Αδιαμφισβήτητος δομικός προσδιορισμός NMR των προϊόντων διμερικής αντίδρασης (συν)-κατεχίνης-λακκάσης ως πιθανοί δείκτες οξείδωσης σταφυλιού και κρασιού

Για περισσότερες λεπτομέρειες, επικοινωνήστε με:tina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη:( συν )-Κατεχίνη—λακκάσηοξείδωσηΤα διμερή πρότυπα συντέθηκαν ημι-σύνθεση χρησιμοποιώντας λακκάση από Trametes Versicolor είναι ένα διάλυμα νερού-αιθανόλης σε ρΗ 3,6. Ανιχνεύθηκαν οκτώ κλάσματα που αντιστοιχούν σε οκτώ πιθανά διμερή προϊόντα οξείδωσης. Τα προφίλ των κλασμάτων συγκρίθηκαν με προφίλ που ελήφθησαν με δύο άλλες οξειδοαναγωγάσες:οξειδάση πολυφαινόληςεξάγεται από σταφύλια και λακκάση από Botrytis cinerea. Τα προφίλ ήταν πολύ παρόμοια, αν και ορισμένες μικρές διαφορές υποδηλώνουν πιθανές ανομοιότητες στην αντιδραστικότητα αυτών των ενζύμων. Στη συνέχεια απομονώθηκαν πέντε κλάσματα και αναλύθηκαν με φασματοσκοπία 1D και 2D NMR. Η προσθήκη ιχνών νιτρικού καδμίου στα δείγματα που διαλυτοποιήθηκαν σε ακετόνη οδήγησε σε πλήρως διαχωρισμένα σήματα NMR φαινολικών πρωτονίων, επιτρέποντας τον σαφή δομικό προσδιορισμό έξι προϊόντων αντίδρασης, ένα από τα κλάσματα που περιέχει δύο εναντιομερή. Αυτά τα προϊόντα μπορούν περαιτέρω να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες οξείδωσης για τη διερεύνηση της παρουσίας και της εξέλιξής τους στο κρασί κατά την οινοποίηση και την παλαίωση του κρασιού.

Λέξεις-κλειδιά: δείκτης οξείδωσης;( συν )-κατεχίνη; φαινολικά σήματα NMR. λακκάση? νιτρικό κάδμιο; οξειδάση πολυφαινόλης

Κάντε κλικ για να λάβετε περισσότερες πληροφορίες

1. Εισαγωγή

Πολυφαινόλεςείναι μια οικογένεια χημικών ενώσεων που υπάρχουν ευρέως στη φύση. Βρίσκονται σε σημαντικές ποσότητες στο τσάι [1], στο κακάο [2,3], στα βατόμουρα [4], στα σταφύλια [5 λίτρα και σε προϊόντα που έχουν υποστεί ζύμωση όπως το κρασί [6]. Ως κύριοι στόχοι οξείδωσης J7,8], οι χημικές δομές των πολυφαινολών εξελίσσονται συνεχώς. Αυτές οι αλλαγές επηρεάζουν τις οργανοληπτικές ιδιότητες πολλών τύπων τροφίμων. είναι υπεύθυνα για φαινόμενα όπως το μαύρισμα των τροφίμων [9] και οι τροποποιήσεις των αισθητηριακών χαρακτηριστικών του κρασιού [10,11. Στην οινολογία, αυτό το φαινόμενο οξείδωσης λαμβάνει χώρα στα σταφύλια ή στα κρασιά. Όσον αφορά την ενζυματική οξείδωση, τα κύρια ένζυμα που ευθύνονται για την αμαύρωση είναι οι οξειδορεδουκτάσες, πιο συγκεκριμένα,οξειδάση πολυφαινόληςυπάρχει στα σταφύλια και στη λακκάση που παράγεται από τον Botrytis cinerea [12].

Ενζυματικήοξείδωσηεμφανίζεται κυρίως στο γλεύκος σταφυλιών, αλλά το περαιτέρω μαύρισμα του κρασιού μπορεί να οφείλεται σε αντιδράσεις χημικής οξείδωσης |7,13]ή σε Botrytis cinerea laccase που μπορεί να είναι πολύ σταθερή κατά τη διάρκεια της παλαίωσης του κρασιού14. Δύο ενζυματικές δραστηριότητες οξείδωσης μπορεί να εμφανιστούν σε φαινολικά υποστρώματα: δραστηριότητα μονοφαινολοοξειδάσης που χαρακτηρίζεται από την υδροξυλίωση μιας υπάρχουσας γειτονικής θέσης ομάδας υδροξυλίου και δραστηριότητα οξειδάσης διφαινόλης που αντιστοιχεί στην οξείδωση των ορθο-διυδροξυβενζολών σε ορθο-βενζοκινόνες.

Σύμφωνα με την Επιτροπή Ονοματολογίας της Διεθνούς Ένωσης Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας (NC-IUBMB), αυτές οι ενζυματικές δραστηριότητες καταλύονται από ένζυμα EC1-κατηγορίας που αντιστοιχούν σε οξειδορεδουκτάσες. Μεταξύ αυτών, οι τρεις κύριες κατηγορίες οξειδοαναγωγασών που καταλύουν την οξείδωση πολυφαινόλης είναι οι EC1.14.18.1 (μονοοξυγενάση μονοφαινόλης), EC1.11.1 (υπεροξειδάση/POD) και EC1.10.3 (οξειδοαναγωγάσες που δρουν στις διφαινόλες).

Αυτή η τελευταία κατηγορία χωρίζεται σε διαφορετικές υποκατηγορίες και δύο από αυτές φάνηκαν ιδιαίτερα ενδιαφέρουσες για αυτήν τη μελέτη: EC1.10.3.1 (οξειδάση πολυφαινόλης/PPO) και EC1.10.3.2 (λακκάση) (Βλ. Συμπληρωματικά Υλικά Εικόνα S1).

Το PPO, η λακκάση και η υπεροξειδάση είναι οι οξειδορεδουκτάσες που είναι κυρίως υπεύθυνες για το μαύρισμα κατά την επεξεργασία των σταφυλιών [13]. Το μαύρισμα που προκαλείται από POD είναι αμελητέο στα φρούτα, αλλά μπορεί να αυξήσει την αποικοδόμηση των φαινολών όταν συνδυάζεται με PPO[15]. Το PPO υπάρχει φυσικά στα σταφύλια και είναι σε θέση να καταλύει την οξείδωση των μονοφαινολών σε κατεχόλες και των κατεχολών σε καφέ χρωστικές [8,13,16]. Οι λακάσες, που εμφανίζονται στα μολυσμένα με Βοτρύτη σταφύλια, έχουν ευρύτερο φάσμα δράσης καθώς μπορούν να καταλύουν την οξείδωση πολλών διαφορετικών υποστρωμάτων. Οι κύριοι στόχοι οξείδωσης των λακασών παραμένουν το 1-2 και το 1-4 διυδροξυβενζόλιο.

