεκτίνη και οι πρωτεογλυκάνες, καθώς η σχετική τους ποσότητα και η κατάσταση αναδίπλωσης διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων και του μήτρα, που εγγυάται τη σωστή υφή του χορίου [3]. Για παράδειγμα, στον εξωκυτταρικό χώρο, η φιμπρονεκτίνη παίζει βασικό ρόλο στη συναρμολόγηση της μήτρας καθώς σχηματίζει μια γέφυρα μεταξύ των υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας (π.χ. ιντεγκρίνες) και του κολλαγόνου, των πρωτεογλυκανών και άλλων εστιακών μορίων προσκόλλησης. Οι λαμινίνες συμβάλλουν στη δομή της εξωκυτταρικής μήτρας και ρυθμίζουν την προσκόλληση, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση, τη σταθερότητα του φαινοτύπου και την αντίσταση στην απόπτωση. Η ελαστίνη είναι επίσης σημαντική για την κυτταρική προσκόλληση και τη μετανάστευση των κυττάρων και έχει την ικανότητα να συμμετέχει στη σηματοδότηση των κυττάρων. Οι ινιδίνες αλληλεπιδρούν παρόμοια με την τροποελαστίνη και τις ιντεγκρίνες και είναι σημαντικές για τη συναρμολόγηση των ελαστινών σε ελαστικές ίνες. Το Fabulous συνδέεται στενά με βασικές μεμβράνες, ελαστικές ίνες και άλλα συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας και συμμετέχει στον σχηματισμό ελαστικών ινών. Οι τενασκίνες είναι πολυμορφικές γλυκοπρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) που μεσολαβούν σε ινωτικές διεργασίες για να επιτρέψουν την αποτελεσματική επιδιόρθωση των ιστών [4]Επιπλέον, η διαδικασία συστολής του δέρματος βασίζεται επίσης στη δράση των ινοβλαστών, των πιο άφθονων κυττάρων στη δερματική μήτρα. δημιουργούν τη σωστή τάση του δέρματος, προάγοντας τις επαφές μεταξύ των συστατικών της μήτρας, τα οποία με τη σειρά τους είναι υπεύθυνα για τη συμπαγή, την πυκνότητα και την αντίσταση του δέρματος. Στη βάση της οργάνωσης του κυτταρικού κυτταροσκελετού τους, υπάρχει ο μηχανισμός ακτίνης-μυοσίνης, ο οποίος καθορίζει πιθανές αλλαγές στο σχήμα και στη δομή τους. Πράγματι, η δέσμευση της ακτίνης και της μυοσίνης προκαλεί μια πιο συμπαγή κυτταρική διαμόρφωση, φέρνοντας τις ίνες πιο κοντά, διασφαλίζοντας την ανάπτυξη υγιούς και συμπαγούς ιστού και αποτρέποντας τη διάσπαση των ινών με αποτέλεσμα τις ρυτίδες. Ωστόσο, η ικανότητα των ινοβλαστών να συστέλλονται και να τεντώνονται χάνεται εν μέρει με τα χρόνια, επειδή τα γερασμένα κύτταρα δεν είναι πλέον σε θέση να ενεργούν σωστά και πλήρως. Λόγω χαμηλότερης μηχανικής δύναμης, οι ινοβλάστες πηγαίνουν σε πιο στρογγυλεμένη και παραμορφωμένη μορφολογία από την επιμήκη [5]. Ορισμένα στοιχεία έχουν δείξει ότι, κατά τη διάρκεια της γήρανσης, η σύνθεση μιας πρωτεΐνης που ονομάζεται MYLK (Μυοσίνη ελαφριάς αλυσίδας κινάση) μειώθηκε σημαντικά. Το MYLK κατέχει μια δραστηριότητα κινάσης που ασκείται από τη φωσφορυλίωση μιας συγκεκριμένης περιοχής μυοσίνης, που ονομάζεται ρυθμιστική ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης, ικανή να επάγει τη δέσμευση της ακτίνης και επομένως να προάγει τη συσταλτικότητα των κυττάρων [6].βιοφλαβονοειδήΌταν ανιχνεύθηκε χαμηλή δραστηριότητα αυτής της πρωτεΐνης, λόγω, για παράδειγμα, μιας μικρότερης έκφρασης πρωτεΐνης, μετρήθηκε η αντίστοιχη μείωση της συστολής του κολλαγόνου της μήτρας [7] και ο πολυμερισμός της ακτίνης [8]. Η συγκρότηση κυτταροσκελετού ακτίνης συνδέεται όχι μόνο με την κίνηση και την ικανότητα των κυττάρων να συστέλλονται, αλλά και με την παραγωγή πρωτεΐνης μήτρας ECM μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα TGF-II (TGFBRII)[9]. Το TGFBRII ανήκει στο σύμπλεγμα υποδοχέα της επιφάνειας των κυττάρων TGF- που, μέσω της ενεργοποίησης των μεταγραφικών παραγόντων Smad, ρυθμίζει την έκφραση πολλών γονιδίων που κωδικοποιούν συστατικά του ECM, συμπεριλαμβανομένου του κολλαγόνου, των λαμινινών, της φιμπρονεκτίνης και της πρωτεογλυκάνης [10]. Η αποσυναρμολόγηση του κυτταροσκελετού ακτίνης ρυθμίζει προς τα κάτω τον υποδοχέα TGF-Il. Αυτή η προς τα κάτω ρύθμιση, με τη σειρά της, μειώνει την παραγωγή κολλαγόνου και άλλων πρωτεϊνών ECM, με αποτέλεσμα την απώλεια της δερματικής μάζας και την ευθραυστότητα του δέρματος.

