Παραλλαγή στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ δύο δίχρωμων γραμμών σόργου που διαφέρουν στην έμφυτη απόκριση ανοσίας

Αφηρημένη:

Η πυροδοτούμενη ανοσία (MTI) που σχετίζεται με το μοριακό πρότυπο (MAMPs) είναι βασικό συστατικό της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης του φυτού στη μικροβιακή αναγνώριση. Ωστόσο, το μεγαλύτερο μέρος της τρέχουσας γνώσης μας για το MTI προέρχεται από φυτά-μοντέλα (δηλαδή, Arabidopsis thaliana) με συγκριτικά λιγότερη εργασία που έχει γίνει χρησιμοποιώντας φυτά καλλιέργειας. Σε αυτήν την εργασία, μελετήσαμε την πυροδοτούμενη από MAMP οξειδωτική έκρηξη (ROS) και τη μεταγραφική απόκριση σε δύο δίχρωμους γονότυπους σόργου, BTx623 και SC155-14E. Το SC{4}}E είναι μια γραμμή που παρουσιάζει υψηλή αντοχή στην ανθρακνόζη και η γραμμή BTx623 είναι ευαίσθητη στην ανθρακνόζη. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν μια σαφή παραλλαγή στη γονιδιακή έκφραση και το ROS ως απόκριση είτε στην πρόκληση μαστιγίνης (flg22) είτε στη χιτίνη μεταξύ των δύο γραμμών. Ενώ η μεταγραφική απόκριση σε κάθε MAMP και σε κάθε γραμμή ήταν μοναδική, υπήρχε σημαντικός βαθμός επικάλυψης και μπορέσαμε να ορίσουμε ένα βασικό σύνολο γονιδίων που σχετίζονται με τη μεταγραφική απόκριση MAMP σόργου. Ο όρος GO και η ανάλυση εμπλουτισμού της οδού KEGG ανακάλυψαν περισσότερα DEG που σχετίζονται με την ανοσία και την αντίσταση στα παθογόνα σε δείγματα SC155-14Ε που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MAMP από ό,τι στο BTx623 με την ίδια επεξεργασία. Τα αποτελέσματα παρέχουν μια βάση για μελλοντικές μελέτες για τη διερεύνηση των έμφυτων οδών ανοσίας στο σόργο, συμπεριλαμβανομένων των προσπαθειών για ενίσχυση της αντοχής στις ασθένειες.

Κάντε κλικ για να αγοράσετε έναπροϊόν βελτιωμένης ανοσίας

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Λέξεις-κλειδιά:

Σόργο δίχρωμο; ROS; έμφυτη ανοσία? MAMP; RNA-seq; γονιδιακή έκφραση

1. Εισαγωγή

Τα φυτά εκτίθενται φυσικά σε ποικίλες καταπονήσεις, συμπεριλαμβανομένων πολλών βακτηριακών, μυκητιακών και ιικών παθογόνων [1]. Τα φυτά προστατεύονται από παθογόνα χρησιμοποιώντας προσχηματισμένες δομές και χημικές ουσίες, καθώς και αποκρίσεις του ανοσοποιητικού συστήματος που προκαλούνται από μόλυνση. Το ανοσοποιητικό σύστημα των φυτών χρησιμοποιεί ένα σύστημα αντίληψης δύο επιπέδων με δύο διασυνδεδεμένα στρώματα υποδοχέων.

Η πρώτη βαθμίδα ενεργοποιείται από επιφανειακά εντοπισμένους υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs), οι οποίοι ανιχνεύουν μόρια έξω από το κύτταρο αναγνωρίζοντας το εισβάλλον παθογόνο μέσω της ανίχνευσης διατηρημένων δομικών μοτίβων, που ονομάζονται Μοριακά Σχέδια που σχετίζονται με το Μικρόβιο (MAMPs), τα οποία πυροδοτούν μέτρια αλλά ευρεία, αμυντική απάντηση [2]. Η φλαγκελίνη, η χιτίνη, οι λιποπολυσακχαρίτες, οι πεπτιδογλυκάνες (PGNs) και ο παράγοντας επιμήκυνσης Tu είναι παραδείγματα καλά μελετημένων MAMP [3-5]. Αυτή η αμυντική απόκριση ονομάζεται ανοσία που προκαλείται από MAMP (MTI) [6]. Η δεύτερη βαθμίδα άμυνας γνωστή ως Efector-Triggered Immunity (ETI) εμφανίζεται ως απόκριση σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες τελεστές που προέρχονται από παθογόνο που αναγνωρίζονται από το φυτό μέσω της δράσης πρωτεϊνών αντίστασης, με αποτέλεσμα μια ισχυρή, αλλά εξαιρετικά ειδική ανοσολογική απόκριση. Η ETI μπορεί συχνά να αναγνωριστεί από την επαγωγή εντοπισμένου κυτταρικού θανάτου που ονομάζεται υπερευαίσθητη απόκριση (HR) [7]. Και τα δύο συστήματα MTI και ETI αντιλαμβάνονται τα παθογόνα και ανταποκρίνονται ενεργοποιώντας την αντιμικροβιακή άμυνα στο μολυσμένο κύτταρο και στα γειτονικά κύτταρα [3,8]. Τα φυτά φέρουν επίσης ανοσοϋποδοχείς που αναγνωρίζουν εξαιρετικά μεταβλητούς παθογόνους τελεστές, σε αυτούς περιλαμβάνονται η κατηγορία πρωτεϊνών NBS-LRR [9].

Επιπλέον, η συστημική επίκτητη αντίσταση (SAR) είναι μια απόκριση αντίστασης "ολόκληρου του φυτού" που εμφανίζεται μετά από προηγούμενη εντοπισμένη έκθεση σε ένα παθογόνο. Το SAR σχετίζεται με την επαγωγή ενός ευρέος φάσματος γονιδίων (γονίδια που σχετίζονται με την παθογένεση) και η ενεργοποίηση του SAR απαιτεί τη συσσώρευση ενδογενούς σαλικυλικού οξέος (SA) [10].

Μελέτες που έγιναν κυρίως με τη χρήση του Arabidopsis έδειξαν ότι το MTI μπορεί να προκαλέσει μια ποικιλία αποκρίσεων, όπως αλλαγές στην παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), παραγωγή ενεργών ειδών αζώτου όπως μονοξείδιο του αζώτου (NO), εναπόθεση καλλόζης, ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου, ροή ιόντων στο πλάσμα μεμβράνη, επαγωγή ή καταστολή της έκφρασης αρκετών γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα των φυτών, αλλοιώσεις στο φυτικό κυτταρικό τοίχωμα, επαγωγή αντιμικροβιακών ενώσεων και σύνθεση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την παθογένεση (PR) [3,11].

Αν και αρκετές από αυτές τις αποκρίσεις MTI μπορούν να θεωρηθούν γενικές αποκρίσεις φυτών, το μέγεθός τους μπορεί να είναι ειδικό για το είδος του φυτού και ακόμη και για την ποικιλία [12-17]. Έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση της απόκρισης MTI του φυτού. Αυτές οι μέθοδοι περιλαμβάνουν μέτρηση της παραγωγής ROS ή NO, φωσφορυλίωση πρωτεϊνικής κινάσης ενεργοποιημένης από μιτογόνο, ειδική γονιδιακή έκφραση που προκαλείται από MAMP, αναστολή ανάπτυξης δενδρυλλίων, λιγνίνη και δεσμευμένες στο κυτταρικό τοίχωμα φαινόλες και αντίσταση που προκαλείται από MAMP σε βακτηριακά και μυκητιακά παθογόνα [18-20].

Το Sorghum bicolor (L.) Moench είναι μια βασική, παγκόσμια καλλιέργεια δημητριακών που έχει προσαρμοστεί σε μια σειρά οικοτόπων και έχει εκτραφεί για διάφορους σκοπούς [21]. Η καλλιέργεια του σόργου αναμένεται να αυξηθεί σημαντικά παγκοσμίως ως μία από τις κύριες καλλιέργειες για την παραγωγή τροφίμων και βιομάζας [22].

Καθώς οι πρακτικές και οι γεωγραφικές περιοχές καλλιέργειας σόργου αυξάνονται, είναι αναπόφευκτο να αυξηθεί η πίεση της νόσου. Το σόργο διακρίνεται μεταξύ άλλων δημητριακών για το ασυνήθιστα ευρύ φάσμα ασθενειών του, το οποίο είναι ένας από τους σημαντικότερους περιορισμούς στην παραγωγή του. Σε παγκόσμιο επίπεδο, οι ευρέως διαδεδομένες μυκητιασικές ασθένειες είναι οι πιο καταστροφικές ασθένειες του σόργου που έχουν ως αποτέλεσμα τεράστιες απώλειες στην απόδοση, τόσο ως προς την ποσότητα όσο και την ποιότητα των κόκκων [23]. Η ανθρακνόζη είναι μια από τις πιο σοβαρές μυκητιασικές ασθένειες που επηρεάζει την απόδοση των κόκκων του σόργου και την παραγωγή βιομάζας. Οι απώλειες απόδοσης λόγω αυτού του παθογόνου μπορεί να είναι 50 έως 70 τοις εκατό σε ευαίσθητες ποικιλίες [24,25]. Τα φυτά έχουν αναπτύξει διάφορες αμυντικές στρατηγικές για την καταπολέμηση της εισβολής παθογόνων. Στο σόργο, αυτές οι στρατηγικές περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών PR [26], τη συσσώρευση υπεροξειδίου του υδρογόνου [27] και τη βιοσύνθεση φλαβονοειδών φυτοαλεξινών [28]. Έχουν χρησιμοποιηθεί διαφορετικές προσεγγίσεις για τη μελέτη των αντιδράσεων αντοχής του σόργου, τον εντοπισμό αμυντικών ενώσεων και τον εντοπισμό φυσικών φραγμών κατά της ανθρακνόζης (βλ. αναφορά [29,30] για ανασκόπηση). Οι μελέτες γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν ευρέως για τον εντοπισμό υποψήφιων γονιδίων ανθεκτικότητας στα φυτά με βάση τη διαφορική έκφραση μεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων ποικιλιών ή μη εμβολιασμένων και εμβολιασμένων με παθογόνα φυτών (π.χ. παραπομπές [31-37]). Οι Wang et al., [37] πραγματοποίησαν μεταγραφική ανάλυση για να μελετήσουν την απόκριση της ποικιλίας σόργου BTx623 στο C. subline-ola. Ανέφεραν ότι τα γονίδια που εμπλέκονται στον μεταβολισμό των φαινυλοπροπανοειδών και στη βιοσύνθεση των δευτερογενών μεταβολιτών αναγνωρίστηκαν ως διαφορικά εκφρασμένα ως απόκριση στη μόλυνση με το παθογόνο σε σχέση με μη εμβολιασμένα φυτά ελέγχου.

