Το Acteoside που προέρχεται από το Cistanche Βελτιώνει την οστεοπόρωση που προκαλείται από γλυκοκορτικοειδή ενεργοποιώντας την οδό PI3K/AKT/mTOR
Dec 23, 2022
Αφηρημένη
Σκοπός
Τα γλυκοκορτικοειδή χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πράξη. ωστόσο, μπορεί να προκαλέσουν παρενέργειες, όπως π.χοστεοπόρωση. Ακτεοσίδη(ACT) από το Cistanche έχει χρησιμοποιηθεί για την καταπολέμηση ποικίλων ασθενειών. Η μελέτη διεξήχθη για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του ACT σε επαγόμενη από γλυκοκορτικοστεροειδήοστεοπόρωση(GIOP) και ο δυνητικός μηχανισμός του.
Μέθοδοι
Η δεξαμεθαζόνη (Dex) εγχύθηκε ενδομυϊκά για να προκληθείοστεοπόρωσησε ένα μοντέλο αρουραίου και το ACT χορηγήθηκε από το στόμα. Το ACT συμπληρώθηκε in vivo σε διεγερμένο με DexοστεοβλαστικήΚύτταρα MC3T3-Ε1. Πραγματοποιήθηκε RT-qPCR για την αξιολόγηση των επιπέδων mRNA τουσχηματισμός οστών(Runx2, CoL1A1) και οστική απορρόφηση (OPG και RANKL). Ένα εμπορικό κιτ ELISA εφαρμόστηκε για την αξιολόγηση των επιπέδων OC και CTX στον ορό. Πραγματοποιήθηκε στύπωμα Western για την αξιολόγηση των επιπέδων πρωτεΐνης στο μονοπάτι σηματοδότησης PI3K/AKT/mTOR. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμασία CCK-8 και κυτταρομετρία ροής για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των οστεοβλαστών και της απόπτωσης.
Αποτελέσματα
Το ACT μείωσε την επαγόμενη από το Dex αλλοίωση της οστικής μικροδομής, αύξησε τα επίπεδα OC στον ορό και μείωσε τα επίπεδα CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and προάγει την απόπτωση; Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα μετριάστηκε σημαντικά από το ACT (Π< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).
συμπέρασμα
ΔΡΑΣΗ απόΚιστάντσεμπορεί να ασκήσει οστεοπροστατευτικά αποτελέσματα ενεργοποιώντας το μονοπάτι σηματοδότησης PI3K/AKT/mTOR για την ανακούφιση της οστεοπόρωσης που προκαλείται από το Dex.
Λέξεις-κλειδιά:Ακτεοσίδη Κιστάντσεπου προκαλούνται από γλυκοκορτικοειδήοστεοπόρωση
Εισαγωγή
Η οστεοπόρωση (OP) είναι μια γενικευμένη σκελετική νόσος που χαρακτηρίζεται από χαμηλή οστική μάζα, καταστροφή της μικροδομής του οστικού ιστού και ανισορροπία στην ομοιόσταση των οστών [1]. Η ΟΠ προκαλεί περισσότερα από 8,9 εκατομμύρια κατάγματα ετησίως και τα οστεοπορωτικά κατάγματα συμβαίνουν σχεδόν κάθε 3 δευτερόλεπτα και οδηγούν σε δια βίου αναπηρία ή θάνατο [2]. Τα γλυκοκορτικοειδή (GCs) χορηγούνται συνήθως για τη θεραπεία μη μολυσματικών φλεγμονωδών ασθενειών (όπως το άσθμα και η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου) καθώς και των αυτοάνοσων καταστάσεων [3]. Ωστόσο, η μακροχρόνια χρήση GC προδιαθέτει σε περισσότερο από το 30 τοις εκατό των περιπτώσεων ΟΠ και περισσότερο από το 10 τοις εκατό των περιπτώσεων οστεονέκρωσης [4]. Τα GCs αναστέλλουν άμεσα τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών [5], μειώνουν την ωρίμανση και τη δραστηριότητα και προκαλούν απόπτωση των οστεοβλαστών, η οποία με τη σειρά της οδηγεί στην ανάπτυξη οστεοπόρωσης που προκαλείται από γλυκοκορτικοστεροειδή (GIOP) [6]. Επιπλέον, αυξανόμενα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η δυσλειτουργία των οστεοβλαστών είναι η κύρια αιτία απώλειας οστού. Ως εκ τούτου, η αύξηση του αριθμού και της λειτουργίας των οστεοβλαστών φαίνεται να είναι η κύρια στρατηγική για την πρόληψη της ΟΠ, ιδιαίτερα της GIOP.
Τα φυτικά φάρμακα, ειδικά αυτά που βασίζονται σε φυσικές ενώσεις, χρησιμοποιούνται εδώ και χιλιάδες χρόνια για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών [7]. Το Cistanche είναι ένα πολύτιμο βότανο που καταγράφεται στην Κινεζική Φαρμακοποιία που φύεται στη νότια περιοχή της Αυτόνομης Περιφέρειας των Ουιγούρων του Σιντζιάνγκ και είναι γνωστό ως τζίνσενγκ της ερήμου [8]. Το Cistanche έχει αποδειχθεί ότι έχει διάφορα αποτελέσματα, όπως ενίσχυση του ανοσοποιητικού, νεφρική προστασία, αντιγηραντική, αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη και νευροπροστατευτική δράση [9].ΑκτεοσίδηΤο (ACT) είναι ένας φαινυλαιθανολικός γλυκοζίτης στο Cistanche, ο οποίος έχει βιολογικές δραστηριότητες, όπως αναστολή της απόπτωσης των νευρώνων [10], ανακούφιση ηπατικής βλάβης [11], αντιφλεγμονώδης [12], αντιοξείδωση [13] , πρόληψη του διαβήτη [14] και της παχυσαρκίας [15], καθώς και του εκφυλισμού του αρθρικού χόνδρου [16]. Επιπλέον, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει τη φαρμακοκινητική του ACT και επιβεβαίωσαν ότι το θεραπευτικό αποτέλεσμα υπάρχει ακόμη και αν η από του στόματος χρήση είναι μόνο 0,12 τοις εκατό. Το ACT θεωρείται προφάρμακο με ενεργούς μεταβολίτες in vivo [17].
Οι Zhang et al. έδειξε μια πιθανή προστατευτική επίδραση του ACT στην απώλεια οστού που προκαλείται από ωοθηκεκτομή σε αρουραίους [18]. Το ACT ρυθμίζει το μονοπάτι σηματοδότησης IGF-1/PI3K/mTOR για την πρόληψη της απώλειας οστού σε διαβητικούς αρουραίους [19]. Η οδός PI3K/AKT/mTOR έχει αναφερθεί ότι έχει κρίσιμους ρυθμιστικούς ρόλους σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του GIOP [20]. Το Naringin ανακουφίζει το GIOP ρυθμίζοντας την οδό σηματοδότησης PI3K/AKT/mTOR [21]. Επιπλέον, αυτή η οδός σηματοδότησης ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών [22], τον σχηματισμό οστών [23] και την επούλωση κατάγματος [24]. Ωστόσο, ο πιθανός ρόλος του ACT στο GIOP και εάν ρυθμίζεται από τη διαμόρφωση της οδού σηματοδότησης PI3K/AKT/mTOR είναι άγνωστος.
Η παρούσα μελέτη στόχευε στην κατανόηση των προστατευτικών επιδράσεων του ACT σε ένα μοντέλο αρουραίου GIOP και σε οστεοβλάστες in vitro και να αποσαφηνίσει τους υποκείμενους μοριακούς μηχανισμούς.
Υλικά και μέθοδοι
πειραματόζωα
Σαράντα 8-αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (SD) εβδομάδων βάρους 280–340 g ελήφθησαν από το Shanghai Laboratory Animal Center (CAS, Σαγκάη, Κίνα). Οι διαδικασίες φροντίδας των πειραματόζωων διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Qiqihar. Και η μελέτη διεξήχθη σε συμφωνία με τις οδηγίες του ARRIVE. Τα ζώα στεγάστηκαν σε κέντρα ζώων χωρίς παθογόνα, 24 ± 2 μοίρες, 12 ώρες κύκλους φωτός και σκότους, υγρασία 50 ± 5 τοις εκατό και με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό.
Κατασκευή μοντέλου GIOP
Μετά από 7 ημέρες προσαρμοστικής σίτισης, οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και μοντέλα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του πίνακα τυχαίων αριθμών, εγχύθηκε δεξαμεθαζόνη (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, ΗΠΑ) 5 mg/kg δύο φορές την εβδομάδα για 6 εβδομάδες ενδομυϊκά για να προκληθεί OP σε αρουραίους στην ομάδα μοντέλου [25]. Οι αρουραίοι στην ομάδα ελέγχου (n = 10) έλαβαν ένεση με ίση ποσότητα φυσιολογικού ορού. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στο σωματικό βάρος στους αρουραίους και στις δύο ομάδες στις 6 εβδομάδες. Στη συνέχεια, οι αρουραίοι στην ομάδα μοντέλου υποδιαιρέθηκαν στην ομάδα μοντέλου, στην ομάδα χαμηλής δόσης ACT (Model συν ACT-L) και στην ομάδα ACT υψηλής δόσης (Μοντέλο συν ACT-H). Το ACT (HPLC 98 τοις εκατό) ελήφθη από την Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Κίνα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα υδατικό εναιώρημα διαλύτη. Μια δόση 50 mg/kg/ημέρα και 100 mg/kg/d ACT χορηγήθηκε από το στόμα σε αρουραίους στις ομάδες χαμηλής και υψηλής δόσης (8 αρουραίους ανά ομάδα), αντίστοιχα, και συνεχίστηκε για 8 εβδομάδες. Μεταξύ αυτών, το μέγεθος του δείγματος υπολογίστηκε με βάση μια προηγούμενη μελέτη [26]. Λαμβάνοντας υπόψη ένα αμφίπλευρο επίπεδο σημαντικότητας 0,05 [95 τοις εκατό διάστημα εμπιστοσύνης ( = 0,05)], 80 τοις εκατό ισχύ και ένα μέγεθος επίδρασης 0,5, η ανάλυση ισχύος υπολόγισε ένα απαραίτητο μέγεθος δείγματος 6 ζώων ανά ομάδα υποθέτοντας σχετικό επίπεδο επίδρασης 30 τοις εκατό οστεοπόρωσης. Επιπλέον, με ποσοστό εγκατάλειψης 20 τοις εκατό, 8 ζώα ανά ομάδα (σύνολο 32 επίμυες) θεωρήθηκαν ιδανικά.
Δείγματα ορού αρουραίων
Μετά από 8 εβδομάδες, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με 10 τοις εκατό ένυδρη χλωράλη (400 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκά, Solarbio, Beijing China), συλλέχθηκε αίμα από την κοιλιακή αορτή, θρομβώθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρήθηκε στις 3500 rpm/min για 10 λεπτά. Ο ορός αποθηκεύτηκε σε φυγοκεντρικούς σωλήνες 1,5 mL μέχρι περαιτέρω χρήση.
Εκτίμηση οστικής πυκνότητας
Η οστική πυκνότητα (BMD) χρησιμοποιήθηκε από ένα πυκνόμετρο οστών μικρών ζώων DAX (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, Κίνα). Εν συντομία, οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση και τα πίσω άκρα τοποθετήθηκαν προς τα έξω. Το δεξί μηριαίο οστό των αρουραίων σαρώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και καταγράφηκαν οι τιμές BMD [27].
Ανάλυση μορφολογίας οστών
Στο τέλος του πειράματος, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση περίσσειας ένυδρης χλωράλης και τα μηριαία οστά στερεώθηκαν σε 70 τοις εκατό αιθανόλη. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν σαρώσεις σε σύστημα VivaCT 40μCT όπως περιγράφηκε σε προηγούμενη μελέτη και ο όγκος/συνολικός όγκος οστού (BV/TV), ο αριθμός δοκιδωτών οστών (Tb.N), το πάχος του δοκιδωτού οστού (Tb.Tn) και ο διαχωρισμός των οστών. (Tb.Sp) αξιολογήθηκαν [28]. Για την ευθανασία, οι αρουραίοι SD αναισθητοποιήθηκαν μετά την ανάλυση μορφολογίας των οστών με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 10 τοις εκατό ένυδρης χλωράλης (350 mg/kg).
Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA)
Εμπορικά κιτ ELISA χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση επιπέδων οστεοκαλσίνης (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) και C-τερματικού τελοπεπτιδίου (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) στον ορό αρουραίων. Εν συντομία, τα αντιδραστήρια απομακρύνθηκαν σε βαθμό 18-25 για να εξισορροπηθεί και να προετοιμαστεί το διάλυμα για πλύσιμο και τυπική επεξεργασία. Πλάκες ενζύμων Οι πλάκες στήθηκαν με τυπικά, τυφλά και φρεάτια δείγματος. Περίπου 100 μL διαλύματος αραιωτικού δείγματος προστέθηκαν στα φρεάτια, επωάστηκαν για 90 λεπτά στους 37 βαθμούς και αντικαταστάθηκαν με βιοτινυλιωμένο αντίσωμα για 60 λεπτά στους 37 βαθμούς. Μετά το πλύσιμο, το διάλυμα εργασίας που δεσμεύει το ένζυμο προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά. Προστέθηκε το διάλυμα υποστρώματος (90 μL) και επωάστηκε για 15 λεπτά με προστασία από το φως. Όταν η μπλε κλίση εμφανίστηκε στα τυπικά φρεάτια, προστέθηκαν 50 μL του διαλύματος τερματισμού και αναλύθηκε η αλλαγή στο OD450.
Αντίστροφη μεταγραφή-ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR)
Το αντιδραστήριο TRlzol LS προστέθηκε στον ορό των αρουραίων και των κυττάρων MC3T3-Ε1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ACT και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε με επώαση σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθήθηκε από την προσθήκη χλωροφορμίου. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του RNA επιβεβαιώθηκαν με μέτρηση της απορρόφησης Α260/280 σε φασματοφωτόμετρο Nanodrop ND-1000. Το κιτ SuperScript II Reverse Transcriptase χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε cDNA. Ακολούθως, εφαρμόστηκε cDNA ως πρότυπο, προστέθηκε εκκινητής και το κύριο κιτ μείγματος SYBR-Green PCR αναμίχθηκε και συμπληρώθηκε με ddH2O σε 20 μL και η αντίδραση ενίσχυσης PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR σύστημα (ABI, CA, ΗΠΑ). Το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά για κανονικοποίηση και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2−ΔΔCt και εκτελέστηκαν εις τριπλούν. Η αλληλουχία εκκινητών για τον μεταγραφικό παράγοντα 2 που σχετίζεται με το Runt (Runx2), το κολλαγόνο τύπου I 1 (CoL1A1), τον ενεργοποιητή υποδοχέα του συνδέτη πυρηνικού παράγοντα-κΒ (RANKL), το osterix και την οστεοπρωτεγερίνη (OPG) παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.
Ανάλυση Western-blot
Προϊόν λύσης RIPA που περιείχε 1 τοις εκατό αναστολέα πρωτεάσης προστέθηκε στα κύτταρα και η συνολική πρωτεΐνη από κάθε ομάδα συλλέχθηκε μετά τη λύση των κυττάρων με ανακίνηση για 5 λεπτά στους 4 βαθμούς. Χρησιμοποιήθηκε κιτ δοκιμασίας BCA για να ποσοτικοποιηθεί η συγκέντρωση πρωτεϊνών σε κάθε ομάδα. Κατόπιν αυτού, τα δείγματα πρωτεΐνης αναμίχθηκαν με 10 τοις εκατό ρυθμιστικό διάλυμα δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS) σε ίσο όγκο και βράστηκαν σε λουτρό νερού στους 95 βαθμούς για 5 λεπτά για μετουσίωση πρωτεΐνης. Παρασκευάστηκε ένα κατακόρυφο πήκτωμα 12 τοις εκατό SDS-πολυακρυλαμιδίου και αφού το πήκτωμα στερεοποιήθηκε, λήφθηκαν δείγματα 30 ug πρωτεΐνης για τον διαχωρισμό ηλεκτροφόρησης γέλης 120 mA 90 λεπτών. Η πρωτεΐνη στη συνέχεια μεταφέρθηκε στη μεμβράνη PVDF στα 90 V για 120 λεπτά. Μετά από σφράγιση με 5 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού, η μεμβράνη PVDF κόπηκε με βάση το μοριακό βάρος του δείκτη και της ζώνης πρωτεΐνης στόχου και επωάστηκε με το αντίστοιχο πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Τα πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού κατά των p-AKT, p-mTOR και p-PI3K αραιώθηκαν σε αναλογία 1:1000 (Proteintech, Wuhan, Κίνα). Το TBST πλύθηκε για 30 λεπτά και επωάστηκε με το αντίστοιχο δευτερεύον αντίσωμα σημασμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Το στύπωμα οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. Η πυκνότητα των ζωνών πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την Εικόνα J. Η GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων πρωτεΐνης.
Κυτταρική καλλιέργεια και ομαδοποίηση
Οι προ-οστεοβλάστες ποντικού MC3T3-E1 αγοράστηκαν από τις κινεζικές συλλογές καλλιέργειας ιστών (CTCC, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε -MEM που περιείχε 10 τοις εκατό ορό εμβρύου βοοειδών και 100 U/mL πενικιλλίνη και 100 mg/mL στρεπτομυκίνης σε υγροποιημένος επωαστήρας στους 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2. Για καλλιέργεια οστικής διαφοροποίησης, το μέσο οστεογονικής επαγωγής παρασκευάστηκε με ανάμειξη 10 mM- -γλυκεροφωσφορικού και 50 mg/mL ασκορβικού οξέος (Sigma-Aldrich) με -MEM και προστέθηκε στα κύτταρα MC3T3-Ε1 για πρόκληση τη διαφοροποίησή τους. Το μέσο άλλαξε μετά από 3 ημέρες. Καλλιέργειες για 14 ημέρες χρησιμοποιήθηκαν για βιωσιμότητα αλκαλικής φωσφατάσης (ALP). Επιπλέον, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τον αναστολέα PI3K LY294002 (10 μΜ) για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από επεξεργασία με Dex και ACT.
Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων
Η δοκιμασία κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8) πραγματοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των οστεοβλαστών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ACT. Τα κύτταρα MC3T3-Ε1 εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 5 χ 103 κύτταρα/φρεάτιο. Μια ποσότητα 1 μΜ Dex εξετάστηκε με βάση προηγούμενες μελέτες [29] και συνεπωάστηκε με βαθμιδωτή συγκέντρωση ACT (10−8, 10−7, 10−6 και 10−5 M). Το μέσο καλλιέργειας στις πλάκες 96-πηγαδιού αντικαταστάθηκε μετά την προσθήκη ενός μέσου ανάμειξης και του αντιδραστηρίου CCK-8 σε αναλογία 10:1. Μετά από συνεχιζόμενη επώαση για 1 ώρα στους 37 βαθμούς, αξιολογήθηκε η αλλαγή στο OD450.
Ανίχνευση αριθμού απόπτωσης οστεοβλαστών
Τα κύτταρα MC3T3-Ε1 που υποβλήθηκαν σε διαφορετικές κατεργασίες υποβλήθηκαν σε πέψη χρησιμοποιώντας θρυψίνη χωρίς EDTA και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Μετά από πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1 ×, προστέθηκαν 5 μL Annexin V-FITC και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά, συμπληρώθηκαν με 5 μL PI και περασμένα από ένα 200-πλέγμα νάιλον. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα κυτταρομετρίας ροής FACScan.
Δοκιμασία δραστικότητας ALP
Τα κύτταρα MC3T3-Ε1 ενοφθαλμίστηκαν σε τρυβλία 24-πηγαδιού και προστέθηκαν ACT και Dex μετά το έμπλαστρο. Το μέσο κυτταροκαλλιέργειας αντικαταστάθηκε με ένα μέσο οστεογονικής διαφοροποίησης για καλλιέργεια. Μετά τη χρήση λύσης κυττάρων με διάλυμα κυτταρικής λύσης (P0012J, Beyotime Biotechnology), το υπερκείμενο συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και η πρότυπη καμπύλη σχεδιάστηκε. Ένα κιτ ALP (P0132S, Beyotime Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της δραστικότητας ALP και υπολογίστηκε το OD450.
Στατιστική ανάλυση
Μετά την εκτέλεση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν, τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 6.0 και εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Χρησιμοποιήθηκε ANOVA για τη σύγκριση στατιστικών διαφορών μεταξύ πολλαπλών ομάδων. Η τιμή P < 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά διαφορετική.
