Ένα νέο πεπτίδιο που προέρχεται από Netrin-1-ενισχύει την προστασία από τον θάνατο των νευρώνων και μετριάζει την ενδοεγκεφαλική αιμορραγία σε ποντίκια Μέρος 1

Περίληψη:

Έχει αναφερθεί ότι το Netrin-1 εμπλέκεται στη νευροπροστασία μετά από τραυματισμό του κεντρικού νευρικού συστήματος. Ωστόσο, ο ελάχιστος λειτουργικός τομέας του Netrin-1 που μπορεί να διατηρήσει τη νευροπροστασία αλλά να αποφύγει τις κύριες παρενέργειες του Netrin παραμένει άγνωστος.

Το κεντρικό νευρικό σύστημα είναι ένα από τα πιο σημαντικά νευρικά συστήματα στο ανθρώπινο σώμα, το οποίο ελέγχει τη σκέψη, τα συναισθήματα και τις πράξεις των ανθρώπων. Όταν το κεντρικό νευρικό σύστημα είναι κατεστραμμένο, θα επηρεαστεί και η μνήμη των ανθρώπων. Αλλά μην ανησυχείτε, μπορούμε να ακολουθήσουμε μερικούς θετικούς τρόπους για να βοηθήσουμε στην αποκατάσταση της μνήμης.

Πρώτα, πρέπει να κατανοήσετε τον αντίκτυπο της βλάβης της μνήμης. Η βλάβη στο κεντρικό νευρικό σύστημα μπορεί να επηρεάσει τις γνωστικές ικανότητες, τις διαδικασίες σκέψης και την προσοχή των ανθρώπων, τα οποία επηρεάζουν άμεσα τη μνήμη των ανθρώπων. Επιπλέον, η βλάβη στο κεντρικό νευρικό σύστημα μπορεί επίσης να προκαλέσει συναισθηματική αστάθεια, κάνοντας τους ανθρώπους πιο επιρρεπείς σε πανικό, άγχος και κατάθλιψη, επηρεάζοντας έτσι την ανάκτηση της μνήμης.

Ωστόσο, αν και η βλάβη στο κεντρικό νευρικό σύστημα μπορεί να επιφέρει ορισμένες αρνητικές επιπτώσεις, μπορούμε να λάβουμε ορισμένα θετικά μέτρα για την προώθηση της ανάκτησης της μνήμης. Αρχικά, μπορούμε να δοκιμάσουμε κάποια γνωστική εκπαίδευση, όπως ανάγνωση, γραφή και επίλυση γρίφων. Αυτές οι δραστηριότητες μπορούν να διεγείρουν τον εγκέφαλο να παράγει νέους νευρώνες και να βοηθήσουν τον εγκέφαλο να δημιουργήσει νέες αναμνήσεις και τρόπους σκέψης.

Δεύτερον, μπορούμε επίσης να προωθήσουμε την ανάκτηση της μνήμης μέσω κάποιας σωματικής άσκησης. Μελέτες έχουν δείξει ότι η σωστή άσκηση μπορεί να τονώσει τον εγκέφαλο να παράγει νέους νευρώνες και νευρωνικές συνδέσεις και να προωθήσει την επεξεργασία νέων πληροφοριών από τον εγκέφαλο. Αυτός είναι ο λόγος που μερικοί άνθρωποι σκέφτονται ξαφνικά μια καλή ιδέα ή λύνουν ένα δύσκολο πρόβλημα ενώ τρέχουν ή περπατούν.

Τέλος, πρέπει να προσέξουμε τον ρόλο της σωστής διατροφικής πρόσληψης στη μνήμη. Η κανονική λειτουργία του εγκεφάλου απαιτεί ορισμένα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά, όπως πρωτεΐνες, βιταμίνες και ιχνοστοιχεία. Εάν το φαγητό μας στερείται αυτών των θρεπτικών συστατικών, θα επηρεάσει τη μνήμη και την ικανότητα σκέψης μας. Επομένως, θα πρέπει να επιλέγουμε κάποιες τροφές πλούσιες σε αυτά τα θρεπτικά συστατικά στη διατροφή μας, όπως ψάρια, άπαχο κρέας, λαχανικά και φρούτα.

Εν ολίγοις, η βλάβη στο κεντρικό νευρικό σύστημα θα έχει κάποιο αντίκτυπο στη μνήμη των ανθρώπων, αλλά μπορούμε να προωθήσουμε την ανάκτηση της μνήμης μέσω της σωστής γνωστικής εκπαίδευσης, της σωματικής άσκησης και του ελέγχου της διατροφής. Ελπίζω ότι όλοι μπορούν να αντιμετωπίσουν τις προκλήσεις στη ζωή θετικά, να διατηρήσουν μια αισιόδοξη στάση και να προσπαθήσουν να αποκαταστήσουν ένα υγιές κεντρικό νευρικό σύστημα και καλή μνήμη. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή το Cistanche είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο με πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του Cistanche προέρχεται από τα διάφορα ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ., τα οποία μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με πολλούς τρόπους.

Κάντε κλικ στο Γνωρίζω για να βελτιώσετε τη βραχυπρόθεσμη μνήμη

Εδώ, διερευνήσαμε το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα ενός πεπτιδίου Ε1 που προέρχεται από τον τομέα EGF3 του Netrin-10 (υπολείμματα 407-422). Διαπιστώσαμε ότι αλληλεπιδρά με το διαγραμμένο ορθοκολικό καρκίνωμα (DCC) για να ενεργοποιήσει τη φωσφορυλίωση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης που παρουσιάζει νευροπροστασία.

Η χορήγηση του πεπτιδίου Ε1 μπόρεσε να βελτιώσει τη λειτουργική ανάκτηση μέσω μειωμένης απόπτωσης σε πειραματικό μοντέλο ενδοεγκεφαλικής αιμορραγίας σε ποντικό (ICH).

Συνοπτικά, αποκαλύπτουμε μια λειτουργική αλληλουχία Netrin-1 που εμπλέκεται στη διαδικασία ανάκτησης μετά από ICH και προσδιορίζουμε ένα υποψήφιο πεπτίδιο για τη θεραπεία της ICH.

Λέξεις-κλειδιά: ενδοεγκεφαλική αιμορραγία; αιμίνη; νευροπροστασία? Netrin-1; πεπτίδιο.

1. Εισαγωγή

Η ενδοεγκεφαλική αιμορραγία (ICH) είναι ένας καταστροφικός υποτύπος εγκεφαλικού με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας και νοσηρότητας [1-3] που περιλαμβάνει ανώμαλη ρήξη εγκεφαλικών αιμοφόρων αγγείων εντός του εγκεφάλου [4,5].

Η χειρουργική αφαίρεση των αιματωμάτων προτιμάται για την επίτευξη αιμόστασης και την ανακούφιση της ενδοκρανιακής πίεσης [6]. Ωστόσο, τα υπολείμματα αιμάτων και τα προϊόντα διάσπασης του αίματος μπορούν ακόμα να προάγουν δευτερογενή εγκεφαλική βλάβη μετά από ICH, προκαλώντας νευρωνική βλάβη και καθυστερώντας τη λειτουργική αποκατάσταση [7-9].

Έτσι, η ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών που στοχεύουν τη δευτερογενή νευρωνική βλάβη που προκαλείται από εγκεφαλικό τραυματισμό θα ήταν ευεργετική για τη θεραπεία του εγκεφαλικού. διαγράφεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου (DCC) και στο UNC5H (μη συντονισμένο-5 ομόλογο) για την ενεργοποίηση της κυτταρικής επιβίωσης, διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού [13-15].

Οι υποδοχείς επάγουν ένα σήμα θανάτου για να μεσολαβήσουν στην απόπτωση όταν το Netrin-1 απουσιάζει [16]. Είναι γνωστό ότι η δέσμευση του Netrin-1 με το DCC έχει ως αποτέλεσμα διμερισμό του DCC και εκκινεί τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 861 της εστιακής προσκολλητίνης (FAK) για να επάγει την ανάπτυξη νευρίτη και την αξονική καθοδήγηση [17,18].

Η σύνδεση του Netrin-1 με το DCC περιλαμβάνει τον τομέα EGF3 του Netrin-1 και τον τομέα FN5 του DCC στην ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Netrin-1 [19,20]. Πρόσφατα, το Netrin-1 έδειξε ότι ασκεί νευροπροστατευτικά αποτελέσματα σε ισχαιμικές περιοχές [21].

Το επίπεδο έκφρασης του Netrin-1 στον ορό, το οποίο αναστέλλει την κυτταρική απόπτωση και προάγει την αναγέννηση των νευρώνων, συσχετίζεται θετικά με την ανάρρωση του ασθενούς από ισχαιμικό εγκεφαλικό [22,23].

Είναι ενδιαφέρον ότι η μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων μυελού των οστών που εκκρίνουν Νετρίνη-1 στο κατεστραμμένο ισχιακό νεύρο του αρουραίου ξεκινά την αναγέννηση των νευραξόνων [24] και μειώνει τον θάνατο του κινητικού νευρώνα [25]. Η στερεοταξική ένεση της πρωτεΐνης Netrin-1 στις κοιλίες μειώνει τον θάνατο των νευρικών κυττάρων μετά από υπαραχνοειδή αιμορραγία μέσω της ενεργοποίησης της σηματοδότησης DCC/APPL1/AKT [26].

Ένα πολυπεπτίδιο που προέρχεται από την περιοχή EGF3 του Netrin-1 (αμινοξέα 423-433) ενεργοποιεί σημαντικά τη φωσφορυλίωση ERK και προάγει την παραγωγή ΝΟ, το οποίο έχει καρδιοπροστατευτικά αποτελέσματα [27,28]. Ωστόσο, η Netrin-1 έχει αναγνωριστεί ως πιθανός βιοδείκτης για την ογκογένεση [29-31] επειδή η ρύθμιση της κατάστασης Netrin-1 βρίσκεται σε πολλαπλούς καρκίνους που προέρχονται από ιστούς [32].

Όταν η Netrin-1 συνδέεται με τον υποδοχέα της DCC ή Unc5H, οι υποδοχείς μεταφέρουν ένα θετικό σήμα που οδηγεί σε επιβίωση, φλεγμονή, αγγειογένεση και αντι-απόπτωση, η οποία με τη σειρά της ρυθμίζει την ογκογένεση [31].

Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να προσδιοριστεί ο ελάχιστος λειτουργικός τομέας του Netrin-1 που μπορεί να διατηρήσει τη νευροπροστασία και να αποφύγει τις κύριες παρενέργειες του Netrin-1.Εδώ, βρήκαμε ότι το πεπτίδιο Ε1 (υπολείμματα 407-422), που προέρχεται από τον τομέα EGF3 του Netrin-1, αλληλεπιδρά με το DCC για την προστασία των νευρώνων από την επαγόμενη από την αιμίνη τοξικότητα.

Σε ένα πειραματικό μοντέλο ποντικών ICH, η εφαρμογή του πεπτιδίου Ε1 βελτίωσε τη λειτουργική ανάκτηση, όπως προσδιορίστηκε από προσδιορισμούς συμπεριφοράς. Επιπλέον, το πεπτίδιο Ε1 μπορεί να αποτρέψει τον εκφυλισμό των νευρώνων μετά από ICH.

Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, εντοπίσαμε μια λειτουργική αλληλουχία του Netrin-1 που εμπλέκεται στην ανάκτηση μετά από ICH και προσδιορίσαμε ότι αυτό το πεπτίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της ICH.

2. Αποτελέσματα

2.1. Ο τομέας EGF3 είναι κρίσιμος για την αλληλεπίδραση Netrin-DCC

Το Netrin-1 αποτελείται από έναν τομέα VI, τρεις επαναλήψεις EGF και έναν C-τερματικό τομέα [33]. Η κρυσταλλική δομή του συμπλέγματος ανθρώπινου Netrin-1/DCC αποκαλύπτει ότι ο τομέας Netrin-1 EGF3 είναι κρίσιμος για την αλληλεπίδραση Netrin{-1/DCC, αλλά όχι οι τομείς EGF1 και EGF2 [34].

Η μεταλλαξιογένεση βασικών υπολειμμάτων αμινοξέων (His407, Gln442 ή Gln443) στην περιοχή EGF3 διέκοψε πλήρως τη δέσμευση Netrin-1/DCC [19]. Οι τομείς EGF1/2 απαιτούνται για τη μετάβαση της ελκυστικής σηματοδότησης σε απωθητική σηματοδότηση όταν το Unc5 συνυπάρχει με το DCC [20].

Έτσι, δημιουργήσαμε αρχικά κατασκευές πλήρους μήκους και EGF3-διαγραμμένες (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 (Εικόνα 1Α) και εκφράσαμε παροδικά αυτές τις κατασκευές σε καλλιεργημένα κύτταρα HEK293T για GSTpulldown .

Παρατηρήθηκε δέσμευση για τα κατασκευάσματα που εξέφραζαν Netrin-1 αλλά όχι Netrin-1(∆407–443) (Εικόνα 1C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο τομέας του EGF3 που περιέχει αμινοξέα 407-443 είναι υπεύθυνος για την αλληλεπίδραση του Netrin-1 με το DCC. Για να διερευνήσουμε τον ρόλο του τομέα EGF3 στο Netrin-DCC, καθαρίσαμε πρώτα το myc-taggedNetrin{{12 }} ή περικομμένο Netrin-1 (∆407–443) (Εικόνα 1Β).

Στη συνέχεια, κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που φέρει DCC cDNA και επωάστηκαν με πρωτεΐνη Netrin-1 και στη συνέχεια η σύνδεση Netrin-1 αξιολογήθηκε με ανοσοχρώση.

Βρήκαμε ότι η πλήρους μήκους Netrin-1, αλλά όχι η περικομμένη Netrin-1, ήταν σε θέση να συνδεθεί με το DCC στην πλασματική μεμβράνη (Εικόνα 1D). Για να προσδιορίσουμε εάν η περιοχή EGF3 μπορεί να αλληλεπιδράσει με το DCC, δημιουργήσαμε ένα κατασκεύασμα GST-EGF3 για να αφαιρέσουμε τα λυμένα κύτταρα που υπερεκφράζουν DCC. Παρατηρήσαμε ειδική δέσμευση του DCC με GST-EGF3 (Εικόνα 1Ε).

Επιπλέον, συνθέσαμε το σημασμένο με FITC πεπτίδιοEGF3 και επιβεβαιώσαμε ότι, όπως το πλήρους μήκους Netrin-1, ήταν σε θέση να συνδεθεί με το DCC στη μεμβράνη πλάσματος (Εικόνα 1F). Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι ο τομέας EGF3 είναι υπεύθυνος για την αλληλεπίδραση του Netrin-1 με το DCC.

2.2. Ο τομέας EGF3 προκαλεί φωσφορυλίωση των οδών προς τα κάτω του Netrin-1

Η αλληλεπίδραση του Netrin-1 και του DCC ενεργοποιεί πολλαπλές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων των FAK, SFK και ERK [16,35]. Η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) είναι μια από τις κύριες δραστηριότητες τυροσινοφωσφορυλίωσης που συνδέεται με τη σηματοδότηση Netrin-1/DCC.

Η Netrin-1 ενεργοποιεί τη φωσφορυλίωση FAK και τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης της οικογένειας Src (SFKs) [17]. Τόσο τα μονοπάτια σηματοδότησης FAK όσο και SFK παίζουν καθοριστικό ρόλο στο αναπτυξιακό στάδιο του νευρικού συστήματος και στην αποκατάσταση τραυματισμών [36,37]. Επιπλέον, η Netrin-1 μπορεί να ενεργοποιήσει την εξωκυτταρικά σήματα ρυθμιζόμενη κινάση-1/2 (ERK1/2), η οποία μεσολαβεί στη δράση του μονοπατιού της ενεργοποιούμενης από μιτογόνο πρωτεΐνης κινάσης (MAPK) [38-40].

Για να διερευνηθεί εάν ο τομέας EGF3 είναι κρίσιμος για την ενεργοποίηση των καθοδικών οδών σηματοδότησης μέσω της δέσμευσης του Netrin-1 στο DCC, εξετάσαμε πρώτα την επίδραση του τομέα EGF3 στη φωσφορυλίωση τυροσίνης 861 του FAK (Εικόνα 2Α) . Βρήκαμε ότι η διαγραφή του EGF3 ανέστειλε τη φωσφορυλίωση του FAK σε καλλιεργημένους φλοιώδεις νευρώνες (Εικόνα 2Β, Γ), επιβεβαιώνοντας έτσι έναν ουσιαστικό ρόλο για τον EGF3 στο μονοπάτι σηματοδότησης Netrin-1.

Στη συνέχεια, οι καλλιεργημένοι νευρώνες του φλοιού διεγέρθηκαν με την πρωτεΐνη σύντηξης GST-EGF3 για 20 λεπτά και το western blotting επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι η θεραπεία με την πρωτεΐνη σύντηξης GST-EGF3 προκάλεσε φωσφορυλίωση FAK, ERK και SFK (Εικόνα 2D-G).

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο τομέας EGF3 του Netrin-1 λειτουργεί ως ισχυρός διεγέρτης για την ενεργοποίηση οδών σηματοδότησης κατάντη.

Εικόνα 1. Ο τομέας EGF3 του Netrin-1 είναι η κρίσιμη περιοχή για την αλληλεπίδραση Netrin-1/DCC. (Α) Εικονογραφήσεις κατασκευών Netrin-1. Οι δομές Netrin-1 είναι Netrin-1 πλήρους μήκους, Netrin-1-(∆407–443) και GST-EGF3. (Β) Καθαρισμένη Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His ποσοτικοποιήθηκε μέσω σύγκρισης με την τυπική καμπύλη BSA. (Γ) Ανοσοκηλίδωση του pull-down κλάσματος από την πρωτεΐνη σύντηξης του τομέα GST-DCC FN5 και μόνο GST. (D) Εικόνες ανοσοφθορισμού κυττάρων Flag-DCC που εκφράζουν 293Τ κύτταρα επωασμένα με μέσο ελέγχου, Netrin-1-myc/his και Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his για 30 λεπτά, αντίστοιχα, και την ποσοτική ανάλυση. Μπάρα κλίμακας, 10 μm. (Ε) Ανοσοκηλίδωση του pull-down κλάσματος από την πρωτεΐνη σύντηξης GST-EGF3 και GST μαζί. (ΣΤ) Εικόνες ανοσοφθορισμού κυττάρων Flag-DCC που εκφράζουν 293Τ επωασμένα με μέσο ελέγχου και σημασμένο με FITC Pep EGF3 για 30 λεπτά, αντίστοιχα, και την ποσοτική ανάλυση. Μπάρα κλίμακας, 10 μm.

Εικόνα 2. Ο τομέας EGF3 ενεργοποιεί τα κατάντη μονοπάτια του Netrin-1. (Α) Πειραματική διαδικασία. (Β) Οι νευρώνες του φλοιού (E17 και DIV3) διεγέρθηκαν με Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) ή μέσο ελέγχου για 20 λεπτά. Τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με ένα αντίσωμα αντι-p-FAK-861 για να επιβεβαιωθεί η δραστηριότητα Netrin-1. (Γ) Η ποσοτική ανάλυση των αποτελεσμάτων western blot φαίνεται στο (Β). n=3. (D) Οι νευρώνες του φλοιού (DIV3) υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1,5 μΜ GST (+), 1,5 μΜ GST-EGF3 πρωτεΐνη σύντηξης (+) ή 1,5 μΜ Νετρίνη-1 (+) για 20 λεπτά. Τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 και anti-p-ERK-202/204.(E–G) Ποσοτική ανάλυση του western αποτελέσματα στυπώματος που φαίνονται στο (D). n=3. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Χρησιμοποιήθηκε ANOVA μονής κατεύθυνσης για όλες τις στατιστικές αναλύσεις που φαίνονται σε αυτό το σχήμα (* p < 0,05, ** p < 0,01, ns, μη σημαντικό). Λεπτομέρειες της ανάλυσης δεδομένων φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

2,3 πεπτίδια Ε1 και Ε2 αλληλεπιδρούν με το DCC για να ενεργοποιήσουν την οδό σηματοδότησης προς τα κάτω του Netrin-1

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, ένα μικρό πεπτίδιο που προέρχεται από την περιοχή EGF3 της Netrin-1 (αμινοξέα 423-433) προκάλεσε φωσφορυλίωση ERK [27]. Συνθέσαμε τα πεπτίδια Ε1 (υπολείμματα 407-422) και Ε2 (υπολείμματα 423-433) που προήλθαν από την περιοχή EGF3 της Netrin-1 (Εικόνα 3Α).

Βρήκαμε ότι η επώαση του πεπτιδίου Ε1 αύξησε τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου FAK και SFK (Εικόνα 3Β, D, Ε) στα κύτταρα καλλιέργειας με τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση, αλλά δεν άλλαξε τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK (Εικόνα 3Β, F).

Σε αντίθεση με το πεπτίδιο Ε1, το πεπτίδιο Ε2 όχι μόνο προκάλεσε τη φωσφορυλίωση τυροσίνης του FAK (Εικόνα 3C, G) και τη φωσφορυλίωση τυροσίνης του SFK (Εικόνα 3C, Η) αλλά επίσης προκάλεσε τη φωσφορυλίωση τυροσίνης του ERK (Εικόνα 3C, Cortical I) σε καλλιέργεια νευρώνων.

Το πεπτίδιο ελέγχου (Pep Ctrl) δεν είχε ανιχνεύσιμη επίδραση στη φωσφορυλίωση τυροσίνης των FAK, SFK και ERK (Εικόνα S1). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η φωσφορυλίωση των συστατικών της οδού σηματοδότησης FAK που προκλήθηκε από το πεπτίδιο Ε1 ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο (Εικόνα S2). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα Ε1 και Ε2 είναι τα ελάχιστα λειτουργικά πεπτίδια του Netrin-1.

Σχήμα 3. Οι ελάχιστες αλληλουχίες του τομέα EGF3 ενεργοποιούν τα κατάντη μονοπάτια του Netrin-1. (Α) Απεικονίσεις των πεπτιδίων. (Β) Οι νευρώνες του φλοιού (DIV3) διεγέρθηκαν με βαθμιδωτή συγκέντρωση του πεπτιδίου Ε1. Τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 και anti-p-ERK-202/204. (Γ) Οι καλλιεργημένοι νευρώνες του φλοιού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βαθμιδωτή συγκέντρωση του πεπτιδίου Ε2.

Τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα για τη μέτρηση της φωσφορυλίωσης των FAK, SFK και ERK. (D–F) Η ποσοτικοποίηση της έκτασης της φωσφορυλίωσης FAK, SFK και ERK που προκαλείται από το πεπτίδιο Ε1 σε νευρώνες φαίνεται στο (Β). n=3. (G–I) Η ποσοτικοποίηση της έκτασης της φωσφορυλίωσης FAK, SFK και ERK που προκαλείται από το πεπτίδιο Ε2 φαίνεται στο (C). n=3. (J) Οι νευρώνες του φλοιού που προέρχονται από μεταλλαγμένα έμβρυα άγριου τύπου DCC και ομοζυγώτες διεγέρθηκαν με πεπτίδια που προέρχονται από Netrin-1 ή Netrin-1- και υποβλήθηκαν σε λύση.

Τα προκύπτοντα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωμα. (K) Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων FAK PY{{0}} και DCC σε μεταλλαγμένους νευρώνες DCC φαίνεται στο (J). n=3. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA για όλες τις στατιστικές αναλύσεις που φαίνονται σε αυτό το σχήμα (* p < 0,05;ns, μη σημαντικό). Λεπτομέρειες για την ανάλυση δεδομένων φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

Για να προσδιορίσουμε εάν η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης FAK εξαρτάται από το DCC, μετρήσαμε την έκταση της φωσφορυλίωσης τυροσίνης του FAK που προκαλείται από αυτά τα πεπτίδια στους νευρώνες DCC+/+ και DCC−/−. Βρήκαμε ότι και τα δύο πεπτίδια Ε1 και Ε2 απέτυχαν να προκαλέσουν τη φωσφορυλίωση του FAK σε νευρώνες DCC-/- (Εικόνα 3J, K).

Βρήκαμε επίσης ότι τα συντιθέμενα πεπτίδια Ε1 και Ε2 με επισήμανση Ν-τερματικού σημείου (Flag-E1 και Flag-E2) συνδέονται απευθείας με την περιοχή DCCFN5 (Εικόνα S3).

2.4. Το πεπτίδιο Ε1 προστατεύει τους νευρώνες από τον επαγόμενο από την αιμίνη κυτταρικό θάνατο in vitro

Για να επιδείξουμε την προστασία έναντι της νευρωνικής βλάβης του πεπτιδίου Ε1, χρησιμοποιήσαμε μια επαγόμενη από την Αιμίνη αντίδραση τοξικότητας για να μιμηθεί δευτερογενής εγκεφαλική βλάβη μετά από ενδοεγκεφαλική αιμορραγία [41,42].

Καλλιεργημένα νευρωνικά κύτταρα που εκφράζουν GnRH (NLT) [43-45] επωάστηκαν με αιμίνη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και διάρκειες. Η επώαση των κυττάρων NLT με την αιμίνη στη μέση θανατηφόρα δόση (60 μΜ) είχε ως αποτέλεσμα μια χρονικά εξαρτώμενη μείωση του ποσοστού επιβίωσης των κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αιμίνη προσελήφθη από τους νευρώνες και μεταβολίστηκε (Εικόνα S4).

Για να εξεταστεί εάν η έκφραση του Netrin-1 και του DCC ανταποκρίθηκε στον επαγόμενο από την αιμίνη θάνατο νευρωνικών κυττάρων, τα καλλιεργημένα κύτταρα NLT επωάστηκαν με αιμίνη για διαφορετικές διάρκειες. Τα αποτελέσματα western blot έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της Netrin-1 και του DCC αυξήθηκαν σημαντικά στις 6 ώρες μετά την επώαση της αιμίνης και στη συνέχεια μειώθηκαν σταδιακά (Εικόνα 4Α, Β).

Για να διερευνήσουμε εάν τα πεπτίδια Ε1 και Ε2 ήταν σε θέση να μετριάσουν τον επαγόμενο από την αιμίνη θάνατο νευρώνων, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία CCK-8 με Netrin-1, PepCtrl, πεπτίδιο Ε1 και πεπτίδιο Ε2.

Βρήκαμε ότι αυτά τα πεπτίδια δεν είχαν ανιχνεύσιμη επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικόνα 4C και Εικόνα S5). Σε σύγκριση με την επώαση με Pep Ctrl και πεπτίδιο E2, το πεπτίδιο Ε1 και η Netrin-1 βελτίωσαν τον νευρωνικό θάνατο που προκλήθηκε από την αιμίνη (Εικόνα 4D). Επίσης, χρωματίσαμε με calcein-AM και PI για να διακρίνουμε ζωντανά και νεκρά κύτταρα.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο η Netrin-1 όσο και το πεπτίδιο Ε1 προστατεύουν από τον θάνατο που προκαλείται από την αιμίνη in vitro (Εικόνα 4E–G). Περαιτέρω, 1,5 μΜ πεπτίδιο Ε1 ανακούφισε τον επαγόμενο από την αιμίνη θάνατο σε πρωτοκαλλιεργημένους νευρώνες (Εικόνα 4Η, Ι). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το πεπτίδιο Ε1 προστατεύει τους νευρώνες από τον επαγόμενο από την αιμίνη κυτταρικό θάνατο.

2.5. Το Netrin-1-Πεπτίδιο Ε1 που προέρχεται προωθεί τη λειτουργική αποκατάσταση μετά από ICH

Για να διερευνήσουμε εάν το πεπτίδιο Ε1 που προέρχεται από το Netrin-1 παίζει σημαντικό ρόλο στη λειτουργική αποκατάσταση μετά από εγκεφαλικό επεισόδιο αιμορραγίας, δημιουργήσαμε ένα πειραματικό μοντέλο ICH ποντικού με έγχυση κολλαγενάσης αναμεμειγμένης με μελάνι στο ραβδωτό σώμα (Εικόνα S6A).

Μετά από τρεις ημέρες, παρουσιάστηκαν εικόνες της τομής του εγκεφάλου για την παρακολούθηση της θέσης της ένεσης και του όγκου της κολλαγονάσης με μελάνι (Εικόνα S6B, C). Τα ποντίκια με αιμορραγία του ραβδωτού σώματος εμφάνισαν αδυναμία στην ομόπλευρη πλευρά λόγω εγκεφαλικής βλάβης (Εικόνα S7A-C).

Το αιμάτωμα στο ραβδωτό σώμα που ακολούθησε ICH ήταν ορατό σε σύγκριση με την ένεση φυσιολογικού ορού (Εικόνα S7D). Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης Netrin{-1 και DCC στον περιαιμωματικό φλοιό αυξήθηκαν σε ποντίκια ICH σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου την ημέρα 2 και η Netrin-1 ήταν ακόμα υψηλότερη σημαντικά την ημέρα 3, υποδεικνύοντας ότι η Netrin-1 είναι σημαντικό για την αποκατάσταση της εγκεφαλικής βλάβης (Εικόνα S7E, F).

Στη συνέχεια, το FITC-επισημασμένο ΤΑΤ-πεπτίδιο Ε1 (FITC-Pep TE1), το οποίο πρόσθεσε μια αλληλουχία ΤΑΤ του Ν-άκρου του πεπτιδίου Ε1, εγχύθηκε στα ποντίκια ICH και το FITC-Pep TE1 αποδείχθηκε ότι διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό ( Εικόνα S8).

Τα ICH και τα ποντίκια ελέγχου εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με το πεπτίδιο (12 mg/kg) ημερησίως ή ίσο όγκο φυσιολογικού ορού (Εικόνα 5Α). Βρήκαμε ότι η χορήγηση με πεπτίδιο ΤΕ1 βελτίωσε το ποσοστό επιβίωσης και διέσωσε ελαττώματα στο σωματικό βάρος μετά από ICH (Εικόνα 5Β, Γ).

Βρήκαμε επίσης ότι ο όγκος κολλαγονάσης που ανιχνεύθηκε με ίση αναλογία μελανιού σε κάθε ομάδα ήταν παρόμοιος, επιβεβαιώνοντας ότι αυτό το πρότυπο ICH μοντέλο κολλαγενάσης είχε ως αποτέλεσμα αναπαραγώγιμα ενδοραβδωτικά αιματώματα (Εικόνα 5D). Το πεπτίδιο TE1 βελτίωσε τις βαθμολογίες συμπεριφοράς των ποντικών ICH στη δοκιμή αφαίρεσης ταινίας (Εικόνα 5Ε ) και δοκιμή κυλίνδρου (Εικόνα 5ΣΤ).

Όπως αναμενόταν, το πεπτίδιο ΤΕ1 μείωσε τον όγκο εμφράγματος μετά από ICH (Εικόνα 5G, Η). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το πεπτίδιο Ε1 μπορούσε να μειώσει τον όγκο του αιματώματος και να βελτιώσει τη λειτουργική ανάκτηση σε ένα μοντέλο ICH ποντικού.

Σχήμα 4. Το πεπτίδιο Ε1 βελτιώνει τον επαγόμενο από την αιμίνη κυτταρικό θάνατο in vitro. (Α) Western blot Netrin-1 και DCC σε καλλιεργημένα κύτταρα NLT που εκτέθηκαν σε Αιμίνη (60 μΜ). (Β) Η ποσοτική ανάλυση των αποτελεσμάτων western blotres φαίνεται στο (Α). n=3. (Γ) Οι αναλύσεις CCK-8 έδειξαν ότι τα πεπτίδια σειράς δεν άλλαξαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων. n=4. (D) 1,5 μΜ Pep E1 διατήρησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων NLT όταν προστέθηκε καλά μετά την έκθεση σε αιμίνη (60 μΜ). n=4. (Ε) Ζωντανή (πράσινη)/Νεκρή (κόκκινη) δοκιμασία NLT κυττάρων που εκτέθηκαν σε αιμίνη (60 μΜ, 6 ώρες). Μπάρα κλίμακας, 50 μm. (F, G) Ποσοτική ανάλυση της ανάλυσης ζωντανών/νεκρών στο (Ε). n=9. (Η) Οι αναλύσεις CCK-8έδειξαν ότι το Pep E1 θα μπορούσε να μειώσει τον επαγόμενο από την αιμίνη κυτταρικό θάνατο σε νευρώνες πρωτογενούς καλλιέργειας. n=8.(I) Απεικόνιση δοκιμασίας ζωντανών/νεκρών νευρώνων πρωτογενούς καλλιέργειας (50 μΜ, 6 ώρες). Μπάρα κλίμακας, 50 μm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η μονόδρομη ANOVA ή η αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις στατιστικές αναλύσεις που παρουσιάζονται σε αυτό το σχήμα (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns, μη σημαντικό). Λεπτομέρειες της ανάλυσης δεδομένων φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

Εικόνα 5. Το πεπτίδιο Ε1 που προέρχεται από Netrin-1-προωθεί τη διαδικασία ανάκτησης μετά από ICH. (Α) Σχηματική απεικόνιση του πειραματικού παραδείγματος ενδοπεριτοναϊκής (IP) ένεσης του πεπτιδίου ΤΕ1 σε μοντελοποίηση ICH ποντικών. (Β) Καταγράφηκε ο λόγος επιβίωσης μετά την ICH κάθε ομάδας και χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Kaplan-Meier. n=10. (Γ) Το σωματικό βάρος αλλάζει σε 5 ημέρες μετά την ICH. n=6.(Δ) Μίγμα κολάζ/αλατούχου με ίση αναλογία μελανιού (συνολικό 0.6 μL) που εγχύθηκε στο ραβδωτό σώμα ποντικών C57, αντιπροσωπευτικές εικόνες που έδειχναν ότι η περιοχή μελανιού ήταν παρόμοια σε ποντίκια που έλαβαν/ χωρίς πεπτίδιο TE1 5 ημέρες μετά την ICH. (E, F) Έγχυση IP του πεπτιδίου ΤΕ1 (12 mg/kg) αλλά όχι ελέγχου ΤΑΤ (12 mg/kg), βελτιωμένη συμπεριφορά όπως παρακολουθείται από μια εργασία αφαίρεσης ταινίας (Ε) ή μια εργασία γωνίας (F).

Αλατούχο διάλυμα, n=10 μεμονωμένα ζώα. ICH, n=6 μεμονωμένα ζώα. ICH + TAT, n=6 μεμονωμένα ζώα. ICH + TE1, n=8 μεμονωμένα ζώα. (Ζ) Αντιπροσωπευτικές τομές χρωματισμένες με αιματοξυλίνη και ηωσίνη σε ποντικούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με/χωρίς πεπτίδιο ΤΕ1 5 ημέρες μετά την ICH. Μπάρα ζυγαριάς, 1 mm. (Η) Ποσοτικοποίηση του όγκου αιμορραγίας σε τομές εγκεφάλου που φαίνεται στο (Ζ).

Αλατούχο διάλυμα, n {{0}} μεμονωμένα ζώα. ICH, n=6 μεμονωμένα ζώα. ICH + TAT, n=6 μεμονωμένα ζώα. ICH + TE1, n=8 μεμονωμένα ζώα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η μονόδρομη ANOVA ή η αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις στατιστικές αναλύσεις που εμφανίζονται σε αυτό το σχήμα (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns, μη σημαντικό). Λεπτομέρειες για την ανάλυση δεδομένων φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

2.6. Το πεπτίδιο Ε1 που προέρχεται από Netrin μειώνει την απόπτωση των νευρώνων μετά από ICH

Να διερευνήσει τους υποκείμενους μηχανισμούς του πεπτιδίου Ε1 στη διαδικασία της λειτουργικής ανάκτησης της ICH. Ανιχνεύσαμε νευρωνικό εκφυλισμό στην περιαιματομική περιοχή με χρώση φθοριού-νεφρίτη C (FJC).

Βρήκαμε ότι η χορήγηση του πεπτιδίου ΤΕ1 μείωσε σημαντικά τον αριθμό των FJC-θετικών κυττάρων σε περιοχές περιαιμάτωμα, υποδεικνύοντας ότι το pep TE1 ανέστειλε τον νευρωνικό εκφυλισμό μετά από ICH (Εικόνα 6Α, Β). Πραγματοποιήσαμε χρώση TUNEL και βρήκαμε ότι το πεπτίδιο TE1 μείωσε σημαντικά τον αριθμό των θετικών στο TUNEL νευρώνων (Εικόνα 6C, D).

Ο αριθμός των θετικών σε TUNEL αστροκυττάρων δεν ήταν ανιχνεύσιμη αλλαγή μετά την αγωγή με πεπτίδιο ΤΕ1 (Εικόνα 6Ε, ΣΤ). Επιπλέον, χρησιμοποιώντας σήμανση FITC 4 kDa δεξτράνης ως ιχνηθέτη για να υποδείξει τη διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB), διαπιστώσαμε ότι το πεπτίδιο ΤΕ1 δεν επηρέασε την ανάκτηση της διαπερατότητας BBB (Εικόνα S9A, B).

Τα επίπεδα ακατέργαστων μονάδων φθορισμού (RFUs) ορού ήταν παρόμοια, επιβεβαιώνοντας την παρουσία του ενέσιμου ιχνηθέτη σε όλα τα ζώα που αναλύθηκαν (Εικόνα S9C). Χρησιμοποιήσαμε επίσης επισημασμένη με φλουορεσκεΐνη λεκτίνη για την επισήμανση μικροαγγείων αλλά δεν καταφέραμε να παρατηρήσουμε οποιαδήποτε βελτίωση μετά τη θεραπεία με ΤΕ1 (Εικόνα S9D, E). Πάνω απ 'όλα, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το πεπτίδιο Ε1 προάγει την ανάκτηση των νευρώνων μετά από ICH αναστέλλοντας τη νευρωνική απόπτωση.

Σχήμα 6. Το πεπτίδιο Ε1 που προέρχεται από νετρίνη-1- μπορεί να προστατεύσει από θάνατο και εκφυλισμό νευρώνων, αλλά όχι από αστροκύτταρα μετά από ICH. Γραμμή κλίμακας, 50 μm και 10 μm, αντίστοιχα. (Β) Ποσοτικοποίηση των θετικών για φθοριούχο νεφρίτη C κυττάρων στην περιαιματωμική περιοχή (n=4). (Γ) Η χρώση TUNEL δείχνει επιδράσεις της ΤΕ1 στη δευτερογενή εγκεφαλική βλάβη (SBI) στις 5 ημέρες μετά την έναρξη της ICH. Αντιπροσωπευτικές εικόνες από ομάδες Saline, ICH, ICH + TAT και ICH ​​+ TE1.

Κάθε ομάδα υποβλήθηκε σε ICH εκτός από την ομάδα Αλατούχου ορού. Μπάρα κλίμακας, 50 μm και 10 μm αντίστοιχα. (Δ) Οι ποσοτικές αναλύσεις για το ποσοστό των θετικών στο TUNEL νευρώνων παρουσιάζονται στο (C). n=4. (Ε)Εντοπισμός TUNEL με GFAP στις 5 ημέρες μετά την ICH. Αντιπροσωπευτικές εικόνες από τις ομάδες Saline, ICH, ICH + TAT και ICH ​​+ TE1. Γραμμή κλίμακας, 50 μm και 10 μm, αντίστοιχα. (ΣΤ) Οι ποσοτικές αναλύσεις για το ποσοστό των θετικών στο TUNEL αστροκυττάρων παρουσιάζονται στο (Ε). n=4. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM.

Η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις που εμφανίζονται σε αυτό το σχήμα (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 ns, μη σημαντικό). Λεπτομέρειες για την ανάλυση δεδομένων φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.

3. Συζήτηση

Η μελέτη μας εντόπισε μια βασική πεπτιδική αλληλουχία του Netrin-1 που είναι κρίσιμη για τη λειτουργική αποκατάσταση μετά από ICH. Με την αλληλεπίδραση με το DCC, αυτό το πεπτίδιο που προέρχεται από το Netrin-1-προστατεύει από τον νευρωνικό θάνατο λόγω δευτερογενούς βλάβης μετά από ICH και είναι επομένως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία για την ICH.

Η θεραπευτική εφαρμογή του Netrin-1, μιας πρωτεΐνης υψηλού μοριακού βάρους, απαιτεί τον προσδιορισμό της ελάχιστης λειτουργικής ακολουθίας του Netrin-1 που προάγει τη μετάδοση σήματος. Στη μελέτη μας, δημιουργήθηκαν τα πεπτίδια Ε1 (υπολείμματα 407-422) και Ε2 (υπολείμματα 423-433), τα οποία προέρχονται από τον τομέα EGF3 του Netrin-1, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι το πεπτίδιο Ε1 (υπολείμματα 407-422) προστατεύει από το θάνατο των νευρώνων μετά από ICH.

Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης Netrin-1 και DCC αυξήθηκαν στα κύτταρα NLT μετά τη θεραπεία με αιμίνη. Η αιμίνη απελευθερώνεται από την αιμοσφαιρίνη μετά από ICH και προκαλεί δευτερογενή τραυματισμό τόσο στα γλοιακά όσο και στα νευρωνικά κύτταρα [46-48].

Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης Netrin-1 και DCC μετά από πειραματική ICH. Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης νετρίνης-1 και DCC μετά από πειραματική ICH.

Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με προηγούμενα αποτελέσματα που δείχνουν ότι η νετρίνη-1 παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάκτηση μετά από ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com