Ωστόσο, αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν με σπορόφυτα της ευαίσθητης ποικιλίας BTx623. Πρόσθετες μεταγραφικές μελέτες για τη σύγκριση της απόκρισης γονιδιακής έκφρασης σε ένα παθογόνο στις ευαίσθητες και ανθεκτικές ποικιλίες σόργου θα ήταν πολύτιμες. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τη γενετική αρχιτεκτονική που ελέγχει την αντίσταση στη βασική νόσο του σόργου και τη σύνδεσή της με την ποσοτική αντοχή στις ασθένειες.

Ως αρχικό βήμα προς αυτή την κατεύθυνση, εξετάσαμε πρόσφατα ένα σύνολο διαφορετικών βλασμάτων σόργου για διακύμανση στην απόκρισή τους στην πρόκληση flg22 και χιτίνης, καθώς και αντοχή σε μυκητιασικές ασθένειες [38]. Σε αυτή την περίπτωση, το MTI προσδιορίστηκε ποσοτικά με μέτρηση της παραγωγής ROS κατά την πρόκληση MAMP. Μεταξύ των αποτελεσμάτων αυτής της προηγούμενης μελέτης, ήταν ο εντοπισμός γονότυπων σόργου που έδειξαν είτε ισχυρή είτε ασθενή απόκριση στην πρόκληση MAMP.

Η αλληλουχία υψηλής απόδοσης επόμενης γενιάς και η μελέτη των μεταγραφωμάτων μπορούν να βοηθήσουν στην αποσαφήνιση των αποκρίσεων μυκητιασικής μόλυνσης στα φυτά και στην αύξηση της κατανόησης σχετικά με τις αποκρίσεις του ξενιστή. Οι αναλύσεις μεταγραφών χρησιμοποιήθηκαν ευρέως για τη μελέτη των αποκρίσεων των φυτών σε μυκητιασικές λοιμώξεις σε πολλά είδη φυτών, συμπεριλαμβανομένων των καλλιεργειών δημητριακών (π.χ. παραπομπές [31-37]).

Ωστόσο, τα δημοσιευμένα δεδομένα σχετικά με τη συγκριτική ανάλυση μεταγραφής των καλλιεργειών δημητριακών έχουν επικεντρωθεί κυρίως στην απόκριση σε διάφορα παθογόνα. Στο σόργο, αρκετές δημοσιεύσεις επικεντρώθηκαν σε συγκρίσεις μεταγραφομένων φυτών που έλαβαν θεραπεία με διάφορα παθογόνα, συμπεριλαμβανομένης της ανθρακνόζης [35,37]. Ορισμένες προηγούμενες δημοσιεύσεις πρότειναν ότι δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ανταπόκρισης στα MAMP και της μυκητιακής νόσου. Για παράδειγμα, οι Zhang et al. [17] ανέφερε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της ανταπόκρισης σε δύο MAMPs flg22 και χιτίνης σε έναν πληθυσμό χαρτογράφησης αραβοσίτου, αλλά καμία αντιστοιχία στην απόκριση σε μυκητιασική νόσο. Οι Kimball et al. [38] ανέφερε επίσης μια χαμηλή συσχέτιση μεταξύ των βαθμολογιών απόκρισης ROS που προκλήθηκαν από flg22-και των αποτελεσμάτων ανθεκτικών σε κηλίδες φύλλων στόχου σε δύο πληθυσμούς RIL σόργου συμπεριλαμβανομένου ενός πληθυσμού BTx623/SC155-14Ε. Ως εκ τούτου, δεδομένης της έλλειψης δεδομένων, θεωρήσαμε σημαντικό να καταγράψουμε μεταγραφικά την απόκριση του σόργου στις θεραπείες MAMP.

Σε αυτήν την τρέχουσα αναφορά, επεκτείνουμε την προηγούμενη ανάλυσή μας μετρώντας την παγκόσμια μεταγραφική απόκριση στην πρόκληση MAMP. Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση αλληλουχίας RNA με βάση το Illumina για να ερευνήσουμε τις μεταγραφικές αλλαγές ως απόκριση είτε στη θεραπεία με flg22 είτε με χιτίνη στους γονότυπους σόργου BTx623 και SC155-14E, τους οποίους προηγουμένως χαρακτηρίσαμε ως αντίστοιχα ασθενείς και ισχυρούς ανταποκριτές MTI, αντίστοιχα. Το BTx623 είναι η γραμμή αναφοράς του δίχρωμου γονιδιώματος Sorghum [22] και το SC155-14E είναι μια γραμμή που δείχνει αυξημένη αντίσταση στην ανθρακνόζη [39]. Patil et al. [39] ανέφερε ότι το SC155-14Ε εμφάνισε υψηλό επίπεδο σταθερής αντίστασης (σχεδόν απαλλαγμένο από ασθένειες) στη νόσο της ανθρακνόζης σε όλα τα περιβάλλοντα που δοκιμάστηκαν ενώ το BTx623 είναι ευαίσθητο σε αυτή τη μυκητιακή νόσο. Η ανάλυση RNA-seq μας εντόπισε 5252 και 8085 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) σε BTx623 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 και χιτίνη, αντίστοιχα, και 3849 και 5786 DEGs σε flg22 και 8085 γονίδια που υποβλήθηκαν σε αγωγή με χιτίνη SC{19}, σε σύγκριση με μάρτυρες, αντίστοιχα από αυτούς τους δύο γονότυπους.

Επιπλέον, μια σύγκριση των DEG που επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς βιοπληροφορικούς αγωγούς έδειξε πολύ παρόμοια αποτελέσματα. Τα προφίλ έκφρασης των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων, η ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακής οντολογίας (GO) και η ανάλυση εμπλουτισμού οδού KEGG έδειξαν μια σαφή παραλλαγή με βάση τον γονότυπο στη γονιδιακή έκφραση που σχετίζεται με το MTI. Ο όρος GO και τα αποτελέσματα εμπλουτισμού της οδού KEGG αποκάλυψαν περισσότερα DEGs που σχετίζονται με την ανοσία και την αντίσταση στα παθογόνα (γονίδια PR, γονιδιακή απόκριση στη χιτίνη, απόκριση γονιδίων στο σαλικυλικό οξύ, γονιδιακή απόκριση στο στρες, κ.λπ.) που παρουσιάζονται σε SC που έχει υποστεί αγωγή με MAMP{{4} }Δείγματα E σχετικά με το BTx623 που έχει υποστεί επεξεργασία με MAMP. Τα αποτελέσματα παρέχουν μια βασική γραμμή για τον εντοπισμό των διαφόρων συστατικών της απόκρισης MTI του σόργου.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Παραλλαγή της οξειδωτικής έκρηξης σε διαφορετικά φύλλα σόργου

Η προηγούμενη ανάλυσή μας για την απόκριση MTI διαφορετικών γονότυπων σόργου αποκάλυψε σημαντική διακύμανση στην οξειδωτική έκρηξη που προκαλείται από MAMP μεταξύ των γονότυπων BTx623 και SC155-14E [38]. Επιπλέον, η SC{4}}E είναι μια γραμμή που εμφανίζει υψηλή αντοχή στην ανθρακνόζη, ενώ η γραμμή BTx623 είναι ευαίσθητη στην ανθρακνόζη [39]. Για αυτούς τους λόγους, αυτοί οι δύο γονότυποι επιλέχθηκαν για σύγκριση χρησιμοποιώντας RNA-seq.

Κατά τη διεξαγωγή των προηγούμενων μετρήσεων ROS, βρήκαμε σημαντική διακύμανση ακόμη και μέσα στο ίδιο εργοστάσιο, γεγονός που μας οδήγησε να διερευνήσουμε την πηγή αυτής της μεταβολής πιο προσεκτικά. Συγκεκριμένα, δοκιμάσαμε την παραγωγή ROS χρησιμοποιώντας τρία σετ φύλλων, από κάτω προς τα πάνω φυτών BTx623 και SC{3}}Ε, ηλικίας δεκαπέντε ημερών. Τα φύλλα σημειώθηκαν ως #1, #2 και #3, από κάτω προς τα πάνω όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ROS (Εικόνα 1Β) αποκάλυψαν ότι: (1) το επίπεδο παραγωγής ROS ήταν χαμηλότερο στα παλαιότερα φύλλα (φύλλο #1), ενώ τα υψηλότερα επίπεδα παραγωγής ROS ως απόκριση είτε στο flg22 είτε στη χιτίνη ήταν από τα νεότερα φύλλα ( φύλλο #3). (2) Τόσο τα κατεργασμένα με MAMP όσο και τα μη επεξεργασμένα BTx623 2τα νεότερα φύλλα (φύλλο #2) παρήγαγαν συγκριτικά χαμηλά επίπεδα παραγωγής ROS.