Στο κρασί, η βενζοκινόνη που παράγεται με οξείδωση (PPO ή λακκάσες) μπορεί εύκολα να υποστεί περαιτέρω αντιδράσεις ανάλογα με τις οξειδοαναγωγικές ιδιότητες και τις ηλεκτρονικές τους συγγένειες [15]. Μπορούν είτε να δράσουν ως ηλεκτρόφιλα και να αντιδράσουν με αμινοπαράγωγα [18] είτε να δράσουν ως οξειδωτικά και να αντιδράσουν, μεταξύ άλλων, με φαινολικά υποστρώματα. Ανάλογα με τη χημική τους διαμόρφωση (κινόνη ή ημι-κινόνη), η βενζοκινόνη μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικά προϊόντα αντίδρασης οξείδωσης. Σε ουδέτερο pH, η (συν)-κατεχίνη θα οξειδωθεί σε κινόνη στη θέση του δακτυλίου Α C5 ή C7 και θα οδηγήσει στον σχηματισμό έξι πιθανών διμερών ισομερών που υποδηλώνουν σύνδεση μεταξύ της θέσης του δακτυλίου Β C2', C5' ή C6' της άνω μονάδας κατεχίνης και η θέση A-ring C6 ή C8 της κάτω μονάδας [19,20]. Η δεϋδροδικατεχίνη είναι ένα πολύ γνωστό προϊόν αυτής της σύζευξης [21]. Οι θέσεις επισήμανσης των δομών εμφανίζονται στο σχήμα 1. Υπό όξινες συνθήκες, μορφές ημι-κινόνης μπορεί επίσης να υπάρχουν στον δακτύλιο Β (θέση OH3'ή OH4') και να οδηγούν σε τέσσερα πιθανά διμερή ισομερή [20,22] με την άνω μονάδα κατεχίνης και τον δακτύλιο Α της κάτω μονάδας (θέση C6 ή C8). Η ενζυματική οξείδωση της κατεχίνης διερευνήθηκε σε προηγούμενες μελέτες [22,23] και τα σχετικά προϊόντα οξείδωσης χαρακτηρίστηκαν με HPLC [24], αν και πιο σπάνια απομονώθηκαν και ποτέ δεν χαρακτηρίστηκαν πλήρως από NMR.

Ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν πρώτα να συγκριθούν από το UHPLC-MS τα προφίλ προϊόντων οξείδωσης διμερών (συν)-κατεχίνης παρουσία τριών εκχυλισμάτων οξειδορεδουκτάσης, δηλαδή PPO που εκχυλίστηκε από σταφύλια, λακκάση από τον μύκητα Botrytis cinerea που υπάρχει σε βοτρυτιωμένα γλυκά κρασιά. [14] και λακκάση από Trametes Versicolor.

Ο δεύτερος στόχος ήταν η ημισύνθεση και ο χαρακτηρισμός των δομών ορισμένων προϊόντων διμερούς οξείδωσης με φασματοσκοπία NMR που ελήφθη με λακκάση από την Trametes Versicolor.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Σύγκριση προφίλ προϊόντων διμερικής αντίδρασης με τρεις διαφορετικές οξυδορεδουκτάσες και (συν)-κατεχίνη

Η (συν)-κατεχίνη οξειδώθηκε αρχικά παρουσία λακκάσης από Trametes Versicolor σε ρΗ 3,6 στο πρότυπο διάλυμα κρασιού. Μετά τον διαχωρισμό του διμερούς κλάσματος από την υπολειμματική (συν)-κατεχίνη και άλλα πολυμερή κλάσματα, συλλέχθηκαν οκτώ κύρια κλάσματα και αναλύθηκαν με UHPLC-UV-MS, σημειωμένες από Ν1 έως Ν8 σε αυξανόμενη σειρά χρόνου κατακράτησης (Πίνακας 1). Τα φάσματα μάζας ηλεκτροψεκασμού σε θετική λειτουργία έδειξαν τις κορυφές ιόντων [Μ συν Η] συν σε m/z 579 για Ν1 έως Ν6, υποθετικά που αντιστοιχούν σε ένα διμερές που σχηματίζεται από έναν απλό δεσμό μεταξύ δύο μονάδων κατεχίνης και [Μ συν Η] συν σε m/577 για N7 και N8, υποθετικά υποδηλώνοντας το σχηματισμό μιας πρόσθετης σύνδεσης.

Αυτά τα οκτώοξείδωσηκλάσματα δυνητικά παρατηρήθηκαν μετά τον χημικό αποπολυμερισμό ενός κλάσματος τανίνης σε προηγούμενες εργασίες [25,26] και θα μπορούσαν ενδεχομένως να είναι τα ίδια με αυτά που έχουν ήδη περιγραφεί από τους Guyot et al. [20], ακόμα κι αν οι πειραματικές συνθήκες ήταν ελαφρώς διαφορετικές. Πράγματι, σε αυτήν την προηγούμενη μελέτη, χρησιμοποιήθηκε ένα ακατέργαστο εκχύλισμα PPO σε pH 3 και 6 για να ληφθούν οκτώ κλάσματα. Στην παρούσα μελέτη, τρία διαφορετικά ένζυμα συγκρίθηκαν σε pH 3,6 στο πρότυπο διάλυμα κρασιού. Η συγκριτική ανάλυση LC-MS των κύριων κλασμάτων οξείδωσης που ελήφθησαν με τα τρία διαφορετικά ένζυμα (λακκάση από Trametes Versicolor, λακκάση από Botrytis cinerea και οξειδάση πολυφαινόλης που εκχυλίστηκε από σταφύλια) παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Για καθένα από τα οκτώ κλάσματα, Οι χρόνοι κατακράτησης ήταν σχεδόν πανομοιότυποι με τα διαφορετικά ένζυμα, και παρόμοια m/z προσδιορίστηκαν με την ανάλυση MS. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι ελήφθησαν τα ίδια κλάσματα για κάθε ένζυμο, που περιείχαν προϊόντα με δομές παρόμοιες με αυτές που υπέθεσαν οι Guyot et al. [20]. Οι Lopez-Serrano και Ros Barcel6 [27] πραγματοποίησαν επίσης μια συγκριτική μελέτη των προϊόντων οξείδωσης (συν)-κατεχίνης με δύο διαφορετικά ένζυμα: την υπεροξειδάση και την οξειδάση πολυφαινόλης, και τα δύο εξαγόμενα από φράουλες. Κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα προϊόντα που ελήφθησαν με τα δύο ένζυμα ήταν ποιοτικά τα ίδια. Μια επιπλέον ένωση με το όνομα N4' με m/z=578 Th και Rt=15.66 λεπτά παρατηρήθηκε σε πειράματα με λακκάση από Botrytis cinerea και εκχυλίστηκε PPO αλλά όχι με λακκάση από Trametes Versicolor, γεγονός που υποδηλώνει πιθανές διαφορές σε αντιδραστικότητα για αυτά τα ένζυμα.