Στην πραγματικότητα, πολλά καλλυντικά συστατικά στοχεύουν στην τόνωση της σύνθεσης πολλών βασικών παραγόντων που είναι υπεύθυνοι για τη διατήρηση της σωστής συμπαγούς δερματικής μήτρας και την καλή συστολή του δέρματος. Σε αυτό το σενάριο, τα εκχυλίσματα που προέρχονται από το είδος Oenothera biennis (Evening Primrose), που ανήκει στην οικογένεια Onagraceae, παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω της περιεκτικότητάς τους σε βιοδραστικές ενώσεις όπως λιπαρά οξέα, φαινόλες, τριτερπένια και φλαβονοειδή, που έχουν ήδη δοκιμαστεί στη θεραπεία διαφόρων παθολογικών παθήσεων του δέρματος [11]. Ορισμένοι από αυτούς τους μεταβολίτες, με τη σειρά τους, αναφέρεται ότι καταστέλλουν μεσολαβητές φλεγμονής όπως η ιντερλευκίνη 1 (IL-1), η ιντερλευκίνη 6 (IL-6), οι κυτοκίνες και ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF- )[12. ]. Επιπλέον, εκχυλίσματα εναέριων τμημάτων Oenothera biennis προστάτευσαν τα κύτταρα HaCaT από βλάβες στο DNA που προκαλούνται από Η, Ο, και κυτταρικό θάνατο, εμποδίζοντας την κυτταρική βλάβη λόγω οξειδωτικού στρες μέσω ενός μηχανισμού που περιλάμβανε την εξάλειψη του ROS και τη οδό σηματοδότησης Nrf2/HO-1. 13]. Επιπλέον, το λάδι Oenothera biennis, το οποίο είναι πλούσιο σε λιπίδια, έχει προταθεί ως καλή ενυδατική κρέμα για ασθενείς με έκζεμα χάρη στην ικανότητά του να διεισδύει εύκολα στο δέρμα [14]. Δυστυχώς, τα παρασκευάσματα εκχυλίσματος καλλιεργούμενων φυτών, που ασχολούνται με καλλυντικά, μπορεί να περιλαμβάνουν ορισμένα μειονεκτήματα: πρώτον, μπορούν να μολυνθούν από τοξικές ή αλλεργιογόνες ουσίες όπως φυτοφάρμακα, λιπάσματα ή ρύπους. Στη συνέχεια, τα φυτά υπόκεινται σε απρόβλεπτο στρες και εποχιακές συνθήκες ή διακυμάνσεις στη διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών, οι οποίες μπορούν να προκαλέσουν τη σύνθεση απροσδόκητων μεταβολιτών. Επιπλέον, τα εκχυλίσματα μπορεί να περιέχουν παθογόνους μικροοργανισμούς, οι οποίοι μειώνουν την ποιότητα των τελικών προϊόντων. Όλα αυτά τα μειονεκτήματα, με τη σειρά τους, συγκλίνουν στον κίνδυνο να έχουμε μια μεταβλητή περιεκτικότητα σε δευτερογενείς μεταβολίτες και χαμηλή αναπαραγωγιμότητα. Για να ξεπεραστούν αυτές οι αδυναμίες, η χρήση καλλιεργειών φυτικών κυττάρων στα καλλυντικά γίνεται πιο δημοφιλής και εκτιμάται ιδιαίτερα, καθώς ξεπερνά πολλά από τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα [15].

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Σε αυτή τη μελέτη, ένα υδρόφιλο εκχύλισμα κυτταροκαλλιεργειών Oenothera biennis (ObHEx) έχει χαρακτηριστεί πλήρως από προηγμένες προσεγγίσεις που βασίζονται σε φασματομετρία μάζας, υποβοηθημένες από βιοπληροφορική και έχουν δοκιμαστεί σε πολλαπλούς βιοχημικούς και βιολογικούς προσδιορισμούς. Το μείγμα περιέχει βιοδραστικές ενώσεις κυρίως λιγνάνων και τριτερπενίων, όπως το αριουνολικό και το ασιατικό οξύ, το οποίο είχε προηγουμένως συσχετιστεί με την παραγωγή προ-κολλαγόνου Ι σε ανθρώπινους ινοβλάστες [16,17]. Το εκχύλισμα διερευνήθηκε για την ικανότητά του να αυξάνει την έκφραση του MYLK, να προάγει τη συστολή του κολλαγόνου της μήτρας, τον πολυμερισμό της ακτίνης και την παραγωγή πρωτεϊνών ECM που ρυθμίζονται από TGF, οι οποίες ευνοούν τη συστολή του χορίου, επιβραδύνοντας έτσι τη γήρανση του δέρματος.

2. Αποτελέσματα

2.1. Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση του υδατοδιαλυτού εκχυλίσματος κυτταρικής καλλιέργειας Oenothera Biennis

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση UPLC-MS/MS του ObHEx και αξιοποιήθηκαν φασματομετρικά δεδομένα υψηλής ανάλυσης για τον χημικό χαρακτηρισμό χρησιμοποιώντας το Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), ένα διαδικτυακό σύστημα φασματομετρίας μάζας που βοηθά στην αναγνώριση και τον σχολιασμό των φυσικών προϊόντων (NPS)[18]. Στόχος του είναι να αποτελέσει μια βάση γνώσεων ανοιχτής πρόσβασης για οργανισμούς σε όλη την κοινότητα και για την κοινή χρήση ακατέργαστων, επεξεργασμένων ή σχολιασμένων δεδομένων φασματομετρίας μάζας κατακερματισμού (MS/MS). Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν αναζητήσεις φασματικής βιβλιοθήκης GNPS και μια εργασία Μοριακής Δικτύωσης Βασισμένης σε Χαρακτηριστικά: η πρώτη ανάλυση μας επέτρεψε να αναγνωρίσουμε φυσικές ενώσεις, συγκρίνοντας τα φάσματα MS/MS τους με εκείνα δομικά χαρακτηρισμένων μεταβολιτών, η δεύτερη με σχετιζόμενες με την ομάδα Τα NP μέσα σε ένα δίκτυο αφού παρόμοια μοτίβα κατακερματισμού MS/MS εμφανίστηκαν από δομικά παρόμοια μόρια [19]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 και στον Πίνακα 1, πολλά NPS αναμφίβολα αναγνωρίστηκαν ότι ανήκουν σε διάφορες κατηγορίες δευτερογενών μεταβολιτών, κυρίως λιγνάνες (Salvador aside και λιριοδένδρον) και τριτερπένια (μουριατικό οξύ, αριονολικό οξύ, ασιατικό οξύ και εδεραγενίνη). Χημικά είδη που δεν ταυτοποιήθηκαν από το GNPS κατατάχθηκαν ανάλογα με τη βιβλιογραφία.

Ως παράδειγμα χρήσης του GNPS, το δίκτυο που προέρχεται από την ανάλυση FBMN έχει αναφερθεί στο Σχήμα 2α, δείχνοντας ότι το ObHEx περιείχε πολλά άλλα αχαρακτήριστα τριτερπένια που σχετίζονται με το μουριατικό οξύ (18, m/z 503.3389, RT 21.89 λεπτά: η ταυτοποίηση μουριατικού οξέος έχει επιβεβαιώθηκε μέσω σύγκρισης με το αναλυτικό του πρότυπο). Για παράδειγμα, διάφορα προηγουμένως αχαρακτηρισμένα είδη σε m/z 701 και 665 αναγνωρίστηκαν ως γλυκοζυλιωμένες μορφές που σχετίζονται με το μουριατικό οξύ ή τα ισομερή του, αντίστοιχα ενυδατωμένα ή όχι με δύο μόρια HO

Επιπλέον, αναφέρθηκαν ιόντα σε m/z 729, 703, 699,687,685, 683 που προέρχονται αντίστοιχα από τη γλυκοζυλίωση συν δύο μόρια Η, Ο των ειδών στα m/z531, 505,501, 489,487 και 485 που δεν έχουν ταυτοποιηθεί, αλλά δεν έχει ταυτοποιηθεί η μονόμετρη: όλα υποτίθεται ότι είναι τριτερπένια, που σχετίζονται με το μουριατικό οξύ ή τα συγγενή του, λόγω της οδού κατακερματισμού του MSMS. Πρόσφατα, πολλά τριτερπένια με m/ 501 και 485 απομονώθηκαν από ένα άλλο είδος Oenothera, το Oenothera Maritima, και η δομή τους έχει αποσαφηνίστηκε με βάση φασματοσκοπικά δεδομένα, συσχετίζοντας έτσι καλά με τα αποτελέσματά μας [20].

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Η ανάλυση FBMN παρείχε επίσης πληροφορίες για τους μεταβολίτες σε m/z 617.3862 (ιόντα MS2 σε m/z 453,145 και 119) που υπάρχουν σε μοριακά δίκτυα που φαίνονται στο Σχήμα 2b και δεν αναφέρονται στη βιβλιογραφία για είδη Oenothera. Αυτή η τιμή m/z και ο κατακερματισμός της ταιριάζουν με το 2-ΟΕρ-κουμαροϋλ αποστολικό οξύ ή τα ισομερή του, αποδεικνύοντας, τουλάχιστον, την παρουσία τριτερπενιοκουμαροϋλίου και επίσης καφεοϋλ εστέρων στο εκχύλισμα. Πράγματι, τα φάσματα MS των ειδών στο m/z 649 (RT 25,72 και 27,19) έδειξαν την παρουσία ιόντων στα m/z 179, 161 και 135 λόγω της διάσπασης του τμήματος του καφεϊκού οξέος, ενώ τα φάσματα MS2 των άλλων ειδών που αναφέρεται στο Σχήμα 2b στο m/z 633 (RT 26.88, 27.20, 28.12 και 28.43), 649 (RT24.18, 24.65, 24.83) και 661 (RT 30.28) έδειξε ιόντα σε m/z 145 και ήταν 145 χαρακτηριστικά για το τμήμα κουμαροϋλίου.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) εντός των ελεγμένων περιοχών. Επιπλέον, το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικοποίησης (LOO) έδειξαν ότι οι χρησιμοποιούμενες μέθοδοι διακρίνονταν από υψηλή ευαισθησία. Τα ληφθέντα αποτελέσματα από την ποσοτική ανάλυση (Πίνακας 3) έδειξαν ότι η λιριοδένδρον και η εδεραγενίνη ήταν η κύρια αντιπροσωπευόμενη λιγνάνη και τριτερπένιο, αντίστοιχα.

2.3.Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης MYLK σε HDF

Η δραστηριότητα του ObHEx δοκιμάστηκε σε HDF στην έκφραση του γονιδίου MYLK, το οποίο κωδικοποιεί την κινάση που είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση της ελαφριάς αλυσίδας της μυοσίνης (Εικόνα 3α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επεξεργασία με το εκχύλισμα και στις δύο συγκεντρώσεις αύξησε την έκφραση του γονιδίου MYLK κατά περίπου 50 τοις εκατό, παρόμοια με τον θετικό έλεγχο TGF-.

2.4. Ανάλυση της ικανότητας συστολής μιας μήτρας κολλαγόνου

Για να αξιολογήσουμε τη δραστηριότητα του ObHEx στη συσταλτική ικανότητα των ινών κολλαγόνου, χρησιμοποιήσαμε HDF διασκορπισμένο σε δίσκους γέλης κολλαγόνου [21]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3β, το εκχύλισμα, στη χαμηλότερη συγκέντρωση, προκάλεσε σημαντική αύξηση στη συστολή του δίσκου κολλαγόνου, υποδηλώνοντας μια πιθανή επίδραση στη σταθερότητα του κολλαγόνου. Η θεραπεία με ML7(1-(5-ιωδοναφθαλίνη-1-σουλφονυλ)-1Η-εξαϋδρο-1,4-διαζεπίνη), έναν αναστολέα MYLK, κατάργησε αυτή την αύξηση, υποδεικνύοντας ότι τόσο το εκχύλισμα όσο και ο TGF- δρουν μέσω του MYLK για τη συστολή του δίσκου του κολλαγόνου.

2.5.Μέτρηση Επιπέδου Πολυμερισμού Ακτίνης

Η ικανότητα του ObHEx να διεγείρει τον πολυμερισμό της ακτίνης διερευνήθηκε μετρώντας το επίπεδο πολυμερισμένης ακτίνης στα κύτταρα, που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το εκχύλισμα και τον θετικό έλεγχο TGF-, μόνο και παρουσία ML7. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3γ, η επεξεργασία και με τις δύο συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων έδωσε αύξηση στην ποσότητα πολυμερούς ακτίνης κατά περίπου 50 τοις εκατό, σε σύγκριση με το 33 τοις εκατό του TGF-.αγοράστε κιστανάκιΚαι πάλι, η προεπώαση με ML7com-κατάργησε πλήρως αυτό το αποτέλεσμα, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή του MYLK στον πολυμερισμό των νηματίων ακτίνης.

2.6. Ανάλυση μονοπατιού TGF RII/SMAD σε HDF

Για να επαληθεύσουμε εάν η αύξηση στον πολυμερισμό ακτίνης και τη συστολή του κολλαγόνου των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ObHEx συσχετίστηκε επίσης με την ενεργοποίηση της οδού μεταγωγής σήματος που προκαλείται από τον TGF RII, παρατηρήσαμε πρώτα την έκφραση του γονιδίου TGF RII και στη συνέχεια επιμολύναμε HDF με το SMAD{{ 0}}πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης και αξιολόγησε την αύξηση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης ως απόκριση στη θεραπεία με ObHEx. Τα αποτελέσματα, που αναφέρονται στο Σχήμα 3δ, ε, έδειξαν ότι η θεραπεία με ObHEx σε 0,002 τοις εκατό και 0,006 τοις εκατό αύξησε την έκφραση του TGF RII με τρόπο παρόμοιο με τον TGF- που χρησιμοποιείται ως θετικός έλεγχος και, παράλληλα, η δραστηριότητα της λουσιφεράσης που συνδέεται με το SMAD αυξήθηκε κατά 80 και 40 τοις εκατό, αντίστοιχα. Σημαντική μείωση σήματος λήφθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ML7, δείχνοντας επίσης ότι αυτή η δραστηριότητα συνδέθηκε με MYLK.

2.7.Ανάλυση Προ-Κολλαγόνου Ι, Τροποελαστίνης και Περιστίνης

Ως συνέπεια της ενεργοποίησης της μεταγωγής σήματος TGF RII, αναλύσαμε τη σύνθεση των κύριων πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας όπως το προκολλαγόνο τύπου Ι, η τροποελαστίνη και η περιοστίνη σε HDF που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ObHEx σε 0,002 τοις εκατό . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3στ, το ObHEx αύξησε την παραγωγή των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών κατά περίπου 98 τοις εκατό, 75 τοις εκατό και 51 τοις εκατό, αντίστοιχα, παρόμοια με τον θετικό έλεγχο TGF-. Τα μέτρα πραγματοποιήθηκαν με δοκιμασία ELISA, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα έναντι του προ-κολλαγόνου Ι, της τροποελαστίνης και της περιστίνης.

2.8. Ανάλυση MYLK, φωσφο-μυοσίνης, κολλαγόνου Ι και τροποελαστίνης σε εκφυτεύματα δέρματος Ex-Vivo

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4a-c, το ObHEx παρήγαγε σημαντική αύξηση στην παραγωγή MYLK και φωσφορυλιωμένης μυοσίνης σε μοσχεύματα ανθρώπινου δέρματος.

Η επαγωγή κολλαγόνου Ι και τροποελαστίνης αναλύθηκαν επίσης σε εκφυτεύματα δέρματος που είχαν υποβληθεί σε προεπεξεργασία με ObHEx και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υδροκορτιζόνη για 8 ημέρες για προσομοίωση της χρονολογικής γήρανσης [22]. Η θεραπεία με υδροκορτιζόνη μείωσε την ποσότητα κολλαγόνου Ι και τροποελαστίνης κατά περισσότερο από 100 τοις εκατό και η παρουσία 0,002 τοις εκατό ObHEx αποκατέστησε την ποσότητα της τροποελαστίνης κατά σχεδόν 91 τοις εκατό και του κολλαγόνου κατά 120 τοις εκατό, σε σύγκριση με το ασκορβικό που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας (Εικόνα 4δ-στ). Αυτό υποδηλώνει μια πιθανή αντιγηραντική δράση του ObHEx, ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αύξηση της σφριγηλότητας του δέρματος δρώντας στα συστατικά της δερματικής μήτρας.

2.9. Μικροσκόπηση Ατομικής Δύναμης (AFM) σε εκφυτεύματα δέρματος

Προκειμένου να συλλέξουμε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις εμβιομηχανικές ιδιότητες του δέρματος που προωθούνται από τη θεραπεία με ObHEx, αξιολογήσαμε την ελαστικότητα, μια εγγενή μηχανική ιδιότητα των δειγμάτων δέρματος ως προς τους συντελεστές του Young [23]. Όπως περιγράφεται στην Ενότητα 4, για τον υπολογισμό του συντελεστή ελαστικότητας, τόσο σε δείγματα δέρματος που έχουν υποστεί επεξεργασία όσο και σε μη επεξεργασμένα δείγματα, συλλέξαμε τις καμπύλες δύναμης με ένα μικροσκόπιο ατομικής δύναμης (AFM) και τις προσαρμόσαμε με το μοντέλο Hertz [24,25]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η επεξεργασία των δειγμάτων δέρματος με το εκχύλισμα είχε χαμηλότερες τιμές μονάδας Young σε σύγκριση με δείγματα που δεν είχαν υποστεί επεξεργασία, υποδηλώνοντας βελτίωση των ελαστικών ιδιοτήτων του δέρματος. Συγκεκριμένα, τα δείγματα δέρματος που δεν είχαν υποστεί επεξεργασία αποκάλυψαν μια μέση τιμή συντελεστή του Young 0.37±0.15 GPa, ενώ τα δείγματα δέρματος που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ObHEx έδειξαν χαμηλότερη μέση τιμή 0.{{11 }}7±0,02 ΣΔΣ. Οι τιμές συντελεστή του Young των δειγμάτων δέρματος ήταν σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [26-28].

3. Συζήτηση

Οι καλλιέργειες φυτικών κυττάρων αποτελούν την πιο πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για βιώσιμη παραγωγή φυτικών δευτερογενών μεταβολιτών εμπορικού ενδιαφέροντος, προσφέροντας συνεχή παροχή υλικού μέσω καλλιέργειας μεγάλης κλίμακας και συνθέτοντας ένα βιώσιμο και φιλικό προς το περιβάλλον σύστημα [29,30]. Τα εκχυλίσματα από καλλιέργειες φυτικών κυττάρων έχουν βρει πολλά υποσχόμενες εφαρμογές στους τομείς της υγειονομικής περίθαλψης και των καλλυντικών, καθώς παρουσιάζουν ορισμένα σχετικά πλεονεκτήματα· (i) περιέχουν μεταβολίτες που βιοσυντίθενται σε εργαστηριακές συνθήκες ελεγχόμενης ανάπτυξης· (i) προέρχονται από τυποποιημένες διαδικασίες παραγωγής, που εγγυώνται την τα ίδια ποιοτικά και ποσοτικά χαρακτηριστικά του λαμβανόμενου είδους· (ii) τα εκχυλίσματα είναι απαλλαγμένα από μολυντές όπως μικροοργανισμούς, ζιζανιοκτόνα, φυτοφάρμακα και μυκητοκτόνα· (iv) είναι ανεξάρτητα από γεωγραφικές ή περιβαλλοντικές διακυμάνσεις και τα είδη φυτών μπορούν να διατηρηθούν στο μέλλον γενιές. Σε αυτόν τον διαγωνισμό, ένα υδατικό εκχύλισμα κυτταρικής καλλιέργειας Oenothera biennis (ObHEx) εξετάστηκε ως μια πολλά υποσχόμενη πηγή βιοδραστικών μορίων προικισμένων με αντιγηραντική δράση του δέρματος. Πράγματι, το ObHEx έχει διερευνηθεί με αναλύσεις UPLC-MSMS υψηλής ανάλυσης σε συνδυασμό με προσεγγίσεις βιοπληροφορικής για να επιτευχθεί ένας ευρύς δομικός χαρακτηρισμός. Ο χαρακτηρισμός ένωσης έχει πραγματοποιηθεί κυρίως με τη χρήση GNPS για την επιτάχυνση της διαδικασίας ταυτοποίησης, τη σύγκριση των φασμάτων MS/MS με εκείνα των δομικά χαρακτηρισμένων μεταβολιτών και, επιπλέον, την αποκάλυψη νέων απροσδόκητων ειδών, ομαδοποιώντας παρόμοια NP σε ένα δίκτυο. Επιπλέον, ο χρόνος κατακράτησης, οι ακριβείς μετρήσεις μάζας και οι αναλύσεις MS2 συγκρίθηκαν επίσης με εκείνες των προτύπων και όλα τα δεδομένα αντιστοιχίστηκαν με τη βιβλιογραφία. Ταυτοποιήθηκαν βιοδραστικές λιγνάνες και τριτερπένια, όπως το Salvador aside, το liriodendron, το my-anthemic acid, το arjunolic acid, το Asiatic acid και η hederagenin. Το λιριοδένδρο [31] και το μουριατικό οξύ [32] παρουσίασαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, ενώ η εδεραγενίνη έδειξε αντιγηραντικές ιδιότητες του δέρματος λόγω της μείωσης της κυτταρικής οξείδωσης και της ενεργοποίησης της λειτουργίας πρωτεασώματος [33]. Ωστόσο, το αριουνολικό και το ασιατικό οξύ θεωρήθηκαν κυρίως υπεύθυνα για ορισμένες από τις ακόλουθες δοκιμασμένες δραστηριότητες, καθώς διεγείρουν τη σύνθεση κολλαγόνου Ι. Πράγματι, έχει αποδειχθεί ότι το ObHEx βελτίωσε τις εμβιομηχανικές ιδιότητες του δέρματος, οι οποίες εξαρτώνται κυρίως από τη σχετική ποσότητα των διαφορετικών συστατικών του ECM και από το πώς οι ινοβλάστες είναι ικανοί να συστέλλονται και να παρέχουν τη σωστή τάση στις δερματικές ίνες.κιστανάκιΣτην πραγματικότητα, το ObHEx προάγει τη συστολή της μήτρας του κολλαγόνου και τον πολυμερισμό της ακτίνης αυξάνοντας την έκφραση του γονιδίου MYLK, ενισχύοντας τη δύναμη συστολής των δερματικών ινοβλαστών. Η συναρμολόγηση του κυτταροσκελετού ακτίνης ρυθμίζει προς τα πάνω τον υποδοχέα TGF-τύπου II και, σύμφωνα με τη διέγερση της σηματοδότησης TGF-/Smad, αυξάνει τα επίπεδα των ρυθμιζόμενων από τον TGF πρωτεϊνών ECM. Πράγματι, το ObHEx προκαλεί την παραγωγή κολλαγόνου τύπου Ι, περιοστίνης και τροποελαστίνης. Επομένως, όλες αυτές οι ιδιότητες το καθιστούν ένα πολλά υποσχόμενο υποψήφιο συστατικό που θα χρησιμοποιηθεί σε καλλυντικά σκευάσματα για την καταπολέμηση της απώλειας σφριγηλότητας και ελαστικότητας του δέρματος που σχετίζεται με την ηλικία. Αυτή η υπόθεση υποστηρίχθηκε από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν στην ανάλυση AFM, η οποία έδειξε ότι η επεξεργασία των δερματικών φετών με ObHEx προκάλεσε βελτίωση των μηχανικών ιδιοτήτων του δέρματος, που ανιχνεύθηκε ως μείωση του συντελεστή Young, υποδεικνύοντας σημαντική μείωση της ακαμψίας και της ακαμψίας του δέρματος.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Καλλιέργειες φυτικών ιστών και Παρασκευή εκχυλίσματος

Τα φυτά Oenothera biennis παρασχέθηκαν από την GEEL Floricultura ss και ήταν ιταλικής προέλευσης (αποφεύγοντας την εφαρμογή του πρωτοκόλλου Nagoya). Κυτταρικές καλλιέργειες ελήφθησαν από φύλλα φυτών Oenothera biennis προκαλώντας τον πολλαπλασιασμό μεριστωματικών κυττάρων σε στερεά πλακίδια άγαρ μέχρι τη λήψη κάλλων. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν στο υγρό μέσο ανάπτυξης (Gamborg B5, συμπληρωμένο με 24 διχλωροφαινοξυοξικό οξύ (1 mg/L), αδενίνη (1 mg/L) και κινετίνη (0.01 mg/L)). , τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως καλλιέργειες εναιωρήματος υπό τροχιακή ανακίνηση. Μόλις ελήφθησαν οι καλλιέργειες περίπου 150 g/L, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) σε ρΗ 7,4 για να παρασκευαστεί ένα υδατοδιαλυτό εκχύλισμα, το οποίο λυοφιλοποιήθηκε. Η σκόνη διαλύθηκε σε νερό ή μέσα κυτταροκαλλιέργειας στις κατάλληλες συγκεντρώσεις για δοκιμή.

4.2. Ανάλυση UPLC-MSMS για Χημικό Χαρακτηρισμό

Παρασκευάστηκε ObHEx(5{{10}} mg/mL) και υποβλήθηκε σε διφασική εκχύλιση βουτανόλης/νερού. Το κλάσμα βουτανόλης ξηράνθηκε και διαλύθηκε σε μεθανόλη (10mg/mL) πριν από την ανάλυση UPLC-MS/MS. Πραγματοποιήθηκε σε ένα κλασικό φασματόμετρο μάζας Q-Exactive από τη Thermo-Scientific (Waltham, MA, ΗΠΑ) εξοπλισμένο με σύστημα Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC. Όλες οι χρωματογραφικές εκτελέσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στήλη Phenomenex Luna③C18 100 A (150×2,0 mm, μέγεθος σωματιδίου 3 μm) στους 40 βαθμούς C και ταχύτητα ροής 0,200 mL/min. Ο όγκος της ένεσης ήταν 5 μL. Η κινητή φάση αποτελούνταν από Α (νερό από ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK σε 0,1 τοις εκατό οξικό οξύ) και Β (100 τοις εκατό ακετονιτρίλιο από τη ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) χρησιμοποιώντας έκλουση βαθμίδωσης από 5 τοις εκατό Β στο0-5λεπτό,5-14 τοις εκατό Β στο5-8 λεπτό,14-32 τοις εκατό Β στο 8-11 λεπτό, 32-95 τοις εκατό Β σε {{ 26}}λεπτά,95-98 τοις εκατό Bat32-33 min, 98 τοις εκατό Β στο 33-38λεπτό,98-5 τοις εκατό Bat38-39 λεπτό και 5 τοις εκατό Β στο { {34}} λεπτά. Όλες οι αναλύσεις MS και MSMS πραγματοποιήθηκαν σε αρνητική λειτουργία ESI με τον ρυθμό ροής αερίου περιβλήματος στο 30 (αυθαίρετες μονάδες), τον ρυθμό ροής βοηθητικού αερίου στο 5 (αυθαίρετες μονάδες), την τάση ψεκασμού στα 3,2 kV και την τριχοειδική θερμοκρασία και η θερμοκρασία του βοηθητικού θερμαντήρα αερίου στους 300 βαθμούς. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με λειτουργία Full MS/dd-MS2 (Top5). Οι πλήρεις ρυθμίσεις MS ήταν: η ανάλυση 70.000, ο στόχος AGC 1×106, το μέγιστο IT 200 ms και μπορεί να κυμαίνεται από 100 έως 800 m/z.dd-Οι ρυθμίσεις MS2 ήταν: ανάλυση 17.500, στόχος AGC 2×105, μέγιστο IT 65 ms, παράθυρο απομόνωσης 1,5 m/z και NCE 35.

που ελήφθησαν επαληθεύτηκαν χειροκίνητα. Τα δεδομένα mzXML υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το Mzmine 2.53 πριν από την εργασία Μοριακής Δικτύωσης βάσει Χαρακτηριστικών (FBMN) στο GNPS. Το βήμα ανίχνευσης μάζας πραγματοποιήθηκε με χρήση του κεντροειδούς ανιχνευτή μάζας διατηρώντας το επίπεδο θορύβου στο 5 × 1{{10}}3. Το κτίριο του χρωματογράμματος Automated Data Analysis Pipeline (ADAP) πραγματοποιήθηκε με τις ακόλουθες ρυθμίσεις: ελάχιστο μέγεθος ομάδας σε έναν αριθμό σαρώσεων των 5, όριο έντασης ομάδας 5 × 1{{20}}³, ελάχιστη μέγιστη ένταση 5× 10 συν ,m/z ανοχής 0.01 m/z ή 10 ppm. Η αποσυνέλιξη του χρωματογράμματος επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας Wavelets (ADAP) ως αλγόριθμο, όριο S/N 3, ελάχιστο ύψος χαρακτηριστικών 1 × 105, όριο συντελεστή/εμβαδόν 5, εύρος διάρκειας αιχμής 0.{{{ 18}}.00 λεπτά και εύρος κυμάτων RT 0.00-0.05. Τα χρωματογραφήματα αποϊσοτοποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο σφυρίδας ισοτοπικών κορυφών με ανοχή m/z 0,001 m/z ή 5,0 ppm και ανοχή RT 0,10 λεπτά. Η εργασία FBMN πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανοχή γονικής μάζας 0,02 Da και ανοχή ιόντων θραύσματος MS4 0,02 Da. Οι άκρες φιλτραρίστηκαν για να έχουν όριο βαθμολογίας 0,7 και τουλάχιστον 2 ταιριασμένες κορυφές. Επιπλέον, ο μέγιστος αριθμός γειτονικών κόμβων για κάθε κόμβο ορίστηκε σε 10.

4.4. Ποσοτική Ανάλυση Λιγνανών και Τριτερπενίων

Οι ίδιες συνθήκες UPLC που αναφέρθηκαν για την ποιοτική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτική ανάλυση των λιγνανών, ενώ για αυτή των τριτερπενίων βελτιστοποιήθηκαν ώστε να διαχωριστούν δύο ζεύγη ισομερών, το αριουνολικό και το ασιατικό οξύ. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε φασματόμετρο μάζας Q-Exactive Classic όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε με Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A(150×2,1 mm, μέγεθος σωματιδίου 5 μm). Η κινητή φάση αποτελούνταν από Α (5 mM υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου, pH 9.00 ρυθμισμένο με υδροξείδιο αμμωνίου) και Β(100 τοις εκατό ακετονιτρίλιο) χρησιμοποιώντας βαθμιδωτή έκλουση 17-28 % B στο 0-18 min, 28-65 % B στο 18-22 min, 65-75 % B στο 22-26min,75-95 % στο {{17 }}, 5 λεπτά, 95 τοις εκατό στα 26,5-30 λεπτά, 95-17 τοις εκατό στα 30-30, 1 λεπτό, 17 τοις εκατό στα 30,1-42 λεπτά. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,450 mL/min και ο όγκος έγχυσης ήταν 5 uL. Τόσο για τις λιγνάνες όσο και για τα τριτερπένια, τα δεδομένα αποκτήθηκαν με λειτουργία Full MS-SIM και PRM. Οι πλήρεις ρυθμίσεις MS-SIM ήταν: η ανάλυση 70.000, στόχος AGC 3×106, μέγιστο IT 200 ms και μπορεί να κυμαίνεται από 200 έως 800 m/z για λιγνάνες και από 400 έως 850 m/z για τα τριτερπένια. Οι ρυθμίσεις PRM ήταν: η ανάλυση 70.000, στόχος AGC 2×10 μοίρες, μέγιστο IT 100 ms, παράθυρο απομόνωσης 1,0 m/z και NCE 35 στην περίπτωση λιγνανών και 50 σε αυτήν των τριτερπενίων.cistanche ΑυστραλίαΑγοράσαμε το Salvador εκτός (#{{0}}XS172930) από τη Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Ελβετία), το liriodendron (#SMB00181) και το αργιονολικό οξύ (#SMB00119) από τη Sigma -Aldrich (St. Louis, MO, Η.Π.Α.), Ασιατικό οξύ (#0027) από την Extrasynthese (Genay, Λυών, Γαλλία) και hederagenin (#89706) από τη PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Γερμανία). Το μυριανθικό οξύ ήταν δώρο από την καθηγήτρια Maria Valeria D'Auria, Πανεπιστήμιο της Νάπολης. Οι καμπύλες βαθμονόμησης λήφθηκαν με έγχυση τυπικών διαλυμάτων στο εύρος συγκεντρώσεων 0,25-25 μΜ για τις λιγνάνες και 0,1-25 uM για τα τριτερπένια. Τόσο το καθαρό Salvador κατά μέρος όσο και το liriodendron έδειξαν δύο κορυφές LC-MSMS, πιθανώς λόγω της χημικής ισορροπίας που δημιουργήθηκε στο διάλυμα. Το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικοποίησης (LOO) για τα πρότυπα καθορίστηκαν με βάση την αναλογία σήματος προς θόρυβο (S/N).

4.5. Καλλιέργειες και εκφυτεύματα κυττάρων δέρματος

Οι ανθρώπινοι δερματικοί ινοβλάστες (HDF) διατηρήθηκαν στο Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκού ορού βοοειδών (FBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA ) σε 95 τοις εκατό αέρα, 5 τοις εκατό CO, και υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 βαθμούς. Τα μοσχεύματα δέρματος, που ελήφθησαν από το δέρμα υγιών θηλυκών δοτών (ηλικίας 44-47) στο χειρουργικό κέντρο Villa Cinzia (Νάπολη, Ιταλία), καλλιεργήθηκαν σε 24-τρυβλία transwell σε DMEM/FBS συν αντιβιοτικά στον αέρα συνθήκες υγρού στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2 υγροποιημένο αέρα. Όλοι οι δότες είχαν δώσει τη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεσή τους για τη χρήση των ιστών του δέρματος, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

4.6. Τεστ Κυτταροτοξικότητας

Οι δοκιμές κυτταροτοξικότητας βασίστηκαν στη χρήση της ένωσης ΜΤΤ [{{0}}(45-διμεθυλθειαζολυλ)-2,5-διφαινυλτετραζόλιο-βρωμίδιο][34]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων στο μέσο καλλιέργειας DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, για περίπου 8 ώρες. Μετά από θεραπεία με ObHEx μεταξύ 0.05 τοις εκατό και 0,0004 τοις εκατό (500 ug/mL και 4 ug/mL) για 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν με 100 μL/φρεάτιο "ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης" που περιέχει∶ 10 mMof Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO, 5 mM γλυκόζης και 0,5 mg/mL χρωματομετρικού υποστρώματος ΜΤΤ σε ρυθμιστικό PBS σε ρΗ 7,4. Μετά από 3 ώρες επώασης στους 37 βαθμούς C σε 5 τοις εκατό CO, προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο 100 μLof διαλυτοποιητικά διαλύματα που περιείχαν 10 τοις εκατό Triton-X100,0,1 N HCl σε απόλυτη ισοπροπανόλη. Μετά από επώαση 16 ωρών, η χρωματομετρική αντίδραση μετρήθηκε στα 595 nm με τον αναγνώστη πλακών Victor3 (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ).

4.7. Ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου MYLK και TGF6RII σε HDF

Ανά φρεάτιο, 1×10 βαθμός HDF αναπτύχθηκε σε 6-πλάκες φρεατίου σε DMEM σε 2 τοις εκατό FBS, μετά από 24 ώρες το FBS αραιώθηκε περαιτέρω σε 0.5 τοις εκατό και το Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,002 τοις εκατό και 0,006 τοις εκατό συγκεντρώσεις ObHExand TGF- 2,5ng/mL, ακολουθούμενη από επώαση 2 ωρών για MYLKand 48 για TGFRII. Για την εξαγωγή RNA, χρησιμοποιήθηκε το κιτ "GenEluteM Total RNA Purification" που αγοράστηκε από την εταιρεία Merck (Darmstadt, Γερμανία). Μετά τις υποδεικνυόμενες αγωγές, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης και υποβλήθηκαν στη διαδικασία εκχύλισης όπως αναφέρεται. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι (Ambion, Austin, ΤΧ, ΗΠΑ) στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά για την απομάκρυνση του γονιδιωματικού μολυντικού DNA. Από κάθε δείγμα, 2 μL φορτώθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1 τοις εκατό παρουσία μετουσιωτικής χρωστικής φόρτωσης με σκοπό τον κβαντισμό της ποσότητας RNA σε σχέση με έναν συγκεκριμένο δείκτη για RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Το GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, ΗΠΑ) έχει χρησιμοποιηθεί ως λογισμικό για κβαντισμό. Στη συνέχεια, 300 ng ολικού RNA μεταγράφηκαν εκ των υστέρων χρησιμοποιώντας το ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση (ThermoScientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η ημι-ποσοτική RT-PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ως εσωτερικά πρότυπα το ζεύγος των γενικών εκκινητών 18S primer/ανταγωνιστή (Ambion, Austin, TX, USA). Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 1,5 τοις εκατό, προβλήθηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο Reliance (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) και αναλύθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Genetools. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση ήταν οι ακόλουθες: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCATAGTC.

4.8. Ανάλυση της ικανότητας συστολής μιας μήτρας κολλαγόνου

Όσον αφορά τα κύτταρα HDF, 2.0× 10 βαθμοί επαναιωρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης 5x DMEM (Gibco, Waltham, MA, ΗΠΑ) σε 24-πλάκα φρεατίου και 2 mg/ Σε κάθε φρεάτιο προστέθηκε mL διάλυμα κολλαγόνου από δέρμα βοοειδών (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Το ρΗ του διαλύματος ρυθμίστηκε στο 7,2. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 βαθμούς C για 45 λεπτά για να επιτραπεί η στερεοποίηση της γέλης κολλαγόνου. DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και/ή ML7 25 uM, ως αναστολέας πρωτεΐνης MYLK, προστέθηκε αργότερα. Μετά από 16 ώρες, το ML7 καθαρίστηκε και προστέθηκε ObHExat η συγκέντρωση 0,002 τοις εκατό σε DMEM με 2 τοις εκατό FBS. TGF- 2.5 ng/mL χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ο δίσκος του κολλαγόνου που σχηματίστηκε αποσπάστηκε αμέσως από το φρεάτιο χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη μικροσπάτουλα για να προωθηθεί η συστολή του. Οι περιοχές του δίσκου κάθε θεραπείας μετρήθηκαν σε χρόνο 0 και 5 ώρες και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Image.

4.9. Ανάλυση Βαθμού Πολυμερισμού Ακτίνης

Στη συνέχεια, 1,5×10 βαθμός κυττάρων HDF ανά φρεάτιο αναπτύχθηκαν σε 24-πλάκα φρεατίου και την επόμενη μέρα το μέσο προστέθηκε με 2 τοις εκατό FBS και την κυτοχαλασίνη Β, η οποία είναι ένας αναστολέας της ακτίνης πολυμερισμός, στα 2 μΜ για 3{{1{{20}}}} λεπτά. Μετά από 30 λεπτά, στα κύτταρα, προστέθηκε ObHEx (0,002 τοις εκατό και 0,006 τοις εκατό) μαζί με TGF- 2.5 ng/mL, που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος, και ML7 25μΜ, ως αρνητικός έλεγχος του MYLKenzyme. Μετά από 30 λεπτά επεξεργασίας, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε ρυθμιστικό φωσφορικό για 30 λεπτά σε πάγο. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και διαπερατήθηκαν με διάλυμα φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος και Triton-X100 στο 0,2 τοις εκατό για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα 0,4 μΜ φαλλοιδίνης συζευγμένης με ροδαμίνη (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ΗΠΑ) για 1 ώρα στο σκοτάδι.οφέλη από το cistancheΤη στιγμή 0 και μετά από 18 ώρες, ο φθορισμός μετρήθηκε στα 540/570 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλακών Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, ΗΠΑ). 4.10.Analysis of SMAD2 Pathway

Κύτταρα HDF σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3×103 σε τρυβλία 96-πηγαδιού και μετά από 16 ώρες επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης DNA X-tremeGeneTM HP (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) με φορέα αναφοράς Smad2 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ObHEx ή TGF- 2.5 ng/mL, μόνα τους ή σε συνδυασμό με ML7 25 μΜ για 24 ώρες. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και η δραστικότητα της λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανάλυσης λουσιφεράσης SteadyGlo (Promega Corporation, Madison, WI, USA) στο Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , ΗΠΑ).