Αντίθετα, τα 2α νεότερα φύλλα του SC155-14E που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MAMP παρήγαγαν σημαντικά (σε επίπεδο 0.01) υψηλότερα επίπεδα παραγωγής ROS από τα μη επεξεργασμένα μακέτα, καθώς και τα επεξεργασμένα ή ψευδή BTx{ {5}}ο νεότερος φεύγει. (3) Η οξειδωτική έκρηξη που προκλήθηκε από εφαρμογές flg22 ή χιτίνης ανιχνεύθηκε σε δίσκους φύλλων από τα νεότερα φύλλα (φύλλο #3) και των δύο γονότυπων, αν και, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως, τα επίπεδα παραγωγής ROS ήταν υψηλότερα σε SC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MAMP 155-14Ε σε σχέση με το BTx623. Η χρονική πορεία της παραγωγής ROS flg22-έναρξη και ενεργοποίησης από χιτίνη στην SC155-14E 2ο νεότερο φύλλο αποκάλυψε ότι η παραγωγή ROS που ενεργοποιήθηκε από χιτίνη συνέβη νωρίτερα από ό,τι η flg22- προκάλεσε την παραγωγή ROS (Εικόνα 1C ). Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρθηκαν από τους Zhang et al. [17] όπου η παραγωγή ROS που προκλήθηκε από χιτίνη εμφανίστηκε νωρίτερα από ό,τι η flg22-προκάλεσε την παραγωγή ROS στα flg22 και στα σπορόφυτα αραβοσίτου που είχαν υποστεί επεξεργασία με χιτίνη. Αναφέρθηκε [40] ότι η παραγωγή ROS ως απόκριση στο flg22 έδειξε την υψηλότερη παραγωγή ROS περίπου στα 12 λεπτά και ήταν η χαμηλότερη στα 30 λεπτά στο Arabidopsis. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ROS στο σόργο έδειξαν την υψηλότερη παραγωγή ROS περίπου στα 13 λεπτά και τη χαμηλότερη στα 30 λεπτά μετά τη θεραπεία με flg22, η οποία είναι πολύ παρόμοια με τα αποτελέσματα στο Arabidopsis. Δεδομένου ότι ο στόχος μας ήταν να βρούμε τις βέλτιστες συνθήκες για τη σύγκριση της απόκρισης MTI των δύο γονότυπων, επιλέξαμε τα 2α νεότερα φύλλα φυτών 15-ημέρας για εκχύλιση RNA και επακόλουθη μεταγραφική ανάλυση. Η διακύμανση μεταξύ των φύλλων μεμονωμένων φυτών σόργου είναι μια υπενθύμιση ότι τα αποτελέσματα μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των πειραμάτων ανάλογα με την πηγή, το χρόνο και άλλα χαρακτηριστικά ενός δεδομένου πειράματος και, ως εκ τούτου, ότι οι πειραματικές παράμετροι πρέπει να ελέγχονται προσεκτικά.

Η οξειδωτική έκρηξη, μια ταχεία, παροδική, παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS), είναι μια από τις πρώτες παρατηρήσιμες πτυχές της αμυντικής απόκρισης ενός φυτού [41]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η έκρηξη ROS είναι μια άμεση απόκριση, αναμένεται μια ελαφρώς μεταγενέστερη μεταγραφική απόκριση των γονιδίων που σχετίζονται με το MTI. Συλλέξαμε δείγματα 60 λεπτά μετά την επεξεργασία με MAMPs για ανάλυση RNA-Seq.

2.2. Γονίδια διαφορικής έκφρασης (DEG) του BTx623 και του SC155-14E σε απόκριση στις θεραπείες MAMP

Για να αξιολογηθεί το επίπεδο έκφρασης των σχολιασμένων γονιδίων κωδικοποίησης πρωτεΐνης δίχρωμου σόργου για κάθε δείγμα, ο αριθμός των καθαρών αναγνώσεων του RNA-seq που χαρτογραφήθηκαν σε κάθε γονίδιο υπολογίστηκε και στη συνέχεια κανονικοποιήθηκε σε FPKM (θραύσματα ανά kb μοντέλο εξονίου ανά εκατομμύριο χαρτογραφημένα θραύσματα). Διερευνήθηκαν οι αλλαγές έκφρασης κάθε γονιδίου σε δίσκους φύλλων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MAMP των BTx623 και SC{4}}E σε σύγκριση με ψευδείς θεραπείες (νερό). Τα συνολικά εκφρασμένα γονίδια ήταν παρόμοια σε όλες τις θεραπείες και των δύο γονότυπων: 27,171, 27,283, 27,161, 27,182, 27,512 και 27,175 γονίδια που εκφράζονται σε ψευδή BTx623, flg22-με αγωγή με BTx623, flg22-με αγωγή με BTx6 {22}}E, flg22-επεξεργασμένο SC155-14E και SC{26}}Ε που έχει υποστεί επεξεργασία με χιτίνη, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήσαμε το γονιδίωμα αναφοράς BTx623 για χαρτογράφηση ανάγνωσης και στις δύο γραμμές, καθώς η συγκεκριμένη αναφορά για το SC155-14E δεν είναι διαθέσιμη. Οι εκφρασμένοι αριθμοί γονιδίων που ανακτήθηκαν από το BTx623 και το SC{{3{0}}Ε με όλες τις παραπάνω συνθήκες αποκάλυψαν ότι και οι δύο σειρές μοιράζονταν παρόμοιους αριθμούς εκφρασμένων γονιδίων. Οι συνολικοί ρυθμοί χαρτογράφησης ανάγνωσης δειγμάτων SC155- 14E mock (3 αντίγραφα), SC155-14E που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 (3 αντίγραφα), SC155-14E που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη (3 αντίγραφα) , BTx623 mock (3 αντίγραφα), BTx623 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 (3 αντίγραφα), BTx623 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη (3 αντίγραφα) ήταν: 93,6 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,8 τοις εκατό , 93,8 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,6 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,6 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,9 τοις εκατό , 93,6 τοις εκατό , , , , . , 93,1 τοις εκατό , 96,9 τοις εκατό , 97.0 τοις εκατό , 97.0 τοις εκατό , 97,2 τοις εκατό , 96,8 τοις εκατό , 97.0 τοις εκατό , 96,9 τοις εκατό , 97.0 τοις εκατό , 97,0 τοις εκατό, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι διαφορετικές επιδράσεις της θεραπείας με MAMPs στα μεταγραφώματα του BTx623 και του SC155-14E δεν οφείλονταν στις διαφορές γονιδιωματικής αλληλουχίας μεταξύ των δύο γονότυπων

Η γραφική παράσταση PCA έκφρασης γονιδίου παρέχει πληροφορίες για τη συσχέτιση μεταξύ των δειγμάτων. Για να διερευνήσουμε την ομοιότητα των δειγμάτων μας, πραγματοποιήσαμε ανάλυση PCA. Η γραφική παράσταση του δείγματος στο PC1 και το PC2 (Εικόνα 2) έδειξε ότι τέσσερις πειραματικές συνθήκες (BTX623_flg22, SC155-14E_flg22 flg22, BTX623_χιτίνη και SC{ {10}}Ε_χιτίνη) διαχωρίστηκαν ευρέως. Αντίθετα, τα τρία βιολογικά αντίγραφα κάθε σειράς σόργου και κάθε επεξεργασίας MAMP, καθώς και η εικονική επεξεργασία, συγκεντρώθηκαν στενά μεταξύ τους, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας μια καλή αναπαραγωγιμότητα μεταξύ βιολογικών αντιγράφων (Εικόνα 2).

Τα ηφαίστεια στο Σχήμα 3 δείχνουν έκφραση γονιδίου στις δύο σειρές σόργου που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 ή χιτίνη. Ένα ηφαιστειακό οικόπεδο είναι ένας τύπος διασκορπισμού που δείχνει στατιστική σημασία (p-value) σε σχέση με το μέγεθος της αλλαγής (πτυχιακή αλλαγή). Επιτρέπει τη γρήγορη οπτική αναγνώριση γονιδίων με μεγάλες πολλαπλές αλλαγές που είναι επίσης στατιστικά σημαντικές. Αυτά μπορεί να είναι τα πιο σημαντικά βιολογικά γονίδια. Στο σχήμα 3, τα γονίδια με −log10 (p-value) ίσο ή μεγαλύτερο από 3 θεωρούνται DEG. Οι κόκκινες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν DEG και οι μαύρες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν τις μη DEG. Σε κάθε διάγραμμα, τα γονίδια με log2 (πλάση{10}}αλλαγή) μεγαλύτερη από 0 είναι γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω, διαφορετικά, γονίδια που ρυθμίζονται προς τα κάτω. Τα πιο ρυθμισμένα γονίδια είναι προς τα δεξιά, τα πιο ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια είναι προς τα αριστερά και τα πιο σημαντικά στατιστικά γονίδια είναι προς τα πάνω.

Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) επιλέχθηκαν από κάθε θεραπεία ανάλογα με τη σημασία έκφρασής τους (p-value 0.001). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι χρησιμοποιήσαμε μια τιμή p 0.001 ως όριο, αλλά όχι FDR (q-τιμές) για να επιλέξουμε DEG σε αυτήν την αναφορά. Οι τιμές FDR (q-τιμές) ήταν επίσης σημαντικές σε αυτό το επίπεδο (Πίνακες S2–S5). Σε μια τιμή p 0,001, οι FDR ήταν 0,0039, 0,0051, 0,0025 και 0,0035 για BTx623 με θεραπεία flg22, SC155-14E με αγωγή flg22, BTx623 με θεραπεία κασσίτερου 26}}Ε με θεραπεία χιτίνης, αντίστοιχα. Οι τιμές p και οι τιμές q των γονιδίων BTx623 και SC{30}}E σε όλες τις συνθήκες παρατίθενται στους Πίνακες S2–S5. Αναλύοντας τα μοτίβα έκφρασης αυτών των γονιδίων σε φύλλα BTx623 και SC{35}}Ε που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MAMP, παρατηρήσαμε μεγάλο αριθμό γονιδίων (14–30 τοις εκατό των συνολικών εκφρασμένων γονιδίων) που εμφάνισαν μεγάλες διαφορές μετά από flg22 ή χιτίνη θεραπεία και στις δύο γραμμές σόργου. Ο αριθμός των συνολικών DEG του BTx623 που υποβλήθηκε σε αγωγή με χιτίνη (8085) ήταν πολύ κοντά σε αυτόν που αναφέρθηκε σε προηγούμενη μελέτη μεταγραφής σε BTx623 που είχε μολυνθεί από το παθογόνο της ανθρακνόζης C. subline-ola (8078) [37]. Οι αριθμοί των DEG ήταν υψηλότεροι στα φύλλα BTx623 που έχουν υποστεί επεξεργασία με flg22 (19 τοις εκατό) ή με χιτίνη (30 τοις εκατό) σε σχέση με το SC155-14E (14 τοις εκατό και 21 τοις εκατό, αντίστοιχα).