2.2. Μελέτη και βελτιστοποίηση φυσικοχημικών παραμέτρων σε φαινολικά και αλειφατικά σήματα OH 1H-NMR

Ο δομικός χαρακτηρισμός των διμερών προκυανιδινών μπορεί να ληφθεί με ανάλυση NMR. Συγκεκριμένα, η ακριβής θέση σύνδεσης μεταξύ των μονάδων μπορεί να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας φάσματα συσχέτισης HMBC και/ή ROESY [28,29] (Εικόνες S2 και S3). Στην περίπτωση ενός δεσμού τύπου αιθέρα (COC), η απόδοση των πρωτονίων σήματος υδροξυλίου είναι απαραίτητη. Μπορεί επίσης να είναι ζωτικής σημασίας στην περίπτωση των δεσμών CC εάν ορισμένα αλειφατικά ή αρωματικά πρωτόνια επικαλύπτονται ή εάν λείπουν κάποιες βασικές συσχετίσεις. Ωστόσο, ακόμη και σε έναν απρωτικό διαλύτη, τα υδροξυλικά πρωτόνια των πολυφαινολών εμφανίζονται συχνά ως γενικά σήματα από τα οποία δεν μπορούν να ληφθούν δομικές πληροφορίες [30]. Αυτό το ζήτημα αντιμετωπίστηκε προσωρινά με την προσθήκη ιχνών του

Cd(NO3)2 στα διαλύματα του δείγματος. Πράγματι, τα ευρέα σήματα Η των ομάδων ΟΗ οφείλονται στη διαμοριακή ανταλλαγή μεταξύ αυτών των πρωτονίων ΟΗ και άλλων πρωτονίων στον διαλύτη ή τη διαλυμένη ουσία. Με τη μείωση των διαμοριακών δεσμών, η παρουσία νιτρικού καδμίου στα δείγματα μπορεί να μειώσει αυτές τις ανταλλαγές, βελτιώνοντας έτσι την ευκρίνεια των σημάτων πρωτονίων ΟΗ.

2.2.1. Επίδραση της προσθήκης καδμίου

Μετά από ξήρανση με ψύξη, τα πέντε κλάσματα Ν2, Ν3, Ν4, Ν6 και Ν8 διαλυτοποιήθηκαν σε ακετόνη-dg. Στη συνέχεια, τα φάσματα NMR πρωτονίων 1D αποκτήθηκαν στους 25 βαθμούς πριν (Σχήμα 2Α) και μετά την προσθήκη μικρών ποσοτήτων καδμίου (Εικόνα 2Β). Στην καθαρή ακετόνη-d., τα φαινολικά πρωτόνια ΟΗ όλων των κλασμάτων εμφανίστηκαν ως ευρείες κορυφές. Μετά την προσθήκη καδμίου, αυτά τα πρωτόνια έδειξαν εξαιρετικά διακριτικά σήματα στην περίπτωση των κλασμάτων N6 και N8, ενώ για τα κλάσματα N2, N3 και N4 τα σήματα ήταν μόνο λίγο πιο ευκρινή. Θα πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι η αύξηση της περιεκτικότητας σε Cd δεν είχε καμία επίδραση στην ανάλυση του σήματος ΟΗ, καθώς δεν παρατηρήθηκε ευκρίνεια ή ευρύτητα του εύρους γραμμής κορυφής όταν προστέθηκαν διαδοχικές μικρές ποσότητες Cd στα δείγματα (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

Σήματα υψηλής ανάλυσης φαινολικού ΟΗ από τα προϊόντα Ν2, Ν3 και Ν4 επιτεύχθηκαν χάρη στην πρόσθετη ξήρανση και επαναδιαλυτοποίηση (Εικόνα 2C,D).

Η διαφορά συμπεριφοράς κατά την προσθήκη Cd μεταξύ των κλασμάτων μπορεί να εξηγηθεί από την ισχύ των μοριακών αλληλεπιδράσεων: ισχυρότερη στην περίπτωση των Ν2, Ν3 και Ν4 σε σύγκριση με τα Ν6 και Ν8, ενώ ένα περαιτέρω βήμα είναι απαραίτητο για τη διάσπαση αυτών των δεσμών.

Αυτό το πρόσθετο βήμα μπορεί να είναι το βασικό βήμα κατά τη χρήση του Cd για τη λήψη σημάτων φαινολικού ΟΗ με υψηλή ανάλυση σε οποιαδήποτε κατάσταση, ανεξάρτητα από την προέλευση των δειγμάτων, την αντίδραση σύνθεσης ή τα φυσικά πολυφαινολικά προϊόντα.

Μια προηγούμενη εργασία που ασχολείται με τον ξεκάθαρο δομικό χαρακτηρισμό τουπολυφαινόληΤα διμερή που χρησιμοποιούν σήματα φαινολικού NMR υψηλής ανάλυσης OH χάρη στην προσθήκη νιτρικού καδμίου δημοσιεύτηκε το 1996[30]. Από ό,τι γνωρίζουμε, καμία άλλη ερευνητική εργασία που χρησιμοποιεί αυτή τη μεθοδολογία δεν έχει δημοσιευτεί από τότε. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν και άλλες έρευνες για την επίτευξη αυτού του στόχου, είτε με προσθήκες με δόση πικρικού οξέος [31] είτε με χρήση χαμηλής θερμοκρασίας απόκτησης [32]. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το περαιτέρω βήμα που είναι απαραίτητο για να επιτευχθεί ένα αποφασιστικό αποτέλεσμα στην οξύτητα κορυφής του ΟΗ με την προσθήκη Cd, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ωστόσο, το κάδμιο φαίνεται να έχει μεγάλη αξία, δεδομένου ότι μπορούν να ληφθούν σήματα υψηλής ανάλυσης χωρίς την ανάγκη προσθήκης ακριβών ποσοτήτων, σε αντίθεση με την απόκτηση φασμάτων πικρικού οξέος ή NMR σε χαμηλές θερμοκρασίες.

2.2.2. Επίδραση της θερμοκρασίας

Μια μείωση της θερμοκρασίας από 25 βαθμούς C σε 15 βαθμούς δεν είχε καμία επίδραση στην ευκρίνεια των σημάτων φαινολικού ΟΗ ή αλειφατικού ΟΗ. Ωστόσο, οι μετατοπίσεις προς τα κάτω των ανταλλάξιμων κορυφών πρωτονίων μας επέτρεψαν να διαχωρίσουμε ορισμένα επικαλυπτόμενα φαινολικά και αλειφατικά σήματα ΟΗ, καθιστώντας την αναγνώρισή τους πιο προφανή (Εικόνα 3). Με τη μείωση της θερμοκρασίας, ο ρυθμός ανταλλαγής πρωτονίων μειώθηκε και θα περίμενε κανείς πιο έντονες κορυφές αλειφατικού ΟΗ [31]. Η θερμοκρασία των 15 βαθμών προφανώς δεν είναι αρκετά χαμηλή για να ληφθούν καλά αναλυμένα αλειφατικά σήματα ΟΗ. Ωστόσο, μας επέτρεψε να αναγνωρίσουμε με σαφήνεια τον συντονισμό δύο αλειφατικών πρωτονίων ΟΗ στα δείγματα Ν3 και Ν6 και ενός στο δείγμα Ν8. Το φάσμα του δείγματος N2 εμφάνισε επίσης δύο σήματα ΟΗ αλειφατικών πρωτονίων, τα οποία ήταν πιο ευδιάκριτα στους 25 βαθμούς C παρά στους 15 βαθμούς (Εικόνα 2E). Στην περίπτωση του δείγματος N4, τα σήματα που προέρχονταν από το αλειφατικό ΟΗ ήταν μόνο εν μέρει ορατά στο φάσματα, είτε η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 25 βαθμούς είτε στους 15 βαθμούς Κελσίου, λόγω της επίμονης επικάλυψης (Εικόνα 2Ε).