4.11. Ανάλυση της σύνθεσης προ-κολλαγόνου Ι, τροποελαστίνης και περιοστίνης

Ανά φρεάτιο, 8× 103 HDF αναπτύχθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίου και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το 0.002 τοις εκατό ObHEx ή TGF 2,5 ng/mL. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ELISA με χρήση μονοκλωνικού πρωτογενούς αντισώματος αντι-προκολλαγόνου τύπου Ι (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), ακολουθούμενη από επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα κατά ποντικού επισημασμένο με υπεροξειδάση (170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA). Τα υπερκείμενα των κυττάρων επικαλύφθηκαν σε άλλη πλάκα για την ανίχνευση τροποελαστίνης και περιστίνης χρησιμοποιώντας το αντίσωμα κουνελιού κατά της τροποελαστίνης (ab21600, Abcam, Cambridge, U ή αντίσωμα ποντικού αντι-περιοστίνης (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology , Dallas, TX, USA), ακολουθούμενη από επώαση με δευτερεύον αντίσωμα κατά κουνελιού επισημασμένο με υπεροξειδάση(170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA). Η χρωματομετρική αντίδραση αναπτύχθηκε με την προσθήκη 100 μL υδατικού διαλύματος OPD (Ο-φαινυλενοδιαμίνη), 0,35 mg/mL σε ρυθμιστικό κιτρικού 50 mM και 0,012 τοις εκατό υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) Μετά από 30 λεπτά, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας τον πολλαπλό αναγνώστη Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, ΗΠΑ).

4.12. Δοκιμές Ex Vivo

Ο ανοσοϊστοφθορισμός (IHF) του MYLK και η φωσφορυλιωμένη μυοσίνη αξιολογήθηκε σε εκφυτεύματα δέρματος δοτών {{0}} ετών. Τα μοσχεύματα ανθρώπινου δέρματος κόπηκαν με διατρητικές βιοψίες των 8 mm και καλλιεργήθηκαν σε 24-πλάκες φρεατίων σε DMEM με 10 τοις εκατό FBS και αντιβιοτικά. Οι λαμβανόμενες γροθιές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.002 τοις εκατό και 0,006 τοις εκατό ObHEx για 24 ώρες. Επωάστηκαν σε 15 τοις εκατό σακχαρόζη, μετά σε 30 τοις εκατό σακχαρόζη και τελικά καταψύχθηκαν. Στη συνέχεια, ελήφθησαν τομές 10 μm χρησιμοποιώντας τον κρυοστάτη CM1520 (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία). Οι αντικειμενοφόρες πλάκες με κρυοτομές ενυδατώθηκαν για 30 λεπτά σε PBS και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα "δεσμεύσεως" (6 τοις εκατό BSA, 5 τοις εκατό ορός, 20 mM MgCl, 0,2 τοις εκατό Tween) για 1 ώρα. Οι κρυοτομές επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού αντι-MYLK (1: 100, GeneTex, Irvine, CA, USA) και το πρωτογενές αντίσωμα αντιφωσφο-μυοσίνη (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) για 16 ώρες στις 4 μοίρες. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με PBS για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερεύον αντίσωμα Alexa-Fluor 546 κατά κουνελιού (1:1000; Α11035 ThermoFisher, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) για 1 ώρα. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI(4',6-5 διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) 1 μg/mL σε PBS για 10 λεπτά. Οι εικόνες ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού και αναλύθηκαν με το λογισμικό ImageJ. Για την IHF της τροποελαστίνης και του κολλαγόνου Ι, χρησιμοποιήθηκαν δερματικά μοσχεύματα 36-γυναικών δοτών ηλικίας. Ελήφθησαν βιοψίες δέρματος όπως περιγράφεται παραπάνω και υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 0,002 τοις εκατό και 0,006 τοις εκατό ObHEx για 24 ώρες. Προστέθηκε στρες με υδροκορτιζόνη στα 10 ug/mL για 8 ημέρες παρουσία ObHEx. Στη συνέχεια, οι βιοψίες καταψύχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και οι τομές επωάστηκαν με το κύριο αντίσωμα αντι-τροποελαστίνης κουνελιού (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, UK) και αντι-κολλαγόνο Ι (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Γερμανία) για 16:00 στους 4 βαθμούς. Οι διαφάνειες αναλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και οι εικόνες αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό ImageJ.

4.13. Μικροσκόπηση Ατομικής Δύναμης (AFM) σε εκφυτεύματα δέρματος

Η ελαστικότητα των δειγμάτων δέρματος που δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ObHEx αξιολογήθηκε διασφαλίζοντας τα μόρια του Young με μια μέθοδο σε νανομετρική κλίμακα βασισμένη σε μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM), που αναπτύχθηκε όχι μόνο για βιολογικά δείγματα αλλά και για ανόργανα. Αυτές οι προσεγγίσεις βασίζονται στις υποθέσεις των μοντέλων του Hertz και θεωρούν το δείγμα και τον πρόβολο ως δύο ελατήρια σε μια σειρά σε μια ρύθμιση πειράματος AFM. Εν συντομία, το δέρμα εκφυτεύματος υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0.006 τοις εκατό του ObHEx και των μη επεξεργασμένων δειγμάτων δέρματος κόπηκαν με κρυοστάτη σε φέτες πάχους 10 μm. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους 12 βαθμούς, στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και εξετάστηκαν σε σταθερή θερμοκρασία και σχετική υγρασία 22 βαθμών και 55 τοις εκατό, αντίστοιχα. Κάθε δείγμα διερευνήθηκε από ένα NanoScope IIA AFM σε Μονή λειτουργία Φασματοσκοπίας Δύναμης χρησιμοποιώντας μια πυραμιδική άκρη (RESP-20) με σταθερά ελατηρίου 0,9 N/m. Για τον υπολογισμό του συντελεστή του Young, αποκτήθηκαν δέκα καμπύλες Δύναμης σε δέκα διαφορετικά σημεία του ίδιου δείγματος επιφανειών. Κάθε καμπύλη Δύναμης είναι μια καμπύλη εκτροπής (Volt) έναντι μετατόπισης (nm) και μπορεί να μετατραπεί σε καμπύλες Δύναμης (N) έναντι διαχωρισμού (nm). Στην πραγματικότητα, κάθε καμπύλη δύναμης αναφέρει καμπύλες φόρτωσης και εκφόρτωσης. Αντιπροσωπεύουν την τάση του άκρου σε σχέση με το δείγμα: όταν το άκρο είναι μακριά από το δείγμα όταν έρχονται σε επαφή και το άκρο αρχίζει να εκτρέπεται και όταν απομακρύνεται ξανά. Μόνο το πρώτο μέρος αυτών των καμπυλών μπορεί να διερευνηθεί. Κάθε ένα από αυτά τα μέρη των καμπυλών ταίριαζε με ένα τυπικό μοντέλο Hertzian, συγκεκριμένα, την τυπική εξίσωση Hertze για μια άκρη πυραμίδας, για την εξαγωγή του συντελεστή ελαστικότητας που είναι γνωστός ως συντελεστής του Young σε GPa.

4.14. Στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές που αναφέρθηκαν ήταν ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, καθένα από τα οποία εκτελέστηκε εις τριπλούν. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν τη στατιστική σημασία που υπολογίζεται σε συμφωνία με το τεστ t: *σημαίνει τιμή μικρότερη ή ίση με 0.05;** τιμή p Μικρότερη ή ίση με 0. 01;***p τιμή Μικρότερη ή ίση με 0,001.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites