για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Προσδιορισμός και επαλήθευση της πρωτεΐνης αγγειακής κυτταρικής προσκόλλησης 1 ως γονιδίου που σχετίζεται με το ανοσοποιητικό που σχετίζεται με τη σωληναρισιακή βλάβη στη διαβητική νεφρική νόσο

Οι Yan Jia, et al

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Διαβητική νεφρική νόσο(DKD) είναι η κύρια αιτίαχρόνια νεφρική νόσος(ΧΝΝ) και νεφρική νόσο τελικού σταδίου (ESRD), αλλά η παθογένεια δεν είναι πλήρως κατανοητή. Ο σωληναρισιακός τραυματισμός παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το προφίλ της διήθησης των σωληναρισιακών ανοσοκυττάρων και να αποκαλύψει τους υποκείμενους μηχανισμούς μεταξύ της βλάβης των σωληναριακών κυττάρων και της διάμεσης φλεγμονής στην DKD(διαβητική νεφρική νόσο)χρησιμοποιώντας στρατηγικές βιοπληροφορικής. Πρώτον, η ανάλυση xCell εντόπισε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που εμφανίζουν σημαντικές αλλαγές στο DKD(διαβητική νεφρική νόσο)σωληνοενδιάμεσο, συμπεριλαμβανομένων ρυθμισμένων προς τα πάνω κυττάρων CD4 συν Τ, κυττάρων Th2, CD8 συν Τ κυττάρων, μακροφάγων Μ1, ενεργοποιημένων δενδριτικών κυττάρων (DCs) και συμβατικών DCs, καθώς και μειωμένων Tregs. Δεύτερον, η πυρόπτωση αναγνωρίστηκε ως η κύρια μορφή κυτταρικού θανάτου σε σύγκριση με άλλες μορφές προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Η πρωτεΐνη προσκόλλησης αγγειακών κυττάρων 1 (VCAM1) αναγνωρίστηκε ως το κορυφαίο γονίδιο κόμβου. Η ανάλυση συσχέτισης έδειξε ότι το VCAM1 συσχετίστηκε σημαντικά θετικά με την πυρόπτωση και τα διηθημένα ανοσοκύτταρα στο διάμεσο σωληνάριο. Η ανοδική ρύθμιση του VCAM1 στο σωληναριστήριο DKD επαληθεύτηκε περαιτέρω στην κοόρτη της European Renal cDNA Bank και παρατηρήθηκε ότι συσχετίζεται αρνητικά με τον ρυθμό σπειραματικής διήθησης (GFR). Η in vitro μελέτη μας επικύρωσε την αυξημένη έκφραση VCAM1 σε κύτταρα HK-2 υπό διαβητικές συνθήκες και η αναστολή της πυρόπτωσης από τη δισουλφιράμη μείωσε την έκφραση VCAM1, την απελευθέρωση φλεγμονώδους κυτοκίνης και την ίνωση. Συμπερασματικά, η μελέτη μας εντόπισε ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση VCAM1 σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, τα οποία ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν με διηθημένα ανοσοκύτταρα, προάγοντας έτσι την ίνωση. Το εγκεκριμένο από τον FDA φάρμακο δισουλφιράμη μπορεί να βελτιώσει την ίνωση σε DKD(διαβητική νεφρική νόσο)με στόχευση σωληναριακής πυρόπτωσης και έκφρασης VCAM1.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:DKD; σωληνάριο ενδιάμεσο; κύτταρα του ανοσοποιητικού? πυρόπτωση; VCAM1; δισουλφιράμη

Το Cistanche μπορεί να θεραπεύσειΔιαβητική νεφρική νόσο

Κάντε κλικ στο Cistanche για νεφρική νόσο

Εισαγωγή

Διαβητική νεφρική νόσο(DKD), μία από τις κοινές επιπλοκές του διαβήτη, είναι η κύρια αιτία της χρόνιας νεφρικής νόσου (ΧΝΝ) και της νεφρικής νόσου τελικού σταδίου (ESRD) σε πολλές ανεπτυγμένες και αναπτυσσόμενες χώρες [1,2]. Σύμφωνα με έκθεση από το China Kidney Disease Network (CK NET), DKD(διαβητική νεφρική νόσο)αντιπροσωπεύει το 26,70 τοις εκατό όλων των περιπτώσεων ΧΝΝ και επιβάλλει μεγάλη ιατρική και οικονομική επιβάρυνση [2]. Η παθογένεση της DKD είναι πολύπλοκη και περιλαμβάνει ένα πλήθος διαφορετικών οδών. Η αποσαφήνιση των παθολογικών χαρακτηριστικών και της παθογένειας της DKD θα βοηθήσει στη βελτίωση της κλινικής διαχείρισης και στον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων.

Αν και η σπειραματική βλάβη είναι το κύριο παθολογικό χαρακτηριστικό της DKD(διαβητική νεφρική νόσο), αυξανόμενα στοιχεία αποκάλυψαν πρόσφατα ότι η σωληναρισιακή παθολογία [3,4], όπως η σωληναριακή ατροφία, η διάμεση ίνωση και τα διάμεση διηθητικά ανοσοκύτταρα, παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της DKD(διαβητική νεφρική νόσο)[5-7]. Η ανάλυση βιοπληροφορικής αντιπροσωπεύει μια αποτελεσματική μέθοδο επεξεργασίας μεγάλων ποσοτήτων δεδομένων σε εξαιρετικά σύντομο χρονικό διάστημα και παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για τη νόσο. Ωστόσο, οι μελέτες βιοπληροφορικής που διερευνούν την έκφραση του σωληνοειδούς διάμεσου γονιδίου και τη διήθηση των ανοσοκυττάρων στην DKD είναι σχετικά σπάνιες.

Σκοπός της μελέτης ήταν να περιγράψει τα χαρακτηριστικά του DKD(διαβητική νεφρική νόσο)διήθηση σωληνοειδών διάμεσων ανοσοκυττάρων και για τον εντοπισμό ορισμένων βασικών ανοσολογικών και φλεγμονωδών γονιδίων για την παροχή νέων γνώσεων σχετικά με την παθογένεση και τη θεραπεία της DKD. Πρώτον, ένα σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχίας σωληνίσκων του DKD(διαβητική νεφρική νόσο)έγινε λήψη από τη βάση δεδομένων Gene Expression Omnibus (GEO). Χρησιμοποιώντας το xCell [8], ένα διαδικτυακό εργαλείο που εκτελεί μια ανάλυση εμπλουτισμού κυτταρικού τύπου δεδομένων γονιδιακής έκφρασης για 64 τύπους ανοσολογικών και στρωματικών κυττάρων, ερευνήσαμε αρχικά τις διαφορές στη διήθηση ανοσοκυττάρων μεταξύ των ιστών των νεφρών από άτομα με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)και κανονικά χειριστήρια. Δεύτερον, ελέγχθηκε ένας κατάλογος γονιδίων διαφορικής έκφρασης που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα (DEGs), μεταξύ των οποίων το γονίδιο με την κορυφαία κατάταξη, η πρωτεΐνη προσκόλλησης αγγείων 1 (VCAM1), αναγνωρίστηκε ως γονίδιο κόμβου του ανοσοποιητικού στο DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Στη συνέχεια, σύνολα γονιδίων που σχετίζονται με διάφορες μορφές κυτταρικού θανάτου ελήφθησαν από το GeneCards και η πυρόπτωση αξιολογήθηκε ως η κύρια μορφή κυτταρικού θανάτου χρησιμοποιώντας αναλύσεις παραλλαγής συνόλου γονιδίων (GSVA) ​​και ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA). Επιπλέον, μια ανάλυση συσχέτισης έδειξε ότι το VCAM1 συσχετίστηκε θετικά με τη διήθηση των σωληναρισιακών ανοσοκυττάρων και την πυρόπτωση. Η ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση του VCAM1 στο σωληναριστήριο DKD επαληθεύτηκε περαιτέρω στην κοόρτη της Ευρωπαϊκής Τράπεζας Νεφρικού cDNA (ERCB) και παρατηρήθηκε ότι συσχετίζεται αρνητικά με τη νεφρική λειτουργία σε ασθενείς με DKD. Μια in vitro μελέτη επικύρωσε την αυξημένη έκφραση VCAM1 σε κύτταρα HK-2 που καλλιεργήθηκαν υπό διαβητικές συνθήκες και η αναστολή της πυρόπτωσης από το εγκεκριμένο από την FDA φάρμακο δισουλφιράμη μείωσε την έκφραση VCAM1, την απελευθέρωση φλεγμονώδους κυτοκίνης και την ίνωση. Επομένως, η σωληναριακή πυρόπτωση και η προς τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση VCAM1 μπορεί να είναι στόχοι για την ανοσοθεραπεία της DKD.

Μέθοδοι

Δεδομένα μικροσυστοιχίας

Το σύνολο δεδομένων έκφρασης ανθρώπινου γονιδίου GSE30529 λήφθηκε από το Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO, βάση δεδομένων. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array ) αποτελούνταν από 10 DKD(διαβητική νεφρική νόσο)δείγματα σωληναρίων και 12 δείγματα ελέγχου

Επεξεργασία δεδομένων

Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα στο σύνολο δεδομένων GSE30529 μεταφορτώθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το πακέτο Limma και πακέτο Oligo, αντίστοιχα [9,10]. Η επεξεργασία δεδομένων περιελάμβανε διόρθωση φόντου, κανονικοποίηση και υπολογισμό έκφρασης. Όταν πολλαπλοί ανιχνευτές χαρτογραφήθηκαν σε ένα σύμβολο γονιδίου, το μέσο επίπεδο έκφρασης των ανιχνευτών υπολογίστηκε και θεωρήθηκε ως το επίπεδο γονιδιακής έκφρασης αυτού του γονιδίου. Οι ανιχνευτές που δεν χαρτογραφήθηκαν στα γονίδια αφαιρέθηκαν.

Το Cistanche μπορεί να θεραπεύσειΔιαβητική νεφρική νόσο

Αναλύσεις ανοσοποιητικών και στρωματικών κυττάρων

Εφαρμόσαμε μια νέα μέθοδο βασισμένη στην γονιδιακή υπογραφή, xCell [8], για να εκτιμήσουμε τη βαθμολογία εμπλουτισμού κυτταρικού τύπου και να καθορίσουμε το προφίλ των διεισδυτικών ανοσοκυττάρων στο σωληνάριο των ασθενών με DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Το xCell είναι μια μέθοδος για ανάλυση εμπλουτισμού κυτταρικού τύπου χρησιμοποιώντας ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων ενός δείγματος (ssGSEA) που υπολογίζει τις βαθμολογίες εμπλουτισμού για 64 τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων 34 τύπων ανοσοκυττάρων, 30 τύπων στρωματικών κυττάρων και άλλων κυττάρων. Ξεπερνά τις άλλες εκτενώς αναλύσεις πυριτίου (συμπεριλαμβανομένου του CIBERSORT) περιλαμβάνοντας περισσότερους τύπους ανοσοκυττάρων και χρησιμοποιώντας μια τεχνική αντιστάθμισης διάχυσης για τη μείωση των εξαρτήσεων μεταξύ στενά συνδεδεμένων τύπων κυττάρων. Οι 34 τύποι ανοσοκυττάρων κατηγοριοποιήθηκαν σε εννέα ομάδες, συμπεριλαμβανομένων υποπληθυσμών CD4 συν Τ κυττάρων, υποπληθυσμών CD8 συν Τ κυττάρων, γάμμα δέλτα Τ κύτταρα (Τ δ κύτταρα), ΝΚ κύτταρα, ΝΚΤ κύτταρα, υποπληθυσμούς Β κυττάρων, υποπληθυσμούς μονοκυττάρων/μακροφάγων. υποπληθυσμούς δενδριτικών κυττάρων (DC) και υποπληθυσμούς κοκκιοκυττάρων.

Αναλύσεις εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA) και αναλύσεις παραλλαγής συνόλου γονιδίων (GSVA)

Χρησιμοποιώντας τα σύνολα γονιδίων χαρακτηριστικών ως το σύνολο γονιδίων αναφοράς, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις παραλλαγής συνόλου γονιδίων (GSVA) ​​μεταξύ DKD(διαβητική νεφρική νόσο) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Ταυτοποιήθηκαν και τα δύο μονοπάτια που ρυθμίζονται προς τα πάνω και προς τα κάτω. Το GSEA πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή επιτραπέζιου υπολογιστή GSEA [12] και ένα ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Κατασκευή συνόλων γονιδίων που αντιπροσωπεύουν διάφορες μορφές κυτταρικού θανάτου και ανάλυση εμπλουτισμού

Τα σύνολα γονιδίων που αντιπροσωπεύουν διάφορες μορφές κυτταρικού θανάτου κατασκευάστηκαν με αναζήτηση των λέξεων-κλειδιών «πυρόπτωση», «νέκρωση», «νέκρωση», «απόπτωση», «φερρόπτωση» και «αυτοφαγία» στη βάση δεδομένων GeneCards (https://www.genecards .org/). Τα μη κωδικοποιητικά γονίδια αφαιρέθηκαν. Τα σύνολα γονιδίων παρατίθενται στον Πίνακα S2. Στη συνέχεια, το σύνολο γονιδίων GSEA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την επιτραπέζια εφαρμογή GSEA για την αξιολόγηση της μορφής κυτταρικού θανάτου στο σωληνάριο διάμεσο. Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις συσχέτισης του Pearson για να διερευνήσουμε τη σχέση μεταξύ των βασικών οδών κυτταρικού θανάτου και των διεισδυτικών ανοσοκυττάρων στο σωληνάριο διάμεσο

Ανάλυση DEGs και διαλογή γονιδίων ανοσοκόμβου

DEGs μεταξύ ασθενών με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)και υγιείς μάρτυρες εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο «Limma» [13] στο λογισμικό R. Μια προσαρμοσμένη τιμή P<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(διαβητική νεφρική νόσο). Στην παρούσα μελέτη, τα δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) ενενήντα τεσσάρων κοινών γονιδίων δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων STRING (https://string-db.org/) και οπτικοποιήθηκαν με το λογισμικό Cytoscape (έκδοση 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/). Μια βαθμολογία αλληλεπίδρασης μεγαλύτερη από 0.4 (μέση εμπιστοσύνη) θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Το CytoHubba, ένα πρόσθετο Cytoscape, χρησιμοποιήθηκε για την εξερεύνηση γονιδίων κόμβου δικτύου PPI [14]. Μεταξύ αυτών, το VCAM1 ήταν το κορυφαίο γονίδιο. Οι αναλύσεις εμπλουτισμού των τριάντα γονιδίων του ανοσοποιητικού κόμβου που προσδιορίστηκαν παραπάνω πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο Metascape [15]. Επιπλέον, οι κυρίαρχες μονάδες στο δίκτυο PPI εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόσθετο MCODE (έκδοση 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) στο λογισμικό Cytoscape.

Επαλήθευση VCAM1 και ανάλυση συσχέτισης με τη νεφρική λειτουργία

Η διαφορική έκφραση του VCAM1 στο διάμεσο του σωληναρίου ασθενών με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)επικυρώθηκε στην κοόρτη ERCB (31 υγιείς μάρτυρες και 17 ασθενείς με DKD). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε την ηλεκτρονική βάση δεδομένων Nephroseq v5 (http://v5.nephroseq.org), μια ολοκληρωμένη πλατφόρμα εξόρυξης δεδομένων για σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης νεφρικών παθήσεων, για να επικυρώσουμε τη συσχέτιση μεταξύ έκφρασης VCAM1 και κλινικών χαρακτηριστικών ασθενών με DKD χρησιμοποιώντας Ανάλυση συσχέτισης Pearson στο ERCB. Μια τιμή p του<0.05 was="" considered="" statistically="">

Χρώση ανοσοφθορισμού για VCAM1

Τομές νεφρού παραφίνης από ασθενή με κλινικοπαθολογική διάγνωση DKD(διαβητική νεφρική νόσο)χρωματίστηκαν με VCAM1. Αυτό εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Πρώτου Νοσοκομείου Πεκίνου (ΑΡ. 20171280). Η μη ειδική δέσμευση αποκλείστηκε με 3 τοις εκατό BSA μετά από σταθεροποίηση και θερμική επεξεργασία για ανάκτηση αντιγόνου. Τομές νεφρών στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα κατά του VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Το επισημασμένο με Cy3- δευτερογενές αντίσωμα ελήφθη από την Jackson ImmunoResearch. Ο παρακείμενος νεφρός ιστός όγκου από δείγματα νεφρεκτομής χρησιμοποιήθηκε ως φυσιολογικός έλεγχος. Αντιπροσωπευτικές εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας μια κάμερα Leica DFC 7000 T μέσω του λογισμικού Leica Application Suite V4.7.1.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Κύτταρα ανθρώπινου νεφρού 2 (HK-2), μια εγγύς σωληναριακή επιθηλιακή κυτταρική σειρά ανθρώπινου νεφρού, καλλιεργήθηκαν σε DMEM (11885084, Gibco, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (10099141 C, Gibco, ΗΠΑ) και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (10378016, Gibco, ΗΠΑ) στους 37 βαθμούς με 5 τοις εκατό CO2. Υψηλή γλυκόζη (30 mM D-γλυκόζη, G8644, Sigma) [16] και TNF (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] χρησιμοποιήθηκαν για να προκληθεί τραυματισμός κυττάρων HK-2 in vitro. Η δισουλφιράμη (DSL, 0,3 μΜ [18,19], NSC190940, Selleck), ένας αναστολέας σχηματισμού πόρων, προστέθηκε 3 ώρες πριν από την πρόκληση τραυματισμού των κυττάρων HK-2.

Western blot

Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κύτταρα ΗΚ{{0}} χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Sigma, R0278) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, 23227). Στη συνέχεια, οι μετουσιωμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS–PAGE) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν ηλεκτρικά σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, IPVH00010). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για 60 λεπτά με 5 τοις εκατό γάλα χωρίς λιπαρά διαλυμένο σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0,1 τοις εκατό Tween 20 (TBST). Τα στυπώματα επωάστηκαν με τα ακόλουθα σχετικά πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) και τουμπουλίνη (ZSBio, TA{20}}, 1 :5000). Η επώαση με αραίωση 1:1000 του συζευγμένου με HRP δευτερογενούς αντισώματος διεξήχθη για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πέντε πλύσεις με TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Milipore, WBKLS0100) για 5 λεπτά και οι εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Image Quant LAS 4000 Mini (GE Healthcare). Η ημιποσοτική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Απομόνωση RNA και ανάλυση RT-PCR

Το ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα HK-2 χρησιμοποιώντας ένα κιτ ολικού RNA απλού RNA (Tiangen, DP419) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ FastKing RT (Tiangen, KR116). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας σύστημα StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, ΗΠΑ) με μεθόδους δύο σταδίων. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα S4. Η συγκριτική γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2−ΔΔCt όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Στατιστική ανάλυση

Το λογισμικό GraphPad Prism 6.0 χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές αναλύσεις και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Εφαρμόστηκε ένα μη ζευγαρωμένο t-test δύο ουρών για συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων. Οι διαφορές στο επίπεδο P < 0.05="" θεωρήθηκαν="" στατιστικά="">

Το Cistanche μπορεί να θεραπεύσειΔιαβητική νεφρική νόσο

Αποτελέσματα

Συσσωρευμένα στοιχεία αποκάλυψαν πρόσφατα ότι η σωληναριδική παθολογία διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Σκοπός της μελέτης ήταν να περιγράψει τα χαρακτηριστικά του DKD(διαβητική νεφρική νόσο)διήθηση σωληνοειδών διάμεσων ανοσοκυττάρων και για τον εντοπισμό ορισμένων βασικών ανοσολογικών και φλεγμονωδών γονιδίων για την παροχή νέων γνώσεων σχετικά με την παθογένεση και τη θεραπεία της DKD. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το προφίλ της διήθησης των σωληναρισιακών ανοσοκυττάρων και προσδιορίσαμε την πυρόπτωση ως την κύρια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στην DKD(διαβητική νεφρική νόσο)χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική ανάλυση. Το VCAM1 αναγνωρίστηκε ως το κορυφαίο γονίδιο κόμβου που σχετίζεται με το ανοσοποιητικό και συσχετίστηκε θετικά με την πυρόπτωση και τα διηθημένα ανοσοκύτταρα. Επιπλέον, η έκφραση VCAM1 επικυρώθηκε ότι είναι αυξημένη σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό διαβητικές συνθήκες. Το εγκεκριμένο από τον FDA φάρμακο δισουλφιράμη ανέστειλε την πυρόπτωση των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων και μείωσε την έκφραση VCAM1, τα επίπεδα φλεγμονωδών κυτοκινών και την ίνωση in vitro.

1. Ροές εργασιών ανάλυσης βιοπληροφορικής

Τα κύρια βήματα της ροής εργασίας φαίνονται στο Σχήμα 1. Αρχικά αξιολογήσαμε τη διήθηση των ανοσοκυττάρων σε σωληναριδικούς ιστούς από ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Στη συνέχεια, η πυρόπτωση, η κύρια μορφή κυτταρικού θανάτου στο διάμεσο του σωληναρίου, ανακαλύφθηκε χρησιμοποιώντας GSEA και GSVA. Στη συνέχεια, εξετάσαμε μια λίστα γονιδίων που σχετίζονται στενά με τη διήθηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού και εντοπίσαμε γονίδια κόμβου. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης μεταξύ διεισδυμένων ανοσοκυττάρων, πυρόπτωσης και του γονιδίου κορυφαίας πλήμνης VCAM1. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε κλινική επικύρωση και επικύρωση ανοσοχρώσης του VCAM1. Τέλος, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω μια in vitro μελέτη για την επικύρωση των αποτελεσμάτων της ανάλυσης βιοπληροφορικής.

2. Αναλύσεις αποσυνέλιξης ανοσοκυττάρων και στρωματικών κυττάρων

Χρησιμοποιήσαμε το xCell, το οποίο δημιουργεί βαθμολογίες εμπλουτισμού κυτταρικού τύπου χρησιμοποιώντας δεδομένα μαζικής γονιδιακής έκφρασης, για να προσδιορίσουμε τους κυτταρικούς τύπους που πιθανώς εμπλέκονται σε σωληναριδική βλάβη στοδιαβητική νεφρική νόσο. Οι βαθμολογίες εμπλουτισμού 64 τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων 34 τύπων ανοσοκυττάρων και 30 τύπων στρωματικών και άλλων κυττάρων, ελήφθησαν για κάθε δείγμα (Εικόνα 2(α)). Ο θερμικός χάρτης των 34 βαθμολογιών εμπλουτισμού ανοσοκυττάρων απεικονίστηκε για να προσδιοριστεί το ανοσοποιητικό τοπίο του DKD(διαβητική νεφρική νόσο)σωληνάριο ενδιάμεσο (Εικόνα 2(β)). Σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες, η πλειονότητα των βαθμολογιών εμπλουτισμού Τ κυττάρων ήταν σχετικά υψηλότερη σε ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο), εκτός από τα CD4 συν Tcm, Tregs, Th1 κύτταρα, CD8 plus προγενέστερα Τ κύτταρα και NKT κύτταρα. Οι βαθμολογίες εμπλουτισμού των aDCs και των cDCs ήταν υψηλότερες σε ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)παρά στους ελέγχους, ενώ οι βαθμολογίες εμπλουτισμού κυττάρων Pro-B ήταν χαμηλότερες σε ασθενείς με DKD. Οι βαθμολογίες εμπλουτισμού των περισσότερων υποομάδων μονοκυττάρων/μακροφάγων και κοκκιοκυττάρων δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ DKD(διαβητική νεφρική νόσο)και φυσιολογικούς ιστούς, εκτός από Μ1 μακροφάγα και ουδετερόφιλα, και ηωσινόφιλα (Πίνακας 1).

Εικόνα 2. Ανάλυση διήθησης ανοσοκυττάρων από xCell στο σωληνάριο διάμεσο του DKD(διαβητική νεφρική νόσο). (α) Σύγκριση βαθμολογιών κυττάρων 64 τύπων κυττάρων στο διάμεσο του σωληναρίου μεταξύ DKD και νεφρικού ιστού ελέγχου στο σύνολο δεδομένων GSE30529. (β) Το κυτταρικό τοπίο του ανοσοποιητικού μικροπεριβάλλοντος στο DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Ο θερμικός χάρτης αντιπροσωπεύει τη βαθμολογία εμπλουτισμού τύπου κυττάρου για κάθε τύπο ανοσοκυττάρου για όλα τα δείγματα. DC, δενδριτικό κύτταρο; Tcm, Τ κελί κεντρικής μνήμης; Tem, αποτελεσματικό Τ κύτταρο μνήμης; Τ δ κύτταρο, γάμμα δέλτα Τ κύτταρο.

3. GSVA και GSEA συνόλων γονιδίων χαρακτηριστικών

Διεξάγαμε GSVA και GSEA του συνόλου γονιδίων χαρακτηριστικών στο σύνολο δεδομένων GSE30529 για να εξερευνήσουμε τις βιολογικές διεργασίες στο DKD(διαβητική νεφρική νόσο)σωληνάριο ενδιάμεσο. Τα μονοπάτια σηματοδότησης «απόκριση ιντερφερόνης άλφα», «απόκριση ιντερφερόνης γάμμα» και «συμπλήρωμα» ενεργοποιήθηκαν σημαντικά στην παθογένεση της σωληναριδικής βλάβης σε ασθενείς με DKD (Εικόνα 3(α)) και εμφανίζεται μια περίληψη των αποτελεσμάτων GSVA στον Πίνακα S1. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε GSEA των τριών συνόλων γονιδίων και διαπιστώσαμε ότι εμπλουτίστηκαν θετικά στο σύνολο δεδομένων. Οι βαθμολογίες κανονικοποιημένου εμπλουτισμού (NES) ήταν 1,89, 1,89 και 1,7{{10}}, με κανονικοποιημένες τιμές p (τιμές NOM p) 0.000, 0,002 και 0,019, αντίστοιχα (Εικόνα 3(βδ)). Όλα τα σημαντικά εμπλουτισμένα μονοπάτια που προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το GSEA φαίνονται στον Πίνακα 2. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η σωληναρισιακή ανοσολογική απόκριση παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της DKD(διαβητική νεφρική νόσο).

4. GSEA και GSVA συνόλων γονιδίων που σχετίζονται με διάφορες μορφές κυτταρικού θανάτου

Ο κυτταρικός θάνατος περιλαμβάνει την πυρόπτωση, τη νέκρωση, τη νέκρωση, την απόπτωση, τη φερρόπτωση και την αυτοφαγία, που έχουν διαφορετικούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς και οδούς σηματοδότησης. Διάφορες μορφές προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου έχουν αναφερθεί ότι σχετίζονται με φλεγμονώδεις και ανοσολογικές αποκρίσεις. Κατασκευάσαμε σύνολα γονιδίων διάφορων τύπων κυτταρικού θανάτου από GeneCards (Πίνακας S2) και στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε GSEA και GSVA για να διερευνήσουμε τη συμμετοχή του κυτταρικού θανάτου στη σωληναρισιακή φλεγμονή σε ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Η GSEA έδειξε ότι μόνο τα σύνολα γονιδίων πυρόπτωσης ήταν σημαντικά εμπλουτισμένα σε ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)σε σύγκριση με τους κανονικούς ελέγχους (NES=1.65, FDR q τιμή=0.023, FWER=0.013) (Εικόνα 3(ε)). Εν τω μεταξύ, η βαθμολογία GSVA για την πυρόπτωση ήταν η υψηλότερη μεταξύ όλων των διαφόρων τύπων κυτταρικού θανάτου που αναλύθηκαν (Πίνακας S3). Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, η πυρόπτωση μπορεί να διαδραματίσει ρόλο στην παθογένεση των σωληναριδικών τραυματισμών σε ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο).

Σχήμα 3. Αναλύσεις εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA) και αναλύσεις παραλλαγής συνόλου γονιδίων (GSVA). (α) Barplot των αποτελεσμάτων GSVA 50 συνόλων γονιδίων χαρακτηριστικών. (β)-(δ) Αποτελέσματα GSEA της «Απόκρισης Χαρακτηριστικού_ ιντερφερόνης-άλφα», «Απόκρισης Χαρακτηριστικού_ ιντερφερόνης-γάμα» και «Συμπληρώματος Χαρακτηριστικού». (ε) Αποτέλεσμα GSEA πυρόπτωσης.

5. Συσχέτιση μεταξύ βαθμολογιών εμπλουτισμού πυρόπτωσης και διήθησης ανοσοκυττάρων

Οι βαθμολογίες εμπλουτισμού GSVA για την πυρόπτωση συσχετίστηκαν με την αναλογία της διήθησης των ανοσοκυττάρων πραγματοποιώντας ανάλυση συσχέτισης Pearson για να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ πυρόπτωσης και διήθησης ανοσοκυττάρων. Παρατηρήσαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ 15 τύπων ανοσοκυττάρων και πυρόπτωσης (Εικόνα 4), υποδηλώνοντας μια στενή αλληλεπίδραση μεταξύ των ανοσοκυττάρων και της πυρόπτωσης.

6. Ανακάλυψη γονιδίων πυρήνα

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορικής έκφρασης για να διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων και των διάμεσων ανοσοκυττάρων. Τετρακόσια οκτώ DEG ταυτοποιήθηκαν μεταξύ της DKD(διαβητική νεφρική νόσο)την ομάδα και την ομάδα ελέγχου, μεταξύ των οποίων 65 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και 343 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω (Εικόνα 5). Κατεβάστηκε ένας κατάλογος γονιδίων που σχετίζεται με το ανοσοποιητικό για τον εντοπισμό DEG που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό και αποκτήθηκαν ενενήντα τέσσερα ανοσογονίδια κόμβου από δύο σύνολα δεδομένων (DEG και η λίστα γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό) μέσω ενός διαγράμματος Venn (Εικόνα 6(α)). Η ανάλυση PPI αυτών των ενενήντα τεσσάρων γονιδίων του ανοσοποιητικού κέντρου αποκάλυψε 97 κόμβους και 694 αλληλεπιδράσεις (Εικόνα S1). Οι κορυφαίοι 30 κόμβοι που υπολογίστηκαν από τον αλγόριθμο MCC αναγνωρίστηκαν ως γονίδια πλήμνης (Εικόνα 6(β) και Πίνακας 3). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάλυση εμπλουτισμού των γονιδίων πλήμνης. Η «απόρριψη αλλομοσχεύματος», η «ανταπόκριση ιντερφερόνης-γάμα», «φλεγμονώδης απόκριση», «απόκριση ιντερφερόνης-άλφα», «επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση» και «συμπλήρωμα» ήταν τα πιο εμπλουτισμένα στοιχεία στην ανάλυση χαρακτηριστικών σημάτων. «Ρευματοειδής αρθρίτιδα», «αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης», «μονοπάτι σηματοδότησης υποδοχέα τύπου Toll», «κοκκύτης» και «μονοπάτι σηματοδότησης NF-kappa B» ήταν οι πιο εμπλουτισμένοι όροι KEGG. «Γάμμα ιντερφερόνης κυτταρικής απόκρισης», «δραστηριότητα χημειοκίνης», «προσκόλληση κυττάρου λευκοκυττάρου» και «ρύθμιση παραγωγής κυτοκίνης» ήταν οι πιο εμπλουτισμένοι όροι GO (Εικόνα 6(γ)). Επιπλέον, το σύστημα βαθμολόγησης MCODE αναγνώρισε δύο συστάδες με βαθμολογία μεγαλύτερη ή ίση με 5. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 και CXCL6 ήταν κόμβοι με υψηλότερους βαθμούς κόμβων στην ενότητα 1 (Εικόνα 6(δ)) και CD1C, Τα EGF, FCER1G, CD3D και CD48 ήταν κόμβοι κόμβου στην ενότητα 2 (Εικόνα 6(ε)).

7. Συσχέτιση μεταξύ έκφρασης VCAM1 και διεισδυτικών ανοσοκυττάρων

Μεταξύ των γονιδίων κόμβου που εντοπίστηκαν, το γονίδιο που κατατάσσεται στην κορυφή, το VCAM1, αναγνωρίστηκε ως γονίδιο κόμβου του ανοσοποιητικού στο DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Η έκφραση VCAM1 αυξήθηκε σημαντικά σε ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)(Εικόνα 7 (α)). Η ανάλυση συσχέτισης αποκάλυψε ότι η έκφραση VCAM1 συσχετίστηκε θετικά με τα CD4 συν Τ κύτταρα (r=0.6877, P=0.0004), CD4 συν Τ κύτταρα μνήμης (r=0.7102, P=0.0002), κύτταρα Th2 (r=0.7358, P < 0,0001),="" cd8="" συν="" tcm="" (r="" {{18="" }}.6026,="" p="0.0030)," τ="" δ="" κύτταρα="" (r="0.5864," p="0.0041)," νκ="" κύτταρα="" (r="0.5692," p="0.0057)," μακροφάγοι="" (r="0.5068," p="0.0161)," m1="" μακροφάγοι="" (r="0.4441," p="0" .0384),="" adcs="" (r="0.4814," p="0.0233)" και="" cdcs="" (r="0.6562," p="0.0009)" αλλά="" συσχετίζονται="" αρνητικά="" με="" τα="" αφελή="" cd8="" συν="" τ="" κύτταρα="" (r="−0,4909," p="0,0204)" και="" κύτταρα="" nkt="" (r="−0,5548," p="0,0074)" (εικόνα="" 7(β="">

8. Συσχέτιση μεταξύ έκφρασης VCAM1 και πυρόπτωσης

Η ανάλυση συσχέτισης Pearson διεξήχθη για να διερευνήσει εάν η ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση VCAM1 στο διάμεσο σωληνάριο ασθενών με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)σχετίζεται με την πυρόπτωση. Η έκφραση VCAM1 σχετιζόταν στενά με την πυρόπτωση (r=0.6118, P=0.0025) (Εικόνα 7(γ)), ​​υποδεικνύοντας ότι η πυρόπτωση μπορεί να προκαλέσει έκφραση VCAM1.

9. Επαλήθευση, κλινική συνάφεια και επικύρωση ανοσοφθορισμού της έκφρασης VCAM1

Πραγματοποιήσαμε σχετική ανάλυση ασθενών με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)από το ERCB για να επικυρώσετε την αλλαγή στην έκφραση VCAM1 στο DKD(διαβητική νεφρική νόσο)σωληνάριο ενδιάμεσο. Κατά συνέπεια, τα επίπεδα mRNA του VCAM1 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)(Εικόνα 8(α)). Η έκφραση VCAM1 συσχετίστηκε αρνητικά με τον ρυθμό σπειραματικής διήθησης (GFR) (r=−0.5920, P=0.0123) (Εικόνα 8(β)) και θετικά συσχετίστηκε με τον ορό επίπεδα κρεατινίνης (r=0.5189, P=0.0328) (Εικόνα 8(γ)). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε χρώση ανοσοφθορισμού για το VCAM1 στον νεφρικό ιστό ενός ασθενούς με DKD(διαβητική νεφρική νόσο)και διαπίστωσε ότι η νεφρική σωληναριακή έκφραση VCAM1 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε σύγκριση με αυτή στους φυσιολογικούς νεφρούς (Εικόνα 8(δ)).

10. Η DSL ανέστειλε την πυρόπτωση των κυττάρων HK-2 που προκαλείται από HG, την έκφραση VCAM1 και τη φλεγμονή

Εκθέσαμε καλλιεργημένα κύτταρα HK-2 σε υψηλή γλυκόζη (HG) και TNF- για 48 ώρες για να προσδιορίσουμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της πυρόπτωσης των σωληναριακών κυττάρων, της έκφρασης VCAM1 και της σωληναριακής ανοσολογικής απόκρισης σε άτομα με DKD(διαβητική νεφρική νόσο). Δεδομένου ότι ο πυρήνας της κυτταρικής πυρόπτωσης είναι ο σχηματισμός πόρων μεμβράνης που προκαλείται από σχισμένο GSDMD, εντοπίσαμε τα επίπεδα της N-τερματικής περιοχής GSDMD (GSDMD-NT) και του VCAM1 χρησιμοποιώντας στύπωμα western. Τόσο το HG όσο και το TNF- προκάλεσαν σημαντική αύξηση στο επίπεδο GSDMD-NT, υποδεικνύοντας την εμφάνιση πυρόπτωσης που προκαλείται από GSDMD (Εικόνα 9(α)). Η έκφραση VCAM1 αυξήθηκε στατιστικά σημαντικά στις ομάδες HG και TNF- (Εικόνα 9(β)). Η δισουλφιράμη (DSL) είναι ένας αποτελεσματικός αναστολέας του σχηματισμού πόρων GSDMD [18]. Η προεπεξεργασία με DSL μείωσε την αύξηση των επιπέδων GSDMD-NT, υποδεικνύοντας ότι η κυτταρική πυρόπτωση είχε κατασταλεί. Εν τω μεταξύ, η έκφραση VCAM1 μειώθηκε στις ομάδες HG και TNF που είχαν υποστεί προεπεξεργασία DSL (Εικόνα 9(ab)). Στη συνέχεια, το προφίλ της φλεγμονώδους κυτοκίνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας qPCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ρυθμισμένα προς τα πάνω επίπεδα των mRNA των MCP-1, IL-1 και IL-18 που προκαλούνται από το HG μειώθηκαν σημαντικά μετά την προεπεξεργασία DSL. Στην ομάδα TNF-, το επίπεδο της IL-1 μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα που υποβλήθηκε σε προεπεξεργασία DSL και τα επίπεδα των MCP-1 και IL-18 δεν άλλαξαν σημαντικά. Δεν βρέθηκαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα των IL-6 και IL-8 mRNA σε καμία ομάδα. Είναι σημαντικό ότι τα επίπεδα TGF- 1 mRNA μειώθηκαν επίσης στις ομάδες που έλαβαν προηγουμένως DSL. Έτσι, τα πυροπτωτικά σωληναριακά κύτταρα αύξησαν την έκφραση VCAM1 υπό διαβητικές συνθήκες και μια θεραπεία που καταργούσε την πυρόπτωση ανέστειλε την έκφραση, τη φλεγμονή και την ίνωση του VCAM1 σε κύτταρα HK-2.

Το Cistanche μπορεί να θεραπεύσειΔιαβητική νεφρική νόσο

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος II

Από: «Ταυτοποίηση και επαλήθευση της πρωτεΐνης προσκόλλησης των αγγείων 1 ως γονιδίου κεντρικού ανοσολογικού συστήματος που σχετίζεται με τη σωληνοειδή διάμεση βλάβη στη διαβητική νεφρική νόσο» από τους Yan Jia, et al.

---BIOENGINEERED 2021, ΤΟΜ. 12, ΑΡ. 1, 6655–6673