2.3.Δομικός χαρακτηρισμός των διμερικών προτύπων—Ανάλυση φάσματος NMR

Τα φάσματα NMR των κλασμάτων Ν2, Ν3, Ν4, Ν6 και Ν8 έδειξαν ότι τα προϊόντα οξείδωσης ήταν υψηλής καθαρότητας αφού οι εντάσεις σήματος άλλων ανιχνευόμενων ενώσεων ήταν μικρότερες από 10 τοις εκατό σε σύγκριση με αυτές αυτών των προϊόντων.

Σε όλα τα φάσματα, μπορούν να διακριθούν τέσσερις περιοχές χημικής μετατόπισης lH τυπικές για μονάδες κατεχίνης (Εικόνα 2C): σήματα των αλειφατικών πρωτονίων των δακτυλίων πυρανίου (δακτύλιοι C) βρίσκονται στην περιοχή από 2,3 έως 5.0 ppm, και εκείνα των αρωματικών πρωτονίων σήματος των δακτυλίων ρεσορκινόλης (δακτύλιοι Α) και των δακτυλίων κατεχόλης (Brings) από 5,5 έως 6,3 ppm και 6,3 έως 7,1 ppm, αντίστοιχα. Τα σήματα ΟΗ φαινόλης και των δύο δακτυλίων Α και Β εμφανίστηκαν από 7,1 έως 10 ppm. Τα φάσματα NMR και των δύο κλασμάτων έδειξαν την παρουσία διακριτών συνόλων σημάτων μονάδων κατεχίνης σε σταθερή αναλογία έντασης: δύο σετ σημάτων παρατηρήθηκαν στα φάσματα των κλασμάτων N2, N3, N6 και N8 σύμφωνα με την παρουσία διμερών και τέσσερα σύνολα στα φάσματα Ν4, τα οποία μπορεί να αντιστοιχούν σε ένα τετραμερές, δύο διμερή ή ένα μείγμα διαφορετικών ολιγομερών, δηλαδή ένα τριμερές συν ένα μονομερές. Προκειμένου να προσδιοριστεί ο βαθμός ολιγομερισμού των προϊόντων που υπάρχουν στο κλάσμα Ν4, διεξήχθη ένα πείραμα 'Η DOSY χρησιμοποιώντας ένα μείγμα που περιείχε κλάσματα και των δύο κλασμάτων Ν4 και Ν2. Οι συντελεστές διάχυσης όλων των σημάτων εμφάνισαν παρόμοιες τιμές (Εικόνα 4), υποδεικνύοντας την παρουσία δύο διμερών κατεχίνης στο κλάσμα Ν4.

Χάρη στα πλήρως αναλυμένα σήματα φαινόλης OH που παρέχουν αξιόπιστα ποσοτικά αποτελέσματα, ο τύπος σύνδεσης μεταξύ των μονάδων κατεχίνης μπορεί να συναχθεί άμεσα από την ενσωμάτωση της επιφάνειας κορυφής. Έτσι, και για τα δύο κλάσματα, Ν3 και Ν6, η έλλειψη μίας ΟΗφαινόλης (που ανήκει είτε σε ρεσορκινόλη είτε σε δακτύλιο κατεχόλης) και η έλλειψη ενός αρωματικού πρωτονίου ρεσορκινόλης έδειξε μια διαφλαβανική σύνδεση (IFL) αιθερικού τύπου που υποδηλώνει αντίθεση σε ένα Α. ή δακτύλιος Β και θέση C6 ή C8 σε δακτύλιο Α. Στην περίπτωση του δείγματος N2, έλειπαν δύο αρωματικά πρωτόνια, ένα δακτυλίου Β και ένα δακτυλίου Α, που υποδηλώνει CA-CB IFL. Το φάσμα 1D'H του κλάσματος Ν4 έδειξε ότι λείπουν δύο πρωτόνια του δακτυλίου Β, καθώς και δύο πρωτόνια του δακτυλίου Α. Οι δεσμοί μεταξύ των διμερών μονάδων του κλάσματος Ν4 είναι επομένως και οι δύο τύποι CC. Τα φάσματα του κλάσματος N8 ήταν αρκετά διαφορετικά από τα άλλα τέσσερα. Ορισμένα σήματα ήταν τυπικά των μονάδων κατεχίνης, στις οποίες έλειπαν τρεις φαινόλες ΟΗ, ένας αρωματικός δακτύλιος Α και ένα πρωτόνια δακτυλίου Β, καθώς και ένα αλειφατικό ΟΗ. Από την άλλη πλευρά, ορισμένα άλλα σήματα NMR είναι άτυπα μιας μονάδας κατεχίνης: μεθυλένιο με αποτυφλωμένες χημικές μετατοπίσεις 13C (~40 ppm) και μια ομάδα κετόνης (~192 ppm).

Τα συστήματα σπιν πρωτονίων των δακτυλίων C, Α και Β προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας αμφότερα τα φάσματα 'H1D και 1H2D TOCSY (δεν παρουσιάζονται). Δύο συστήματα περιστροφής δακτυλίου C ABMX (τυπικά της κατεχίνης) παρατηρήθηκαν στα φάσματα των κλασμάτων Ν2, Ν3, Ν6 και Ν8 και τέσσερα για το κλάσμα Ν4. Στα φάσματα των κλασμάτων N2, N3, N6 και N8, δύο μετα-συζευγμένα διπλά (J~2Hz) και ένα απλό στην περιοχή του αρωματικού δακτυλίου Α αντιστοιχίστηκαν, αντίστοιχα, στα πρωτόνια του δακτυλίου Α της μονάδας μη συνδεδεμένης κατεχίνης και στο υπολειμματικό πρωτόνιο του δακτυλίου Α της μονάδας κατεχίνης συνδεδεμένης με C{6-ή C8-. Στα φάσματα του Ν4, λόγω της παρουσίας δύο διμερών, ανιχνεύθηκαν τέσσερις μετα-συζευγμένες διπλές και δύο μονές και εκχωρήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα συστήματα πρωτονίων δακτυλίου Β προσδιορίστηκαν επίσης εύκολα από αυτά τα φάσματα και μας επέτρεψαν να αναγνωρίσουμε δύο συστήματα σπιν πρωτονίων ABM για τα διμερή των κλασμάτων Ν3 και Ν6, ενώ ένα σύστημα σπιν πρωτονίων ABM και ένα σύστημα σπιν AB ανιχνεύθηκαν για το διμερές N2 και ένα ABM και συστήματα σπιν πρωτονίου ενός ΑΜ για διμερές N4. Το διμερές Ν8 εμφάνισε μόνο ένα σύστημα περιστροφής δακτυλίου Β ΑΒΜ τυπικό μονομερούς κατεχίνης.

2.3.1.Προσδιορισμός της θέσης δακτυλίου Α του IFL των διμερών των κλασμάτων N2, N3, N4 και N6

Η εγκατάσταση της γέφυρας που βρίσκεται στον δακτύλιο Α των διμερών (δηλ., θέση C6A-ή C8A) απαιτεί την απόδοση του υπολειπόμενου πρωτονίου ΗΑ της μονάδας κατεχίνης που συνδέεται με CA. Χάρη στα εξαιρετικά διαλυμένα σήματα φαινολικού ΟΗ, ένα εύκολο σημείο εκκίνησης ήταν η αναγνώριση των δύο πρωτονίων OH φαινόλης των μονάδων που συνδέονται με τον δακτύλιο Α, δηλαδή του δακτυλίου Α που

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm) που αποδόθηκαν εύκολα στα C7A και C8A, αντίστοιχα. Μόλις εκχωρηθούν τα C6A και C8A, το υπολειπόμενο πρωτόνιο ΗΑ μπορεί να αποδοθεί απευθείας στα φάσματα HSQC. Βρέθηκε έτσι ότι αυτό το υπολειμματικό πρωτόνιο ΗΑ ήταν Η6Α για όλα τα κλάσματα Ν2, Ν3, Ν4, Ν6. Το IFL μεταξύ των μονάδων κατεχίνης υπονοούσε έτσι μια θέση C8A για όλα τα διμερή.

2.3.2. Προσδιορισμός της θέσης του δακτυλίου B του IFL

Διμερή των κλασμάτων Ν2 και Ν4. Τα φάσματα του κλάσματος N2 έδειξαν δύο διαφορετικούς τύπους συστημάτων σπιν πρωτονίων δακτυλίου Β: ένα AMX που αντιστοιχεί στον δακτύλιο Β της μη συνδεδεμένης μονάδας και ένα AM με σταθερά σύζευξης περίπου 8 Hz, χαρακτηριστικό των H6'B και H5' Β μιας μονάδας συνδεδεμένης με C2'B. Η σύνδεση μεταξύ των μονάδων του διμερούς Ν2 είναι επομένως C2'B-C8A. Τα φάσματα NMR του κλάσματος N4 έδειξαν επίσης διαφορετικά συστήματα σπιν Β: δύο AMX, που αντιστοιχούν στον μη συνδεδεμένο δακτύλιο Β και δύο συστήματα AXspin, και τα δύο εμφανίζουν σταθερές σύζευξης περίπου 2 Hz, οι οποίες είναι χαρακτηριστικές των H2'B και H6' Β πρωτόνια μονάδων συνδεδεμένων με C5'B. Η παρουσία συσχετισμών μακράς εμβέλειας'H/13C μεταξύ H6'Band C8A, οι οποίες παρατηρήθηκαν στα φάσματα HMBC των δύο διμερών, είναι σύμφωνα με μια σύνδεση C5/'B-C8A (Εικόνα 5).

Διμερή των κλασμάτων Ν3 και Ν6. Τα φάσματα των κλασμάτων Ν3 και Ν6 έδειξαν την παρουσία δύο συστημάτων πρωτονίων δακτυλίου ΑΜΧ Β και την έλλειψη ενός σήματος φαινόλης ΟΗ. Εφόσον όλα τα OHA φαινολικά πρωτόνια των διμερών μονάδων ταυτοποιήθηκαν (όπως περιγράφεται παραπάνω), το φαινολικό σήμα ΟΗ που λείπει μπορεί να είναι είτε αυτό του OH3'B είτε αυτό του OH4'B.

Η θέση OH (3'B ή 4'B) μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί μέσω συσχετίσεων ROE με το H2'Bor H5'B, αντίστοιχα, ή χρησιμοποιώντας συσχετίσεις HMBC μακράς εμβέλειας όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5.

Η απόδοση του υπολειπόμενου ΟΗ των δακτυλίων Β πραγματοποιήθηκε εύκολα χρησιμοποιώντας συσχετίσεις μακράς εμβέλειας HMBC ή ROESY, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5. Στην περίπτωση του διμερούς N3, παρατηρήθηκε συσχέτιση ROE μεταξύ του H5'B και του υπολειπόμενου OH «Β της μονάδας κατεχίνης που συνδέεται μέσω του δακτυλίου Β της. Αυτό το ΟΗ προσδιορίστηκε έτσι ως OH4'B. Στην περίπτωση του κλάσματος N6, το υπολειμματικό OH'B εκχωρήθηκε στο OH3'B, καθώς παρατηρήθηκε συσχέτιση ROE μεταξύ αυτού του OH και του H2'B. Οι μακροχρόνιες συσχετίσεις HMBC είναι σύμφωνες με αυτές τις αποδόσεις. Οι θέσεις σύνδεσης αυτών των δύο διμερών στη συνέχεια προσδιορίστηκαν ως εξής: CO3'B-C8A και CO4'B-C8A για Ν3 και Ν6. αντίστοιχα.

Κλάσμα N8. Η ανάλυση φάσματος του διμερούς N8 έδειξε ότι μια μονάδα αυτού του διμερούς είναι η κατεχίνη με δύο θέσεις σύνδεσης, μία τον δακτύλιο Α, μία στη θέση C8A και την άλλη στη θέση C-O7A, καθώς τα πρωτόνια H8A και OH7A είναι λείπει. Η άλλη μονάδα αυτού του διμερούς εμφάνιζε μοναδικά φασματικά χαρακτηριστικά, υποδεικνύοντας την απώλεια της αρωματικότητας του δακτυλίου Β και την παρουσία αρκετών θέσεων σύνδεσης και στους δύο δακτυλίους Β και C.

Τα σήματα 'Η NMR που προέκυψαν από τον δακτύλιο Β ήταν δύο διπλά στα 2,49 και 2,71 ppm, που εμφάνιζαν μια δίδυμη σύζευξη~15 Hz (12,03 ppm) τυπική για μια ομάδα μεθυλενίου και μια απλή στα 6,38 ppm που προέρχεται από ένα αιθυλενικό πρωτόνιο. Δεδομένου ότι αυτά τα πρωτόνια μεθυλενίου και αιθυλενίου δεν συζεύχθηκαν, είναι πιθανό να βρίσκονται στις θέσεις 2'Β και 5'Β. Το φάσμα HIMBC έδειξε όλες τις συσχετίσεις, επιτρέποντας ακριβείς αποδόσεις αυτών των ανθράκων του δακτυλίου Β, όπως φαίνεται στο σχήμα 5. Το H2C αυτής της μονάδας έδωσε τρεις συσχετίσεις με άνθρακες δακτυλίου Β: ο ένας είναι ο άνθρακας μεθυλενίου στα ~45 ppm, ο οποίος αποδόθηκε έτσι σε Το C2'B, και τα υπόλοιπα δύο, με άνθρακες που αντηχούν σε ~90 ppm και ~162 ppm, που μπορούν να αποδοθούν στα C1'B και C6'B. : ο ένας είναι ο άνθρακας που είχε αποδοθεί προηγουμένως στο C3'B (~95 ppm), και ο άλλος, ο οποίος αντηχούσε σε ~90 ppm, θα μπορούσε έτσι να αποδοθεί στο C1'B. Ο άνθρακας στα~162 ppm συνάγεται στη συνέχεια ότι είναι C6'B.

Η παρουσία ενός αλειφατικού ΟΗ (~5,8 ppm) στη θέση C3'B (~95 ppm) προσδιορίστηκε μέσω της συσχέτισης του ROE και με τα δύο πρωτόνια Η2'Β. Επιπλέον, το OH3/B έδωσε συσχέτιση HMBC με τεταρτοταγή άνθρακα στα~192,5 ppm, χαρακτηριστικό μιας ομάδας κετόνης στη θέση C4'B.

Η θωράκιση αυτού του C1'B περίπου 40 ppm είναι σύμφωνη με την απώλεια της αρωματικότητας του δακτυλίου Β. Επιπλέον, η έλλειψη ΟΗ στη θέση C7A της άλλης μονάδας συμφωνεί με έναν αιθερικό δεσμό C1'BO-C7A.

Τα δεδομένα NMR έδειξαν ότι ο δακτύλιος C αυτής της μονάδας δεν έχει καθόλου OH3C. Η παρουσία ενός δεσμού C3C-O-C3'B είναι σύμφωνη με τη θωράκιση του C3C περίπου 1,5 ppm καθώς και με τη χημική μετατόπιση του C3'B που είναι τυπική του ημικεταλικού άνθρακα (95 ppm).

Συνολικά, τα φασματικά δεδομένα NMR μας επιτρέπουν να συμπεράνουμε ότι αυτό το διμερές αντιστοιχεί στην αφυδροκατεχίνη Α που περιγράφηκε προηγουμένως από τους Winges et al.[33] και στη συνέχεια από τους Guyot et al.[20].

Οι δομές των έξι διμερών ενώσεων που προσδιορίζονται με αυτές τις αναλύσεις NMR φαίνονται στο Σχήμα 6, όπου τα Ν2, Ν3, Ν6 και Ν8 είναι καθαρά προϊόντα και το Ν4 είναι ένα μίγμα δύο ισομερών.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1.Χημικά

(συν)-ένυδρη κατεχίνη Μεγαλύτερη ή ίση με 98 τοις εκατό. λακκάση από Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); διβασικό διένυδρο φωσφορικό νάτριο Μεγαλύτερο ή ίσο με 98 τοις εκατό. κιτρικό οξύ (αντιδραστήριο ACS, τετραένυδρο νιτρικό κάδμιο 99,997 τοις εκατό· μυρμηκικό οξύ και Amberlite XAD7HP ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, ΗΠΑ). Η ακετόνη-dg αγοράστηκε από την Euriso-top (Saarbrüocen, Germany), and trifluorken, οξύ (TFA) από την Roth Labo (Καρλσρούη, Γερμανία). Το νερό LC-MS, το ακετονιτρίλιο LC-MS (ACN) και η μεθανόλη LC-MS (MeOH) ήταν όλα από VWR (Radnor, PA, ΗΠΑ).

3.2. Παρασκευή του μοντέλου διαλύματος κρασιού

Το πρότυπο διάλυμα κρασιού ήταν ένα διάλυμα αιθανόλης/νερού (12/88;o/o)με 0.033 Μ τρυγικό οξύ, ρυθμισμένο σε pH 3,6 με NaOH 1 M [34].

3.3. Ακατέργαστα εκχυλίσματα PPO σταφυλιού

Το εκχύλισμα PPO παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τους Singleton et al.[35]. Τα κατεψυγμένα σταφύλια αναμίχθηκαν πρώτα σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα οξικού (1,5 Μ, ρΗ 5, 10 gL-I ασκορβικό οξύ). Το μίγμα στη συνέχεια διηθήθηκε και φυγοκεντρήθηκε (3000 g, 10 λεπτά). Το υπόλειμμα τελικά πλύθηκε με ακετόνη (80 τοις εκατό) και ξηράνθηκε στον αέρα.

3.4.Λακάση από Botrytis Cinerea

Η λακκάση από το Botrytis cinerea ελήφθη όπως περιγράφεται από τους Quijada-Morin et al.[36]. Παρήχθη από το στέλεχος VA612 (συλλέχθηκε το 2005 σε έναν αμπελώνα στο Hautvillers, Champagne, Γαλλία, από την ποικιλία Pinot Noir). Εν συντομία, καλλιέργειες σε στερεό μέσο μαγιάς βύνης αφέθηκαν για μία εβδομάδα στους 24 βαθμούς υπό μπλε φως. Τα σπόρια στη συνέχεια ξύστηκαν και εμβολιάστηκαν σε φιάλη Erlenmeyer 5{22}}0 mL που περιείχε 125 mL μέσου καλλιέργειας (4{{30}} gL-1γλυκόζη, 7 gL{{10}}γλυκερόλη, 0,5 g·L-1L-ιστιδίνη, 0,1 g:L-1 CuSO, 1,8 gL-1 NaNO3,0,5 g:L -1 KCl,0,5gL-1 CaCl2·H2O,0,05g:L-1 FeSO4.7H2O,1,0g L-1KH2PO4 και 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Μετά από 3 ημέρες επώασης και 2 ημέρες ανάπτυξης στο ίδιο προηγούμενο μέσο, ​​γαλλικό οξύ (2 gL-1) προστέθηκε στις προκαλλιέργειες. Μετά από 5 ημέρες, το υγρό μέσο διηθήθηκε και το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε εφαπτομενική διήθηση σε σύστημα διήθησης Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Αγγλία) εξοπλισμένο με μοριακό βάρος 30 kDa αποκοπής της μεμβράνης. Το συμπύκνωμα υποβλήθηκε τελικά σε διαδιήθηση έναντι απεσταγμένου νερού και μόνο τα κλάσματα που παρουσίαζαν οξειδωτική δράση έναντι του ABTS διατηρήθηκαν (-80 βαθμός ).

3.5.Διαδικασία οξείδωσης

Ένα διάλυμα λακκάσης (1 gL-1) σε ρυθμιστικό φωσφορικού-κιτρικού άλατος παρασκευάστηκε προηγουμένως και προστέθηκε σε ένα διάλυμα 6 g.L-1(συν)-κατεχίνης (μοντέλο κρασί) για να ληφθεί μια τελική συγκέντρωση λακκάσης { {6}}.3 gL-1. Το ληφθέν διάλυμα στη συνέχεια αναδεύτηκε αργά (180 rpm) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Οι συγκεντρώσεις βελτιστοποιήθηκαν προηγουμένως και ο πειραματισμός πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

3.6. Διακοπή αντίδρασης στο Resin Amberlite XAD7HP

Μια στήλη amber lite ρυθμίστηκε με αιθανόλη (απόλυτη) και ξεπλύθηκε με δύο όγκους στήλης milli-O νερού. Το προηγούμενο μέσο αντίδρασης λακκάσης/(συν)-κατεχίνης έπεσε στη στήλη και εκλούστηκε πρώτα με δύο όγκους στήλης milli-Qwater [37]. Η στήλη στη συνέχεια εκλούστηκε με αιθανόλη μέχρις ότου το συλλεγμένο κλάσμα αποχρωματίστηκε. Μόνο τα κλάσματα αιθανόλης διατηρήθηκαν, εξατμίστηκαν και λυοφιλοποιήθηκαν. Η σκόνη αποθηκεύτηκε σε -80 βαθμό μέχρι να χρησιμοποιηθεί.

3.7. Διαδικασία καθαρισμού του διμερούς κλάσματος με χρήση flash χρωματογραφίας

Η λυοφιλοποιημένη σκόνη καθαρίστηκε αρχικά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα χρωματογραφίας φλας puriflash430 εξοπλισμένο με ανιχνευτή UV ρυθμισμένο στα 280 nm και στήλη Puriflash diol 50 um f0025. Η δυαδική κινητή φάση αποτελούνταν από ακετονιτρίλιο (διαλύτης Α) και μεθανόλη (διαλύτης Β), αμφότερα οξινισμένα με 0,1 τοις εκατό TFA. Πραγματοποιήθηκε μια σειρά ενέσεων με σταθερό ρυθμό ροής 20 mL·min-1, χρησιμοποιώντας την ακόλουθη κλίση: 100 τοις εκατό Α για 4,4 λεπτά. 0-10 % Β σε 10 λεπτά, 10 % Β για 5 λεπτά. 10-90 τοις εκατό Β σε 5 λεπτά, 90 τοις εκατό Β για 3 λεπτά,90-10 τοις εκατό Β σε 2 λεπτά, 10 τοις εκατό Β για 10 λεπτά. Ο όγκος της ένεσης ήταν 1 mL (300 mg λυοφιλοποιημένης σκόνης διαλυμένη σε 1 mL διαλύτη Α). Τρία διακριτά κλάσματα συλλέχθηκαν κάθε φορά. Η πρώτη αντιστοιχούσε σε υπολειμματική (συν)-κατεχίνη και η τρίτη ήταν ένα μείγμα πολυφαινολών υψηλού μοριακού βάρους. Το δεύτερο εκλουόμενο κλάσμα, που περιέχει ένα μίγμα προϊόντων διμερούς οξείδωσης, εξατμίστηκε και λυοφιλοποιήθηκε πριν από το δεύτερο στάδιο καθαρισμού.

3.8. Διαδικασία καθαρισμού προϊόντων οξείδωσης από το διμερές κλάσμα με χρήση ενός χρωματογραφικού συστήματος ημι-παρασκευής

Το κλάσμα που περιέχει προϊόντα διμερικής οξείδωσης καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ημι-παρασκευαστικό σύστημα χρωματογραφίας μέσης πίεσης Bio-Rad NGC 10 εξοπλισμένο με στήλη Varian Dynamax C18 Microsorb αντίστροφης φάσης (250 × 21,2 mm, 3 um). Η δυαδική κινητή φάση αποτελούνταν από milli-O νερό (διαλύτης Α) και 80 τοις εκατό ακετονιτρίλιο, 20 τοις εκατό Milli-Q νερό (διαλύτης Β), και τα δύο οξινισμένα με 0,05 τοις εκατό TFA. Μια σειρά ενέσεων (300 μL) της λυοφιλοποιημένης σκόνης (20 mg διαλυμένα σε 200 uL διαλύτη Α και 100 uL ACN) πραγματοποιήθηκαν υπό τις ακόλουθες συνθήκες έκλουσης: 100 τοις εκατό Α για 4 λεπτά. 0-35 τοις εκατό Β σε 46 λεπτά,35-100 τοις εκατό Β σε 2 λεπτά, 100 τοις εκατό Β για 5 λεπτά. Οκτώ διακριτά κλάσματα συλλέχθηκαν κάθε φορά, που αντιστοιχούσαν σε καθαρά σήματα UPLC στα 280 nm. Κάθε κλάσμα εξατμίστηκε και λυοφιλοποιήθηκε πριν από την ανάλυση NMR.

3.9.Προετοιμασία δείγματος για ανάλυση NMR

Περίπου 1 mg από κάθε λυοφιλοποιημένη σκόνη ζυγισμένη σε σωλήνες Eppendorf διαλύθηκε σε 500 μL ακετόνης-dg. Στη συνέχεια, στα δείγματα προστέθηκαν~10 uL ενός συμπυκνωμένου διαλύματος νιτρικού καδμίου σε ακετόνη-d, και τα προκύπτοντα διαλύματα μεταφέρθηκαν σε σωλήνες NMR 5 mm για ανάλυση NMR. Πραγματοποιήθηκε ένα επιπλέον στάδιο για ορισμένα δείγματα: μετά τη διαλυτοποίηση των λυοφιλοποιημένων σκονών σε ακετόνη-dg παρουσία ιχνών καδμίου, τα δείγματα εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού και στη συνέχεια επαναδιαλυτοποιήθηκαν σε ακετόνη-d χωρίς περαιτέρω προσθήκη Cd.

3.10.Προδιαγραφές οργάνου

Ανάλυση UPLC-MS. Οι αντιδράσεις παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας δύο συστήματα UPLC-MS. Το πρώτο χρησιμοποιήθηκε για τον ακριβή προσδιορισμό των χρόνων διατήρησης προϊόντων χρησιμοποιώντας μια μέθοδο μακράς κλίσης. δηλ. Υγρή χρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης Waters συνδεδεμένη με Φασματομετρία Μάζας (UHPLC-MS). Το σύστημα υγρής χρωματογραφίας ήταν ένα Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) εξοπλισμένο με ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδου. Χρησιμοποιήσαμε μια στήλη Acquity UPLC HSS T3 (1,8 um, 2,1 ×150 mm). Η θερμοκρασία της στήλης ήταν 25 βαθμοί. Η δυαδική κινητή φάση αποτελούνταν από 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε νερό (διαλύτης Α) και ακετονιτρίλιο (διαλύτης Β). Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε με σταθερό ρυθμό ροής 0.25mL·min-1, χρησιμοποιώντας την ακόλουθη κλίση:8-11 τοις εκατό B σε 2 λεπτά, 11 τοις εκατό B για 8 λεπτά; 11-25 τοις εκατό B σε 15 λεπτά;25-55 τοις εκατό Bin 5 λεπτά;55-99 τοις εκατό Bin 1 λεπτό; 99 τοις εκατό B για 4 λεπτά;99-8 τοις εκατό Bin1 λεπτό; 8 τοις εκατό B για 4 λεπτά. Ο όγκος της ένεσης ήταν 5 μL. Το φασματόμετρο μάζας ήταν ένας απλός τετραπόλος ιονισμού ηλεκτροψεκασμού Waters Acquity QDa (ESI) (Waters, Milford, ΜΑ, ΗΠΑ). Η τριχοειδής τάση ορίστηκε στα 0,8 kV. Τα φάσματα μάζας αποκτήθηκαν σε ένα εύρος μάζας 200-900 Αραιώστε τη λειτουργία θετικού ιόντος.

Το δεύτερο σύστημα UHPLC-MS, που χρησιμοποιήθηκε για γρήγορη επαλήθευση κατά τη διάρκεια των βημάτων καθαρισμού, ήταν το ίδιο με αυτό που περιγράφηκε προηγουμένως, με θερμαινόμενη στήλη Acquity UHPLC HSS T3 (1,8 μm, 2,1×100 mm) στους 38 βαθμούς. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε με σταθερό ρυθμό ροής 0,55 mL·min-1, χρησιμοποιώντας την ακόλουθη γρήγορη κλίση: 0.1-40 τοις εκατό B σε 5 λεπτά. 40-99 τοις εκατό B σε 2 λεπτά. 99 τοις εκατό Β για 1 λεπτό. 99-0.1 τοις εκατό B σε 1 λεπτό. Ο όγκος της ένεσης ήταν 2 μL. Το φασματόμετρο μάζας ήταν μια παγίδα ιόντων ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) Bruker Amazon X (Bruker Daltonics, Βρέμη, Γερμανία). Η τριχοειδής τάση ρυθμίστηκε στα -5,5 kV. Τα φάσματα μάζας αποκτήθηκαν σε ένα εύρος μάζας 50-2000 Αραιώστε τη λειτουργία θετικού ιόντος.

Όλες οι αναλύσεις UPLC-MS πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Όργανο NMR. Όλα τα φάσματα NMR καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Agilent DD{{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ΗΠΑ), που λειτουργεί στα 500,05 και 125,74 MHz για πυρήνες πρωτονίου και άνθρακα{-13, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή έμμεσης ανίχνευσης 5 mm εξοπλισμένο με πηνίο βαθμίδωσης. 1D'H και 13C, 2Dhomonuclear1H TOCSY και ROESY, και ετεροπυρηνικά lH/13C HSQC και HMBC Πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κλασικές αλληλουχίες παλμών και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αμφότερες τις V4Nova και το MessJRJ4Nova. Λογισμικό .1 (Mestrelab Research, Ισπανία). Οι μετρήσεις DOSY αποκτήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως 38]. Οι παράμετροι λήψης της ακολουθίας παλμών DgcsteSL ήταν οι εξής: ο χρόνος καθυστέρησης διάχυσης και το πλάτος του παλμού κλίσης ορίστηκαν στα 50 ms και 2 ms, αντίστοιχα, η ισχύς διαβάθμισης (g) αυξήθηκε σε 16 βήματα με ίση απόσταση g2 από 0,3 έως 32G·cm-I. Μετά τη διόρθωση φάσης, τα φάσματα 2D DOSY κατασκευάστηκαν από τη μέτρηση του ύψους κορυφής χρησιμοποιώντας το λογισμικό VNMRJ4.2.

Όλα τα φάσματα αναφέρθηκαν στα σήματα ακετόνης-dg διαλύτη ('υπολειπόμενο σήμα Η στα 2,05 ppm και σήμα 13C στα 29,92 ppm).

4. Συμπεράσματα

Διερευνήθηκε η δράση τριών διαφορετικών οξειδορεδουκτασών (οξειδάση πολυφαινόλης που εκχυλίστηκε από σταφύλια, λακκάση από Botrytis cinerea και λακκάση από Trametes Versicolor) στην (συν)-κατεχίνη και τα προφίλ που προέκυψαν από LC-UV-MS ήταν πολύ παρόμοια, αν και κάποιες μικρές διαφορές πρότεινε πιθανές ανομοιότητες στην αντιδραστικότητα αυτών των ενζύμων.

Οι δομές έξι προϊόντων οξείδωσης κατεχίνης-λακκάσης (χρησιμοποιώντας λακκάση από Trametes Versicolor) ελήφθησαν με βάση συγκεκριμένες υπογραφές NMR (τέσσερα καθαρά προϊόντα, π.χ., N2, N3, N6 και N8, και N4, που αντιστοιχούν σε ένα μείγμα δύο ισομερή). Η πλήρης απόδοση των σημάτων φαινολικού ΟΗ ήταν δυνατή χάρη στην προσθήκη νιτρικού καδμίου με μια διαδικασία προετοιμασίας δείγματος που επέτρεψε τη σαφή απόδοση των δεσμών μεταξύ των μονάδων κατεχίνης για ορισμένες από τις ενώσεις ενδιαφέροντος. Αυτή η διαδικασία θα απλοποιήσει σημαντικά την ανάλυση NMR μιγμάτων πολυφαινολών, είτε συντεθειμένων είτε εκχυλισμένων από φυσικά προϊόντα.

Τα πρότυπα που λαμβάνονται σε αυτή την εργασία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον ως δείκτες οξείδωσης για τη διερεύνηση της παρουσίας και της εξέλιξής τους κατά την ωρίμανση των σταφυλιών και την παλαίωση του κρασιού. Εκτός από την κατεχίνη, άλλες πολυφαινολικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των φλαβονοειδών και των μη φλαβονοειδών, μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα της λακκάσης για τη λήψη πρόσθετων νέων προτύπων.

Συντομογραφίες

NMR: πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός,

Cd: κάδμιο,

TOCSY: φασματοσκοπία ολικής συσχέτισης,

ROESY: Φασματοσκοπία φαινομένου Overhauser πυρηνικού περιστρεφόμενου πλαισίου,

HSQC: ετεροπυρηνικό πείραμα μονοκβαντικής συσχέτισης,

HMBC: ετεροπυρηνική συνδεσιμότητα πολλαπλών ζωνών,

DOSY: φασματοσκοπία διατεταγμένης διάχυσης.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Khan, Ν.; Mukhtar, H. Tea Polyphenols for Health Promotion. Life Sci. 2007, 81, 519-533. [CrossRef]

2. Fayeulle, Ν.; Vallverdu-Quealt, Α.; Meudec, Ε.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Χαρακτηρισμός των παραγώγων New Flavan-3-Ol σε ζυμωμένους κόκκους κακάο. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, Μ.; Moehring, J.; Wagner, AE Polyphenols from Cocoa and Vascular Health—A Critical Review. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, Ρ.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, Α.; Wickramasinghe, SR Συγκεντρώσεις πολυφαινολών από εκχύλισμα πυρηνικού βατόμουρου με χρήση νανοδιήθησης. Food Bioprod. Επεξεργάζομαι, διαδικασία. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. Antoniolli, Α.; Fontana, AR; Piccoli, Ρ.; Bottini, R. Χαρακτηρισμός Πολυφαινολών και Αξιολόγηση Αντιοξειδωτικής Ικανότητας στον Πυρηνό Σταφυλιού του Cv. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Πώς εξελίσσονται οι πολυφαινόλες του κρασιού κατά τη διάρκεια της παλαίωσης του κρασιού; Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, Μηχανισμοί οξείδωσης AMS που εμφανίζονται στα κρασιά. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL Oxygen with Phenols and Related Reactions in Must, Wines, and Model Systems: Observations and Practical Implications. Είμαι. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69-77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Food Browning as a Polyphenol Reaction. Στην πρόοδος στην έρευνα τροφίμων. Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; Τόμος 19, σελ. 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, Α.; Rinaldi, Α.; Ugliano, Μ.; Moio, L. Evolution of Phenolic Compounds and Stringency κατά τη διάρκεια της παλαίωσης του κόκκινου κρασιού: Επίδραση της έκθεσης σε οξυγόνο πριν και μετά την εμφιάλωση. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]