Παρόλο που ο υψηλότερος αριθμός DEG στο BTx623 που έχει υποστεί αγωγή με MAMP σε σχέση με το SC155-14E ήταν αντίθετος με την απόκριση ROS αυτών των δύο γονότυπων, αυτό ίσως δεν αποτελεί έκπληξη, καθώς η απόκριση ROS και η απόκριση έκφρασης γονιδίου στη θεραπεία με MAMP εμφανίζονται σε διαφορετικοί χρόνοι, είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητοι και διαμεσολαβούνται από διαφορετικούς μηχανισμούς [42,43]. Ο όρος GO και ο εμπλουτισμός της οδού KEGG αποκάλυψαν περισσότερα DEG που σχετίζονται με την ανοσία και την αντίσταση στα παθογόνα που παρουσιάστηκαν σε δείγματα SC155-14Ε που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MAMP. Επιπλέον, το γεγονός ότι οι αριθμοί των DEG ήταν υψηλότεροι στα δείγματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη σε σχέση με αυτά που υποβλήθηκαν σε αγωγή με flg22 ταίριαξε καλά με τις αναλύσεις απόκρισης ROS (Εικόνα 1Β) όπου είδαμε μια ισχυρότερη απόκριση ROS κατά την επεξεργασία με χιτίνη.

Για να διερευνήσουμε σε ποιο βαθμό τα γονίδια και οι βιολογικές διεργασίες μοιράζονται μεταξύ των θεραπειών flg22 και χιτίνης στο BTx623 και το SC155-14E, συγκρίναμε τα DEG τους με περισσότερες λεπτομέρειες. Τα διαγράμματα Venn στο Σχήμα 4Α δείχνουν την επικάλυψη σε DEG στο σύνολο, τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω και προς τα κάτω σε μια τιμή p 0.001. Από το σύνολο των 10.535 DEG, ένα βασικό σύνολο 2272 γονιδίων ανταποκρίθηκε τόσο στη θεραπεία με flg22 όσο και στη χιτίνη και στις δύο σειρές σόργου. Ομοίως, από το σύνολο των 5410 γονιδίων που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, ένα βασικό σύνολο 1778 γονιδίων ρυθμίστηκε προς τα πάνω και στους δύο γονότυπους, ενώ, από ένα σύνολο 5125 γονιδίων που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω, ένα σύνολο πυρήνα 474 ρυθμίστηκε προς τα κάτω και στους δύο γονότυπους.

Τα δεδομένα αλληλουχίας RNA που παρουσιάζονται εδώ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη διοχέτευση βιοπληροφορικής με εργαλεία Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 και Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) με προεπιλεγμένες παραμέτρους (pipeline #1). Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω τα αποτελέσματα της ανάλυσης, χρησιμοποιήσαμε έναν άλλο αγωγό (σωλήνωση #2) με HiSat2, HTSeq και edgeR για να εκτελέσουμε την ανάλυση. Το HiSat2 είναι η επόμενη ανάπτυξη του TopHat2. Συγκρίναμε τα DEG για κάθε κατάσταση (δηλαδή, δύο γονότυπους που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 ή χιτίνη, όλοι, DEG με ρύθμιση προς τα πάνω ή προς τα κάτω) που επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας και τις δύο αγωγούς. Τα αποτελέσματα (Εικόνα 5) έδειξαν ότι οι αριθμοί DEG που επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας και τους δύο αγωγούς ήταν πολύ κοντά.

Τα συνολικά DEG που επιλέχθηκαν με τον αγωγό #1 έναντι του αγωγού #2 ήταν BTx623_flg22: 5241 έναντι 5413. SC155-14E_flg22: 3849 έναντι 3476; BTx623_χιτίνη: 8085 έναντι 8320; SC155-14E_χιτίνη: 5786 έναντι 5383. Οι ρυθμισμένες προς τα πάνω DEG που επιλέχθηκαν με τη γραμμή αγωγού #1 έναντι της γραμμής αγωγού #2 ήταν BTx623_flg22: 3074 έναντι 3076. SC155-14E_flg22: 2591 vs. 2483; BTx623_χιτίνη: 4156 έναντι 4583; SC155-14E_χιτίνη: 3486 έναντι 3346. Τα DEG με ρύθμιση προς τα κάτω που επιλέχθηκαν με τον αγωγό #1 έναντι του αγωγού #2 ήταν BTx623_flg22: 2152 έναντι 2237. SC155-14E_flg22: 1257 vs. 993; BTx623_χιτίνη: 3919 έναντι 3757; SC155-14E_χιτίνη: 2296 έναντι 2037. Επιπλέον, τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5 αποκάλυψαν επίσης ότι ένα υψηλό ποσοστό των DEG που επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τους δύο αγωγούς επικαλύπτονταν σε όλες τις συνθήκες. Το ποσοστό των επικαλυπτόμενων αριθμών DEG/Αριθμών DEG που επιλέχθηκαν με τη χρήση της γραμμής #1 ήταν 79,6 τοις εκατό και 73,7 τοις εκατό . 80,8 τοις εκατό και 74,4 τοις εκατό των συνολικών DEG BTx{623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_χιτίνης και SC155-14E{{{73} }χιτίνη, αντίστοιχα; 83 τοις εκατό , 80,6 τοις εκατό , 85,3 τοις εκατό και 81,1 τοις εκατό των προς τα πάνω ρυθμιζόμενων DEG των BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_χιτίνης και SC{{ 88}}Ε_χιτίνη, αντίστοιχα. 75,1 τοις εκατό , 59,5 τοις εκατό , 75,8 τοις εκατό και 67,4 τοις εκατό των προς τα κάτω ρυθμιζόμενων DEGs BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_χιτίνης και SC{{ 105}}Ε_χιτίνη, αντίστοιχα. Έτσι, αυτά τα συγκριτικά αποτελέσματα απέδειξαν ότι τα δεδομένα αλληλουχίας RNA που παρουσιάζονται είναι σωστά ανεξάρτητα από το ποια από τις δύο μεθόδους χρησιμοποιείται για την ανάλυση.

Ο χάρτης θερμότητας των ομαδοποιημένων προφίλ έκφρασης των DEG των BTx623 και SC155-14Ε που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 ή χιτίνη για τα τρία βιολογικά αντίγραφα παρουσιάζεται στο Σχήμα 6. Οι τιμές γονιδιακής έκφρασης κανονικοποιήθηκαν ως z-scores. Το χρώμα γίνεται από μωβ σε κόκκινο καθώς αυξάνεται η τιμή, υποδεικνύοντας τη γονιδιακή έκφραση από χαμηλή σε υψηλή. Αυτός ο χάρτης θερμότητας δείχνει ξεκάθαρα τη διαφορική ρύθμιση των γονιδίων στο BTx623 και στο SC155-14E ως απόκριση στην επεξεργασία flg22 ή χιτίνης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι οι χάρτες θερμότητας τριών βιολογικών αντιγράφων σε κάθε κατάσταση ήταν πολύ κοντά, υποδεικνύοντας καλή αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των βιολογικών αντιγράφων.

Επιπλέον, συγκρίσεις ανά ζεύγη (Εικόνα 7Α) μεταξύ των ρυθμιζόμενων προς τα πάνω και προς τα κάτω DEG από τις θεραπείες flg22 και χιτίνης έδειξαν ότι υπήρχε μεγάλη επικάλυψη μεταξύ BTx623 και SC155-14E. Μεταξύ των 3074 γονιδίων που προκλήθηκαν από flg22-στο BTx623, το 83,8 τοις εκατό προκλήθηκαν επίσης στο BTx623 ως απόκριση στη θεραπεία με χιτίνη, ενώ από τα γονίδια που επήγαγαν τα 2591 flg22-στο SC155-14E, {{ 16}}.6 τοις εκατό ανταποκρίθηκαν επίσης σε SC155-14E που υποβλήθηκε σε αγωγή με χιτίνη. Αυτό ίσως δεν αποτελεί έκπληξη, καθώς προηγούμενες εργασίες στο Arabidopsis thaliana έδειξαν σημαντική επικάλυψη στα γονίδια που ανταποκρίνονται σε μια ποικιλία διαφορετικών MAMP, τα οποία καθορίζουν τις γενικές οδούς MTI [44-46].

Επιπλέον, οι Zhang et al. [17] ανέφερε επίσης μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ flg22 και απόκρισης χιτίνης στον αραβόσιτο. Παρατηρήθηκε λιγότερη επικάλυψη μεταξύ δίσκων φύλλων BTx623 και SC{3}}Ε που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ίδιο MAMP (Εικόνα 7Α). Το 64,3 τοις εκατό των γονιδίων που επάγονται από flg22-στο BTx623 προκλήθηκαν σε SC που υποβλήθηκε σε αγωγή με flg22-Ε και το 68,3 τοις εκατό των επαγόμενων από τη χιτίνη γονιδίων στο BTx623 προκλήθηκαν σε SC που υποβλήθηκε σε αγωγή με χιτίνη{{15} ΜΙ. Ομοίως, από τα 2152 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω κατά την αγωγή με flg22 του BTx623, ένα υψηλό ποσοστό (75,9 τοις εκατό) επίσης ρυθμίστηκε προς τα κάτω από τη χιτίνη στο BTx623. Από τα 1257 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από το flg22 στο SC155-14E, το 70,8 τοις εκατό υπορυθμίστηκαν επίσης από τη χιτίνη στο SC155-14E. Ωστόσο, μόνο το 29 τοις εκατό των γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα κάτω flg22 στο BTx623 ήταν επίσης υπορυθμισμένα στο flg22-SC155-14E με αγωγή και το 45 τοις εκατό των γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα κάτω με χιτίνη στο BTx623 ήταν μειωμένα σε επεξεργασμένο με χιτίνη SC155-14E (Εικόνα 7Α). Ως εκ τούτου, ενώ υπήρξε σημαντική σύγκλιση στις οδούς MTI προς το flg22 και τη χιτίνη στους δύο γονότυπους που συγκρίθηκαν, τα δεδομένα υποδηλώνουν επίσης ενδιαφέρουσα πολυπλοκότητα σχετικά με το πώς αυτοί οι δύο γονότυποι ανταποκρίνονται σε διαφορετικά MAMP.

2.3. Ανάλυση λειτουργικού εμπλουτισμού γονιδίου Συγκρίνοντας την απόκριση MTI του BTx623 και του SC155-14E

Για να προσδιορίσουμε τις λειτουργικές κατηγορίες γονιδίων που ρυθμίζονται ως απόκριση είτε στο flg22 είτε στη χιτίνη και τη διαφορική απόκριση των δύο σειρών σόργου που δοκιμάστηκαν, χρησιμοποιήσαμε την πλατφόρμα PlantRegMap [47,48] για να πραγματοποιήσουμε Ανάλυση Εμπλουτισμού Συνόλων Γονιδίων με βάση τα ανιχνευθέντα DEG στο βιολογικό κατηγορία διαδικασίας. Το Σχήμα 8Α και Β δείχνει τους κορυφαίους όρους GO των γονιδίων εμπλουτισμένων με βιολογικές διεργασίες με DEG που ρυθμίζονται προς τα πάνω και DEG που ρυθμίζονται προς τα κάτω τόσο από το BTx623 όσο και από το SC155-14E. Η πλήρης λίστα των DEG παρέχεται στους Πίνακες S6–S13. Πολλά από αυτά τα γονίδια συνδέονται με διεργασίες όπως η απόκριση στο στρες, οι αμυντικές αποκρίσεις των φυτών, η απόκριση σε ερέθισμα, η απόκριση σε βιοτικό ερέθισμα, η απόκριση στο βακτήριο, η απόκριση σε άλλο οργανισμό, η κυτταρική επικοινωνία, η μεταβολική διαδικασία του φωσφόρου και η φωσφορυλίωση πρωτεΐνης.

Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 8Α και Β δείχνουν σαφείς διαφορές στην έκφραση των γονιδίων που συνήθως συνδέονται με την έμφυτη ανοσία μεταξύ των δύο γονότυπων σόργου. Σε αυτούς τους εμπλουτισμένους όρους GO, βρέθηκαν μερικά μοναδικά DEG σε κάθε κατάσταση με επικάλυψη. Για παράδειγμα, ο όρος αμυντική απόκριση GO (GO 0006952): 91 και 84 ρυθμισμένα προς τα πάνω DEG εμπλουτίστηκαν σε BTx623 ή SC155-14Ε που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22, αντίστοιχα. Σε αυτές τις DEG, οι 24 DEG ήταν μοναδικές στο BTx623 και οι 15 DEG βρέθηκαν μόνο στο SC155-14E και οι άλλοι εμφανίστηκαν και στους δύο γονότυπους σόργου. Ομοίως, 102 και 93 ρυθμισμένα προς τα πάνω DEG εμπλουτίστηκαν σε BTx623 ή SC155-14Ε που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη, αντίστοιχα. Μέσα σε αυτά τα DEG, 20 DEG ήταν μοναδικά στο BTx623 και 14 DEG ήταν μοναδικά στο SC155-14E και τα άλλα παρουσιάστηκαν και στους δύο γονότυπους σόργου.

Στον όρο GO της "απόκρισης στη χιτίνη (GO: 0010200)", παρατηρήσαμε 18 αυξημένα ρυθμισμένα DEG από ένα σύνολο 779 γονιδίων αυτής της κατηγορίας εμπλουτισμένα στα δείγματα SC155-14E που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη (Εικόνα 8 ), ενώ κανένα γονίδιο δεν εμπλουτίστηκε στα δείγματα BTx623 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη. Επιπλέον, 16 αυξημένη ρύθμιση DEG εμπλουτίστηκαν σε flg22-επεξεργασμένα δείγματα SC155-14E και 12 αυξημένα ρυθμισμένα DEG εμπλουτίστηκαν σε δείγματα BTx623 με flg22-επεξεργασία (Εικόνα 8). Η σύγκριση των λιστών DEG του όρου GO "απόκριση στη χιτίνη" στο flg22 και στο BTX623 και στο SC{21}}E που έχει υποστεί επεξεργασία με χιτίνη (Πίνακας S9) αποκάλυψε ότι τα DEG εμπλουτισμένα σε flg22 ή SC που έχουν υποστεί επεξεργασία με χιτίνη{{25} Το E ήταν το ίδιο εκτός από το ότι η χιτίνη προκάλεσε δύο περισσότερα DEG από το flg22. Αντίθετα, και τα 12 DEG που εμπλουτίστηκαν με flg22-BTX623 ήταν διαφορετικά από τα DEG που προκλήθηκαν από MAMP στο SC155-14E. Αυτά τα DEG που προκαλούνται από MAMPs μπορεί να συμβάλλουν στην απόκριση αντίστασης της ανθρακνόζης στο SC155-14E, καθώς η χιτίνη είναι ένα τυπικό μόριο MAMP από τα κυτταρικά τοιχώματα των μυκήτων που προκαλεί ανοσολογικές αποκρίσεις των φυτών. Οι Stringlis et al. [49] ανέφερε επίσης ότι ένα σύνολο ρυθμισμένων DEGs εμπλουτίστηκαν στον όρο GO της «απόκρισης στη χιτίνη» από χιτίνη, flg22, και ένα ωφέλιμο φυτό ριζοβακτήρια Pseudomonas simiae με WCS417 φυτά Arabidopsis. Οι Matic et al. [33] ανέφερε ότι 21 DEG εμπλουτίστηκαν στον όρο GO της "απόκρισης στη χιτίνη" από την ανάλυση RNA-seq φύλλου ρυζιού μιας ανθεκτικής ποικιλίας αλλά όχι από μια ευαίσθητη ποικιλία μετά από μόλυνση με το μυκητιακό παθογόνο Fusarium fujikuroi.

Τα γονίδια PR (σχετιζόμενα με την παθογένεια) εμπλέκονται στην ανοσολογική απόκριση των φυτών [50] και έχουν αντιμυκητιακή δράση έναντι πολλών φυτοπαθογόνων μυκήτων [51]. Οι πρωτεΐνες PR{3}} είναι μικρές, κυρίως όξινες, ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες με αντιμυκητιακές ιδιότητες που έχουν συσχετιστεί με αμυντικές αποκρίσεις σε φυτικά είδη συμπεριλαμβανομένου του σόργου [52]. Τα μέλη της οικογένειας του γονιδίου PR-10 προκλήθηκαν από επιθέσεις παθογόνων σε μια μεγάλη ποικιλία φυτικών ειδών [53]. Στο σόργο, οι Lo et al. [26] ανέφερε ότι η έκφραση PR-10 προκλήθηκε ως μέρος της ενεργού άμυνας του ξενιστή του σόργου έναντι των μυκητιακών παθογόνων φυλλώματος C. heterostrophus και C. sublineolum. Οι Katie et al. [54] ανέφερε ότι αρκετές ποικιλίες σόργου έδειξαν σημαντική επαγωγή κανονικοποιημένων σχετικών ποσοτήτων PR{10}} μετά τον εμβολιασμό με μυκητιακά σπόρια C. lunata και F. capsicum σε δοκιμές αγρού. Σε συνθήκες θερμοκηπίου, τα κολλήματα των εμβολιασμένων φυτών έδειξαν επαγωγή mRNA PR-10 και η απόκριση ήταν μεγαλύτερη σε δύο ανθεκτικές ποικιλίες που δοκιμάστηκαν σε σχέση με δύο ευαίσθητες ποικιλίες.

Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι μεταξύ των DEG που εντοπίστηκαν, βρέθηκαν τέσσερα γονίδια PR-10 (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI{_3001 G401000). Στο SC155-14E και οι τέσσερις PR-10 DEG ρυθμίστηκαν προς τα πάνω με επεξεργασία flg22 ή χιτίνης, αντίθετα, στο BTx623, το SORBI_3001G401000 δεν βρέθηκε στα DEG και το SORBI{{15} Το G401300 (προκαθορισμένο) παρουσιάστηκε μόνο στο BTx623 με επεξεργασία χιτίνης αλλά όχι με θεραπεία flg22. Αυτό έδειξε ότι η έκφραση των γονιδίων PR θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως απόκριση σε υψηλότερα επίπεδα προϊόντος ROS μετά από θεραπεία με MAMPs και αντίσταση έναντι της ανθρακνόζης στο SC155-14E.

Το σαλικυλικό οξύ (SA) είναι ένα φυτικό ανοσοποιητικό σήμα απαραίτητο τόσο για την τοπική αμυντική απόκριση όσο και για τη συστηματική επίκτητη αντίσταση. Παίζει σημαντικό ρόλο στην αντοχή και την άμυνα των φυτών έναντι των επιθέσεων παθογόνων [55]. Στο σόργο, οι Tugizimana et al. [56] ανέφεραν ποσοτικές αλλαγές στα επίπεδα του ιασμονικού οξέος, των συζυγών σαλικυλικού οξέος και του ασπισικού οξέος στο μολυσμένο με C. subline-ola σόργο. Το C. subline-ola είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της ανθρακνόζης. Οι γονότυποι του σόργου με ενισχυμένα επίπεδα αμινοξέων (τρυπτοφάνη και τυροσίνη), ιασμονικού οξέος και σαλικυλικών συζεύξεων και ζεατίνης ήταν πιο ανθεκτικοί στην ανθρακνόζη. Σε αυτήν τη μελέτη, ο όρος GO «απόκριση στο σαλικυλικό οξύ» (GO:0009751) που περιλαμβάνει 19 αυξημένα ρυθμιζόμενα DEG εμπλουτίστηκε ειδικά μόνο σε SC155-14Ε που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με χιτίνη (Πίνακας S9). Ως εκ τούτου, η σαλικυλική οδός σηματοδότησης θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο ως απόκριση σε υψηλότερα επίπεδα παραγωγής ROS μετά από θεραπεία με MAMP και αντίσταση στην ανθρακνόζη στο SC155-14E.

Επιπλέον, 169 αυξημένα ρυθμιζόμενα DEG εμπλουτίστηκαν στην απόκριση του όρου GO στο στρες μόνο σε SC155-14Ε που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με χιτίνη (Πίνακας S9). Οι άλλοι όροι GO που απαντώνται αποκλειστικά στο SC155-14E που έχει υποστεί επεξεργασία με MAMP, αλλά όχι στο BTx623 με την ίδια επεξεργασία είναι δευτερογενείς μεταβολικές διεργασίες (GO:0019748), βιοσυνθετική διαδικασία φωσφατιδυλοχολίνης (GO:0006656) και βιοσυνθετική διαδικασία λιπιδίων ( GO:0008610).

Επιπλέον, 169 αυξημένα ρυθμιζόμενα DEG εμπλουτίστηκαν στην απόκριση του όρου GO στο στρες μόνο σε SC155-14Ε που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με χιτίνη (Πίνακας S9). Οι άλλοι όροι GO που απαντώνται αποκλειστικά στο SC155-14E που έχει υποστεί επεξεργασία με MAMP, αλλά όχι στο BTx623 με την ίδια επεξεργασία είναι δευτερογενείς μεταβολικές διεργασίες (GO:0019748), βιοσυνθετική διαδικασία φωσφατιδυλοχολίνης (GO:0006656) και βιοσυνθετική διαδικασία λιπιδίων ( GO:0008610).

Εξετάσαμε επίσης τη σύνθεση γονιδίων που ρυθμίζονται από κοινού μεταξύ των δύο γονότυπων μετά από επεξεργασία flg22 ή χιτίνης, καθώς και τα βασικά σύνολα DEG σε όλες τις θεραπείες και δύο γονότυπους με ανάλυση εμπλουτισμού GO (Εικόνες 4Β και 7Β). Η πλήρης λίστα των DEG παρέχεται στους Πίνακες S14 και S15. Το σχήμα 4Β έδειξε τους εμπλουτισμένους όρους GO των συνόλων πυρήνων των συνολικών, ρυθμιζόμενων προς τα πάνω και προς τα κάτω DEG σε BTx623 και SC155-14E με όλες τις θεραπείες. Οι όροι GO που σχετίζονται με την απόκριση των MAMPs και την άμυνα των φυτών (π.χ. δέσμευση χιτίνης, αμυντική απόκριση, δραστηριότητα πρωτεϊνικής κινάσης, φωσφορυλίωση πρωτεΐνης, δραστηριότητα κινάσης πρωτεΐνης σερίνης/θρεονίνης) εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε αυξημένα ρυθμιζόμενα DEG ενώ οι όροι GO της βιοσυνθετικής διαδικασίας δευτερογενούς μεταβολίτη. δέσμευση ιόντων σιδήρου, δραστικότητα οξειδοαναγωγάσης εμπλουτίστηκαν μόνο σε μειωμένα ρυθμιζόμενα DEG. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν παρόμοιο με τα αποτελέσματα στο Arabidopsis όπου οι όροι GO που σχετίζονται με την ανταπόκριση σε διεγέρτες (πεπτίδια flg22 από P. simile WCS417 και P. aeruginosa PAO1, χιτίνη και βακτηριακά κύτταρα του P. simile WCS417) εμπλουτίστηκαν πιο σημαντικά στην αυξημένη ρύθμιση βασικό σύνολο DEG [49].

Το Σχήμα 7Β έδειξε τους σημαντικά εμπλουτισμένους όρους GO των συν-ρυθμιζόμενων (δηλαδή, ρυθμιζόμενων προς τα πάνω ή προς τα κάτω και στους δύο γονότυπους) συνόλων DEG μεταξύ BTx623 και SC155-14E μετά από επεξεργασία flg22 ή χιτίνης. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι οι όροι GO που σχετίζονται με την απόκριση MAMPs και την άμυνα των φυτών (π.χ. αμυντική απόκριση, δραστηριότητα πρωτεϊνικής κινάσης, φωσφορυλίωση πρωτεΐνης, δραστηριότητα πρωτεϊνικής σερίνης/θρεονίνης κινάσης) εμπλουτίστηκαν μόνο σε flg22 ή αυξημένα ρυθμιζόμενα DEG χιτίνης και στους δύο γονότυπους ενώ οι όροι GO της βιοσυνθετικής διαδικασίας δευτερογενούς μεταβολίτη, η δέσμευση της αίμης, η δέσμευση ιόντων σιδήρου, η δραστικότητα οξειδοαναγωγάσης ενός ατόμου οξυγόνου και η βιοσυνθετική διαδικασία φωσφατιδυλοχολίνης εμπλουτίστηκαν αποκλειστικά σε σετ DEG που ρυθμίζονται προς τα κάτω.

2.4. KEGG Pathway Enrichment Analysis of MTI Response of BTx623 and SC155-14E

Το σχήμα 9 δείχνει την ανάλυση εμπλουτισμού της οδού KEGG των προς τα πάνω ρυθμιζόμενων DEG που βρέθηκαν στα δείγματα BTx623 και SC{4}}Ε που έχουν υποστεί επεξεργασία με MAMP χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο DAVID [57]. Η πλήρης λίστα των DEG παρέχεται στους Πίνακες S16–S20. Τα αποτελέσματα προσδιορίζουν εκείνα τα συγκεκριμένα κορυφαία μονοπάτια KEGG που εμπλουτίστηκαν ως αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του MTI στους δύο γονότυπους σόργου. Στο μονοπάτι KEGG "αλληλεπίδραση φυτού-παθογόνου", παρατηρήσαμε ότι 24 ρυθμισμένα προς τα πάνω DEGs εμπλουτίστηκαν στα δείγματα SC{11}}E που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη, ενώ κανένα από τα DEG δεν εμπλουτίστηκε στα δείγματα BTx623 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χιτίνη. Η ισχυρότερη απόκριση χιτίνης του γονότυπου SC155-14E συσχετίζεται με τη μεγαλύτερη αντοχή αυτού του γονότυπου στη μυκητιασική νόσο ανθρακνόζη [39]. Επιπλέον, ο εμπλουτισμός της οδού KEGG αποκάλυψε 28 γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση του όρου φαινυλοπροπανοειδούς σε SC155-14Ε που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με flg22. Η οδός βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών ξεκινά με φαινυλαλανίνη η οποία μπορεί να μετατραπεί σε αρωματικές ενώσεις όπως φλαβονοειδή, βενζενοειδή, κουμαρίνη, υδροξυκινναμικά και λιγνίνη [58,59]. Πολλά φαινυλοπροπανοειδή και φλαβονοειδή συμμετείχαν στην απόκριση αντοχής στην ασθένεια [28,60]. Η παραγωγή φυτοαλεξινών είναι μια σημαντική αμυντική απόκριση έναντι του παθογόνου της ανθρακνόζης C. subline-ola [28] στο σόργο. Οι 3- δεοξυ ανθοκυανιδίνες είναι μια ασυνήθιστη ομάδα φλαβονοειδών που αναγνωρίζονται ως φυτοαλεξίνες στο σόργο. Οι φυτοαλεξίνες είναι μικρά μόρια με αντιμικροβιακή δράση που παράγονται μετά από μόλυνση από παθογόνο [61]. Οι Wang et al. [37] διαπίστωσε επίσης ότι ο όρος KEGG βιοσύνθεση φαινυλοπροπανοειδών εμπλουτίστηκε σημαντικά σε DEGs φυτών μολυσμένων με C. subline-ola στη μεταγραφική μελέτη τους για το σόργο. Θα πρέπει να σημειώσουμε ότι τα αποτελέσματα εμπλουτισμού της οδού KEGG (Εικόνα 9) έδειξαν επίσης υψηλότερη απόκριση του BTx623 μετά τη θεραπεία με MAMPs σε ορισμένες οδούς που μπορεί να παίζουν ρόλο στις αλληλεπιδράσεις φυτού-παθογόνου (π.χ. στις οδούς βιοσύνθεσης φαινυλαλανίνης και τρυπτοφάνης, βιοσύνθεση αντιβιοτικών).

Επιπλέον, τα αποτελέσματα της ανάλυσης εμπλουτισμού της οδού KEGG των προς τα κάτω ρυθμιζόμενων DEGs αποκάλυψαν ότι δέκα DEGs ρυθμίστηκαν προς τα κάτω ως «πρωτεΐνες φωτοσύνθεσης κεραίας» και 84 DEG σχολιάστηκαν καθώς συμμετείχαν στη «βιοσύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών» εμπλουτίστηκαν σε επεξεργασία flg22 BTx623. Ωστόσο, τέτοιες μελέτες γονιδιακής έκφρασης μπορούν να ταυτοποιήσουν γονίδια που εκφράζονται διαφοροποιημένα ως απόκριση στη θεραπεία με MAMPs ή στη μόλυνση από παθογόνο, αλλά δεν αποδεικνύεται απαραίτητα ότι αυτά τα γονίδια είναι κρίσιμα για αντοχή έναντι ενός συγκεκριμένου παθογόνου. Έτσι, θα χρειαζόταν περαιτέρω έρευνα για να κατανοηθούν οι αιτιολογικές σχέσεις μεταξύ της μυκητιακής αντοχής και της ενεργοποίησης αυτών των οδών KEGG και στους δύο γονότυπους, όπως αποκαλύπτεται από την ανάλυση RNA-Seq.

Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση εμπλουτισμού της οδού KEGG για τα σύνολα πυρήνων των DEG σε όλες τις συνθήκες (Εικόνα 4C) καθώς και τα συν-ρυθμιζόμενα DEG μεταξύ των δύο γονότυπων μετά από επεξεργασία flg22 ή χιτίνης (Εικόνα 7C). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι έξι σημαντικά μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένης της οδού αλληλεπίδρασης φυτού-παθογόνου, εμπλουτίστηκαν μόνο σε σετ πυρήνων DEG που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω αλλά όχι σε σετ πυρήνων DEG με μειωμένη ρύθμιση. Ομοίως, επτά και τρία μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένης της οδού αλληλεπίδρασης φυτού-παθογόνου, εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε DEG που ρυθμίζονται προς τα πάνω με χιτίνη και DEG με φλg22 προς τα πάνω σε BTx623 και SC155-14E, αντίστοιχα. Αντίθετα, μόνο η βιογένεση του ριβοσώματος στο μονοπάτι των ευκαρυωτών εμπλουτίστηκε σε DEG που ρυθμίζονται με τη χιτίνη και στους δύο γονότυπους.

2.5. Επικύρωση των δεδομένων RNA-Seq με χρήση ποσοτικής RT-PCR επιλεγμένων γονιδίων

Για να επιβεβαιώσουμε τα δεδομένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης που ελήφθησαν από το RNA-seq, πραγματοποιήσαμε ανάλυση qRT-PCR για να αξιολογήσουμε την έκφραση εννέα επιλεγμένων υποψήφιων γονιδίων. Αυτά τα εννέα γονίδια επιλέχθηκαν με βάση την έκφραση που παρατηρήθηκε από το RNA-seq σε τρεις κατηγορίες: (α) εκφράζονται παρόμοια σε BTx623 και SC155-14E με επεξεργασία flg22 ή χιτίνης. (β) εκφράζεται μόνο σε SC155-14E που έχει υποστεί αγωγή με MAMP αλλά με εξαιρετικά χαμηλή έκφραση σε BTx623 που έχει υποστεί αγωγή και (γ) εκφράζεται 2–21- φορές υψηλότερη σε SC155-14E που έχει υποστεί επεξεργασία με MAMP σε σχέση με BTx623 . Τα αποτελέσματα της ανάλυσης qRT-PCR (Πίνακας 1) αποκάλυψαν μια πλήρη συμφωνία με τα επίπεδα έκφρασης που καθορίστηκαν με ανάλυση αλληλουχίας RNA για καθένα από τα εννέα γονίδια που αξιολογήθηκαν. Αυτά τα αποτελέσματα μας δίνουν εμπιστοσύνη ότι οι μετρήσεις που έγιναν από το RNA-seq αντικατοπτρίζουν τη μεταγραφική απόκριση των γραμμών σόργου στη θεραπεία με MAMP

2.6. συμπεράσματα

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε αρχικά τις βέλτιστες συνθήκες για τη σύγκριση της απόκρισης MTI των δύο γονότυπων δοκιμάζοντας την παραγωγή ROS χρησιμοποιώντας τρία σετ φύλλων και επιλέξαμε τα δεύτερα νεότερα φύλλα φυτών δεκαπέντε ημερών για εκχύλιση RNA και επακόλουθη μεταγραφική ανάλυση. Μια χρονική πορεία της παραγωγής ROS που ενεργοποιήθηκε από flg22-και προκάλεσε χιτίνη στη σειρά σόργου SC155-14E (Εικόνα 1Γ) αποκάλυψε ότι η παραγωγή ROS που ενεργοποιήθηκε από χιτίνη συνέβη νωρίτερα από εκείνη που προκλήθηκε από τη θεραπεία με flg22. Λάβαμε τα προφίλ έκφρασης της μυκητιασικής νόσου ανθεκτικό στην ανθρακνόζη Σόργο δίχρωμο γονότυπο SC155-14E με υψηλή ανταπόκριση στη θεραπεία με MAMPs στην παραγωγή ROS και τον ευαίσθητο γονότυπο BTx623 με χαμηλή ανταπόκριση στο προϊόν ROS στη θεραπεία με MAMP κατά τα αρχικά στάδια της έμφυτης απόκρισης ανοσίας.

Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν μια σαφή παραλλαγή της γονιδιακής έκφρασης στους γονότυπους σόργου BTx623 και SC155-14E ως απόκριση στη θεραπεία με MAMP. Ενώ οι αποκρίσεις στα δύο MAMP έδειξαν σημαντική επικάλυψη σε κάθε γραμμή (86,6–70,8 τοις εκατό ), ήταν διακριτές. Κάποια, αν και χαμηλότερη, επικάλυψη (68,3–29 τοις εκατό) παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ των αποκρίσεων των δύο γραμμών στο ίδιο MAMP. Ένας σημαντικός αριθμός DEG, 2272 από τις 10.535 DEG, εντοπίστηκαν και στις τέσσερις συνθήκες και ορίζουν δοκιμαστικά την απόκριση του πυρήνα MAMP. Αυτή η λίστα γονιδίων θα πρέπει να είναι χρήσιμη σε εκείνα τα εργαστήρια που θέλουν να καταγράψουν την απόκριση γονιδιακής έκφρασης στη θεραπεία με MAMP. Η ανάλυση RNA-seq εντόπισε μεγάλα σύνολα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε BTx623 και SC155-14Ε που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 ή χιτίνη σε σύγκριση με μη επεξεργασμένους ψευδείς μάρτυρες αυτών των δύο γραμμών. Επιπλέον, μια σύγκριση των DEG που επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς αγωγούς βιοπληροφορικής έδειξε πολύ παρόμοια αποτελέσματα. Η λεπτομερής ανάλυση προφίλ έκφρασης αυτών των DEG, η ανάλυση εμπλουτισμού GO και η ανάλυση οδού KEGG αποκάλυψαν μια σαφή παραλλαγή στην απόκριση γονιδιακής έκφρασης των δύο γονότυπων. Ο όρος GO και ο εμπλουτισμός της οδού KEGG ανακάλυψαν περισσότερα DEG που σχετίζονται με την ανοσία και την αντίσταση στα παθογόνα (γονίδια PR, γονιδιακή απόκριση στη χιτίνη, απόκριση γονιδίων στο σαλικυλικό οξύ, απόκριση στο στρες, βιοσύνθεση φαινυλοπροπανοειδών, κ.λπ.) σε SC που υποβλήθηκε σε αγωγή με MAMP{{18} }Δείγματα E σχετικά με BTx623 με την ίδια επεξεργασία. Αυτές οι πληροφορίες παρέχουν σημαντικές βασικές πληροφορίες σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα αυτού του βασικού φυτού καλλιέργειας ανταποκρίνεται στην πρόκληση MAMPs. Δεδομένης της γενικής έλλειψης πληροφοριών σχετικά με την έμφυτη ανοσολογική απόκριση των καλλιεργούμενων φυτών, σε σχέση με το μοντέλο Arabidopsis, οι κατάλογοι γονιδίων και οι μέθοδοι που περιγράφονται παρέχουν μια πηγή για περαιτέρω διερεύνηση της απόκρισης του σόργου στα παθογόνα και θα πρέπει να διευκολύνουν τις προσπάθειες για τη βελτίωση της αντοχής στις ασθένειες. αυτή τη σημαντική καλλιέργεια τροφίμων και βιομάζας.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Φυτικά Υλικά

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο σειρές σόργου που παρέχονται από τον Δρ. William Rooney (Πανεπιστήμιο A&M του Τέξας, College Station, ΗΠΑ) και τον Δρ. Stephen Kresovich (Πανεπιστήμιο Clemson, Clemson, ΗΠΑ). Το BTx623 είναι μια τυπική σειρά σόργου με διαθέσιμη ολόκληρη αλληλουχία γονιδιώματος [22] και η SC155-14E είναι μια γραμμή που αναπτύχθηκε για αντοχή στην ανθρακνόζη [39].

3.2. Δοκιμασίες ROS

Οι σπόροι σόργου BTx623 και SC155-14Ε αποστειρώθηκαν επιφανειακά (70 τοις εκατό αιθανόλη για 1 λεπτό και στη συνέχεια 10 τοις εκατό λευκαντικό για 10 λεπτά, ξεπλύθηκαν με ddH2O σε αυτόκλειστο) και φυτεύτηκαν σε αυτόκλειστο μείγμα γλαστρών Sunshine και βλάστησαν σε θαλάμους ανάπτυξης ( 16 h/8 h φως/σκοτάδι, 28/26 ◦C, 60–70 τοις εκατό υγρασία). Για πειράματα χρησιμοποιήθηκαν φυτά δεκαπέντε ημερών.

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο MAMP, flg22 (Genscript catalog# RP19986) και χιτίνη από κέλυφος καβουριού (Sigma-Aldrich, αρ. καταλόγου C3641). Το Flg22 είναι ένα πεπτίδιο που προέρχεται από το Ν-άκρο των μαστιγών των παθογόνων βακτηρίων των φυτών και είναι γνωστό ότι προκαλεί μια ειδική έμφυτη ανοσολογική απόκριση στα φυτά [62]. Η χιτίνη είναι ένα τυπικό μόριο MAMP που προέρχεται από κυτταρικά τοιχώματα μυκήτων, το οποίο προκαλεί ανοσοαποκρίσεις των φυτών [3]. Οι αναλύσεις ROS πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους Kimball et al. [38]. Για να αξιολογηθεί η διακύμανση της απόκρισης MAMP σε μεμονωμένους γονότυπους, καθώς και τη θέση των φύλλων, αξιολογήθηκαν και τα τρία πλήρως διογκωμένα φύλλα των φυτών κάθε γονότυπου ξεχωριστά. Τα φύλλα από το κάτω μέρος μέχρι την κορυφή των φυτών σόργου δεκαπέντε ημερών κάθε γονότυπου σημειώθηκαν ως φύλλο #1, #2 και #3. Χρησιμοποιήσαμε μόνο το μεσαίο τμήμα του φύλλου για δειγματοληψία για να μετρήσουμε την παραγωγή ROS. Αμέσως μετά τις επεξεργασίες, το σήμα χημειοφωταύγειας κάθε δείγματος καταγράφηκε για 30 λεπτά χρησιμοποιώντας μια κάμερα CCD Photek (Photek Ltd., East Sussex UK). Οκτώ φρεάτια αποτελούνταν από μια εικονική επεξεργασία (χωρίς MAMP) και οκτώ φρεάτια αποτελούνταν από μια επεξεργασία (με MAMP). Σε κάθε περίπτωση, συγκρίθηκαν τρία βιολογικά αντίγραφα με συνολικά 8 δείγματα για κάθε επεξεργασία.

3.3. Επεξεργασία δείγματος με MAMPs

Για πειράματα χρησιμοποιήθηκαν φυτά δεκαπέντε ημερών. Οι θεραπείες MAMPs πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στους Valdes-Lopez et al. [12] με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, το δεύτερο φύλλο (από την κορυφή, δηλαδή το δεύτερο νεότερο φύλλο) από πέντε φυτά για κάθε σειρά σόργου αποσπάστηκε και στη συνέχεια διηθήθηκε υπό κενό με ddH2O σε αυτόκλειστο για 2 λεπτά. Περίπου πενήντα φυλλικοί δίσκοι διαμέτρου 1 cm κόπηκαν από τα διεισδυμένα με νερό φύλλα κάθε γονότυπου και συνενώθηκαν. Σαράντα πέντε δίσκοι φύλλων από κάθε γονότυπο μεταφέρθηκαν σε τρία διαφορετικά τρυβλία Petri (15 δίσκοι φύλλων σε κάθε τρυβλίο Petri) και στη συνέχεια επέπλευσαν όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου σε ddH2O σε αυτόκλειστο με τις πλάκες καλυμμένες με φύλλο αλουμινίου. Την επόμενη μέρα, το νερό αφαιρέθηκε από όλα τα τρυβλία Petri και αντικαταστάθηκε με 10 mL ddH2O (mock), 10 mL 1 μΜ flg22, ή 10 mL διαλύματος χιτίνης 20 mg/mL. Μετά από μια επεξεργασία 60-λεπτών, φέτες φύλλων που υποβλήθηκαν σε ψεύτικη επεξεργασία και επεξεργασία με MAMP συλλέχθηκαν σε διαφορετικούς σωλήνες και καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα φέτας φύλλου (για 101 "ies ied-11272) immunityBTx623 και SC155-14E με εικονικές επεξεργασίες, flg22 ή χιτίνη, τρία βιολογικά αντίγραφα) αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C για εξαγωγή RNA. Οι διαδικασίες που περιγράφονται παραπάνω πραγματοποιήθηκαν κάτω από σκοτεινές συνθήκες για να εξαλειφθεί οποιοδήποτε πιθανό αποτέλεσμα φωτοσύνθεσης.

3.4. Εξαγωγή RNA, Αλληλουχία και Κατασκευή Βιβλιοθήκης

Η εξαγωγή RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Direct-zol RNA Miniprep Plus της Zymoresearch (κατάλογος #R2071) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Αλληλουχία υψηλής απόδοσης πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστήμιο του Μισούρι DNA Core Facility. Δεκαοκτώ βιβλιοθήκες κατασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με αντιδραστήρια που παρέχονται στο κιτ προετοιμασίας δείγματος έλικας mRNA TruSeq της Illumina. Η συγκέντρωση του δείγματος προσδιορίστηκε με φθορόμετρο Qubit (Invitrogen) χρησιμοποιώντας το κιτ ανάλυσης Qubit HS RNA και η ακεραιότητα του RNA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα αυτοματοποιημένης ηλεκτροφόρησης Fragment Analyzer. Εν συντομία, το mRNA που περιέχει πολυ-Α καθαρίστηκε από το συνολικό RNA (1 μg), το RNA κατακερματίστηκε, το δίκλωνο cDNA δημιουργήθηκε από το τεμαχισμένο RNA και ο δείκτης που περιείχε τους προσαρμογείς συνδέθηκε στα άκρα. Τα ενισχυμένα κατασκευάσματα cDNA καθαρίστηκαν με την προσθήκη σφαιριδίων Axyprep Mag PCR Clean-up. Το τελικό κατασκεύασμα κάθε καθαρισμένης βιβλιοθήκης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα αυτοματοποιημένης ηλεκτροφόρησης Fragment Analyzer, ποσοτικοποιήθηκε με το φθορόμετρο Qubit χρησιμοποιώντας το κιτ ανάλυσης Qubit HS dsDNA και αραιώθηκε σύμφωνα με το τυπικό πρωτόκολλο αλληλουχίας της Illumina για τον προσδιορισμό αλληλουχίας στο NextSeq 500. Η σειρά ήταν απλή. διαβάζεται σε 75 βάσεις.

3.5. Χαρτογράφηση και Επεξεργασία Αναγνώσεων RNA-Seq

Τα δεδομένα αλληλουχίας αντιπροσώπευαν έξι διαφορετικές καταστάσεις: BTx623 με θεραπεία ψευδούς, flg22 ή χιτίνης και SC155-14E με θεραπεία ψευδούς, flg22 ή χιτίνης. Κάθε συνθήκη αντιπροσωπεύτηκε από τρία βιολογικά αντίγραφα, με αποτέλεσμα 18 συνολικά δείγματα. Αρχικά, τα 30 άκρα των αναγνώσεων "κόπηκαν" για προσαρμογείς Illumina, για διφορούμενα νουκλεοτίδια (N's) και (λόγω της τεχνολογίας NextSeq) για τεχνητό πολυ-G (που αντιπροσωπεύεται ως G{100}) χρησιμοποιώντας cutadapt έκδοση 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, πρόσβαση στις 21 Αυγούστου 2019) για αναγνώσεις των οποίων τα 30 άκρα αλληλεπικαλύπτονται με τον προσαρμογέα για τουλάχιστον 3 βάσεις με 90 τοις εκατό ταυτότητα. Εάν μετά από αυτό το κούρεμα, μια ανάγνωση περιείχε λιγότερες από δέκα βάσεις, απορρίφθηκε (μαζί με τη ζευγαρωμένη ανάγνωση, εάν υπάρχει). Οι βαθμολογίες ποιότητας για τα δεδομένα αλληλουχίας RNA μετά το κόψιμο εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το FASTQC (έκδοση 0.11.9) [63]. Για όλες τις θέσεις στις αναγνώσεις, η διάμεση βαθμολογία ποιότητας είναι περίπου 34, υποδεικνύοντας ότι η βασική ακρίβεια κλήσης είναι υψηλότερη από 99,9 τοις εκατό . Οι αναγνώσεις για κάθε δείγμα ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. ανώτατου επιπέδου. fa) με το Tophat 2.1.1. Τα προκύπτοντα αρχεία ευθυγράμμισης παρασχέθηκαν στα Μανικετόκουμπα 2.2.1 για τη συγκέντρωση μεταγραφών για κάθε δείγμα. Η έκδοση σχολιασμού που χρησιμοποιήθηκε σε αυτήν την έρευνα ήταν το Sorghum_δίχρωμο_NCBIv3.38.gff3. Δείγματα από την ίδια κατάσταση συγχωνεύτηκαν χρησιμοποιώντας Cuffmerge. Ο σκοπός ήταν να παρασχεθεί μια ενιαία βάση για τον υπολογισμό της έκφρασης γονιδίου και μεταγραφής σε κάθε κατάσταση.

3.6. Βιοπληροφορική Ανάλυση Δεδομένων RNA-Seq

Τα δεδομένα αλληλουχίας RNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας εργαλεία βιοπληροφορικής Bowtie{{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 και Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) με προεπιλεγμένες παραμέτρους. Χρησιμοποιήσαμε τον ίδιο αγωγό με αυτά τα εργαλεία όπως περιγράφεται στους Trapnell et al. [64]. Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω τα αποτελέσματα της ανάλυσης, χρησιμοποιήσαμε μια άλλη διοχέτευση με HiSat2 (έκδοση 2.1.0), HTSeq (έκδοση 0.12.4) και edgeR (έκδοση 3.26.8) για την εκτέλεση της ανάλυσης. Το HiSat2 είναι η επόμενη ανάπτυξη του TopHat2. Αρχικά, χρησιμοποιήσαμε το HiSat2 για να κάνουμε την ευθυγράμμιση χρησιμοποιώντας το γονιδίωμα αναφοράς Sorghum. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το HTSeq για να μετρήσουμε πόσες αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν σε κάθε γονίδιο. Για αυτό, χρειαζόμασταν τα αρχεία bam που δημιουργήθηκαν από το προηγούμενο βήμα και τον σχολιασμό γονιδιώματος (αρχείο gif). Σημειώστε ότι το γονιδίωμα αναφοράς και τα αρχεία σχολιασμού είναι τα ίδια με αυτά που χρησιμοποιήσαμε στην αρχική διοχέτευση. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε το R πακέτο edgeR για να προσδιορίσουμε τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σε κάθε συνθήκη

3.7. Ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων
Το συγχωνευμένο συγκρότημα τροφοδοτήθηκε στο Cuffdiff, το οποίο υπολογίζει τα επίπεδα έκφρασης και ελέγχει τη στατιστική σημασία των παρατηρούμενων αλλαγών μεταξύ δύο συνθηκών. Συγκρίναμε τις συνθήκες μεταξύ mock έναντι flg22 και mock έναντι χιτίνης για BTx623 και SC155-14E, αντίστοιχα. Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια εξήχθησαν χρησιμοποιώντας 0.001 κατώφλια τιμής p. Τα ηφαίστεια έγιναν χρησιμοποιώντας το πακέτο R (ggplot2 V3.3.0) για να δείξουν τη σημασία της αλλαγής της γονιδιακής έκφρασης σε συνθήκες BTx623 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 ή χιτίνη και SC155- 14E που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με flg22 ή χιτίνη, αντίστοιχα. Οι γονιδιακές κουκκίδες με −log10 (p-value) ίσο ή μεγαλύτερο από τρία θεωρήθηκαν DEG. Σε κάθε διάγραμμα, οι γονιδιακές κουκκίδες με log2 (πτυχή_αλλαγή) μεγαλύτερη από το μηδέν ήταν γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, διαφορετικά ρυθμίζονταν προς τα κάτω γονίδια.

3.8. PCA Plot

Για να εξεταστεί η σχέση μεταξύ των τιμών γονιδιακής έκφρασης τριών βιολογικών αντιγράφων κάθε σειράς σόργου και κάθε επεξεργασίας MAMP, δημιουργήθηκαν γραφικές παραστάσεις ανάλυσης κύριου συστατικού (PCA) χρησιμοποιώντας πακέτα R (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει μια συνθήκη μετά την αντιστοίχιση από τον αρχικό χώρο χαρακτηριστικών (έκφραση γονιδίου) στα δύο πρώτα κύρια συστατικά. Οι τελείες που ανήκουν στην ίδια κατάσταση τείνουν να συγκεντρώνονται μεταξύ τους

3.9. Θερμικός χάρτης DEG

1 Division of Plant Science and Technology and Biochemistry, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Τμήμα Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Επιστήμης Υπολογιστών, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Plant Science Research Unit, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu