Ακτεοσίδη στο κινεζικό φυσικό φυτό-Cistanche για τη βελτίωση της νεφρικής νόσου--Μέρος I

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Ένα φυσικό προϊόν ακτεοσίδης που βελτιώνει τη νεφρική βλάβη σε ποντίκια db/db διαβήτη και κύτταρα HK-2 μέσω της ρυθμιστικής οδού σηματοδότησης NADPH/ οξειδάσης-TGF-/Smad

Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τις προστατευτικές επιδράσεις και τους μηχανισμούς τουακτεοσίδησε DKD σε αρσενικά ποντίκια db/db με διαβήτη και κύτταρα HK-2 που προκαλούνται από υψηλή γλυκόζη. Τα ποντίκια db/db διαβήτη χωρίστηκαν τυχαία στην ομάδα μοντέλου, την ομάδα μετφορμίνης, την ομάδα ιρβεσαρτάνης καιακτεοσίδηομάδα. Παρατηρήσαμε το φυσικό προϊόν τουακτεοσίδηπαρουσιάζουν σημαντική επίδραση σενεφρική προστασίαμέσω ανάλυσης βιοχημικών δεικτών και ενδογενών μεταβολιτών, ιστοπαθολογικών παρατηρήσεων και western blotting. Κύτταρα HK-2 που υποβλήθηκαν σε υψηλή γλυκόζη χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα in vitro. Οι μοριακοί μηχανισμοί διερευνήθηκαν με RT-PCR και western blot.Ακτεοσίδηαποτρέπει τα επαγόμενα από υψηλή γλυκόζη κύτταρα HK-2 και τα ποντίκια db/db με διαβήτη αναστέλλοντας το μονοπάτι σηματοδότησης NADPH/οξειδάση-TGF-/Smad.Ακτεοσίδηρύθμισε τη διαταραγμένη μεταβολική οδό του μεταβολισμού των λιπιδίων, του μεταβολισμού των γλυοξυλικών και δικαρβοξυλικών και του μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος. Ανακαλύψαμε το φυσικό προϊόν τουακτεοσίδηπαρουσιάζει σημαντική επίδραση στονεφρική προστασία.Αυτή η μελέτη άνοιξε το δρόμο για περαιτέρω διερεύνηση της παθογένεσης, την έγκαιρη διάγνωση και την ανάπτυξη ενός νέου θεραπευτικού παράγοντα για την DKD.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ ακτεοσίδη, διαβητικόςΝεφρική Νόσος, μεταβολικό προφίλ, μονοπάτι σηματοδότησης NADPH/οξειδάσης-TGF-/Smad, ROS

Μέρος Ι

Η ακτεοσίδη θεραπεύει τη Νεφρική Νόσο

1|ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ακτεοσίδηείναι ένα αντιπροσωπευτικό συστατικό των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών, ευρέως διανεμημένο σε 79 γένη φυτών, όπως το Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticolaκαι άλλα φαρμακευτικά φυτά.Ακτεοσίδηχαρακτηρίζεται από καφεϊκό οξύ και υδροξυτυροσόλη συνδεδεμένα σε ένα τμήμα γλυκόζης μέσω εστερικών και γλυκοσιδικών δεσμών, αντίστοιχα, με μονάδα ραμνόζης συνδεδεμένη με το μόριο γλυκόζης (Zhao et al., 2015). Αναφέρεται ότιακτεοσίδηδιαθέτει ευρέως φαρμακολογικές δραστηριότητες, όπως π.χνεφρόπροστασία (Gan et al., 2018), αντιοξείδωση (He et al., 2011), νευροπροστασία (Li, Zhou, Xu, Song, & Lu, 2018), προστασία του ήπατος (Lee et al., 2004), αντικαρκινική (Ohno , Inoue, Ogihara, & Saracoglu, 2002) και ούτω καθεξής. Ωστόσο, οι προστατευτικές επιδράσεις τουακτεοσίδησε διαβητικούςνεφρική βλάβηείναι ασαφείς.

Ο διαβήτης είναι μια από τις ταχύτερα αναπτυσσόμενες καταστάσεις έκτακτης ανάγκης παγκοσμίως για την υγεία του 21ου αιώνα. Το 2019, υπολογίζεται ότι 463 εκατομμύρια άνθρωποι έχουν διαβήτη και ο αριθμός αυτός προβλέπεται να φτάσει τα 578 εκατομμύρια έως το 2030 και τα 700 εκατομμύρια έως το 2045. Ο παγκόσμιος επιπολασμός του διαβήτη αυξάνεται ραγδαία, ειδικά στον αναπτυσσόμενο κόσμο, και ο επιπολασμός του διαβήτηΝεφρική Νόσος(DKD) και τελικό στάδιονεφρική νόσο(ESRD) συνεχίζει να αυξάνεται (Hu, 2011). Η DKD είναι μια από τις πιο επίφοβες διαβητικές χρόνιες μικροαγγειακές επιπλοκές και η κύρια αιτία της ESRD. Η θνησιμότητα από όλες τις αιτίες σε άτομα με DKD είναι περίπου 30 φορές υψηλότερη από αυτή σε διαβητικούς ασθενείς χωρίς νεφροπάθεια. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότινεφρώνσωληναριακή επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT) και συσσώρευση εξωκυτταροπλασματικής μήτρας (ECM) στονεφρώντο διάμεσο διάμεσο παίζει βασικούς παράγοντες στην παθογένεση της DKD (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Όλο και περισσότερες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η εξέλιξη τουνεφρώνΗ ίνωση στη διαβητική νεφροπάθεια διαμεσολαβήθηκε από πολλά μονοπάτια σηματοδότησης. Ο TGF- έχει ενοχοποιηθεί ως βασικός παθογόνος παράγοντας στους περισσότερους τύπους ΧΝΝ που σχετίζονται με ίνωση, συμπεριλαμβανομένης της DKD (Lv & Zhang, 2019). Το ετερομερές σύμπλεγμα σηματοδότησης, που προκύπτει από τη δέσμευση του TGF- 1 στον υποδοχέα τύπου II και με τη σειρά του υποδοχέα τύπου Ι, μετατρέπει σήματα μέσω Smads που ρυθμίζονται από υποδοχείς (Smad2/3) και Smad κοινού εταίρου (Smad4), οδηγώντας σε μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων-στόχων (Sierra et al., 2015). Η συσσώρευση ROS μπορεί να οδηγήσει σε οξειδωτικές καταπονήσεις στο κύτταρο, οδηγώντας σε βλάβη των κυτταρικών συστατικών, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών και του DNA. Τελικά, το οξειδωτικό στρες οδηγεί σενεφρώνίνωση και μείωση τουνεφρική λειτουργία. Οι οξειδάσες NADPH (NOX) είναι αποδεκτές ως κύριες πηγές παραγωγής ROS στη διαβητική νεφροπάθεια και τη χρόνιαΝεφρική Νόσος. Η ανοδική ρύθμιση και η υπερ-ενεργοποίηση των NOX επίσης πιθανότατα συμβάλλουν στο οξειδωτικό στρες σε παθοφυσιολογικά στάδια. Ανύψωση τουνεφρώνΤο επίπεδο ROS μέσω της μεσολαβούμενης από υπεργλυκαιμία ενεργοποίησης NOX οδηγεί σε οξειδωτικό στρες, το οποίο προκαλεί βλάβη σειστούς των νεφρών, προκαλώντας DKD (Lee, An, Kim, & Bae, 2020).

Το Metabolomics είναι μια νέα και σημαντική τεχνολογία omics για ποιοτική και ποσοτική ανάλυση όλων των μικρών μοριακών μεταβολιτών σε ζωντανά κύτταρα, ιστούς και σωματικά υγρά. Ως νέος κλάδος για τον εντοπισμό των συνολικών μεταβολικών αλλαγών των ζωντανών οργανισμών, η μεταβολομική παρέχει νέες γνώσεις για τη μελέτη του διαβήτη και των διαβητικών επιπλοκών (Lu, Xie, Jia, & Jia, 2013).

Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση της προστατευτικής δράσης του φυσικού προϊόντοςακτεοσίδησε DKD διαβητικών αρσενικών ποντικών db/db και κυττάρων HK-2 που προκαλούνται από υψηλή γλυκόζη in vitro και τον μηχανισμό της. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, υιοθετήθηκαν ποντίκια db/db για την αξιολόγηση τουνεφρώνπροστατευτικές επιδράσεις τωνακτεοσίδηκαι η ρύθμιση διαφορετικών μεταβολιτών στον ορό αναλύθηκε για να φωτιστούν οι μηχανισμοί τουακτεοσίδη. Επιπλέον, το υψηλής γλυκόζης επαγόμενο HK-2 in vitro μοντέλο αξιολογεί την αποτελεσματικότητα τουακτεοσίδησε ποντικούς db/db με προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης οδού σηματοδότησης NADPH/ οξειδάσης-TGF-/Smad.

2|ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1|Χημικά και όργανα

Το ακετονιτρίλιο ποιότητας UPLC αγοράστηκε από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία). Το μυρμηκικό οξύ αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Missouri).Ακτεοσίδη(Καθαρότητα μεγαλύτερη από ή ίση με 98 τοις εκατό ) αγοράστηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Ελέγχου Τροφίμων και Φαρμάκων (Πεκίνο, Κίνα). Η δομή τουακτεοσίδηφαίνεται στο Σχήμα 1Α. Κιτ αντιδραστηρίων αζώτου ουρίας ορού (BUN), κιτ αντιδραστηρίων ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (GOT), κιτ αντιδραστηρίων αμινοτρανσφεράσης αλανίνης (GPT), κιτ αντιδραστηρίων ολικής χοληστερόλης (TCHO), κιτ αντιδραστηρίων τριγλυκεριδίων (TG), κρεατινίνη ορού (Scr) Το κιτ αντιδραστηρίων (mALB) και το κιτ αντιδραστηρίων ινσουλίνης (INS) αγοράστηκαν από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Κίνα). Τα δισκία υδροχλωρικής μετφορμίνης αγοράστηκαν από την Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd. Το Irbesartan αγοράστηκε από την Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd. Το DMEM και το F12 αγοράστηκαν από την GIBCO, Αμερική. NOX1 (αριθμός καταλόγου: ab121009), NOX2 (αριθμός καταλόγου: ab129068), NOX4 (αριθμός καταλόγου: ab154244) και Smad7 (αριθμός καταλόγου: ab216428) το πρώτο αντίσωμα αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο). -SMA (αριθμός καταλόγου: 19245), E-cadherin (αριθμός καταλόγου:3195), NF-κB p65 (αριθμός καταλόγου: 8242), TGF- 1 (αριθμός καταλόγου: 3711), Smad2 (αριθμός καταλόγου: 5339) , Smad3 (αριθμός καταλόγου: 9523), Smad4 (αριθμός καταλόγου: 46535) και PSmad2/3 (αριθμός καταλόγου: 8828) αγοράστηκαν το πρώτο αντίσωμα από την CST. Όλα τα άλλα χημικά και αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας και κατασκευάστηκαν στην Κίνα.

Σύστημα Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) εξοπλισμένο με φασματόμετρο Quattro Micro MS και Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire). Το απιονισμένο νερό καθαρίστηκε σε σύστημα Milli-Q (Millipore, Bedford, Massachusetts). Ο σταθμός εργασίας Mass Lynx v4.1 υιοθετήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων και χρησιμοποιήθηκε φυγόκεντρος εξαιρετικά υψηλής ταχύτητας σε χαμηλή θερμοκρασία (Thermo Scientific, Ηνωμένο Βασίλειο) και μικροσκόπιο DMI3000M (Leica, Γερμανία).

2.2|Πειραματικές συνθήκες σε ζώα

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες και τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη αναθεωρήθηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Θεσμών των Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής του Nanjing (Nanjing, Κίνα). Τα πρωτόκολλα που περιγράφονται στην παρούσα μελέτη ήταν σε συμφωνία με τις κατευθυντήριες γραμμές του ιδρύματος για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων. Τα ποντίκια αγοράστηκαν από το Animal Model Research Center του Πανεπιστημίου Nanjing (Αρ. πιστοποιητικού Su 2015–0001). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν με 8-αρσενικά ποντίκια db/db εβδομάδων και ποντίκια γέννας άγριου τύπου db/m αντιστοίχισης ηλικίας με αρχικό σωματικό βάρος 30 40 g. Το μοντέλο διαβητικού ποντικιού db/db είναι ένα διεθνώς αναγνωρισμένο ζωικό μοντέλο διαβήτη. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο μηχανισμός της DKD σε ποντίκια db/db είναι παρόμοιος με αυτόν των ανθρώπων. Τα ζώα στεγάστηκαν σε κλουβιά με σταθερή υγρασία (περίπου 60 τοις εκατό ± 2 τοις εκατό) και θερμοκρασία (περίπου 23 ± 2 βαθμοί) και με κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών. Τα ζώα περνούσαν μια περίοδο προσαρμογής 3 εβδομάδων, κατά τη διάρκεια της οποίας τους επετράπη απεριόριστη πρόσβαση σε τροφή και νερό βρύσης. Μετά την περίοδο εγκλιματισμού, τα ποντίκια db/db χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες με έξι σε κάθε ομάδα: ομάδα μοντέλου (φυσιολογικό ορό, Μ), ομάδα μετφορμίνης (250 mg kg^-1 d^-1, EJSG), ομάδα ιρβεσαρτάνης (50 mg kg^-1 d^-1, EBST),ακτεοσίδηομάδα (70 mg kg^-1 d^-1, MRHTG), μία φορά την ημέρα (Gao, Peng, Huo, Liu, & Yan, 2015). Επιπλέον, σε αυτή τη μελέτη, η μετφορμίνη και η ιρβεσαρτάνη επιλέχθηκαν ως φάρμακα θετικού ελέγχου. Έχει αναφερθεί ότι η ιρβεσαρτάνη μπορεί να μειώσει την αρτηριακή πίεση, τα λιπίδια του αίματος καιλιπίδιο των νεφρών.Δεν έχει καμία επίδραση στη γλυκόζη του αίματος και στα λιπίδια του ήπατος. Μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία και την παθολογική αλλαγή τουνεφράτων ποντικών db/db. Η προστατευτική δράση της μετφορμίνης στονεφρόαντανακλάται στη μείωση της πρωτεϊνουρίας σε διαβητικούς αρουραίους και ασθενείς με διαβήτη τύπου 2. Η ζωική δόση μετφορμίνης και ιρβεσαρτάνης προέκταση από την ανθρώπινη ημερήσια δόση, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κανονικοποίησης της επιφάνειας σώματος. Στη συνέχεια, στα ποντίκια χορηγήθηκε το αντίστοιχο φάρμακο μία φορά την ημέρα με πλύση στομάχου για 6 εβδομάδες και τα ποντίκια db/m χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου, στα οποία δόθηκε ο ίδιος όγκος φυσιολογικού ορού ταυτόχρονα.

2.3|Συλλογή δειγμάτων

Κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου, τα σωματικά βάρη και τα επίπεδα γλυκόζης αίματος νηστείας (FBG) καταγράφηκαν εβδομαδιαία, τα επίπεδα FBG μετρήθηκαν με σύστημα παρακολούθησης γλυκόζης αίματος One Touch Ultra II (Life Scan, Milpitas, Καλιφόρνια) με ουραία φλέβα κάθε Δευτέρα (στις 8 π.μ. ). Μετά από 6 εβδομάδες χορήγησης, τα ποντίκια ήταν νηστικά σε μεταβολικά κλουβιά με ελεύθερη πρόσβαση σε νερό για τη συλλογή ούρων 24 ωρών. Όλα τα δείγματα ούρων φυγοκεντρήθηκαν αμέσως στις 3000 rpm για 10 λεπτά μετά τη συλλογή, και τα υπερκείμενα διαχωρίστηκαν και αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό μέχρι την ανάλυση. Στο τέλος της μελέτης, τα ποντίκια θυσιάστηκαν υπό αναισθησία με 10 τοις εκατό ένυδρη χλωράλη (3 mg/kg) και συλλέχτηκε αίμα για τη συγκέντρωση των βιοχημικών παραμέτρων και τη μεταβολομική μελέτη. Στη συνέχεια, τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm για 10 λεπτά και τα δείγματα ορού διαχωρίστηκαν και αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό μέχρι την ανάλυση. Ο δεξιός νεφρός αφαιρέθηκε με ένα τεμάχιο στερεωμένο με 10 τοις εκατό ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για ιστολογική εξέταση. ονεφρώνο φλοιός απομονώθηκε από το άλλο κομμάτι και καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο για western blotting.

Cistanche για τη θεραπεία της νεφρικής ανεπάρκειας

2.4|Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

Η ανθρώπινη σειρά RTEC HK{{0}} ελήφθη από την Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Το πλήρες μέσο ήταν DMEM χαμηλής γλυκόζης με 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης. Τα κύτταρα HK-2 καλλιεργήθηκαν σε 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2 και κορεσμένη υγρασία. Τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν σε συρροή 80 τοις εκατό, η οποία αφαιρέθηκε από τον επωαστήρα και το αρχικό μέσο στο τρυβλίο απορρίφθηκε. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν χρησιμοποιώντας 0,5 ml φωσφορικού ρυθμιστικού αλατούχου διαλύματος (PBS) και χωνεύτηκαν με επεξεργασία με 0,5 ml θρυψίνης για 1-2 λεπτά στους 37 βαθμούς. Η πέψη τερματίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μέσο DMEM 2 ml και το κυτταρικό εναιώρημα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 450 g για 5 λεπτά στους 4°C. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 2 ml αντίστοιχου μέσου DMEM για να ληφθεί ένα εναιώρημα ενός κυττάρου. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε διαφορετικούς δίσκους/μικροπλάκες σε διαφορετικές πυκνότητες για μετέπειτα πειραματισμό, όπως περιγράφεται παρακάτω. Κύτταρα HK-2 επιστρώθηκαν σε 96-πλάκες και τρυβλία φρεατίων, προεπεξεργασμένα με DMEM χαμηλής γλυκόζης (5 mmol/L), επωάστηκαν στους 37 C και 5 τοις εκατό CO₂για 6 ώρες και στη συνέχεια συγχρονίστηκαν. Οι πειραματικές ομάδες χωρίστηκαν ως εξής: ομάδα ελέγχου (C), χωρίς παράγοντα παρέμβασης. ομάδα μοντέλου (Μ), στην οποία τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διάλυμα DMEM υψηλής περιεκτικότητας σε γλυκόζη (30 mmol/L). ομάδα ελέγχου οσμωτικής πίεσης (DMEM συν 24,5 mmol/L μαννιτόλη, GLC). ομάδα ιρβεσαρτάνης (25 mmol/L) καιακτεοσίδη(MRHTG) σε πέντε δόσεις (5, 10, 25, 50 και 100 μmol/L), αντίστοιχα.

2,5|Μορφολογία κυττάρων

Τα κύτταρα HK-2 πλύθηκαν δύο φορές με PBS και εξετάστηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο (OLYMPUS IX51). Η μορφολογία των κυττάρων παρατηρήθηκε υπό 100 μεγεθύνσεις.

2.6|Μετρήσεις βιοχημικών δεικτών

Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα τουακτεοσίδησε ποντίκια db/db αξιολογήθηκαν για τα επίπεδα mALB στα ούρα και FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT και BUN στον ορό, τα οποία ανιχνεύθηκαν ακολουθούμενη από την περιγραφή που παρέχεται από τον κατασκευαστή του κιτ.

2.7|Παθολογική ανάλυση

Μέρος τουνεφρώνΟ φλοιός πραγματοποιήθηκε για χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (HE) και περιοδικού οξέος-Schiff (PAS) προκειμένου να παρατηρηθούν παθολογικές αλλαγές σενεφρικό ιστό, βαθμοί υπερπλασίας ιστού ίνωσης, δομές σπειραμάτων και σωληναρίων μέσω ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (400). Όταν τραβάτε μια φωτογραφία, προσπαθήστε να γεμίσετε όλο το οπτικό πεδίο μενεφρικό ιστόγια να διασφαλίσετε ότι το φως φόντου κάθε φωτογραφίας είναι το ίδιο. Το λογισμικό Image-Pro Plus 6.0 χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή του ίδιου κόκκινου-μωβ χρώματος ως ενοποιημένο κριτήριο για την κρίση του θετικού όλων των φωτογραφιών. Η συσσωρευμένη οπτική πυκνότητα (IOD) της θετικής έκφρασης της βασικής μεμβράνης και η περιοχή εικονοστοιχείων του σπειραματικού αγγειακού πλέγματος (AREA) ελήφθησαν με ανάλυση κάθε φωτογραφίας και υπολογίστηκε η μέση οπτική πυκνότητα (IOD/AREA).

2.8|Western blotting

Νεφρικός ιστόςκαι τα κύτταρα εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό λύσης. τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν. Μετά από πλήρη πυρόλυση, φυγοκεντρήστε για 5 λεπτά στις 12000 rpm, και πάρτε το υπερκείμενο και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε κιτ συγκέντρωσης πρωτεΐνης δικινχονικού οξέος (BCA). Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό, η πρωτεΐνη διαχωρίστηκε με 10 τοις εκατό SDS-PAGE, μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF, στη συνέχεια αποκλείστηκε σε 5 τοις εκατό BSA σε TBST και επωάστηκε με πρωτογενή αντισώματα ακολουθούμενα από τα αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα. Η αντιδραστικότητα αντισώματος στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με ECL και ποσοτικοποιήθηκε με λογισμικό ImageJ.Νεφρικοί ιστοίτα δείγματα αναλύθηκαν με western blotting για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500 ), πρωτεΐνη Smad4 (1:1000) και Smad7 (1:1000).

2,9|Ανάλυση ELISA

Η έκκριση της μονοκυτταρικής χημειοελκυστικής πρωτεΐνης -1 (MCP-1), της ιντερλευκίνης –1 (IL-1), του παράγοντα νέκρωσης όγκου- (TNF-) και της ιντερλευκίνης-6 (IL -6) στο υπερκείμενο κάθε κυττάρου μετρήθηκαν με κιτ ELISA.

2.10|PCR σε πραγματικό χρόνο

Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα προετοιμάστηκαν για την PCR σε πραγματικό χρόνο για να εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης των NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-cadherin, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 και Smad7 mRNA. Τα κύτταρα σε κάθε ομάδα (περίπου 1 107 κελιά) συλλέχθηκαν. Το ολικό RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο ενός σταδίου του Trizol και προσδιορίστηκε η καθαρότητα και η συγκέντρωσή του. Με την GAPDH ως εσωτερική αναφορά, η αλληλουχία εκκινητών ήταν η ακόλουθη. TGF- 1, εκκινητής αίσθησης: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, αντιπληροφοριακός εκκινητής: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3; E-cadherin, sense primer: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, antisense primer: 5-GGTGAATTCGGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, εκκινητής αίσθησης: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGGTC-3, αντιπληροφοριακός εκκινητής: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, εκκινητής αίσθησης: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, antisense primer: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, εκκινητής αίσθησης: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, αντιπληροφοριακός εκκινητής: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, εκκινητής αίσθησης: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, αντιπληροφοριακός εκκινητής: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, sense primer: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, antisense primer: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, sense primer: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, antisense primer: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT-3; Smad4, sense primer: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, antisense primer: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, sense primer: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, antisense primer: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, εκκινητής αίσθησης: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, αντιπληροφοριακός εκκινητής: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, εκκινητής αίσθησης: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, αντιπληροφοριακός εκκινητής: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.

2.11|Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα και η στατιστική ανάλυση συμμορφώνονται με τις συστάσεις για τον πειραματικό σχεδιασμό και την ανάλυση στη φαρμακολογία. Όλα τα πειράματα τυχαιοποιήθηκαν και τυφλώθηκαν. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως Μ ± SD/SEM του υποδεικνυόμενου αριθμού (n) ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα στην τρέχουσα μελέτη παρουσιάζονται ως M ± SD/SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η σημασία των διαφορών αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμασία Tukey (περισσότερες από δύο ομάδες) ή Student's t-test (δύο ομάδες). Οι δοκιμές post hoc εκτελούνται μόνο όταν το F πέτυχε p < .05="" και="" δεν="" υπήρχε="" σημαντική="" ανομοιογένεια="" διακύμανσης.="" όλες="" οι="" δοκιμές="" ήταν="" διπλής="" όψης="" και="" το="" p="">< 0,05="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="" σημαντικό.="" η="" στατιστική="" ανάλυση="" πραγματοποιήθηκε="" χρησιμοποιώντας="" το="" λογισμικό="" graphpad="" prism="">

Ακτεοσίδη Cistanche για τη βελτίωση των νεφρών

2.12|Συνθήκες UPLC-QTOF/MS και ανάλυση δεδομένων

Όλα τα δείγματα ορού αποψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την παρασκευή. Τα 3{17}}0 ul ακετονιτρίλιο προστέθηκαν σε δείγματα ορού 100 ul σε καταβυθισμένη πρωτεΐνη και αναμίχθηκαν έντονα για 60 δευτερόλεπτα. Όλα τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 13000 rpm για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς. Τέλος, το υπερκείμενο εγχύθηκε σε ανάλυση UPLC-QTOF/MS. Ο διαχωρισμός του μεταβολίτη πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) εξοπλισμένο με Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). Ένα κλάσμα 2 ul διαλύματος δείγματος εγχύθηκε σε Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2,1 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Milford, Connecticut) στους 35 βαθμούς και ο ρυθμός ροής ήταν 0,4 ml/min. Η βέλτιστη κινητή φάση αποτελούνταν από νερό (Α) (που περιέχει 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ) και ακετονιτρίλιο (Β). Οι βελτιστοποιημένες συνθήκες έκλουσης UPLC για ανάλυση ορού ήταν 0 3 λεπτά, 95 τοις εκατό 55 τοις εκατό Α. 4 13 min, 55 τοις εκατό 5 τοις εκατό A; 13 14 λεπτά, 5 τοις εκατό Α. Η αυτόματη δειγματοληψία διατηρήθηκε στις 4 μοίρες .

Η φασματομετρία μάζας διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), ένα τετράπολο και ένα διαδοχικό μετρητή μάζας ορθογώνιας επιτάχυνσης χρόνου πτήσης. Η λευκίνη-εγκεφαλίνη χρησιμοποιήθηκε ως η μάζα κλειδώματος που δημιουργούσε [Μ συν Η]^συνιόν (m/z 556,2771) και [ΜΗ]^-ιόν (m/z 554,2615) σε θετικό και αρνητικό τρόπο, αντίστοιχα. Η συγκέντρωση λευκίνης-εγκεφαλίνης ήταν 200 pg/ml και ο ρυθμός ροής έγχυσης ήταν 100 ul/min για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια κατά τη διάρκεια της ανάλυσης MS μέσω αντλίας σύριγγας. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν σε λειτουργία κέντρου από 100 έως 1,000 m/z. Και για τον θετικό και τον αρνητικό τρόπο ηλεκτροψεκασμού, η τάση τριχοειδούς και κώνου ορίστηκε στα 3,0 kV και 30 V, αντίστοιχα. Το αέριο αποδιάλυσης ρυθμίστηκε στα 600 L/hr σε θερμοκρασία 350 βαθμών, το αέριο κώνου ρυθμίστηκε στα 50 L/hr και η θερμοκρασία πηγής ρυθμίστηκε στους 120 βαθμούς. Ο ρυθμός απόκτησης δεδομένων ορίστηκε στα 30 ms, με καθυστέρηση 0,02 δευτερολέπτων.

Επιπλέον, 10 δείγματα ορού επιλέχθηκαν τυχαία από κάθε ομάδα και αναμίχθηκαν μαζί ως δείγματα ποιοτικού ελέγχου (QC), αντίστοιχα. Το δείγμα QC χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση της κατάστασης του UPLCQTOF/MS, καθώς περιείχε τις περισσότερες πληροφορίες ολόκληρου του δείγματος. Τα δείγματα QC εγχύθηκαν έξι φορές στην αρχή του τρεξίματος προκειμένου να συντηρηθεί ή να εξισορροπηθεί το σύστημα και στη συνέχεια ανά 10 δείγματα για περαιτέρω παρακολούθηση της σταθερότητας της ανάλυσης. Κάθε μέρα, μετά τη βαθμονόμηση του οργάνου, το δείγμα QC αναλύονταν αρχικά για να ελεγχθεί η σταθερότητα του οργάνου προκειμένου να διασφαλιστεί η σταθερή απόδοση του συστήματος.

Όλη η απόκτηση δεδομένων και οι αναλύσεις των δεδομένων ελέγχονταν από το λογισμικό Waters MassLynx v4.1. Ο πολυμεταβλητός πίνακας δεδομένων αναλύθηκε από το λογισμικό EZinfo 2.0 (Waters Corp.). Οι κύριες παράμετροι περιλαμβάνουν το εύρος χρόνου διατήρησης 0 14 min; λόγος μάζας m/z 100 1,000, εύρος ανοχής μάζας 0.{{10}}1 Da, όριο έντασης κορυφής 50, παράθυρο ποιότητας 0,05 Da, διατήρηση χρονικά παράθυρα 0,20 λεπτά και αυτόματη ανίχνευση 5 τοις εκατό ύψους κορυφής και θορύβου. Η ένταση κάθε ιόντος κανονικοποιήθηκε σε σχέση με τον συνολικό αριθμό ιόντων για να δημιουργηθεί ένας πίνακας δεδομένων που αποτελείται από τον χρόνο κατακράτησης, την τιμή m/z και την κανονικοποιημένη περιοχή κορυφής.

Οι προκύπτοντες πίνακες δεδομένων εισήχθησαν στο λογισμικό EZinfo 2.0 για ανάλυση κύριου στοιχείου, ανάλυση μερικής διάκρισης ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) και ορθογώνια προβολή σε λανθάνουσες δομές (OPLS-DA). Από το OPLS-DA, διάφοροι μεταβολίτες μπορούσαν να αναγνωριστούν ως υπεύθυνοι για το διαχωρισμό μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας μοντέλου και επομένως θεωρήθηκαν ως πιθανοί δείκτες. Οι πιθανοί δείκτες ενδιαφέροντος εξήχθησαν από S-plots που κατασκευάστηκαν μετά από ανάλυση με OPLS-DA και οι μεταβλητές που είχαν σημαντική συμβολή στη διάκριση μεταξύ των ομάδων υποβλήθηκαν σε περαιτέρω ταυτοποίηση του μοριακού τύπου.

Η σημασία της μεταβλητής (VIP) στην τιμή προβολής είναι ένα σταθμισμένο άθροισμα των τετραγώνων των βαρών PLS και οι μεταβλητές με VIP > 1 θεωρήθηκαν ότι επηρεάζουν τον διαχωρισμό των δειγμάτων στις γραφικές παραστάσεις βαθμολογίας που δημιουργούνται από την ανάλυση OPLS-DA. Σε όλα τα πειράματα, το επίπεδο εμπιστοσύνης ορίστηκε στο 95 τοις εκατό για να προσδιοριστεί η σημασία της διαφοράς (p < .{10}}5).="" αυτές="" οι="" μεταβλητές="" επιλέχθηκαν="" τελικά="" ως="" πιθανοί="" βιοδείκτες.="" τα="" διαγράμματα="" βαθμολογίας="" pls-da="" περιγράφηκαν="" από="" την="" παράμετρο="" διασταυρούμενης="" επικύρωσης="" r2y="" και="" q2,="" η="" οποία="" αντιπροσωπεύει="" τη="" συνολική="" επεξηγημένη="" παραλλαγή="" για="" τον="" πίνακα="" x="" και="" την="" προβλεψιμότητα="" του="" μοντέλου,="" αντίστοιχα.="" τα="" εξαιρετικά="" μοντέλα="" αποκτώνται="" όταν="" οι="" αθροιστικές="" τιμές="" των="" r2y="" και="" q2="" είναι="" πάνω="" από="" 0,8.="" οι="" σχετικές="" αποστάσεις="" μεταξύ="" των="" ομάδων="" χορήγησης="" και="" της="" ομάδας="" ελέγχου="" από="" την="" γραφική="" παράσταση="" βαθμολογίας="" pls-da="" υπολογίστηκαν="" με="" τη="" μέση="" τιμή="" (άξονας="" x="" και="" y-άξονας)="" όλων="" των="" δειγμάτων="" της="" ομάδας="" ελέγχου="" ως="" σημείο="">

Οι πιθανοί μεταβολίτες που επιλέχθηκαν ταυτοποιήθηκαν σύμφωνα με τον προσδιορισμό του ακριβούς m/z, του χρόνου κατακράτησης και του τυπικού θραύσματος MS/MS και του μοτίβου των δυνητικών βιοδεικτών παραπάνω, οι οποίοι ελήφθησαν στον τρόπο θετικού και αρνητικού ιόντος. Η κατασκευή της μεταβολικής οδού πραγματοποιήθηκε με το Metabo Analyst, το οποίο είναι ένα διαδικτυακό εργαλείο για την οπτικοποίηση της μεταβολομικής (https://www. metaboanalyst.ca/) που βασίζεται σε πηγές βάσης δεδομένων συμπεριλαμβανομένου του KEGG (HTTP:// www.genome .jp/kegg/) και τις βάσεις δεδομένων HMDB (http://www.hmdb. ca/) για αναζήτηση. Ο χρόνος κατακράτησης και το τυπικό θραύσμα και μοτίβο MS/MS είχαν μεγάλη χρησιμότητα για να περιορίσουν το εύρος των πιθανών μορίων.

Το Acteoside στο Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

3|ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Κάντε κλικ εδώ για πληροφορίες σχετικά με το Μέρος II (αποτελέσματα) αυτού του άρθρου.

Απόσπασμα από: « Ένα φυσικό προϊόν τουακτεοσίδηβελτιώνωνεφρική βλάβησε ποντίκια διαβήτη db/db και κύτταρα HK-2 μέσω ρυθμιστικής οδού σηματοδότησης NADPH/ οξειδάσης-TGF-/Smad' -----από Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

----Έρευνα φυτοθεραπείας. 2021; 35:5227-5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196